化合物和使用方法与流程

化合物和使用方法
发明领域
1.本发明涉及用于人类或动物施用的化合物及其使用方法。特别地，本发明涉及适于制备用于使用放射性核素(即，内放射学或核医学成像)的成像和/或放射治疗的剂的化合物。这样的成像技术的实例是单光子发射计算机断层扫描(spect)、闪烁扫描和正电子发射断层扫描(pet)。放射治疗中使用的放射性核素的实例包括α粒子发射体、β粒子发射体和俄歇电子发射体。此外，本发明涉及用于核医学成像和/或放射治疗的试剂盒和成像/放射治疗剂。
2.背景
3.放射标记的化合物可用于分子成像和放射治疗二者，并且在现有技术中已经描述了这些中的若干。
4.wo2012/022676描述了适于体内pet成像的放射标记的cmet结合肽。cmet结合肽用放射性同位素
18
f标记。还描述了药物组合物、剂和组合物的制备方法和使用该组合物体内成像的方法，特别是用于癌症的管理。
5.wo2012/119937描述了锝成像剂，其包含适于体内spect或pet成像的放射标记的cmet结合肽。cmet结合肽经由螯合剂缀合物标记。还描述了药物组合物、剂和组合物的制备方法和使用组合物体内成像的方法，特别是用于癌症的诊断。
6.wo2005/030266公开了cmet作为用于光学成像的造影剂的优选的生物靶，具体地用于结肠直肠癌(crc)诊断。wo2005/030266公开了光学成像剂，其包含对异常表达的靶具有亲和力的载体、接头部分和一个或更多个在光学成像中可检测的报告部分。
7.wo2004/078778公开了结合cmet或包含cmet和hgf的复合物的多肽或多聚体肽构建体。wo2004/078778公开了，肽可以用可检测的标记进行标记用于体外和体内应用，或者用药物进行标记用于治疗应用。
8.arulappu等人(nucl.med.2016,57,765-770)公开了开发用于头颈癌的癌症成像的
18
f pet剂。该剂基于26个氨基酸的肽，具有两个内部二硫键，与cmet受体特异性结合。该肽上的赖氨酸残基用
18
f标记。
9.然而，诸如这样的剂的合成(其中放射性核素被共价地引入)是复杂的，产率低并且需要纯化步骤来提供足够纯度的成像剂。此外，这样的合成需要使用辅基，诸如p-18
f苯甲醛作为起始原料，其需要从
18
f-氟化物制备。因此，与绝大多数基于
18
f的pet剂类似，制备需要熟练的放射化学家和专用设备诸如特定的机器人和盒子以及防护的“热”细胞。因此，需要专业场所来实施这种特定类型的
18
f pet成像剂的合成。
10.由于与制备具有共价结合的
18
f的剂相关的问题，已经出现了可以被螯合剂结合的替代性放射性核素的使用。例如，用于spect成像的
67
ga和用于pet成像的
68
ga已经变得更加普遍，al
18
f盐的使用也是如此。
11.尽管存在包含与螯合剂(能够螯合放射性同位素)缀合的靶向部分的成像剂的实例，但是具有能够靶向细胞表面cmet过表达并具有高亲和力结合、有利的动力学特征(kinetic profile)、特异性摄取和/或快速全身清除的成像和/或放射治疗剂将是有益的，
cr2co
2-、-co2cr
2-、-nrco-、-conr-、-nr(c＝o)nr-、-nr(c＝s)nr-、-so2nr-、-nrso
2-、-cr2ocr
2-、-cr2scr
2-、cr2nrcr
2-、c
4-8
亚环杂烷基基团、c
4-8
亚环烷基基团、c
5-12
亚芳基基团、c
3-12
亚杂芳基基团、氨基酸、糖或单分散性聚乙二醇(peg)构建模块；
35.每个r独立地选自h、c
1-4
烷基、c
2-4
烯基、c
2-4
炔基、c
1-4
烷氧基烷基或c
1-4
羟烷基；
36.m是值1至20的整数；
37.n是值0或1的整数；
38.im是适于络合放射性部分的螯合剂。
39.该化合物可以包含放射性部分。
40.z1基团取代了最后一个氨基酸残基的胺基团。因此，当z1是h时，cmbp的氨基末端终止于最后一个氨基酸残基的游离nh2基团。z2基团取代了最后一个氨基酸残基的羰基基团。因此，当z2是oh时，cmbp的羧基末端终止于最后一个氨基酸残基的游离co2h基团，并且当z2是obc时，该末端羧基基团被电离为co2bc基团。
41.术语“代谢抑制基团”(m
ig
)是意指在氨基末端(z1)或羧基末端(z2)抑制或阻抑cmbp肽的体内代谢的生物相容性基团。这样的基团对于本领域技术人员来说是熟知的，并且对于肽胺末端，这样的基团合适地选自以下：n-酰化基团-nh(c＝o)rg，其中酰基基团-(c＝o)rg具有选自以下的rg：c
1-6
烃基、c
3-10
芳基基团或包含聚乙二醇(peg)构建模块。以下描述了对于接头基团(l)合适的peg基团。这样的peg基团可以是式ia或ib的生物改性剂(biomodifier)。这样的氨基末端m
ig
基团可以是乙酰基、苄氧基羰基或三氟乙酰基，通常是乙酰基。
42.对于肽羧基末端合适的代谢抑制基团包括：羧酰胺、叔丁基酯、苄基酯、环己基酯、氨基醇或聚乙二醇(peg)构建模块。对于cmbp肽的羧基末端氨基酸残基，合适的m基团是将氨基酸残基的末端胺用c
1-4
烷基基团n-烷基化，任选地用甲基基团n-烷基化。这样的m
ig
基团可以是羧酰胺或peg，并且通常是羧酰胺。
43.式i表示，-(l)n[im]部分可以在z1、z2或cmbp中的任何合适的位置附接。对于z1或z2，当z1/z2中的任一个是m
ig
时，-(l)n[im]部分可以附接到m
ig
基团。当z1是h或z2是oh时，在z1或z2位置的-(l)n[im]部分的附接分别得到式[im]-(l)
n-[cmbp]-z2或式z
1-[cmbp]-(l)
n-[im]的化合物。在任一肽末端对cmbp代谢的抑制也可以通过以这种方式附接-(l)n[im]部分来实现，但是-(l)n[im]在本文中m
ig
的定义之外。
[0044]
式i的-(l)
n-部分可以在im的任何合适的位置附接。-(l)
n-部分或者取代im的现有取代基，或者共价地附接到im的现有取代基。-(l)
n-部分任选地经由im的羧基烷基取代基附接。
[0045]
术语“肿瘤保留基团”(t
rg
)意指在肿瘤细胞等中增强或改进化合物体内保留的生物相容性基团。这样的基团可以是增加化合物的总体大小的部分并且对于肽胺末端或肽羧基末端，合适地选自：多胺、聚赖氨酸、peg(单分散)、白蛋白、脂肪直链碳链、糖(糖基化)。
[0046]
术语“生物分布增强基团”(d
eg
)意指增强化合物体内生物分布或延长化合物体内血液保留(增强或改进药物代谢动力学)的生物相容性基团。对于肽胺末端或肽羧基末端，这样的基团合适地选自：多胺、聚赖氨酸、peg(单分散)、白蛋白、脂肪线性碳链、糖(糖基化)，最合适地是peg(单分散)。
[0047]
术语“cmet结合环肽”(cmbp)意指与肝细胞生长因子(hgf)高亲和力受体，也称为
cmet(c-met或肝细胞生长因子受体)结合的肽。合适的cmbp肽对cmet/hgf复合物的cmet具有少于约10μm的表观kd。cmbp肽包含脯氨酸残基，并且已知这样的残基可以显示主链酰胺键的顺式/反式异构化。本文描述的cmbp肽包括任何这样的异构体。
[0048]
术语“生物相容性阳离子”(bc)意指带正电的平衡离子，其与离子化的带负电的基团形成盐，其中所述带正电的平衡离子也是无毒的，并且因此适于施用到哺乳动物体，特别是人体。合适的生物相容性阳离子的实例包括：碱金属钠或钾；碱土金属钙和镁；和铵离子。通常的生物相容性阳离子是钠和钾，通常地是钠。
[0049]
术语“氨基酸”意指l-氨基酸或d-氨基酸、氨基酸类似物(例如萘基丙氨酸)或氨基酸模拟物，其可以是天然存在的或纯合成来源的，并且可以是光学纯的，即单一对映异构体并因此是手性的，或者对映异构体的混合物。本文使用常规的氨基酸3字母或单字母缩写。所用的氨基酸可以是光学纯的。术语“氨基酸模拟物”意指天然存在的氨基酸的合成类似物，其是电子等排体，即被设计成模拟天然化合物的空间和电子结构。这样的电子等排体是本领域技术人员熟知的，并且包括但不限于缩肽、逆转肽(retro-inverso peptide)、硫代酰胺、环烷烃或1,5-二取代四唑[参见m.goodman,biopolymers,24,137,(1985)]。
[0050]
术语“肽”意指包含通过肽键(即连接一个氨基酸的胺和另一个氨基酸的羧基的酰胺键)连接的两个或更多个氨基酸(如以上定义的)的化合物。术语“肽模拟物”或“模拟物”指模拟肽或蛋白的生物活性但在化学性质上不再是肽的生物活性化合物，即它们不再含有任何肽键(即氨基酸之间的酰胺键)。这里，术语肽模拟物以更广泛的意义使用，包括本质上不再完全是肽的分子，诸如伪肽、半肽和类肽。
[0051]
术语“螯合剂”(im)意指它的某些原子可以与单个金属离子或金属离子盐形成几个键的物质。螯合剂是一种多齿配体，通常由富含给电子元素诸如氮或氧的大环组成。
[0052]
式i的接头基团-(a)
m-的作用之一可以是将im与cmbp肽的活性位点拉开距离。当化合物相对较大时这一点特别重要，这样就不会损害与靶蛋白的相互作用。这可以通过联合以下来实现：柔性(例如简单的烃基链)，从而大基团可以有自由将自身远离活性位点定位；和/或刚性，诸如环烷基或芳基间隔基，其将im远离活性位点定向。接头基团的性质也可以用来改变化合物的生物分布。因此，例如在接头中引入醚基团将有助于改变血浆蛋白结合。当-(a)
m-包含聚乙二醇(peg)构建模块或1至10个氨基酸残基的肽链时，接头基团可用于改变化合物体内药物代谢动力学和血液清除率。这样的“生物改性剂”接头基团可以改变化合物从背景组织诸如肌肉或肝和/或从血液中的清除速率，从而由于较少的背景干扰得到更好的诊断图像。生物改性剂接头基团也可用于促进特定的排泄途径，例如，经由肾相对于经由肝。
[0053]
术语“糖”意指单糖、二糖或三糖。合适的糖包括：葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、甘露糖和乳糖。任选地，糖可以被官能化以允许容易偶联到氨基酸。因此，例如，氨基酸的葡糖胺衍生物可以经由肽键与其它氨基酸缀合。天冬酰胺的葡糖胺衍生物(从novabiochem商业可得)是这样的一个实例：
[0054][0055]
成像剂的分子量合适地为至多8,000道尔顿。任选地，分子量在2,800道尔顿至6,000道尔顿的范围内，通常地3,000道尔顿至4,500道尔顿，最通常地3,200道尔顿至4,000道尔顿。
[0056]
本发明的成像剂具有的两个肽末端可以均被m
ig
基团保护，即任选地z1和z2都是m
ig
，其通常是不同的。如以上所述，z1/z2中的任一个可以任选地等同于-(l)n[im]。以这种方式保护两个肽末端对于体内成像应用来说是重要的，因为否则快速代谢将被预期并且对cmet选择性结合亲和力的随之损失。当z1和z2都是m
ig
时，任选地z1是乙酰基并且z2是伯酰胺。z1可以是乙酰基并且z2可以是伯酰胺，并且-(l)n[im]部分可以附接到cmbp的赖氨酸残基的ε胺侧链。
[0057]
本发明的cmbp肽对于cmet与cmet/hgf复合物的结合可以具有少于约10nm的kd(基于荧光偏振测定测量)，最通常地在1nm至5nm的范围内，并且少于3nm是理想的。
[0058]
式i的cmbp的肽序列(seq-1)：
[0059]
cys
a-xaa
1-cys
c-xaa
2-gly-pro-pro-xaa
3-phe-glu-cys
d-trp-cys
b-tyr-xaa
4-xaa
5-xaa6[0060]
(seq-1)
[0061]
是一个17-mer肽序列，其主要负责与cmet选择性结合。当本发明的cmbp肽包含多于17个氨基酸残基时，剩余的氨基酸可以是除半胱氨酸以外的任何氨基酸。此外，未受保护的半胱氨酸残基可能造成对明确的cys
a-cysb和cys
c-cysd二硫桥的不想要的扰乱(scrambling)。另外的肽优选地包含至少一个氨基酸残基，并且侧链适于-(l)n[im]部分的容易缀合。合适的这样的残基包括用于与胺官能化的-(l)n[im]基团缀合的asp或glu残基，或用于与羧基或活性酯官能化的-(l)n[im]基团缀合的lys残基。用于-(l)n[im]缀合的氨基酸残基合适地远离cmbp肽(seq-1)的17-mer结合区定位，并且任选地位于c-或n-末端。任选地，用于缀合的氨基酸残基是lys残基。
[0062]
用已知的氨基酸取代苯丙氨酸和萘丙氨酸来评估seq-1的色氨酸残基的取代。然而，发现cmet亲和力的损失表明色氨酸残基对活性是重要的。任选地，cmbp肽还包含n-末端丝氨酸残基，得到18-mer(seq-2)：ser-cys
a-xaa
1-cys
c-xaa
2-gly-pro-pro-xaa
3-phe-glu-cys
d-trp-cys
b-tyr-xaa
4-xaa
5-xaa6.
[0063]
(seq-2)
[0064]
除了seq-1或seq-2，cmbp还可以包括以下任一：
[0065]
(i)在cmbp肽的肽c-末端或肽n-末端的4个氨基酸残基内的asp或glu残基或其类似物，和-(l)n[im]用胺基团官能化，所述胺基团被缀合到所述asp或glu残基或其类似物的羧基侧链以得到酰胺键；或者
[0066]
(ii)在cmbp肽的肽c-末端或肽n-末端的4个氨基酸残基内的lys残基或其类似物，和-(l)n[im]用羧基基团官能化，所述羧基基团被缀合到所述lys残基或其类似物的ε胺侧
链以得到酰胺键。
[0067]
除了seq-1或seq-2，cmbp还可以包含在cmbp肽的肽c-末端或肽n-末端4个氨基酸残基内的lys残基或其类似物，并且-(l)n[im]用羧基基团官能化，所述羧基基团被缀合到所述lys残基或其类似物的ε胺侧链以得到酰胺键。
[0068]
asp和/或glu的类似物可以包括2-氨基丁二酸、2-氨基己二酸、2-氨基庚二酸、2-氨基辛二酸、2-氨基壬二酸、2-氨基癸二酸、2-氨基十一烷二酸和2-氨基十二烷二酸中的一种或更多种。
[0069]
lys的类似物可以包括2,3-二氨基丙酸、2,4-二氨基丁酸、2,5-二氨基戊酸、2,7-二氨基庚酸、2,8-二氨基辛酸、2,9-二氨基壬酸、2,10-二氨基癸酸、2,11-二氨基十一酸、2,12-二氨基十二酸中的一种或更多种。
[0070]
当存在合成接头基团(l)时，它可以包含促进缀合到[im]和z
1-[cmbp]-z2的末端官能团。当l包含1至10个氨基酸残基的肽链时，氨基酸残基可以独立地选自组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或丝氨酸，任选地可以独立地选自甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或丝氨酸。任选地，l可以包含1至5个氨基酸的肽链。任选地，l可以包含2个氨基酸的肽链。任选地，l可以包含3个氨基酸的肽链。氨基酸残基可以独立地选自组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或丝氨酸，任选地可以独立地选自甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或丝氨酸。氨基酸残基可以是甘氨酸。
[0071]
在式-(a)
m-的合成接头基团中，每个a可以是氨基酸并且m可以是值1至5的整数。任选地，每个a可以是氨基酸并且m可以是2。任选地，每个a可以是氨基酸并且m可以是3。氨基酸可以独立地选自组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或丝氨酸，任选地可以独立地选自甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或丝氨酸。氨基酸或每个氨基酸可以是甘氨酸。
[0072]
当l包含peg部分时，它可以包含衍生自式ia(17-氨基-5-氧代-6-氮杂-3,9,12,15-四氧代十七烷酸)或ib的单分散peg样结构的寡聚化的单元：
[0073][0074]
其中p是1至10的整数。可选地，可以使用基于式ib的丙酸衍生物的peg样结构：
[0075][0076]
其中p如式ia所定义的并且q是3至15的整数。在式ib中，p可以是1或2并且q可以是5至12。
[0077]
l可以包含1至10个氨基酸残基的肽链和peg部分。在式-(a)
m-的合成接头基团中，每个a可以独立地是氨基酸或单分散聚乙二醇(peg)构建模块。任选地，每个a可以独立地是氨基酸。m可以是值1至5的整数，任选地是3，任选地是2。
[0078]
当接头基团不包含peg或肽链时，l基团可以具有构成-(a)
m-部分的、连接的原子的主链，该主链具有2至10个原子，最优选地2至5个原子，并且2个或3个原子是特别优选的。2个原子的最小接头基团主链赋予成像部分分开良好的优点，从而使任何不希望的相互作用最小化。
[0079]
式z
1-[cmbp]-z2的肽可以通过包括以下的制备方法获得：
[0080]
(i)线性肽的固相肽合成，所述线性肽具有与期望的cmbp肽相同的肽序列并且其中cysa和cysb不受保护，并且cysc和cysd残基具有硫醇保护基团；
[0081]
(ii)从固体支持物裂解，并且用溶液中的水性碱处理步骤(i)的肽，以得到具有连接cysa和cysb的第一二硫键的单环肽；
[0082]
(iii)除去cysc和cysd硫醇保护基团并环化，以得到连接cysc和cysd的第二二硫键，其是期望的双环肽产物z
1-[cmbp]-z2。
[0083]
术语“保护基团”意指抑制或阻抑不希望的化学反应的基团，但是该基团被设计成有足够的反应性使得它可以在不改变分子其余部分的足够温和的条件下从所讨论的官能团裂解。脱保护后获得期望的产物。胺保护基团是本领域技术人员熟知的并且合适地选自：boc(其中boc为叔丁氧基羰基)、fmoc(其中fmoc为芴基甲氧基羰基)、三氟乙酰基、烯丙氧基羰基、dde[即1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环亚己基)乙基]或npys(即3-硝基-2-吡啶氧硫基)。合适的硫醇保护基团是trt(三苯甲基)、acm(乙酰氨基甲基)、t-bu(叔丁基)、叔-丁硫基、甲氧基苄基、甲基苄基或npys(3-硝基-2-吡啶氧硫基)。另外的保护基团的使用在“protective groups in organic synthesis”theorodora w.greene和peter g.m.wuts,(john wiley&sons,1991)中描述。通常的胺保护基团是boc和fmoc，最通常地是boc。其他通常的硫醇保护基团是trt和acm。
[0084]
固相肽合成的另外的细节在p.lloyd-williams,f.albericio和e.girald；chemical approaches to the synthesis of peptides and proteins,crc press,1997中描述。cmbp肽最好储存在惰性气氛中并且保存在冰箱中。当在溶液中使用时，最好避免7以上的ph，因为这有扰乱二硫桥的风险，并且最好避免低ph因为这会引发肽的聚集。
[0085]z1-[cmbp]-z2可以具有都等于m
ig
的z1和z2。通常的cmbp肽和z1/z2基团如以上描述的。特别地，通常cmbp肽包含asp、glu或lys残基以促进如以上描述的通常的cmbp肽的描述的缀合。最通常地，cmbp肽包含lys残基。
[0086]
以上描述了z
1-[cmbp]-z2的制备。其中z3是活性酯的z
1-[cmbp]-z3肽可以通过常规方法从其中z2是oh或生物相容性阳离子(bc)的z
1-[cmbp]-z2制备。
[0087]
术语“活化酯”或“活性酯”意指相关羧酸的酯衍生物，其被设计成包含更好的离去基团，并且因此允许与亲核试剂诸如胺更容易反应。合适的活性酯的实例是：n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)、磺基琥珀酰亚胺酯、五氟苯酚、五氟硫酚、对硝基苯酚、羟基苯并三唑和pybop(即苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基六氟磷酸鏻)。活性酯可以是n-羟基琥珀酰亚胺酯或五氟苯酚酯，特别是n-羟基琥珀酰亚胺酯。可选地，可以使用通过形成酸酐的羧酸分子内活化形式。
[0088]
放射性部分可以是α射线(α)发射体、β射线(β)发射体和γ射线(γ)发射体中的至少一种。
[0089]
β射线发射体可以是电子(β-)发射体和正电子(β

)发射体中的至少一种。
[0090]
化合物可以用于正电子发射断层扫描(pet)、单光子发射计算机断层扫描(spect)、闪烁扫描和放射治疗中的一种或更多种。化合物可用于单光子发射计算机断层扫描(spect)和放射治疗中的一种或更多种。化合物可以用于放射治疗。
[0091]
放射性部分可以选自由以下组成的组中的一种或更多种：
90
y、
177
lu、
188
re、
186
re、
67
cu、
212
bi、
213
bi、
211
at、
225
ac、
131
i、
166
ho、
149
pm、
199
au、
105
rh、
227
th、
153
sm、
89
sr、
223
ra、
77
br、
123
i、
125
i、
99m
tc、
67
ga、
111
in、
68
ga、
64
cu、
89
zr、
11
c、
15
o、
13
n、
82
rb和
18
f及其合适的盐。
[0092]
放射性部分可以选自由以下组成的组中的一种或更多种：
90
y、
177
lu、
188
re、
186
re、
67
cu、
212
bi、
213
bi、
211
at、
225
ac、
131
i、
166
ho、
149
pm、
199
au、
105
rh、
227
th、
153
sm、
89
sr、
223
ra、
77
br、
123
i和
125
i及其合适的盐。
[0093]
放射性部分可以选自由以下组成的组中的一种或多种：
68
ga、
64
cu、
89
zr、
11
c、
15
o、
13
n、
82
rb和
18
f及其合适的盐。
[0094]
放射性部分可以选自由以下组成的组中的一种或更多种：
99m
tc、
67
ga和
111
in及其合适的盐。
[0095]
放射性部分可以选自由以下组成的组中的一种或更多种：
68
ga、
18
f、
89
zr、
177
lu、
225
ac、
213
bi、
227
th和
90
y及其合适的盐。
[0096]
放射性部分可以选自由以下组成的组中的一种或更多种：
68
ga和
177
lu及其合适的盐。
[0097]
放射性部分可以是
177
lu或其合适的盐。
[0098]
螯合剂可以选自由以下组成的组中的一种或更多种：轮环藤宁(cyclen)(1,4,7,10-四氮杂环十二烷)、环拉胺(1,4,8,11-四氮杂环十四烷)、tacn(1,4,7-三氮杂环壬烷)、thp(三(羟基吡啶酮))、dotaga(2,2’,2
”‑
(10-(1,4-二羧基乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸)、nodaga(1,4,7-三氮杂环壬烷,1-戊二酸-4,7-乙酸)、trap(1,4,7-三氮杂环壬烷次膦酸)、nopo(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二[亚甲基(羟甲基)次膦酸]-7-[亚甲基(2-羧乙基)次膦酸)、nota(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸)、dota(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)、data((6-戊酸)-6-(氨基)甲基-1,4-二氮杂卓三乙酸酯))、aazta(1,4-双(羧甲基)-6-[双(羧甲基)]氨基-6-甲基全氢-1,4-二氮杂卓)、hbed-cc(n,n
’‑
双(2-羟基-5-(亚乙基-β-羧基)苄基)乙二胺n,n
’‑
二乙酸)及其衍生物。
[0099]
螯合剂可以是以下中的至少一种：thp(三(羟基吡啶酮))、dotaga(2,2’,2
”‑
(10-(1,4-二羧基乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸)、dota(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)和nodaga(1,4,7-三氮杂环壬烷,1-戊二酸-4,7-乙酸)。
[0100]
螯合剂可以是以下中的至少一种：dotaga (2,2’,2
”‑
(10-(1,4-二羧基乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸)和dota (1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)。
[0101]
螯合剂可以是dotaga (2,2’,2
”‑
(10-(1,4-二羧基乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸)。螯合剂可以是dota(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)。
[0102]
除了seq-1，cmbp还包含在cmbp肽c-末端或cmbp肽n-末端的4个氨基酸残基内的asp或glu残基，并且-(l)nim用胺基团官能化，所述胺基团被缀合到所述asp或glu残基的羧基侧链以得到酰胺键。
[0103]
除了seq-1，cmbp可以包含在cmbp肽c-末端或cmbp肽n-末端的4个氨基酸残基内的lys残基，并且-(l)nim可以用羧基基团官能化，所述羧基基团被缀合到所述lys残基的ε胺侧链以得到酰胺键。
[0104]
cmbp可以包含seq-2或seq-3的氨基酸序列：
[0105]
ser-cys
a-xaa
1-cys
c-xaa
2-gly-pro-pro-xaa
3-phe-glu-cys
d-trp-[0106]
cys
b-tyr-xaa
4-xaa
5-xaa6(seq-2)；
[0107]
ala-gly-ser-cys
a-xaa
1-cys
c-xaa
2-gly-pro-pro-xaa
3-phe-glu-cys
d-trp-cys
b-tyr-xaa
4-xaa
5-xaa
6-gly-thr(seq-3)。
[0108]
xaa3可以是arg。
[0109]
除了seq-1、seq-2或seq-3，cmbp还可以在n-末端或c-末端包含接头肽，该接头肽选自-gly-gly-gly-lys(seq-4)、-gly-ser-gly-lys-(seq-5)和-gly-ser-gly-ser-lys(seq-6)。
[0110]
接头肽的lys残基是用于-(l)n[im]部分缀合的通常的位置。一些cmbp肽包含seq-3连同seq-4的接头肽，具有26-mer氨基酸序列(seq-7)：
[0111]
ala-gly-ser-cys
a-tyr-cys
c-ser-gly-pro-pro-arg-phe-glu-cys
d-trp-cys
b-tyr-glu-thr-glu-gly-thr-gly-gly-gly-lys。
[0112]
(seq-7)
[0113]
cmbp可以具有氨基酸序列(seq-7)：
[0114]
ala-gly-ser-cys
a-tyr-cys
c-ser-gly-pro-pro-arg-phe-glu-cys
d-trp-cys
b-tyr-glu-thr-glu-gly-thr-gly-gly-gly-lys。
[0115]
z1和z2都可以独立地是q，任选地是m
ig
。
[0116]
z1可以是乙酰基并且z2可以是伯酰胺。
[0117]
n可以是1。n可以是0。
[0118]
seq-1、seq-2、seq-3和seq-7的cmbp肽可以具有z1＝z2＝m
ig
，并且可以具有z1＝乙酰基和z2＝伯酰胺。
[0119]-(l)n[im]部分合适地附接到z1或z2基团中的任一或者不同于seq-1的cmet结合序列的cmbp肽的氨基酸残基。可能的氨基酸残基和缀合部位如以上描述的。当-(l)n[im]部分附接到z1或z2时，它可以通过缀合到n-末端或c-末端来取代z1或z2，并以这种方式阻断体内代谢。
[0120]
该化合物可以适于制备用于放射治疗的剂，化合物具有式i：
[0121][0122]
其中：
[0123]
z1附接到cmbp的n末端，并且是q；
[0124]
z2附接到cmbp的c末端，并且是q；
[0125]
其中q是代谢抑制基团(m
ig
)，m
ig
是抑制或阻抑肽的体内代谢的生物相容性基团；
[0126]
cmbp是17至30个氨基酸的cmet结合环肽，其包含氨基酸序列(seq-1)：
[0127]
cys
a-xaa
1-cys
c-xaa
2-gly-pro-pro-xaa
3-phe-glu-cys
d-trp-cys
b-[0128]
tyr-xaa
4-xaa
5-xaa6；
[0129]
其中：xaa1是asn、his或tyr；
[0130]
xaa2是gly、ser、thr或asn；
[0131]
xaa3是thr或arg；
[0132]
xaa4是ala、asp、glu、gly或ser；
[0133]
xaa5是ser或thr；
[0134]
xaa6是asp或glu；
[0135]
并且cys
a-d
各自是半胱氨酸残基，使得残基a和b以及c和d环化形成两个分别的二硫键；
[0136]
l是式-(a)
m-的合成接头基团，其中每个a独立地是-cr
2-、-cr＝cr-、-c≡c、-cr2co
2-、-co2cr
2-、-nrco-、-conr-、-nr(c＝o)nr-、-nr(c＝s)nr-、-so2nr-、-nrso
2-、-cr2ocr
2-、-cr2scr
2-、cr2nrcr
2-、c
4-8
亚环杂烷基基团、c
4-8
亚环烷基基团、c
5-12
亚芳基基团、c
3-12
亚杂芳基基团、氨基酸、糖或单分散性聚乙二醇(peg)构建模块；
[0137]
每个r独立地选自h、c
1-4
烷基、c
2-4
烯基、c
2-4
炔基、c
1-4
烷氧基烷基或c
1-4
羟烷基；
[0138]
m是值1至20的整数；
[0139]
n是值0或1的整数；以及
[0140]
im是适于络合放射性部分的螯合剂，
[0141]
其中所述螯合剂是以下中的至少一种：dotaga(2,2,2
”‑
[0142]
(10-(1,4-二羧基乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸)和dota(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)。
[0143]
化合物可以适于制备用于放射治疗的剂，化合物具有式i：
[0144][0145]
其中：
[0146]
z1附接到cmbp的n末端，并且是q；
[0147]
z2附接到cmbp的c末端，并且是q；
[0148]
其中q是代谢抑制基团(m
ig
)，m
ig
是抑制或阻抑肽的体内代谢的生物相容性基团；
[0149]
cmbp是17至30个氨基酸的cmet结合环肽，其包含氨基酸序列(seq-1)：
[0150]
cys
a-xaa
1-cys
c-xaa
2-gly-pro-pro-xaa
3-phe-glu-cys
d-trp-cys
b-[0151]
tyr-xaa
4-xaa
5-xaa6；
[0152]
其中：xaa1是asn、his或tyr；
[0153]
xaa2是gly、ser、thr或asn；
[0154]
xaa3是thr或arg；
[0155]
xaa4是ala、asp、glu、gly或ser；
[0156]
xaa5是ser或thr；
[0157]
xaa6是asp或glu；
[0158]
并且cys
a-d
各自是半胱氨酸残基，使得残基a和b以及c和d环化形成两个分别的二硫键；
[0159]
l是式-(a)
m-的合成接头接头基团，其中每个a独立地是氨基酸或单分散聚乙二醇(peg)构建模块；
[0160]
m是值1至5的整数；
[0161]
n是1；以及
[0162]
im是适于络合放射性部分的螯合剂，其中螯合剂是以下中的至少一种：dotaga(2,2’,2
”‑
(10-(1,4-二羧基乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸)和dota(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸)。
[0163]
根据本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，其包含第一方面的化合物和生物相容性运载体，呈适于哺乳动物施用的形式。药物组合物还可以包含如第一方面中描述的放射性部分。放射性部分可以由螯合剂络合。
[0164]
生物相容性运载体可以是溶剂，通常地是水性溶剂，通常地是水。溶剂可以是流体。
[0165]“生物相容性运载体”可以是流体，特别是液体，在其中可以悬浮或溶解成像剂，使得组合物在生理上是可耐受的，即可以施用到哺乳动物体而没有毒性或不适当的不适。生物相容性运载体合适地是可注射的运载体液体，诸如无菌、无热原的注射用水；水性溶液诸如盐水(其可以有利地被平衡，使得用于注射的最终产物是等渗的)；一种或更多种张度调节物质(例如血浆阳离子与生物相容性平衡离子的盐)、糖(例如葡萄糖或蔗糖)、糖醇(例如山梨醇或甘露醇)、二醇(例如甘油)或其他非离子多元醇材料(例如聚乙二醇、丙二醇等)的水性溶液。生物相容性运载体可以是无热原的注射用水或等渗盐水。成像剂和生物相容性运载体各自在合适的瓶或容器中提供，其包括允许保持无菌完整性和/或放射性安全性的密封容器，以及任选地惰性顶空气体(例如氮气或氩气)，同时允许通过注射器或套管添加和取出溶液。优选的这样的容器是隔膜密封的瓶，其中气密封闭件用外密封件(overseal)(通常地为铝)卷边(crimp)。该封闭件适于用皮下注射针头进行单次或更多次穿刺(例如卷曲的隔膜密封封闭件)，同时保持无菌完整性。这样的容器具有另外的优点，即如果期望，封闭件可以承受真空(例如，改变顶空气体或脱气溶液)，并且承受压力变化诸如压力降低，而不允许外部大气气体诸如氧气或水蒸气进入。
[0166]
药物组合物可以具有用于单个患者的剂量并且可以在合适的注射器或容器中提供。
[0167]
根据本发明的第三方面，提供了一种用于制备第二方面的药物组合物的试剂盒，
该试剂盒包含无菌固体形式的第一方面的化合物，使得当用无菌供应的第二方面的生物相容性运载体重构时，发生溶解以得到期望的药物组合物。
[0168]
试剂盒还可以包含如第一方面中描述的放射性部分。放射性部分可以由螯合剂络合。
[0169]
根据本发明的另一方面，提供了一种对哺乳动物体成像的方法，包括使用第一方面的化合物和第二方面的药物组合物中的至少一种。
[0170]
成像可以是体内的。
[0171]
成像可以是pet成像、闪烁扫描和spect成像中的至少一种。
[0172]
成像可以是spect成像。
[0173]
成像可以是为了获得体内cmet过表达或定位的部位的图像。
[0174]
成像方法，其中任选地，第一方面的化合物或第二方面的药物组合物已经预先施用到哺乳动物体。
[0175]
该成像方法可以包括以下步骤：
[0176]
a)施用第一方面的化合物和第二方面的药物组合物中的至少一种；
[0177]
b)检测来自放射性部分的由放射性部分衰变产生的发射；和
[0178]
c)从步骤(b)的发射形成感兴趣的组织表面的图像。
[0179]
成像方法可用于辅助检测、诊断、预后、结果预测、手术、分期、处理、治疗、放射治疗、对处理的监测、对疾病进展的监测和/或监测治疗。
[0180]
成像方法可用于辅助检测、诊断、预后、结果预测、手术、分期、处理、治疗、放射治疗、对处理的监测、对疾病进展的监测和/或监测对癌症或癌前状况的治疗。
[0181]
一种检测、诊断、预后、结果预测、手术、分期、处理、治疗、放射治疗、对处理的监测、对疾病进展的监测或监测治疗的方法，其包括成像方法。
[0182]
根据本发明的另一方面，提供了第一方面的化合物或第二方面的药物组合物，其用作以下中的至少一种：哺乳动物体成像中的成像剂和哺乳动物体放射治疗中的放射治疗剂中的至少一种。
[0183]
根据本发明的另一方面，提供了第一方面的化合物或第二方面的药物组合物，其用作哺乳动物体放射治疗中的放射治疗剂。
[0184]
根据本发明的另一方面，提供了第一方面的化合物或第二方面的药物组合物，用作以下二者：哺乳动物体成像中的成像剂和哺乳动物体放射治疗中的放射治疗剂。
[0185]
根据本发明的另一方面，提供了第一方面的化合物和第二方面的药物组合物中的至少一种，用作药物。
[0186]
根据本发明的另一方面，提供了第一方面的化合物和第二方面的药物组合物中的至少一种，用于检测、诊断、预后、结果预测、手术、分期、处理、治疗、放射治疗、对处理的监测、对疾病进展的监测和/或监测治疗。
[0187]
根据本发明的另一方面，提供了第一方面的化合物和第二方面的药物组合物中的至少一种，用于检测、诊断、预后、结果预测、手术、分期、处理、治疗、放射治疗、对处理的监测、对疾病进展的监测和/或监测对癌症或癌前状况的治疗。
[0188]
根据本发明的另一方面，提供了第一方面的化合物和第二方面的药物组合物中的至少一种，用于检测、诊断、预后、结果预测、手术、分期、处理、治疗、放射治疗、对处理的监
测、对疾病进展的监测和/或监测对cmet过表达或定位的部位的治疗。
[0189]
根据本发明的另一方面，提供了第一方面的化合物和第二方面的药物组合物中的至少一种，用于获得体内cmet过表达或定位的部位的图像和/或治疗与之相关的状况。
[0190]
根据本发明的另一方面，提供了使用第一方面的化合物和第二方面的药物组合物中的至少一种进行检测、诊断、预后、结果预测、手术、分期、处理、治疗、放射治疗、对处理的监测、对疾病进展的监测和/或监测治疗的方法。
[0191]
根据本发明的另一方面，提供了使用第一方面的化合物和第二方面的药物组合物中的至少一种对哺乳动物体进行放射治疗的方法。
[0192]
根据本发明的另一方面，提供了使用第一方面的化合物和第二方面的药物组合物中的至少一种对哺乳动物体进行成像和放射治疗二者的方法。
[0193]
根据本发明的另一方面，提供了使用第一方面的化合物和第二方面的药物组合物中的至少一种进行检测、诊断、预后、结果预测、手术、分期、处理、治疗、放射治疗、对处理的监测、对疾病进展的监测和/或监测对癌症或癌前状况的治疗的方法。
[0194]
根据本发明的另一方面，提供了使用第一方面的化合物和第二方面的药物组合物中的至少一种进行检测、诊断、预后、结果预测、手术、分期、处理、治疗、放射治疗、对处理的监测、对疾病进展的监测和/或监测对cmet过表达或定位的部位的治疗的方法。
[0195]
根据本发明的另一方面，提供了一种使用第一方面的化合物和第二方面的药物组合物中的至少一种获得与体内cmet过表达或定位的部位的图像和/或治疗与之相关的状况的方法。
[0196]
根据本发明的另一方面，提供了第一方面的化合物和第二方面的药物组合物中的至少一种的用途。
[0197]
根据本发明的另一方面，提供了第一方面的化合物和第二方面的药物组合物中的至少一种在检测、诊断、预后、结果预测、手术、分期、处理、对处理的监测、治疗、放射治疗、对疾病进展的监测和监测治疗中的至少一种中的用途。
[0198]
根据本发明的另一方面，提供了第一方面的化合物和第二方面的药物组合物中的至少一种作为成像剂和放射治疗剂中的至少一种的用途。
[0199]
根据本发明的另一方面，提供了第一方面的化合物和第二方面的药物组合物中的至少一种作为放射治疗剂的用途。
[0200]
根据本发明的另一方面，提供了第一方面的化合物和第二方面的药物组合物中的至少一种在检测、诊断、预后、结果预测、手术、分期、处理、治疗、放射治疗、对处理的监测、对疾病进展的监测和监测对癌症或癌前状况的治疗中的至少一种中的用途。
[0201]
根据本发明的另一方面，提供了第一方面的化合物和第二方面的药物组合物中的至少一种在检测、诊断、预后、结果预测、手术、分期、处理、治疗、放射治疗、对处理的监测、对疾病进展的监测和监测对cmet过表达或定位的部位的治疗中的至少一种中的用途。
[0202]
根据本发明的另一方面，提供了第一方面的化合物和第二方面的药物组合物中的至少一种在获得体内cmet过表达或定位的部位的图像和治疗与之相关的状况中的至少一种中的用途。
[0203]
应当理解，为了体内使用，通过，例如，用生物相容性运载体重构，将制剂制成适于哺乳动物施用的形式。
[0204]
如所描述的可选的特征和不同的实施方案加上必要的变更适用于每一个和每个方面及其每一种和每种实施方案。
[0205]
附图简述
[0206]
现将参照附图、以实例的方式描述本发明的实施方案，在附图中：
[0207]
图1描绘了包含nodaga的本发明化合物(化合物1)和获得化合物1的反应方案；
[0208]
图2描绘了包含thp的本发明化合物(化合物2)和获得化合物2的反应方案；
[0209]
图3描绘了包含dota的本发明化合物(化合物3)和获得化合物3的反应方案；
[0210]
图4描绘了包含dotaga的本发明化合物(化合物4)和获得化合物4的反应方案；
[0211]
图5显示了
68
ga-化合物3(注射后1小时和3小时)和
18
f-fdg(注射后1小时)的体内pet/ct成像；
[0212]
图6显示了
177
lu-化合物3(注射后1.5小时、17小时、41小时、65小时和141小时)的体内spect成像；
[0213]
图7显示了
18
f-fdg(注射后1小时)的体内pet/ct成像；以及
[0214]
图8显示了
177
lu-化合物3(注射后4.5小时、20小时、45小时、67小时和141小时)的体内spect成像。
[0215]
详述
[0216]
如以下描述地制备可用作成像剂或放射治疗剂(或作为前体或作为试剂盒的一部分)的化合物。
[0217]
cmet结合肽的制备
[0218]
步骤(a)：受保护的前体线性肽的合成
[0219]
前体线性肽具有以下结构：
[0220]
ac-ala-gly-ser-cys-tyr-cys(acm)-ser-gly-pro-pro-arg-phe-glu-cys(acm)-trp-cys-tyr-glu-thr-glu-gly-thr-gly-gly-gly-lys-nh2(包含seq-7)。
[0221]
使用fmoc化学，从0.1mmol rink amide novagel树脂开始，在applied biosystems 433a肽合成仪上组装肽基树脂h-ala-gly-ser(tbu)-cys(trt)-tyr(tbu)-cys(acm)-ser(tbu)-gly-pro-pro-arg(pbf)-phe-glu(otbu)-cys(acm)-trp(boc)-cys(trt)-tyr(tbu)-glu(otbu)-thr(ψ
me,me
pro)-glu(otbu)-gly-thr(tbu)-gly-gly-gly-lys(boc)-聚合物(包含seq-7)。在偶联步骤中应用过量的1mmol预活化氨基酸(使用hbtu)。将glu-thr伪脯氨酸(novabiochem 05-20-1122)掺入序列中。将树脂转移到氮气鼓泡器装置中并且用溶于dcm(5ml)中的乙酸酐(1mmol)和nmm(1mmol)的溶液处理60分钟。通过过滤除去酸酐溶液并且用dcm洗涤树脂并且在氮气流下干燥。
[0222]
在含有2.5％tis、2.5％4-硫代甲酚和2.5％水的tfa(10ml)中进行从树脂中同时除去侧链保护基团和裂解肽2小时30分钟。通过过滤除去树脂，在真空中除去tfa并且将乙醚加入到残留物。用乙醚洗涤形成的沉淀并且风干，提供264mg粗制肽。
[0223]
粗制肽通过制备型hplc(梯度：20％-30％b经10min，其中a＝h2o/0.1％tfa以及b＝acn/0.1％tfa，流速：10ml/min，柱：phenomenex luna 5μc18(2)50
×
21.20mm，检测：uv 214nm，产物保留时间：30min)纯化提供100mg纯的cmet结合肽线性前体。通过分析型hplc(梯度：10％-40％b经10min，其中a＝h2o/0.1％tfa以及b＝acn/0.1％ tfa，流速：0.3 ml/min，柱：phenomenex luna 3μ c18 (2)50
×
2mm，检测：uv 214nm，产物保留时间：6.54min)
分析纯的产物。使用电喷射质谱进行进一步产物表征(计算的mh
22
：1464.6，发现的mh
22
：1465.1)。
[0224]
步骤(b)：单环cys4-16二硫桥的形成
[0225]
cys4-16；ac-ala-gly-ser-cys-tyr-cys(acm)-ser-gly-pro-pro-arg-phe-glu-cys(acm)-trp-cys-tyr-glu-thr-glu-gly-thr-gly-gly-gly-lys-nh2(包含seq-7)。
[0226]
将来自步骤(a)的线性前体(100mg)溶解在5％dmso/水(200ml)中，并且用氨将溶液调整至ph 6。将反应混合物搅拌5天。然后用tfa将溶液调整至ph 2，并且通过真空蒸发除去大部分溶剂。将残留物(40ml)逐份(in portions)注入到制备型hplc柱上用于产物纯化。
[0227]
残留物通过制备型hplc(梯度：0％b持续10min，然后0-40％b经40min，其中a＝h2o/0.1％tfa以及b＝acn/0.1％tfa，流速：10ml/min，柱：phenomenex luna 5μc18(2)250
×
21.20mm，检测：uv 214nm，产物保留时间：44min)纯化提供72mg纯的cmet结合肽单环前体。通过分析型hplc(梯度：10％-40％b经10min，其中a＝h2o/0.1％tfa以及b＝acn/0.1％tfa，流速：0.3ml/min，柱：phenomenex luna 3μc18(2)50
×
2mm，检测：uv 214nm，产物保留时间：5.37min(p1)；5.61min(p2)；6.05min(p3))分析纯的产物(作为异构体p1到p3的混合物)。使用电喷射质谱进行进一步产物表征(计算的mh
22
：1463.6，发现的mh
22
：1464.1(p1)；1464.4(p2)；1464.3(p3))。
[0228]
步骤(c)：第二cys6-14二硫桥的形成
[0229]
在氮气覆盖下，将来自步骤(b)的单环前体(72mg)溶解在75％acoh/水(72ml)中。依次加入1m hcl(7.2ml)和acoh中的0.05m i2(4.8ml)，并且将混合物搅拌45分钟。加入1m抗坏血酸(1ml)，得到无色混合物。真空蒸发大部分溶剂并且将残留物(18ml)用水/0.1％tfa(4ml)稀释，并且用制备型hplc纯化产物。
[0230]
残留物通过制备型hplc(梯度：0％b持续10min，然后20％-30％b经40min，其中a＝h2o/0.1％tfa以及b＝acn/0.1％tfa，流速：10ml/min，柱：phenomenex luna 5μc18(2)250
×
21.20mm，检测：uv 214nm，产物保留时间：43-53min)纯化提供52mg纯的cmet结合肽。通过分析型hplc(梯度：10％-40％b经10min，其中a＝h2o/0.1％tfa以及b＝acn/0.1％ tfa，流速：0.3 ml/min，柱：phenomenex luna 3μ c18 (2)50
×
2mm，检测：uv 214nm，产物保留时间：6.54min)分析纯的产物。使用电喷射质谱进行进一步产物表征(计算的mh
22
：1391.5，发现的mh
22
：1392.5)。
[0231]
化合物1的制备
[0232]
参照图1的反应流程，化合物1如以下制备。
[0233]
在氮气下，将从bachem获得的gmp级cmet结合肽(150.0mg，49.8μmol)溶解在10ml圆底烧瓶中的无水dmf(1.9ml)中。将从chematec获得的nodaga-nhs酯(43.80mg，1.2当量)溶解在无水dmf(600μl)中，并且加入从sigma aldrich获得的无水dipea(173μl，20.0当量)(99.5％生物技术级)。将活性酯溶液加入到肽溶液中，此时形成沉淀。将悬浮液在25℃搅拌1小时，此时用hplc分析样品，显示不完全反应。将悬浮液再搅拌1小时，此时通过hplc分析另一个样品，再次显示不完全反应。将nodaga-nhs酯(8.7mg，0.52当量)和dipea(34.7μl，4当量)加入到反应混合物。3小时30分钟后停止反应，尽管起始肽向产物的转化不完全(剩余约5％的起始肽)。向反应混合物加入冰冷的mtbe(15ml)并且离心沉淀(2分钟，3,260rpm，5℃)。将粗产物溶于1ml水中，产生两相液体，通过半制备型hplc(aa 100mm，ph 7，acn，1％/
分钟，10ml/min，柱zorbax c18 30
×
250mm，3次注入，tr＝26.73分钟)纯化。化合物1以中等产率(76.9mg，49％)和优异的纯度(》98％，210和254nm)获得。
[0234]
hplc和maldi/tof证实已经获得化合物1。
[0235]
hplc结果
[0236]
(洗脱剂a：h2o中0.1％tfa，洗脱剂b：乙腈中0.09％tfa；柱：agilent zorbax eclipse plus 95a c18,2.1
×
150mm,3.5um p/n 959763-902；梯度：5％b持续2.5min，然后85min内5％至90％b，然后90％b持续2.5min，然后2.5min内90％至5％b，然后5％b持续2.5min；检测：210nm)
[0237]
·
t
r cmet肽：29.2min；tr产物＝30.1分钟
[0238]
(洗脱剂a：水中0.1m乙酸铵，洗脱剂b：乙腈；柱：agilent zorbax eclipse plus 95a c18,2.1
×
150mm,3.5um p/n 959763-902；梯度：5％b持续2.5min，然后85min内5％至90％b，然后90％b持续2.5min，然后2.5min内90％至5％b，然后5％b持续2.5min；检测：210nm)
[0239]
·
t
r cmet肽：21.0min；tr产物＝19.15分钟
[0240]
(洗脱剂a：h2o中0.1％tfa，洗脱剂b：乙腈中0.09％tfa；柱：agilent zorbax eclipse plus 95a c18,2.1
×
150mm,3.5um p/n 959763-902；梯度：5％b持续2.5min，然后17min内5％至90％b，然后90％b持续2.5min，然后2.5min内90％至5％b，然后5％b持续2.5min；检测：210nm)
[0241]
·
tr产物＝12.6分钟
[0242]
maldi/tof结果
[0243]
·
肽(重新分析)：2,786.98(m 4h)
[0244]
·
产物：3,141(计算的产物质量＝3,140.43)
[0245]
化合物2的制备
[0246]
化合物2根据图2中的反应方案并根据以下描述制备。
[0247]
将从chematec获得的gmp级c-met肽(30.0mg，9.97μmol)和p-ncs-bz-thp(14.37mg，1.5当量)溶解在10ml圆底烧瓶中的无水dmf(1ml)中。加入无水dipea(26.0μl，15.0当量)，在其上形成沉淀。搅拌部分溶解的悬浮液。hplc分析显示，2小时后肽几乎完全转化，并且4小时后完全转化，此时溶液浑浊，有一些沉淀。向反应混合物加入冰冷的mtbe(15ml)，并且离心沉淀(2min，3260rpm，5℃)。用冷mtbe(6ml)重复洗涤，并且离心沉淀(2min，3260rpm，5℃)。将所得的白色固体在氩气流下干燥，然后真空干燥(31.95mg)。将粗产物溶解于400μl水和400μl acn中，并且通过半制备型hplc(h2o中tfa 0.1％、acn，0.75％/分钟，20ml/min，柱zorbax c18 21.2
×
250mm，1次注入，tr＝34.3min，追踪文件521)纯化。以良好的产率和纯度(89％uv 254nm)获得化合物。
[0248]
hplc、esi /ms和maldi/tof证实已经获得化合物2。
[0249]
hplc结果
[0250]
(洗脱剂a：h2o中0.1％tfa，洗脱剂b：乙腈中0.09％tfa；柱：agilent zorbax eclipse plus 95a c18,2.1
×
150mm,3.5um p/n 959763-902；梯度：5％b持续2.5min，然后85min内5％至90％b，然后90％b持续2.5min，然后2.5min内90％至5％b，然后5％b持续2.5min；检测：210nm)
[0251]
·
tr产物＝13.7分钟
[0252]
esi /ms结果
[0253]
·
产物：1,872.8.3(m 2h)
2
；1,248.5(m 3h)
3
[0254]
maldi/tof结果
[0255]
·
起始肽：2,786.98(m 4h)

[0256]
·
产物：3,738(计算的产物质量＝3,741.43)
[0257]
化合物3的制备
[0258]
dota-nhs作为用于胺标记的活化的物质在商业上可得。它可用于
68
ga和
177
lu螯合。根据图3中的反应方案，将dota-nhs与cmet结合肽缀合以提供化合物3。进一步的细节在以下提供。
[0259]
将从bachem获得的gmp级cmet结合肽(10mg，3.17μmol)溶解在1.5mleppendorf管中的无水dmf(100μl)中并且加入从sigma aldrich获得的dipea(8.26μl，15.0当量)(99.5％生物技术级)。将从chematec获得的dota-nhs(4.10mg，1.7当量)溶解在无水dmf(50μl)中并且加入到胺溶液中。用氩气冲洗反应混合物，并且在氩气正压下在20℃反应约24小时。
[0260]
1小时后取样并且用hplc分析。约24小时后取另一份样品，并且通过esi /ms和maldi/tof分析以证实完全反应。
[0261]
hplc、esi /ms和maldi/tof都证实了cmet结合肽完全转化为化合物3。
[0262]
hplc结果(洗脱剂a：h2o中0.1％tfa，洗脱剂b：乙腈中0.09％tfa；柱：agilent zorbax eclipse plus 95a c18,2.1
×
150mm,3.5um p/n959763-902；梯度：5％b持续2.5min，然后85min内5％至90％b，然后90％b持续2.5min，然后2.5min内90％至5％b，然后5％b持续2.5min；检测：210nm)
[0263]
·
t0＝t
r cmet肽：29.2分钟
[0264]
·
t
1小时
＝t
r cmet肽：无峰；tr产物：28.9分钟
[0265]
esi /ms结果
[0266]
·
反应混合物经过约24小时
–
正电离：1,585.3(m 2h)
2
；1,056.9(m 3h)
3
[0267]
maldi/tof结果
[0268]
·
肽(重新分析)：2,785.05
[0269]
·
反应混合物经过约24小时：3,170(计算的产物质量＝3,169.44)
[0270]
化合物4的制备
[0271]
dotaga酸酐作为用于胺标记的活化的物质在商业上可得。它可用于
68
ga和
177
lu螯合。根据图4中的反应方案，将dotaga酸酐与cmet结合肽缀合以提供化合物4。进一步的细节在以下提供。
[0272]
将从bachem获得的gmp级cmet结合肽(25mg，7.92μmol)溶解在10ml圆底烧瓶中的无水dmf(300μl)中，该烧瓶预先通过置于180℃的烘箱中而不含水分。将从sigma aldrich获得的dipea(21μl，15.0当量)(99.5％生物技术级)加入到圆底烧瓶中并且用氩气冲洗。将从chematec获得的dotaga酸酐(7.26mg，2.0当量)溶解在eppendorf管中的无水dmf(300μl)中，并且加入到胺溶液中。将反应混合物超声以溶解，然后用氩气冲洗，并且在氩气正压下在约90℃反应约4小时。
[0273]
在30分钟、1小时、1小时30分钟、2小时和4小时后取样，并且通过hplc分析。用maldi/tof分析每个所取的样品，并且用esi /ms分析4小时后所取的样品，以证实完全反应。
[0274]
hplc、esi /ms和maldi/tof都证实了cmet结合肽完全转化为化合物4。
[0275]
hplc结果(洗脱剂a：h2o中0.1％tfa，洗脱剂b：乙腈中0.09％tfa；柱：agilent zorbax eclipse plus 95a c18,2.1
×
150mm,3.5um p/n959763-902；梯度：5％b持续2.5min，然后85min内5％至90％b，然后90％b持续2.5min，然后2.5min内90％至5％b，然后5％b持续2.5min；检测：210nm)
[0276]
·
t
30分钟
＝trcmet肽：29.214分钟；tr产物：28.854分钟
[0277]
·
t
1小时
＝trcmet肽：29.105分钟；tr产物：28.724分钟
[0278]
·
t
1小时30分钟
＝trcmet肽：29.112分钟；tr产物：28.745分钟
[0279]
·
t
2小时
＝trcmet肽：29.607分钟；tr产物：28.796分钟
[0280]
·
t
4小时
＝trcmet肽：29.560分钟；tr产物：28.747分钟
[0281]
esi /ms结果
[0282]
·
反应混合物经过约4小时
–
正电离：1,621.4(m 2h)
2
，1,632.3(m na h)
2
，1,081.0(m 3h)
3
[0283]
maldi/tof结果
[0284]
·
反应混合物经过约4小时：3,244.3(m h)

；3266(m na)

(计算的产物质量＝3,241.50)
[0285]
对化合物3和化合物4进行了以下实验：
[0286]
·
残留溶剂分析(实验1)；
[0287]
·
平衡离子化学计量的确定(实验2)；
[0288]
·
通过荧光偏振的竞争结合测定(实验3)；
[0289]
·
用
177
lu放射标记化合物3和化合物4(实验4)；和
[0290]
·
用
68
ga放射标记化合物3和化合物4(实验5)。
[0291]
实验1：化合物3和4的残留溶剂分析
[0292]
测试化合物3和4的下列残留溶剂：二甲基甲酰胺(dmf)；乙腈(mecn)；二异丙基乙胺(dipea)；叔丁基甲基醚(tbme)；二氯甲烷(dcm)；和三氟乙酸(tfa)。
[0293]
(a)程序
[0294]
通过顶空气相色谱(gc)如下进行dmf、mecn、dipea、tbme和dcm分析。
[0295]
化合物3和4的样品通过将每种化合物精确称量出约10mg到单独的hplc顶空瓶中来制备，一式两份。将1ml的二甲胺(dma)加入到每个瓶并用卷边盖将瓶密封。
[0296]
对照标准品分析制备的样品，标准品包括所需的感兴趣的溶剂。
[0297]
标准品中的溶剂以表1中列出的工作标准浓度制备。
[0298][0299]
注1：ich限值＝international council for harmonisation of technical requirements for pharmaceuticals for human use(人用药品技术要求国际协调理事会)限值
[0300]
注2：密度值取自sigma-aldrich，全部为在25℃的密度值。
[0301]
n/a＝不适用
[0302]
表1：工作标准浓度
[0303]
为了分析，将1ml标准品准确移液至20ml顶空瓶中并且牢固地加盖。为每个所需的标准品的注入准备一个瓶。
[0304]
在表2中列出的条件下，使用tri-plus 300顶空自动进样器在thermo trace 1300gc上通过gc分析样品和标准品。
[0305]
[0306][0307]
表2：gc和顶空参数
[0308]
tfa分析通过hplc如下进行。
[0309]
通过将335μl tfa移液至100ml 0.008n硫酸中制备tfa标准储备溶液，得到5mg/ml储备液。然后用0.008n硫酸稀释储备溶液以得到0.1mg/ml、0.05mg/ml、0.025mg/ml、0.010mg/ml和0.005mg/ml的标准品。
[0310]
在表3中列出的条件下通过hplc分析标准品。这产生了定量化合物3和4中tfa量的标准曲线。标准曲线覆盖了500ppm至10,000ppm的范围。
[0311]
化合物3和4的样品通过将每种化合物精确称量出20mg到单独的2ml容量瓶中制备(仅是由于原料缺乏可得性)。然后用0.008n硫酸将烧瓶定容以提供10mg/ml溶液。
[0312]
两个样品在10mg/ml时形成凝胶，使得它们不适于注入到hplc柱上。将样品进一步稀释至2mg/ml。这些样品仍然粘稠，但适于hplc注入。增加注入体积以补偿样品中的稀释系数。
[0313]
表3中列出了用于tfa分析的hplc条件。
[0314]
柱bio-rad aminex hpx-87h 300
×
7.8mm柱温35℃流动相0.008n硫酸
流速0.6ml/min运行时间10分钟注入体积10μl(标准品),50μl(样品)检测210nm
[0315]
表3：用于tfa分析的hplc条件
[0316]
(b)结果
[0317]
通过气相色谱(gc)确定化合物3和4残留溶剂获得的结果如表4中所示。
[0318][0319]
注1：ich限值＝人用药品技术要求国际协调理事会限值
[0320]
注2：通过gc，dmf在空白注入中作为残留检出，并且被报告为最大潜在结果，其仍低于ich限值。
[0321]
注3：dipea没有被ich q3c(r5)残留溶剂指导原则(ich guideline q3c(r5)for residual solvents)分类，并且因此没有指定的限值。
[0322]
nd＝未检测到
[0323]
表4：残留溶剂分析结果概述
[0324]
由于tfa从盐的解离，所提出的方法不能确定tfa残留限值。tfa解离导致样品的tfa响应远远超过《5000ppm的预期水平。
[0325]
因此，hplc分析被认为不适于确定样品中的残留tfa。
[0326]
(c)结论
[0327]
在化合物3和化合物4中检测到的残留溶剂均在各自的人用药品技术要求国际协调理事会(ich)限值内，其意味着化合物3和化合物4都适于人类施用。
[0328]
实验2：化合物3和4的平衡离子化学计量确定
[0329]
通过hplc分析确定化合物3和4的三氟乙酸(tfa)化学计量。
[0330]
(a)程序
[0331]
化合物3和4都被认为是五tfa盐。因此，化合物中tfa的理论百分比按以下计算：
[0332]
·
tfa分子量＝114.02g/mol
[0333]
·
五tfa盐的分子量＝570.1g/mol
[0334]
·
化合物3(五盐)的分子量＝3739.6g/mol
[0335]
·
化合物4(五盐)的分子量＝3811.6g/mol
[0336]
因此，每种化合物中tfa的理论百分比是：
[0337]
·
化合物3＝(570.1/3739.6)
×
100＝15.24％tfa
[0338]
·
化合物4＝(570.1/3811.6)
×
100＝14.96％tfa
[0339]
为了确定化学计量，样品以1mg/ml制备并且对照0.15mg/ml的tfa标准品分析，0.15mg/ml是预期的平衡离子含量(15％)。
[0340]
通过以下制备约0.15mg/ml的tfa标准品，一式两份：将100μltfa稀释到10ml0.008n硫酸来得到15mg/ml的储备液，然后将其稀释(1ml至100ml，在0.008n硫酸中)以得到0.15mg/ml的标准溶液。
[0341]
通过以下制备约1mg/ml的化合物3和4的样品：将5mg每种化合物称量到单独的5ml容量瓶中。用0.008n硫酸将烧瓶定容。
[0342]
使用表5中列出的条件，通过hplc分析样品和标准品。
[0343]
柱bio-rad aminex hpx-87h 300
×
7.8mm柱温35℃流动相0.008n硫酸流速0.6ml/min运行时间10分钟注入体积10μl(标准品),50μl(样品)检测210nm
[0344]
表5：用于tfa分析的hplc条件
[0345]
样品相对于标准品的回收率通过考虑所用的重量和稀释度来计算。样品的回收将确定化学计量，并且结果将遵循以下模式：
[0346]
·
五盐＝100％回收率
[0347]
·
四盐＝80％回收率
[0348]
·
三盐＝60％回收率
[0349]
·
双盐＝40％回收率
[0350]
·
单盐＝20％回收率
[0351]
(b)结果
[0352]
标准品回收率为107.0％。这归因于所遵循的标准品准备程序。具体地，由于其挥发性，纯tfa很难处理。这造成处理和测量出纯挥发性物质时的问题。
[0353]
化合物3得到91.86％的回收率。
[0354]
化合物4得到99.06％的回收率。
[0355]
回收率在平衡离子确定所置于的正常置信限值内。
[0356]
测试证实用于化合物3和化合物4的五化学计量在10％置信限内。
[0357]
实验3：通过荧光偏振(fp)对化合物3和4的竞争结合测定
[0358]
对于cmet结合环肽(未标记)、cmet-dota(化合物3)和cmet-dotaga(化合物4)与cmet受体的结合，半最大抑制浓度(ic
50
)值和解离常数(kd)值通过竞争荧光偏振(fp)测定确定。
[0359]
荧光偏振方法的原理可以简单描述如下：
[0360]
单色光通过水平偏振滤光器并且激发样品中的荧光分子。只有那些在垂直偏振面上正确取向的分子才能吸收光，被激发，并且随后发射光。发射的光在水平面和垂直面二者中测量。各向异性值(a)是光强度之间的比，遵循以下等式：
[0361]
a＝(水平偏振器的强度-垂直偏振器的强度)/(水平偏振器的强度 2*垂直偏振器的强度)。
[0362]
荧光各向异性测量在96孔平底板中使用molecular devices m5多模式板读取器进行。
[0363]
所用的测定缓冲液是磷酸盐缓冲盐水(pbs)，ph 7.4，含0.01％tween20。
[0364]
储存液制备
[0365]
将荧光探针(带有荧光标记(cy5)的cmet结合环肽)溶解在测定缓冲液中以得到1mm的储备液。还制备了1μm的储备母液和50nm的工作储备液。
[0366]
将cmet受体(100μg)溶解在测定缓冲液(1ml)中以得到775nm的储备母液。还制备了500nm和167nm的工作储备液。
[0367]
将肽(cmet结合环肽(未标记)、化合物3和化合物4)溶解在测定缓冲液中以得到0.5mm或1mm的储备母液。还制备了67μm的工作储备液。
[0368]
肽竞争测定
[0369]
向板加入2倍稀释筛选的肽(cmet结合环肽(未标记)、化合物3和化合物4；30μl/孔的67μm储备液)得到20μm至20nm的最终浓度。还加入cmet受体(30μl/孔的167μm储备液)得到50nm的最终浓度。还加入荧光探针(40μl/孔的50nm储备液)得到20nm的最终浓度(100μl总体积)。每个孔一式三份地重复。100μl测定缓冲液(一式三份)用作非荧光空白。扫描前将板在30℃孵育10分钟。在室温(25℃)，以ex/em/截止值滤光片(cof)640/675/665nm一式三份地扫描该板。
[0370]
对cmet肽(未标记)、化合物3和化合物4中的每一种相对于竞争肽浓度绘制各向异性。
[0371]
ic
50
值通过使用kaleidagraph v4.03用以下等式进行数据拟合来确定：
[0372][0373]
其中r是观察到的各向异性，r0是游离探针的各向异性，r1是完全结合的探针的各向异性，以及[肽]是竞争肽浓度。
[0374]
kd值通过使用kaleidagraph v4.03用以下等式进行数据拟合来确定：
[0375][0376]
其中r是观察到的各向异性，r0是游离探针的各向异性，r1是完全结合的探针的各向异性，[肽]是竞争肽浓度，k
dp
是cmet受体和荧光探针的解离常数，以及kd是竞争肽与cmet受体结合的解离常数。
[0377]
平均ic
50
值和kd值在下表6中提供。
[0378]
肽kd(nm)ic
50
(nm)cmet肽(未标记)6.9
±
0.8320
±
37
化合物33.0
±
0.5139
±
21化合物42.6
±
0.4121
±
18
[0379]
表6：cmet结合环肽(未标记)、化合物3和化合物4的平均ic
50
值和kd值
[0380]
结果显示，cmet结合环肽(未标记)、化合物3和化合物4对cmet受体具有相当的亲和力，并且ic
50
值和kd值的任何变化都在实验误差内。
[0381]
实验4：用
177
lu放射标记化合物3和化合物4
[0382]
进行研究以确定用镥-177(
177
lu)放射标记化合物3和4的可行性。
[0383]
初步研究
[0384]
测试肽(化合物3和4)与
177
lu的各种比，以通过hplc和快速薄层色谱(itlc)评估相应的放射标记产率。
[0385]
使用ph 5.6的0.4m乙酸铵(用于测试1至8的缓冲液1)或ph 4的0.4m乙酸铵和0.325m龙胆酸(用于测试9至12的缓冲液2)进行放射标记程序。具有》500mbq/nmol的比活度的[
177
lu]lucl3用于放射标记研究。将指定的体积(表8中的v
177lu
)的[
177
lu]lucl3与适当的缓冲液和1nmol的肽(化合物3或化合物4)混合。将反应混合物在热混合器系统中在80℃孵育持续10、20或30分钟的孵育时间。以化合物3和4对
177
lu的各种比例的放射标记测试的概述在表7中列出。每个测试的具体条件在表8中列出。在孵育结束时，将1μl混合物注入hplc系统并且使用表9中列出的条件进行分析。
[0386][0387]
表7：以化合物3和4与
177
lu的各种比进行的放射标记测试
[0388][0389][0390]
v＝体积
[0391]
m＝分钟
[0392]
表8：在表7中列出的每个测试的实验条件
[0393][0394]
表9：hplc条件
[0395]
使用hplc和itlc如下确定放射标记产率和放射性化学纯度(rcp)。放射标记产率定义了纯化前
177
lu的掺入百分比(即放射标记的功效)。
[0396]
通过itlc的放射标记产率
[0397]
通过itlc的放射标记产率用以下等式确定：
[0398][0399]
其中rf是保留系数，其被定义为样品中某一组分的移动距离与溶剂前沿从样品最初应用点的移动距离之比。当组分保持在应用点或原点时，rf为0。当组分随溶剂前沿迁移时，rf为1。
[0400]
通过hplc的放射标记产率和放射化学纯度
[0401]
通过hplc的放射标记产率使用以下等式确定：
[0402][0403]
其中面积峰#2是游离
177
lu，面积峰#3是副产物(或者当没有副产物峰时，是用
177
lu标记的化合物3或4)，并且面积峰#4是用
177
lu标记的化合物3或4(当有副产物峰时)。
[0404]
放射化学纯度使用以下等式确定：
[0405][0406]
其中面积峰#2是游离
177
lu并且面积峰#3是用
177
lu标记的化合物3或4。
[0407]
放射标记测试的结果在表10中提供。
[0408][0409]
表10：测试1至12的放射标记产率、放射化学纯度和比活度结果
[0410]
化合物3和4都在80℃在10分钟内用30mbq/nmol和60mbq/nmol
177
lu成功标记。
[0411]
发现将孵育时间增加到20或30分钟会导致较差的放射化学纯度。缓冲液1和缓冲液2都能够完成化合物3和4的完全放射标记。
[0412]
最初的结果显示在与
177
lu一起孵育10分钟后，放射性核素的掺入》99％(放射标记产率)并且化合物3和4的放射化学纯度》99％。
[0413]
优化研究
[0414]
进行了进一步测试以将比活度提高到至少120mbq/nmol。
[0415]
使用ph 4的0.4m乙酸铵和0.325m龙胆酸(缓冲液2)进行放射标记程序。比活度》500mbq/nmol的
177
lucl3用于放射标记研究。将指定的体积(表12中的v
177lu
)的
177
lucl3与缓冲液2和1nmol的肽(化合物3或化合物4)混合。将反应混合物在热混合器系统中在80℃孵育持续10分钟的孵育时间。以化合物3和4与
177
lu的各种比进行的进一步放射标记测试的概述在表11中列出。每个测试的具体条件在表12中列出。在孵育结束时，将1μl混合物注入hplc系统并且使用表9中列出的条件进行分析。
[0416][0417]
表11：以化合物3和4与
177
lu的各种比进行的进一步放射标记测试
[0418][0419]
v＝体积
[0420]
m＝分钟
[0421]
表12：在表11中列出的每个测试的实验条件
[0422]
放射标记的化合物3和4(化合物3-177
lu放射缀合物和化合物4-177
lu放射缀合物)的稳定性也在最初放射标记后24小时通过hplc分析。
[0423]
使用hplc和itlc确定如以上定义的放射标记产率和放射化学纯度(rcp)。
[0424]
进一步放射标记测试的结果在表13中提供。
[0425][0426]
表13：测试13至24的放射性标记产率、放射化学纯度和比活度结果
[0427]
使用ph 4的0.4m乙酸铵和0.325m龙胆酸作为缓冲液，在80℃持续10分钟用120mbq/nmol和150mbq/nmol 177
lu成功标记化合物3和4。
[0428]
放射化学产率和放射化学纯度都》95％。
[0429]
在溶液中24小时后，hplc结果显示放射化学纯度仍然》90％。24小时后观察到的杂质可能是由于辐射分解。
[0430]
临床研究
[0431]
还在临床环境中进行了放射标记实验。在本实验中，
177
lu的起始活度为7.6gbq。
[0432]
放射标记实验如下进行。将化合物3(32nmol)溶解在超纯水(2μg/μl)和1.5ml的ph 4.8的0.4m乙酸钠缓冲液(8mg/ml)中。加入龙胆酸并且将混合物转移到
177
lu v瓶(v-vial)。将该瓶在95℃加热25分钟。在用注射用水溶解混合物并随即无菌过滤后，获得6.9gbq的与
177
lu缀合的化合物3。获得了》200mbq/nmol(n＝3)的比活度。放射化学产率和放射化学纯度都》99％。
[0433]
还发现注射溶液的稳定性非常好，在室温24小时后观察到》98％的放射化学纯度和《2％的两种未知杂质。
[0434]
结论
[0435]
所获得的放射化学纯度和比活度意味着，可以将相关量的放射性带到肿瘤(即cmet过表达的部位)用于使用这种方法进行靶向放射治疗。相关量的放射性被描述为2gbq至8gbq，通常地7.4gbq。此外，使用以上描述的程序意味着不需要大量的“冷”肽(即未标记的肽)，大量的“冷”肽将使cmet受体饱和并且防止任何放射性被带到肿瘤部位。
[0436]
实验5：用
68
ga放射标记化合物3和化合物4
[0437]
初步研究
[0438]
进行初步研究以评估用
68
ga放射标记化合物3和4的可行性。通过hplc确定放射标记产率和放射化学纯度(rcp)。
[0439]
使用ph 4.5的1m乙酸钠缓冲液进行放射标记程序。用阳离子预纯化洗脱的[
68
ga]gacl3用于放射标记研究。将指定的体积(表15中的v
68ga
)的[
68
ga]gacl3与缓冲液、水、乙醇和4nmol至16nmol的肽(化合物3或化合物4)混合。将反应混合物在热混合器系统中在95℃孵
育5至10分钟的孵育时间。以化合物3和4与
68
ga的各种比进行的放射标记测试的概述在表14中列出。每个测试的具体条件在表15中列出。在孵育结束时，将2.5μl混合物注入hplc系统并且使用表16中列出的条件进行分析。
[0440][0441]
表14：以化合物3和4与
68
ga的各种比进行的放射标记测试
[0442][0443]
v＝体积
[0444]
m＝分钟
[0445]
表15：表14列出的每个测试的实验条件
[0446][0447]
表16：hplc条件
[0448]
使用hplc确定放射标记产率和放射化学纯度(rcp)。放射标记产率定义了纯化前
68
ga的掺入百分比(即放射标记的功效)。
[0449]
通过hplc的放射标记产率和放射化学纯度
[0450]
通过hplc的放射标记产率使用以下等式确定：
[0451][0452]
其中面积峰#2是游离
68
ga，面积峰#3是副产物(或者当没有副产物峰时，是用
68
lu标记的化合物3或4)，并且面积峰#4是用
68
ga标记的化合物3或4(当有副产物峰时)。
[0453]
放射化学纯度使用以下等式确定：
[0454][0455]
其中面积峰#2是游离
68
ga并且面积峰#3是用
68
ga标记的化合物3或4。
[0456]
放射标记测试的结果在表17中提供。
[0457][0458]
表17：测试1至3的放射标记产率、放射化学纯度和比活度结果
[0459]
使用以上列出的条件，化合物3和4都用
68
ga成功地标记。然而，纯化后，比活度仅达到12mbq/nmol。
[0460]
在初步研究中，在与
68
ga一起孵育后，化合物3和4都获得了约60％的放射化学纯度。未观察到辐射分解。
[0461]
延长标记时间重复初步研究
[0462]
测试肽(化合物3和4)与
68
ga的各种比，以通过hplc和快速薄层色谱(itlc)评估相应的放射标记产率。
[0463]
使用ph 4.5的1m乙酸钠缓冲液进行放射性标记程序。
68
gacl3：分级洗脱用于放射标记研究。在微管中，将表19中的指定体积v
68ga
(在微管中测量的活度约7.3mbq)的
68
gacl3与(0.11
×v68ga
)的缓冲液和0.24nmol至1.36nmol的肽(化合物3或化合物4)混合。将反应混合物在热混合器系统中在95℃孵育持续10分钟的孵育时间。以化合物3和4对
68
ga的各种比例的放射标记测试的概述在表18中列出。每个测试的具体条件在表19中列出。
[0464]
在孵育结束时，离心微管，并且将2.5μl混合物注入hplc系统并且使用表16中列出的条件进行分析。
[0465]
对于itlc，遵循以下程序：
[0466]
·
在itlc-sg纸上点样1μl混合物，并且用柠檬酸盐缓冲液(0.1m，ph 5)作为流动相洗脱(itlc 1)；以及
[0467]
·
在itlc-sg纸上点样1μl混合物，并用乙酸铵(5m)/甲醇1/1溶液洗脱(itlc 2)。
[0468][0469]
表18：以化合物3和4与
68
ga的各种比进行的放射标记测试
[0470][0471]
v＝体积
[0472]
m＝分钟
[0473]
表19：在表18中列出的每个测试的实验条件
[0474]
如以上描述的，使用hplc确定放射标记产率和放射化学纯度(rcp)。通过itlc的放射标记产率如下确定。
[0475]
通过itlc的放射性标记产率
[0476]
通过itlc的放射性标记产率使用以下等式确定：
[0477][0478]
其中rf是保留系数，其被定义为样品中某一组分的移动距离与溶剂前沿从样品最初应用点的移动距离之比。当组分保持在应用点或原点时，rf为0。当组分随溶剂前沿迁移时，rf为1。
[0479]
放射标记测试的结果在表20中提供。
[0480][0481]
表20：测试4至11的放射标记产率、放射化学纯度和比活度结果
[0482]
使用以上列出的条件，化合物3和4都用
68
ga成功地标记。然而，放射标记的化合物3和4(化合物3-68
ga放射缀合物和化合物4-68
ga放射缀合物)不够纯，不适于静脉内施用到人
体。发现可以加入乙醇来防止辐射分解。
[0483]
用约83％的放射化学纯度，获得26mbq/nmol的比活度(测试8)。
[0484]
优化研究
[0485]
基于初步研究的结果，进行了进一步测试以优化
68
ga向化合物3和4中的掺入。化合物3用于优化研究。
[0486]
使用ph 4.5的1m乙酸钠缓冲液(缓冲液1)或ph 4.5的0.5m乙酸钠缓冲液(缓冲液2)进行放射标记程序。
68
gacl3：分级洗脱用于放射标记研究。
[0487]
在95℃加热：
[0488]
在微管中，将表22中的指定体积v
68ga
(在微管中测量的活度约7.3mbq)的
68
gacl3与(0.11
×v68ga
)的适当的缓冲液、0.24nmol的肽(化合物3或化合物4)和11.3μl的乙醇混合。将反应混合物在热混合器系统中在95℃孵育持续10或15分钟的孵育时间。
[0489]
在110℃加热：
[0490]
在密封玻璃v瓶中，将表22中的指定体积v
68ga
(在微管中测量的活度约29.2mbq)的
68
gacl3与(0.11
×v68ga
)的适当的缓冲液、0.96nmol的肽(化合物3或化合物4)和45.4μl的乙醇混合。将反应混合物在加热模块中在110℃孵育持续10分钟的孵育时间。
[0491]
在孵育结束时，离心微管，并且将2.5至5μl混合物注入hplc系统并且使用表16中列出的条件进行分析。
[0492]
以化合物3和4与
68
ga的各种比进行的放射标记测试的概述在表21中列出。每个测试的具体条件在表22中列出。
[0493]
对于itlc，遵循以下程序：
[0494]
·
在itlc-sg纸上点样1μl混合物，并且用柠檬酸盐缓冲液
[0495]
(0.1m，ph 5)作为流动相洗脱(itlc 1)；以及
[0496]
·
在itlc-sg纸上点样1μl混合物，并用乙酸铵(5m)/甲醇1/1溶液洗脱(itlc 2)。
[0497][0498]
表21：以化合物3和4对
68
ga的各种比例的放射标记测试
[0499][0500]
v＝体积
[0501]
m＝分钟
[0502]
etoh＝乙醇
[0503]
表22：在表21中列出的每个测试的实验条件
[0504]
使用hplc和itlc确定如以上定义的放射标记产率和放射化学纯度(rcp)。
[0505]
优化测试的结果在表23中提供。
[0506][0507]
表23：测试12至23的放射标记产率、放射化学纯度和比活度结果
[0508]
优化研究得出以下结论：
[0509]
·
将孵育温度增加到110℃，导致放射标记产率降低(参见测试12至15(95℃)相比于测试16至17(110℃))；
[0510]
·
延长培养时间并没有显著增加放射标记的产率(参见测试12和14(10分钟)相比于测试13和15(15分钟))；
[0511]
·
乙醇的添加并没有显著防止辐射分解(结果显示，有或没有添加乙醇，辐射分解都没有高于5％)；
[0512]
·
乙醇的添加表现为增加了
68
ga胶体的形成；
[0513]
·
要求低于3.8的ph以确保达到可接受的比活度；以及
[0514]
·
为了达到合适的放射化学纯度，需要在hplc注入之前进行纯化步骤(优选地使用sep-pak c18筒)。
[0515]
在优化研究期间，获得高达25mbq/nmol的比活度(测试18)，并且放射化学纯度为约83％。
[0516]
结论
[0517]
所获得的放射化学纯度和比活度意味着，可以将相关量的放射性带到肿瘤(即cmet过表达的部位)用于使用这种方法进行成像。描述了为约12.5至75mbq的相关量的放射性用于处于开发阶段的实验性剂。
[0518]
使用化合物3进行以下进一步的实验：
[0519]
·
体内剂量学研究(实验6)。
[0520]
实验6：化合物3的体内剂量学研究
[0521]
使用化合物3进行剂量学研究以调查本文所述化合物用于成像和放射治疗的适用性。
[0522]
(a)患者背景
[0523]
参与研究的两名人类患者的详细情况在表24中提供。
[0524][0525]
表24：用于体内研究的患者详细信息
[0526]
(b)程序
[0527]
用
68
ga放射标记化合物3以提供成像剂(
68
ga-化合物3)。使用的放射标记程序如下。将[
68
ga]gacl3与缓冲液(ph 4.5的1m乙酸钠缓冲液)和化合物3混合。将反应混合物在95℃孵育持续10分钟的孵育时间。获得25mbq/nmol的比活度和未经纯化约98％的放射化学纯度。
[0528]
用
177
lu放射标记化合物3以提供治疗剂(
177
lu-化合物3)。使用的放射标记程序如下。将化合物3溶解在超纯水(2μg/μl)和1.5ml的ph 4.8的0.4m乙酸钠缓冲液(8mg/ml)中。加入龙胆酸并且将混合物转移到
177
luv瓶。将该瓶在95℃加热25分钟。在用注射用水溶解混合物并随即无菌过滤后，获得6.9gbq的
177
lu-化合物3。获得了》200mbq/nmol(n＝3)的比活度。
[0529]
在将治疗剂(
177
lu-化合物3)注射到患者1内之前七天，对患者1施用成像剂(
68
ga-化合物3)。对于患者1，
68
ga具有240mbq的活度并且
177
lu具有835mbq的活度。注射成像剂后1小时和3小时进行治疗前正电子发射断层扫描/计算机断层扫描(pet/ct)成像。在施用治疗剂的前一天，对患者1施用
18
f-氟脱氧葡萄糖(
18
f-fdg)。
18
f具有227mbq的活度。注射
18
f-fdg后1小时进行pet/ct成像。然后对患者1施用治疗剂。然后在注射治疗剂后1.5小时、17小时、
41小时、65小时和141小时进行治疗前单光子发射计算机断层扫描(spect)成像。
[0530]
在将治疗剂(
177
lu-化合物3)注射到患者2内之前四天，对患者2施用
18
f-fdg。对于患者2，
18
f具有208mbq的活度并且
177
lu具有959mbq的活度。注射
18
f-fdg后1小时进行pet/ct成像。然后对患者2施用治疗剂。然后在注射治疗剂后4.5小时、20小时、45小时、67小时和141小时进行治疗前spect成像。
[0531]
为了比较，对患有前列腺癌的第三名患者施用前列腺特异性膜抗原(psma)，其被认为在目前是核医学成像和治疗的最成功的靶之一。使用的程序如下。在将治疗剂(用
177
lu放射标记的psma)注射到患者内之前十九天，对患者施用成像剂(用
18
f标记的psma)。
18
f具有250mbq的活度并且
177
lu具有9185mbq的活度。
177
lu-psma治疗剂的活度是剂量学研究中使用的
177
lu-化合物3治疗剂的活度约10倍高。这是因为对psma剂的剂量学研究已经完成并且较高的剂量被认为对体内使用是安全的。注射
18
f-psma后1小时进行pet/ct成像。然后对患者施用
177
lu-psma治疗剂。然后在注射治疗剂后19小时、43小时和65小时进行治疗前spect成像。
[0532]
(c)成像
[0533]
pet/ct成像使用siemens biographmct flow pet/ct进行。spect成像使用siemens intevo spect/ct进行。
[0534]
患者1的治疗前pet/ct成像结果如图5中所示。图像显示注射后(p.i.)1小时和3小时二者，在肿瘤中
68
ga-化合物3(在图像上称为
68
ga-cmet)的累积。注射后1小时，也显示在肿瘤中
18
f-fdg累积。
[0535]
患者1的治疗前spect成像结果在图6中显示。该图像显示了注射后(p.i.)高达141小时在肿瘤中
177
lu-化合物3的累积和保留。
[0536]
患者2的治疗前pet/ct成像结果在图7中显示。该图像显示了注射后1小时在肿瘤中
18
f-fdg的累积。
[0537]
患者2的治疗前spect成像结果在图8中显示。该图像显示了注射后(p.i.)高达141小时在肿瘤中
177
lu-化合物3的累积和保留。
[0538]
(d)结果
[0539]
患者1中治疗剂(
177
lu-化合物3)的剂量学研究结果在表25中提供。患者2中治疗剂(
177
lu-化合物3)的剂量学研究结果在表26中提供。为了比较，
177
lu-psma治疗剂的结果在表27中提供。
[0540][0541]
[0542]
vol＝体积
[0543]
h＝小时
[0544]
表25：患者1中
177
lu-化合物3的剂量学结果(
177
lu活度为835mbq)
[0545][0546]
voi＝感兴趣的体积
[0547]
vol＝体积
[0548]
h＝小时
[0549]
表26：患者2中
177
lu-化合物3的剂量学结果(
177
lu活度为959mbq)
[0550][0551]
voi＝感兴趣的体积
[0552]
h＝小时
[0553]
表27：
177
lu-psma治疗剂的剂量学结果(
177
lu活度为9185mbq)
[0554]
结果显示治疗剂在关键组织和器官中的累积剂量。
[0555]
尽管使用
177
lu-化合物3在肿瘤中获得的平均剂量低于使用
177
lu-psma获得的平均剂量，但这是可以预期的，因为对使用化合物3的患者提供的
177
lu的活度较低。
[0556]
为了评估结果，对经批准的放射治疗剂的剂量学值进行了文献检索。
177
lu-dotatate是经批准的用于全身放射治疗的化合物。brogsitter等人(nuklearmedizin,
2017,第56(1)卷,第1-8页)报告，
177
lu-dotatate递送5.53gy/gbq(中位数2.70gy/gbq；范围0.44-15.3gy/gbq)的肿瘤剂量。所报告的器官剂量如下：肾(2.03
±
0.96gy/gbq)、肝(1.67
±
1.73gy/gbq)、脾(4.50
±
3.69gy/gbq)和全身(0.15
±
0.08gy/gbq)。所报告的肿瘤与肾的剂量比为2.4
±
5.6。nicolas等人(j nucl med,2017,第58卷,第1435页,doi:10.2967/jnumed.117.191684)报告，
177
lu-dotatate对4cm肿瘤递送0.333gy/gbq的肿瘤剂量，并且具有6.4小时(范围5.4-7.3小时)的肿瘤保留时间。
[0557]
此外，okamoto等人(j nucl med,2016,第116卷,doi:10.2967/jnumed.116.178483)报告，
177
lu-psma-i&t向肿瘤病变递送3.2
±
2.6gy/gbq(范围0.22-12gy/gbq)的每周期平均吸收剂量。
[0558]
在文献检索期间发现的通常限值是对肾23gy或对骨髓2gy。
[0559]
(e)结论
[0560]
由
177
lu-化合物3递送的肿瘤剂量在经批准的放射治疗剂
177
lu-dotatate和后期临床开发放射治疗剂
177
lu-psma的范围内。还发现肿瘤半衰期在与
177
lu-psma相似的时间范围内，并且长于
177
lu-dotatate。此外，使用
177
lu-化合物3对肾、肝和脾的器官剂量均低于
177
lu-dotatate报告的结果。
[0561]
因此，剂量学研究表明，本文描述的化合物适用于放射治疗，因为递送至肿瘤的剂量在已经批准的或处于临床开发后期的放射治疗剂所观察的范围内。
[0562]
在不偏离本发明的范围和精神的情况下，所描述的本发明的实施方案的各种修改和变化对于本领域技术人员将是明显的。尽管本发明已经结合具体实施方案进行了描述，应理解，如要求保护的本发明不应被过度限于这样的具体实施方案。事实上，对本领域技术人员明显的是，对所描述的进行本发明的模式的各种修改意图被本发明覆盖。
[0563]
缩写
[0564]
使用常规的单字母或三字母氨基酸缩写。
[0565]
aazta：1,4-双(羧甲基)-6-[双(羧甲基)]氨基-6-甲基全氢-1,4-二氮杂卓
[0566]
acm：乙酰氨基甲基
[0567]
acn(或mecn)：乙腈
[0568]
boc：叔丁氧基羰基
[0569]
bz：苯甲酰
[0570]
环拉胺(cyclam)：1,4,8,11-四氮杂环十四烷
[0571]
轮环藤宁(cyclen)：1,4,7,10-四氮杂环十二烷
[0572]
crc：结肠直肠癌
[0573]
ct：计算机断层扫描
[0574]
data：(6-戊酸)-6-(氨基)甲基-1,4-二氮杂卓三乙酸酯
[0575]
dcm：二氯甲烷
[0576]
dde：1-(4,4-二甲基-2,6-二氧代环亚己基)乙基
[0577]
dipea：n,n-二异丙基乙胺
[0578]
dma：二甲胺
[0579]
dmf：二甲基甲酰胺
[0580]
dmso：二甲基亚砜
[0581]
dota：1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸
[0582]
dotaga：2,2’,2
”‑
(10-(1,4-二羧基乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸
[0583]
esi /ms：电喷射电离质谱
[0584]
etoh：乙醇
[0585]
fdg：氟脱氧葡萄糖
[0586]
fp：荧光偏振
[0587]
fmoc：9-芴基甲氧基羰基
[0588]
gc：气相色谱
[0589]
gbq：吉贝可(gigabecquerel)
[0590]
gmp：良好生产规范
[0591]
hbed-cc：n,n
’‑
双(2-羟基-5-(亚乙基-β-羧基)苄基)乙二胺n,n
’‑
二乙酸
[0592]
hbtu：邻苯并三唑-1-基-n,n,n’,n
’‑
四甲基脲六氟磷酸盐
[0593]
hgf：肝细胞生长因子
[0594]
hplc：高效液相色谱
[0595]
hspyu：o-(n-琥珀酰亚胺基)-n,n,n’,n
’‑
四甲基脲六氟磷酸盐
[0596]
ic
50
：半最大抑制浓度
[0597]
itlc：快速薄层色谱
[0598]
kd：解离常数
[0599]
maldi/tof：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱
[0600]
mbq：兆贝可(megabecquerel)
[0601]
mecn：乙腈
[0602]
mtbe：甲基叔丁基醚
[0603]
ncs：n-氯-琥珀酰亚胺
[0604]
nhs：n-羟基-琥珀酰亚胺
[0605]
nmm：n-甲基吗啉
[0606]
nmp：1-甲基-2-吡咯烷酮
[0607]
nodaga：1,4,7-三氮杂环壬烷,1-戊二酸-4,7-乙酸
[0608]
nopo：1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二[亚甲基(羟甲基)次膦酸]-7-[亚甲基(2-羧乙基)次膦酸
[0609]
nota：1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸
[0610]
npys：3-硝基-2-吡啶氧硫基
[0611]
peg：聚乙二醇
[0612]
pet：正电子发射断层扫描
[0613]
pbf：2,2,4,6,7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基
[0614]
pbs：磷酸盐缓冲盐水
[0615]
psma：前列腺特异性膜抗原
[0616]
pybop：苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基六氟磷酸鏻
[0617]
rcp：放射化学纯度
[0618]
spect：单光子发射计算机断层扫描
[0619]
tbu：叔丁基
[0620]
tacn：1,4,7-三氮杂环壬烷
[0621]
tbme：叔丁基甲基醚
[0622]
tfa：三氟乙酸
[0623]
thp：三(羟基吡啶酮)
[0624]
tis：三异丙基硅烷
[0625]
trap：1,4,7-三氮杂环壬烷次膦酸
[0626]
trt：三苯甲基
[0627]
序列表自由文本
[0628]
seq-1
[0629]
cys
a-xaa
1-cys
c-xaa
2-gly-pro-pro-xaa
3-phe-glu-cys
d-trp-cys
b-tyr-xaa
4-xaa
5-xaa6[0630]
xaa1是asn、his或tyr；
[0631]
xaa2是gly、ser、thr或asn；
[0632]
xaa3是thr或arg；
[0633]
xaa4是ala、asp、glu、gly或ser；
[0634]
xaa5是ser或thr；和
[0635]
xaa6是asp或glu。
[0636]
17-mer cmet结合肽。
[0637]
seq-2
[0638]
ser-cys
a-xaa
1-cys
c-xaa
2-gly-pro-pro-xaa
3-phe-glu-cys
d-trp-cys
b-tyr-xaa
4-xaa
5-xaa6[0639]
xaa1是asn、his或tyr；
[0640]
xaa2是gly、ser、thr或asn；
[0641]
xaa3是thr或arg；
[0642]
xaa4是ala、asp、glu、gly或ser；
[0643]
xaa5是ser或thr；和
[0644]
xaa6是asp或glu。
[0645]
18-mer cmet结合肽。
[0646]
seq-3
[0647]
ala-gly-ser-cys
a-xaa
1-cys
c-xaa
2-gly-pro-pro-xaa
3-phe-glu-cys
d-trp-cys
b-tyr-xaa
4-xaa
5-xaa
6-gly-thr
[0648]
xaa1是asn、his或tyr；
[0649]
xaa2是gly、ser、thr或asn；
[0650]
xaa3是thr或arg；
[0651]
xaa4是ala、asp、glu、gly或ser；
[0652]
xaa5是ser或thr；和
[0653]
xaa6是asp或glu。
[0654]
22-mer cmet结合肽。
[0655]
seq-4
[0656]
gly-gly-gly-lys
[0657]
是cmet结合肽的一部分的四肽序列。
[0658]
seq-5
[0659]
gly-ser-gly-lys
[0660]
是cmet结合肽的一部分的四肽序列。
[0661]
seq-6
[0662]
gly-ser-gly-ser-lys
[0663]
是cmet结合肽的一部分的五肽序列。
[0664]
seq-7
[0665]
ala-gly-ser-cys-tyr-cys-ser-gly-pro-pro-arg-phe-glu-cys-trp-cys-tyr-glu-thr-glu-gly-thr-gly-gly-gly-lys
[0666]
26-mer cmet结合肽。