一种增强杀虫效力和抗非生物逆境能力的生防真菌孢子培养方法与流程

1.本发明属于生物技术领域，涉及一种增强杀虫效力和抗非生物逆境能力的生防真菌孢子培养方法。


背景技术：

2.人们发现有近1000种真菌能够感染并杀死昆虫，其中一些如绿僵菌和白僵菌等丝孢菌纲真菌已开发成环境友好的真菌杀虫剂，用于防治重要的农林业害虫、卫生害虫和它们所传播的疾病(zhao et al.,2016)。但是真菌杀虫剂存在杀虫速度较慢和耐受不利环境条件能力较弱等特点，这些限制了它们的更广泛的应用。前人在深入研究昆虫病原真菌致病机制和抗逆机制的基础上，利用基因工程技术提高它们的杀虫速度和抗逆能力，为增强真菌杀虫剂的效率提供了多个遗传改良菌株(zhao et al.,2016)。但是转基因菌株的安全性需要进行全面评价，同时公众接受还需要一定的时间，这些也使得效率较高的转基因菌株在近期难以得以应用。
3.通过改变培养条件可以调节真菌孢子的生理状态，进而改变野生型生防真菌菌株耐受环境不利因素的能力，进而提高真菌杀虫剂的效率。在培养绿僵菌的过程中提供一定时间白光处理，所产生的孢子萌发更快，杀虫速度也加快。在培养的过程中提供短暂的无氧处理，也可以提高绿僵菌的杀虫速度。而在培养基中添加水杨酸(salicylic acid)提高了绿僵菌孢子的热耐受能力。上述实验使用的是野生型菌株，这些性能得以改善的孢子可以直接制备真菌杀虫剂而加以应用。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是提供一种增强杀虫效力和抗非生物逆境能力的生防真菌孢子培养方法。
5.本发明的技术方案如下：
6.本发明首先提供了一种增强杀虫效力和抗非生物逆境能力的生防真菌孢子培养方法，其包括如下步骤：将生防真菌在含有5-羟色胺或5-羟色胺盐酸盐的真菌培养基中进行培养，得到孢子。
7.优选的，所述的生防真菌为昆虫病原真菌。更优选的，所述的生防真菌为罗伯茨绿僵菌。
8.优选的，所述的5-羟色胺或5-羟色胺盐酸盐在真菌培养基中的浓度不小于1mm。优选的，所述的5-羟色胺或5-羟色胺盐酸盐在真菌培养基中的浓度为1mm。
9.优选的，所述培养的温度为26
±
1℃；培养时间为14-18d。
10.优选的，含有5-羟色胺或5-羟色胺盐酸盐的真菌培养基的制备方法为，在避光条件下，将5-羟色胺或5-羟色胺盐酸盐加入真菌培养基中。
11.优选的，所述的真菌培养基为用于腐生生长的培养基，例如为pda培养基。
12.所述的杀虫效力为杀灭稻飞虱、天牛、蝗虫、松毛虫、螟虫或蚊虫等害虫的效力。
13.本发明所述的抗非生物逆境能力包括耐受紫外线辐射、耐受高温、耐受氮饥饿胁迫或耐受碳饥饿胁迫中的一种或多种的能力。
14.本发明还提供了一种上述方法得到的孢子在制备具有抗非生物逆境能力的真菌杀虫剂中的应用，所述的真菌杀虫剂具有更强的杀虫效力，且对紫外线辐射、高温、氮饥饿胁迫或碳饥饿胁迫等非生物逆境具有较强的抗逆能力。
15.本发明以基础研究的成果为理论指导，在培养基质中添加化合物5-羟色胺或5-羟色胺盐酸盐来获得在杀虫时萌发速度加快，侵染结构形成提前，穿透昆虫体壁速度加快和抗非生物逆境能力增强的真菌孢子，为获得杀虫效力和抗非生物逆境能力均提高的生防真菌孢子提供一个新的培养方法，所得孢子可以直接应用，展示了良好的应用前景。
附图说明
16.图1为以腐生、共生和寄生生活方式培养的罗伯茨绿僵菌毒力检测结果。(a)被感染大蜡螟幼虫的存活曲线。(b)半数致死时间lt
50
(试虫死亡数量达到总数的一半时所需时间)。pda:在pda培养基上培养的孢子；root:在植物根上培养的孢子；insect：在绿僵菌感染大蜡螟形成的僵虫上培养的孢子。不同字母表示样品间存在显著差异(p＜0.05，tukey’s test in one-way anova)。毒力测定实验重复3次，每次40只大蜡螟幼虫，所示数据为平均值
±
标准误。
17.图2为罗伯茨绿僵菌的毒力检测结果。(a)被感染大蜡螟幼虫的存活曲线。(b)半数致死时间lt
50
。pda:在普通pda上培养而得的孢子。pda dmso：在添加有dmso溶剂的pda培养基上培养而得的孢子，dmso的体积用量与添加5-羟色胺溶液体积用量相等；pda 1mm serotonin:在含有1mm 5-羟色胺的pda培养基上培养而得的孢子，其它名字意义如此相同；pda 1mm serotonin hydrochloride:在含有1mm 5-羟色胺盐酸盐的pda培养基上培养而得的孢子。不同字母表示样品间存在显著差异(p＜0.05，tukey’s test in one-way anova)。毒力测定实验重复3次，每次40只大蜡螟幼虫，所示数据为平均值
±
标准误。
18.图3为孢子萌发速率、附着孢形成速率和膨压测定结果。(a)孢子在ye培养基【0.0125％的酵母膏提取液(yeast extract)】中的萌发率。(b)孢子在含ye培养基的疏水培养皿表面的附着孢形成率。(c)孢子在蝗虫后翅上的附着孢形成率。(d)附着孢膨压。(e)孢子穿透蝗虫后翅能力。dmso：在添加有dmso溶剂的pda培养基上培养而得的孢子；dmso serotonin:在含有1mm 5-羟色胺的pda培养基上培养而得的孢子；dmso serotonin hydrochloride:在含有1mm 5-羟色胺盐酸盐的pda培养基上培养而得的孢子。不同字母表示样品间存在显著差异(p＜0.05，tukey’s test in one-way anova)。比例尺：1cm。所有实验重复三次，所示数据为平均值
±
标准误。
19.图4为孢子内脂滴、三酰甘油和甘油含量测定结果，其中：(a)被脂溶性荧光染料bodipy染色的脂滴在孢子中的分布。fluorescence：绿色荧光通道；bright field：白光通道；merge：绿色荧光和白光的融合照片。标尺：10μm。(b)使用流式细胞仪统计不同荧光强度的孢子数量。孢子用bodipy染色。(c)孢子内三酰甘油含量。(d)孢子内甘油含量。dmso：在添加有dmso溶剂的pda培养基上培养而得的孢子；dmso serotonin:在含有1mm 5-羟色胺的pda培养基上培养而得的孢子；dmso serotonin hydrochloride:在含有1mm 5-羟色胺盐酸
盐的pda培养基上培养而得的孢子。不同字母表示样品间存在显著差异(p＜0.05，tukey’s test in one-way anova)。所有实验重复三次，所示数据为平均值
±
标准误。
20.图5为不同非生物逆境胁迫下孢子萌发率测定结果。其中：(a)孢子在高温胁迫下萌发速率的测定。(b)孢子在紫外线胁迫下萌发速率的测定。(c)孢子在氮饥饿胁迫下萌发速率的测定。(d)孢子在碳饥饿胁迫下萌发速率的测定。dmso：在添加有dmso溶剂的pda培养基上培养而得的孢子；dmso serotonin:在含有1mm 5-羟色胺的pda培养基上培养而得的孢子；dmso serotonin hydrochloride:在含有1mm 5-羟色胺盐酸盐的pda培养基上培养而得的孢子。不同字母表示样品间存在显著差异(p＜0.05，tukey’s test in one-way anova)。所有实验重复三次，所示数据为平均值
±
标准误。
具体实施方式
21.下面结合实验对本发明的内容作进一步的说明。
22.实施例1：在植物根际培养的绿僵菌孢子杀虫能力分析
23.将罗伯茨绿僵菌孢子接种到土豆葡萄糖固体培养基(potato dextrose agar,pda)上，于26℃培养14d后，收集孢子，用tritonx-100溶液(0.01％v/v)制备成终浓度为5
×
105conidia/ml的孢子悬浮液，取5μl孢子悬浮液接种到一株在1/2ms(无糖)培养基上生长的拟南芥植株根部。共生培养14天后，收集植物根部的孢子，用tritonx-100溶液(0.01％v/v)制成终浓度为1
×
107conidia/ml的孢子悬浮液。将40头大蜡螟高龄幼虫放入15ml孢子悬浮液中，轻轻摇晃15秒后，将昆虫转移到无菌的吸水纸上，轻轻擦拭后，将试虫放入1安杯的塑料杯(1头虫/杯)中，在杯盖上打6个孔(提供空气)。将接种后的试虫放入人工气候箱(26℃，湿度为90％)，每隔24小时观察感染症状，并记录大蜡螟的死亡数。在死亡的大蜡螟的塑料杯中放入湿润的无菌棉球，保湿7d左右，根据是否从体内长出绿僵菌来判断试虫是否由绿僵菌感染致死。统计3-14天因罗伯茨绿僵菌侵染而致死的试虫数量，杀虫实验进行3次生物学重复，每次重复使用40头试虫。用dps(v7.05版)软件中计数型数据机值分析统计半致死时间lt
50
(试虫死亡数量达到总数的一半时所需天数)。
24.实验结果如图1所示：与在pda培养基上培养所得孢子相比，在拟南芥根际培养所得孢子的lt
50
下降了23.5％。在pda培养基上培养所得孢子的杀虫能力与在绿僵菌感染大蜡螟形成的僵虫上培养的没有显著差异。
25.实施例2：在pda培养基中添加5-羟色胺或5-羟色胺盐酸盐增强罗伯茨绿僵菌的杀虫速度
26.为了研究在植物根际培养的绿僵菌孢子杀虫能力提高的原因。首先通过液相质谱发现，拟南芥根部的5-羟色胺含量为0.0287
±
0.0087ng/g植物鲜重，而与绿僵菌共生的拟南芥根部5-羟色胺含量为0.0483
±
0.0134ng/g植物鲜重。
27.本发明进一步通过比较普通pda培养基上和添加有5-羟色胺的pda培养基上产生的孢子的杀虫能力，来分析是否是5-羟色胺负责增强罗伯茨绿僵菌的杀虫速度。5-羟色胺价格较高，为了降低生产孢子的成本，本发明也分析了价格低廉的5-羟色胺盐(5-羟色胺盐酸盐)是否有与5-羟色胺类似的功能。为此，首先用dmso溶剂配制了5-羟色胺母液(0.1m)，并过滤除菌。将一定量的5-羟色胺母液加入到55℃左右pda培养基中，混用后制成终浓度含1mm，500μm，100μm或10μm 5-羟色胺的pda平板。下述研究发现，1mm的5-羟色胺能提高绿僵
菌的杀虫能力和抗非生物逆境能力，为此也分析了1mm 5-羟色胺盐酸盐也是否具有这样的功效。对照为加入相应量的dmso溶剂的pda培养基和普通pda培养基。接种绿僵菌孢子，在26℃培养14d后，按实施例1中的方法制成终浓度为1
×
107conidia/ml的孢子悬液，并进行杀虫实验。
28.实验结果如图2所示：与普通pda培养基和仅含dmso的pda培养基上培养的孢子相比，在含1mm 5-羟色胺或5-羟色胺盐酸盐的pda培养基上培养的孢子杀虫能力增强，它们的lt
50
分别下降了32.8％和29.9％，最终致死率分别上升了19％和13.4％。在添加5-羟色胺的pda上培养的孢子的杀虫能力与添加5-羟色胺盐酸盐的没有显著差异，在普通pda培养基上培养的孢子的杀虫能力与在仅添加dmso的pda上培养的没有显著差异。
29.实施例3：在含5-羟色胺或5-羟色胺盐酸盐培养基上培养的孢子萌发和附着胞形成加快，附着孢膨压升高，穿透昆虫体壁能力增强
30.1)方法：
31.孢子培养方法。实验组：罗伯茨绿僵菌孢子在添加有1mm 5-羟色胺或5-羟色胺盐酸盐的pda培养基上培养14天；对照组：罗伯茨绿僵菌孢子在添加有dmso的pda培养基上培养14天。其中，对照组中dmso的体积用量与实验组中5-羟色胺和5-羟色胺盐酸盐的溶液体积用量相等。收集实验组和对照组培养得到的孢子。
32.孢子萌发速率测定。对照组和实验组所得的孢子分别用tritonx-100溶液(0.01％v/v)制成孢子悬液(4
×
107conidia/ml)，取60μl接种于含有3ml ye液体培养基的疏水培养皿(corning，usa)中。于26℃培养7小时后，每隔1小时测定萌发率。每个平皿随机统计300个分离良好的孢子，每个实验组接种3个培养皿，共做3次生物学重复。
33.附着孢形成速率测定。分别在昆虫体壁(东亚飞蝗成虫的后翅)和含上述ye培养基的疏水培养皿中检测附着胞形成情况。对照组和实验组所得的孢子分别用tritonx-100溶液(0.01％v/v)制成浓度为3
×
107conidia/ml的孢子悬液，对于昆虫体壁，取200μl接种于提前用1％次氯酸钠消毒的蝗虫后翅上(预先放置在2％水琼脂培养基上)，于26℃培养16h后，每隔4小时观察并统计附着孢形成比例。对于ye培养基，取70μl接种于含有3ml ye液体培养基的培养皿(corning，usa)中，于26℃培养12h后，每隔2小时观察附着孢形成情况。每个翅膀或平皿随机统计300个孢子，每个实验组接种3个重复，该实验重复3次。
34.附着孢膨压测定。对照组和实验组所得的孢子分别用用tritonx-100溶液(0.01％v/v)制成浓度为3
×
107conidia/ml的孢子悬液，取40μl接种于含有3ml ye液体培养基的培养皿(corning，usa)中。于26℃培养20h后，倒掉培养液，于培养皿正中央滴入100μl聚乙二醇(peg-8000)溶液，处理10min后，用水清洗培养皿3次，计数变形或者破损的附着孢。该实验重复3次，每次设置3个重复。
35.2)结果
36.与对照组所得孢子相比，在含5-羟色胺或5-羟色胺盐酸盐(1mm)的pda培养基上所培养的孢子萌发速度加快(图3a)，在ye培养基和昆虫体壁上形成附着胞提前(图3b、c)，附着胞内部膨压上升(图3d)，菌体穿透昆虫体壁的速度加快(图3e)。在这3个分析中，在添加5-羟色胺的pda上培养的孢子与添加5-羟色胺盐酸盐的没有显著差异。
37.实施例4：在含5-羟色胺或5-羟色胺盐酸盐培养基上培养的孢子含更多脂滴，三酰甘油和甘油
38.在病原真菌侵染昆虫时，附着在体壁上的孢子萌发，并进一步分化成内部具有巨大膨压的侵染结构——附着胞，附着胞的形成是真菌穿透寄主表皮的先决条件。在罗伯茨绿僵菌中，储存在孢子脂滴中的三酰甘油在附着孢成熟过程中降解转化为甘油，提高附着胞内的膨压，为成功穿透昆虫体壁提供保障。因此，孢子内三酰甘油和脂滴含量越高，则在孢子萌发及附着胞形成阶段所提供的能量越多。孢子内甘油含量越高，则附着胞的膨压越高。附着胞内能量及膨压越高，则附着胞形成速率越快，侵染昆虫的能力越强。
39.1)方法：
40.孢子培养方法。实验组：罗伯茨绿僵菌孢子在添加有1mm 5-羟色胺或5-羟色胺盐酸盐的pda培养基上培养14天；对照组：罗伯茨绿僵菌孢子在添加有dmso的pda培养基上培养14天。其中，对照组中dmso的体积用量与实验组中5-羟色胺和5-羟色胺盐酸盐的溶液体积用量相等。收集实验组和对照组培养得到的孢子。
41.三酰甘油(tag)和甘油(glycerol)含量测定。对照组和实验组所得的孢子分别用tritonx-100溶液(0.01％v/v)制成浓度为5
×
107conidia/ml的孢子悬液，每次取1ml置于1.5ml ep管中，于8000rpm离心5min，共取3次，去上清将孢子放入液氮中充分研磨后，粉末重悬于适量的异丙醇或裂解液中。于4℃ 5000rpm离心5分钟，收集上清。利用三酰甘油含量测定试剂盒(elabscience)和甘油含量测定试剂盒(普利莱)测定上清中三酰甘油和甘油的含量。
42.脂滴(lipid droplet)染色。对照组和实验组所得的孢子分别用tritonx-100溶液(0.01％v/v)制成浓度为2
×
107conidia/ml的孢子悬液，取1ml置于1.5ml ep管中，于8000rpm离心5分钟后，去上清，用含3％甲醛的pbs溶液重悬孢子，于室温固定20min。用pbs溶液清洗样品3次后，在避光条件下，加入脂滴染色液(含10μg/ml bodipy的pbs溶液)重悬孢子，在室温下静置染色1h。用pbs溶液清洗样品3次后，在于激光共聚焦显微镜和流式细胞仪中检测孢子的荧光强度。
43.2)结果
44.与含溶剂dmso的pda培养基上培养的分生孢子相比，在含5-羟色胺或5-羟色胺盐酸盐(1mm)的pda培养基上培养的孢子内含有更高水平的脂滴(图4a、b)、三酰甘油(图4c)和甘油(图4d)，而在添加5-羟色胺的pda上培养的孢子与添加5-羟色胺盐酸盐的没有显著差异。
45.实施例5：在含5-羟色胺或5-羟色胺盐酸盐培养基上培养的孢子在高温、紫外线辐射、氮饥饿胁迫和碳饥饿胁迫下萌发加快
46.1)方法：
47.孢子培养方法。实验组：罗伯茨绿僵菌孢子在添加有1mm 5-羟色胺或5-羟色胺盐酸盐的pda培养基上培养14天；对照组：罗伯茨绿僵菌孢子在添加有dmso的pda培养基上培养14天。其中，对照组中dmso的体积用量与实验组中5-羟色胺和5-羟色胺盐酸盐的溶液体积用量相等。收集实验组和对照组培养得到的孢子。
48.高温、紫外胁迫下萌发速率测定。对照组和实验组所得的孢子分别用tritonx-100溶液(0.01％v/v)制成孢子悬液(4
×
107conidia/ml)，取60μl接种于含有3ml ye液体培养基的疏水培养皿(corning，usa)中。对于高温胁迫下萌发速率测定，将已接种孢子悬液的培养皿置于37℃培养箱中6小时后，每隔2h在倒置显微镜下观察孢子的萌发情况。对于紫外胁
迫下萌发速率测定，将已接种孢子悬液的培养皿打开盖子置于bio-sun

chamber uvb(uvb＝312nm)的仪器(bio-sun

chamber)中进行0.4j/cm2剂量的照射，将照射后的培养皿置于26℃培养箱中培养12h之后，每隔2h在倒置显微镜下观察孢子的萌发情况。每个实验组接种3个培养皿，共做3次生物学重复。
49.碳饥饿、氮饥饿胁迫下萌发速率测定。对照组和实验组所得的孢子分别用tritonx-100溶液(0.01％v/v)制成孢子悬液(4
×
107conidia/ml)，取60μl接种于含有3ml只添加kno3或葡萄糖的基础盐液体培养基的疏水培养皿(corning，usa)中，将已接种孢子悬液的培养皿置于26℃培养箱中6小时后，每隔2h在倒置显微镜下观察孢子的萌发情况。每个实验组接种3个培养皿，共做3次生物学重复。
50.2)结果
51.与对照组所得孢子相比，在含5-羟色胺或5-羟色胺盐酸盐(1mm)的pda培养基上所培养的孢子在高温(图5a)、紫外(图5b)、氮饥饿(图5c)、碳饥饿(图5d)胁迫下萌发速率加快。在上述4个分析中，在添加5-羟色胺的pda上培养的孢子与添加5-羟色胺盐酸盐的没有显著差异。
52.以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。