MCUR1作为高原红细胞增多症的生物标志物的用途以及筛选药物的方法与流程

mcur1作为高原红细胞增多症的生物标志物的用途以及筛选药物的方法
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，具体地，涉及mcur1作为高原红细胞增多症的生物标志物的用途以及筛选药物的方法，更具体地，涉及试剂在制备药物中的用途、用于治疗或预防高原红细胞增多症的药物、筛选药物的方法、生物模型在筛选药物中的用途、试剂在制备试剂盒或者设备中的用途、检测高原红细胞增多症的试剂盒、造血干细胞和/或红细胞中 mcur1的表达量作为高原红细胞增多症的生物标志物的用途。


背景技术：

2.人们将海拔2500米以上的地区定义为高原，全世界有超过1.4亿的人口居住在高原地区。高原环境的特点是低压、寒冷、高辐射以及缺氧，在这种环境下，机体容易出现各种异常反应，从而导致高原性疾病，比如高原红细胞增多症、高原性肺水肿、高原性脑水肿等。已有的研究表明，高原世居人群为适应高海拔环境，必须进行相应的改变，这些改变包括生理和遗传两个方面，所谓高原适应 (high-altitude adaptation，haa)是指世居高原的人群或动物发生了一种可以遗传的，并具有遗传基础的结构、功能和习惯特征，因而能很好的在高原环境中生存繁衍的过程。然而，从目前国内外高原医学研究内容来看，从haa的机制角度上对遗传和环境因素的研究还不多，而且，据世界卫生组织估计，全世界约有1.8亿人遭受高原环境的影响。因此，阐明人类对高原环境的适应机制意义重大。
3.长期生活在高原环境的人群，不同程度地面临各种慢性高原病的威胁，尤其是移居高原的平原人群最为明显。高原红细胞增多症是高原地区最常见的一种慢性高原病，简称“高红症”，多见于高原移居人群。与同海拔高度的健康人相比，高红症病人的红细胞、血红蛋白、红细胞容积显着增高，动脉血氧饱和度降低，并伴有多血症的临床症状及体征，易发生头痛、气短、乏力、失眠等症状。长期以来，这一病症的成因及其相关调控机制尚未完全阐明，导致患者难治愈，且预防效果不佳。到目前为止，在高原地区对高红症仍然缺乏有效的治疗方法，唯一有效的治疗措施是将患者送回平原地区，但是这种方法因各种原因，在人群中不能大规模推广。因此，发现高原适应性相关基因，阐明其发挥作用的功能机制，对预防和治疗高红症具有重要意义。


技术实现要素：

4.发明人前期对世居高原藏族个体和世居平原汉族个体的基因组进行了全基因组深度测序研究。采用系统的生物信息学方法比较了高原藏族和平原汉族人群之间基因组序列变异的差异，发现线粒体钙单向转运体调节蛋白1(mitochondrial calcium uniporter regulator 1， mcur1)基因是潜在的高原适应性基因。通过分析数据(数据来源：gse46480)，来提示 mcur1与haa的潜在联系。结果表明，急性高原暴露后，人群在高原的mcur1的表达水平显著高于其在平原时的水平，提示mcur1可能在适应高原环境过程中发挥作用。由此，mcur1基因可能通过调控红系生成，参与高原适应的过程，说明mcur1基因和蛋
白在高原红细胞增多症临床诊断以及治疗中可能具有较好的应用价值，这对于该病的诊断、阻断疾病在家族中的遗传以及以mcur1基因作为靶点开发药物都具有重要意义。针对 mcur1的sirna和抑制剂可以用作开发治疗高原红细胞增多症的药物或试剂盒。
5.在本发明的第一方面，本发明提出了试剂在制备药物中的用途，所述试剂用于抑制 mcur1基因的表达，所述药物用于治疗或预防高原红细胞增多症。发明人发现mcur1基因的表达量与高原红细胞增多症的发病密切相关，从而可以通过检测该基因表达量在生物样本中是否发生，有效地检测生物样本是否患高原红细胞增多症。根据本发明的实施例，所提供的基因表达量是可检测的。
6.在本发明的第二方面，本发明提出了一种用于治疗或预防高原红细胞增多症的药物。根据本发明的实施例，所述药物含有：用于抑制mcur1基因表达的试剂。需要说明的是，这里的抑制是指能使得mcur1基因表达恢复到原来的野生状态或者其他不具有致病性的状态，而对于个体基因组的其他序列不产生实质影响。如前所述，前面所述的基因表达与高原红细胞增多症的发病密切相关，由此，包含抑制前面所述的基因表达的试剂的药物能有效用于治疗或高原红细胞增多症。
7.根据本发明的实施例，所述试剂为基于shrna、反义核酸、核酶、显性负突变、 crispr-cas9、crispr-cpf1和锌指核酸酶至少之一的试剂。
8.在本发明的第三发面，本发明提出了一种筛选药物的方法，所述药物用于治疗高原红细胞增多症。根据本发明的实施例，所述方法包括：将候选药物与造血干细胞和/或红细胞进行接触；以及检测所述接触前后，造血干细胞和/或红细胞中mcur1的表达水平，其中，所述接触后造血干细胞和/或红细胞中mcur1的表达水平低于所述接触前造血干细胞和/ 或红细胞中mcur1的表达水平，是候选药物为目标药物的指示。根据本发明的实施例，利用本发明的方法可以快速高效准确地筛选适于治疗高原红细胞增多症的药物。
9.在本发明的第四方面，本发明提出了生物模型在筛选药物中的用途。根据本发明的实施例，所述生物模型中造血干细胞和/或红细胞的mcur1基因表达升高。所提供的生物模型能有效地用作高原红细胞增多症的相关研究。根据本发明的实施例，所提供的生物模型可以用于筛选药物，所述药物用于治疗高原红细胞增多症。所提供的生物模型可以为细胞模型或者动物模型。生物模型携带的mcur1基因与野生型mcur1基因相比具有更高的表达量。
10.在本发明的第五方面，本发明提出了试剂在制备试剂盒或者设备中的用途，所述试剂用于确定mcur1基因的表达量，所述试剂盒或者设备用于诊断高原红细胞增多症。根据本发明的实施例，前面提到的mcur1基因的表达量与高原红细胞增多症的发病密切相关，进而可以将能够用于检测这些mcur1基因的表达量的试剂来制备试剂盒或者设备，所得到的试剂盒或设备能有效筛选出患有高原红细胞增多症的生物样品。
11.在本发明的第六方面，本发明提出了一种检测高原红细胞增多症的试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括确定mcur1基因表达量的试剂。根据本发明的实施例，如前所述，前面所述的mcur1基因的表达量与高原红细胞增多症的发病密切相关，进而能用于包含能有效地检测mcur1基因的表达量的试剂的试剂盒能有效筛选出患高原红细胞增多症的生物样品。
12.在本发明的第七方面，本发明提出了造血干细胞和/或红细胞中mcur1的表达量作
为高原红细胞增多症的生物标志物的用途。
13.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
14.本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
15.图1是根据本发明实施例的鉴定cd34

细胞中敲低mcur1的效果；
16.图2是根据本发明实施例的敲低mcur1，红系细胞的比例显著减少效果，其中，图a 通过联苯胺染色实验，检测血红蛋白阳性细胞比例，左边为代表性图片，右边为统计结果；图b-c通过qrt-pcr实验，检测红系生成标志物cd235a和hbg1的表达；图d通过流式细胞术，检测红系细胞表面标志cd235a和cd71的表达，左边为代表性图片，右边为统计结果；
17.图3是根据本发明实施例的敲低mcur1，抑制早期红系生成效果，其中，图a为该实验所用细胞收集于诱导培养2天，通过流式细胞术，检测bfu-e和cfu-e的比例，左边是代表性图片，右边是统计结果；图b为通过流式细胞术，分选bfu-e细胞群，然后接种至methocult h4434培养基内，于24孔板中培养，接种密度为1000细胞/孔，7天后观察bfu-e克隆形成情况，左边是代表性图片，右边是统计结果；图c为通过流式细胞术，分选cfu-e细胞群，然后接种至methocult h4430培养基内，于24孔板中培养，接种密度为1000细胞/孔，14天后观察cfu-e克隆形成情况，左边是代表性图片，右边是统计结果；
18.图4是根据本发明实施例的敲低mcur1，阻碍红系生成进程效果，其中，图a为giemsa 染色实验代表性图片；图b为第3、7和10天giemsa染色实验的统计结果；图c为第10 天giemsa染色实验的统计结果；
19.图5是根据本发明实施例的mcur1基因表达水平与血红蛋白浓度的相关性分析图；
20.图6是根据本发明实施例的基因集富集分析提示mcur1正向调控mtor信号通路结果，其中，图a在诱导培养5天后，收集细胞提取rna，而后进行转录组测序；图b为对差异表达的mrna进行gsea分析；
21.图7是根据本发明实施例的mcur1依赖mtor增加红系细胞比例结果，其中，图a 为通过联苯胺染色实验，检测血红蛋白阳性细胞比例，左边为代表性图片，右边为统计结果；图b-c为通过qrt-pcr实验，检测红系生成标志物cd235a和hbg1的表达；图d为通过流式细胞术，检测红系细胞表面标志cd235a和cd71的表达，左边为代表性图片，右边为统计结果；
22.图8是根据本发明实施例的mcur1依赖mtor促进早期红系生成结果，其中，图a 通过流式细胞术，检测bfu-e和cfu-e的比例，图a为代表性图片；图b为统计bfu-e 和cfu-e的比例的结果；
23.图9是根据本发明实施例的mcur1依赖mtor促进红系生成进程，其中，图a为 giemsa染色实验代表性图片；图b为giemsa染色实验统计结果；
24.图10是根据本发明实施例的mcur1正调控mtor信号通路关键分子结果；
25.图11是根据本发明实施例的mcur1维持细胞生物能量代谢，抑制ampk活性结果，其中，图a为荧光实验结果，荧光染料fluo-4标记细胞浆钙离子，rhod-2标记线粒体的钙离子，ionomycin是钙离子激动剂，左边为代表性图片，右边为根据rhod-2荧光值的统计结果；图b
为线粒体压力测试实验，左边统计迹线中的每个点代表3个不同孔的平均值，右边为根据细胞基础氧耗率(basal)、atp合成氧耗率(atp-coulped)和最大氧耗率(maximal) 的统计结果；图c为检测细胞中atp含量；图d为检测细胞中amp含量，并统计amp/atp 比值；图e为荧光实验结果，荧光染料rhod123标记线粒体，利用tmrm的荧光值作为膜电位的指标，左边为代表性图片，右边为根据tmrm荧光值的统计结果；图f为荧光实验结果，荧光染料rhod123标记线粒体，mitosox标记线粒体活性氧，左边为代表性图片，右边为根据mitosox荧光值的统计结果；图g为western blotting实验结果，检测mcur1 对ampk及ampk上游激酶lkb1、camkk2的影响；图h为western blotting实验结果，检测mcur1对ampk的影响；
26.图12是根据本发明实施例的mcur1依赖ampk增加红系细胞比例结果，其中，图a 为通过联苯胺染色实验，检测血红蛋白阳性细胞比例，左边为代表性图片，右边为统计结果；图b-c为通过qrt-pcr实验，检测红系生成标志物cd235a和hbg1的表达；图d 为通过流式细胞术，检测红系细胞表面标志cd235a和cd71的表达，左边为代表性图片，右边为统计结果；
27.图13是根据本发明实施例的mcur1依赖mtor促进早期红系生成的结果，其中，图a为流式检测结果，图b为统计结果；
28.图14是根据本发明实施例的mcur1依赖ampk促进红系生成进程的结果，其中，图a为giemsa染色实验代表性图片；图b为giemsa染色实验统计结果；
29.图15是根据本发明实施例的mcur1依赖于ampk正向调控mtor信号通路关键分子结果。
具体实施方式
30.下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
31.此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
32.在本文中，mcur1基因的核酸序列信息、mcur1蛋白序列信息均为数据库中所记载信息，本领域技术人员可通过查阅核酸或蛋白质数据库获得，例如：ncbi(national centerfor biotechnology information)数据库。
33.在本文中，mcur1基因的核酸序列信息、mcur1蛋白序列信息为人、非人灵长类、小鼠等动物。
34.在本文中，mcur1又被称为ccdc90a，分子量约40kda，它定位于线粒体内膜，具有两个跨膜结构域，和一个卷曲螺旋结构域，其中n-和c-末端面向内膜，卷曲螺旋结构域保留在基质内。
35.在本文中，本发明发现了mcur1基因表达量升高导致高原红细胞增多症的发生。 mcur1基因表达量可以用于筛查高原红细胞增多症患者的分子诊断及与相关疾病的鉴别诊断，并且快速、准确、高效、简便、早期诊断率高，检测结果可以为高原红细胞增多症的早期诊断、鉴别诊断及药物治疗提供科学依据。
36.需要说明的是，上述mcur1基因，是以收录于ncbi数据库中的内容作为参考，本领
域技术人员应该理解的是，由于数据库的更新或者数据库的不同，序列等可能会稍有不同或者变化，这些不同或者变化均可以给出的该数据库中的内容为标准确定，这些不同或者变化也均包含在本发明的保护范围之内。
37.而且，本领域技术人员能够理解的是，本文中所使用的mcur1基因是以人类基因组 grch38中野生型mcur1基因为准，但当该野生型mcur1基因存在于其他物种时，该序列可能会有所差异，可以将该物种的野生型mcur1基因与人类基因组中野生型mcur1 基因进行比对，获得该物种的野生型mcur1基因中所对应的位置。
38.申请人为了系统地发现新的高原适应相关基因/通路，对48例高原藏族个体和50 例平原汉族进行了全基因组测序。采用基于固定指数(fixation index，fst)的正选分析方法，申请人鉴定出候选haa相关基因56个，其中，首次发现的候选基因有35个。基因集合富集分析发现，本研究发现的候选基因集合在红系细胞中显著高表达，并且，显著富集于hif-1和钙信号通路等生物学通路。其中，排名第一的snp——rs61644582 位于6p23区域(在所有信号中排名第二)，它紧邻mcur1基因。该信号在两个独立验证群体中同样显著。本发明的发明人利用数据集bodymap 2.0(gse30611)和 genealtas(gse1133)，发现在人体各组织器官中，血液组织中mcur1的表达量相对较高，这提示mcur1可能在血液中发挥功能。进一步，分析dmap数据集，它包括了38种人的不同类型造血细胞的基因表达谱，结果发现红细胞中mcur1的mrna 表达水平显著高于其他类型的造血细胞，并且红系生成各阶段的细胞中，mcur1的表达丰度显著上升。综合上述结果说明mcur1是候选的高原适应基因，可促进红系生成。
39.本发明的目的在于将mcur1基因作为预警、诊断和治疗高原红细胞增多症中的分子标志物，并将沉默mcur1蛋白的试剂作为治疗高原红细胞增多症的药物或试剂盒，所述沉默是通过shrna、反义核酸、核酶、显性负突变、crispr-cas9、crispr-cpf1 和锌指核酸酶至少之一实现。
40.试剂在制备药物中的用途
41.在本发明的一个方面，本发明提出了试剂在制备药物中的用途，所述试剂用于抑制 mcur1基因的表达，所述药物用于治疗或预防高原红细胞增多症。发明人发现mcur1基因的表达量与高原红细胞增多症的发病密切相关，从而可以通过检测该基因表达量在生物样本中是否发生，有效地检测生物样本是否患高原红细胞增多症。根据本发明的实施例，所提供的基因表达量是可检测的。
42.根据本发明的实施例，所述药物用于下列的至少之一：抑制造血干细胞和/或红细胞的 mcur1基因表达升高；抑制造血干细胞和/或红细胞的生长；抑制造血干细胞和/或红细胞向红系分化；抑制造血干细胞和/或红细胞中的mtor信号通路激活；和促进造血干细胞和 /或红细胞中的ampk信号通路激活。所述试剂可以抑制或降低mcur1基因表达，即：所述药物可以使mcur1基因表达恢复至野生型正常水平；所述试剂可以通过抑制或降低 mcur1基因表达来减少造血干细胞和/或红细胞的分裂和生长，减少造血干细胞和/或红细胞向红系分化，使造血干细胞或红细胞处于正常水平；所述试剂可以通过抑制或降低 mcur1基因表达抑制造血干细胞和/或红细胞中的mtor信号通路激活，或促进促进造血干细胞和/或红细胞中的ampk信号通路激活，进而实现使造血干细胞或红细胞处于正常水平，缓解高原红细胞增多症的症状。
43.根据本发明的实施例，患有所述高原红细胞增多症的患者体内造血干细胞和/或红细胞的mcur1表达水平增高、造血干细胞和/或红细胞的mtor信号通路被激活或造血干细胞和/或红细胞的ampk信号通路被抑制。根据本发明的实施例，所述药物适用于高原红细胞增多症的患者，所述患者具有下列特征：体内造血干细胞和/或红细胞的mcur1表达水平增高、造血干细胞和/或红细胞的mtor信号通路被激活或造血干细胞和/或红细胞的ampk 信号通路被抑制。
44.根据本发明的实施例，所述抑制mcur1基因的表达是通过shrna、反义核酸、核酶、显性负突变、crispr-cas9、crispr-cpf1和锌指核酸酶至少之一实现的。例如，crisprs 技术是一种由rna指导cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术，crispr-cas9主要通过基因敲除、特种变异的引入和定点转基因三种途径来实现基因组改造，基于crispr-cas9的方法，发明人可以设计出sgrna并合成该序列的grna，然后将grna与cas9在细胞中共表达，通过grna介导cas9蛋白与目标dna区域结合，进而实现特定位点的修复或改变，达到控制基因表达的效果。
45.根据本发明的实施例，所述抑制mcur1基因的表达是通过反义核酸实现的，所述试剂具有seq id no：1～2至少之一所示的核苷酸序列。根据本发明的实施例，反义核酸是指能与特定mrna精确互补、特异阻断其翻译的rna或dna分子。利用反义核酸特异地封闭某些基因表达，使之低表达或不表达。
46.根据本发明的具体实施例，所述seq id no：1～2的核苷酸序列如下所示：
47.gacagacaggaagaucgaa(seq id no:1)
48.ucgacacucaugccuuagu(seq id no:2)
49.根据本发明的实施例，所述试剂具有与seq id no：1～2所示序列至少80％、85％、 90％、95％相同序列。
50.用于治疗或预防高原红细胞增多症的药物
51.在本发明的另一方面，本发明提供了一种用于治疗或预防高原红细胞增多症的药物，。根据本发明的实施例，所述药物含有：用于抑制mcur1基因表达的试剂。这里的抑制是指能使得mcur1基因表达恢复到原来的野生状态或者其他不具有致病性的状态，而对于个体基因组的其他序列不产生实质影响。如前所述，前面所述的基因表达与高原红细胞增多症的发病密切相关，由此，包含抑制前面所述的基因表达的试剂的药物能有效用于治疗或高原红细胞增多症。
52.根据本发明的实施例，所述试剂为基于shrna、反义核酸、核酶、显性负突变、 crispr-cas9、crispr-cpf1和锌指核酸酶至少之一的试剂。例如，crisprs技术是一种由rna指导cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术，crispr-cas9主要通过基因敲除、特种变异的引入和定点转基因三种途径来实现基因组改造，基于crispr-cas9的方法，发明人可以设计出sgrna并合成该序列的grna，然后将grna与cas9在细胞中共表达，通过 grna介导cas9蛋白与目标dna区域结合，进而实现特定位点的修复或改变，达到控制基因表达的效果。
53.筛选药物的方法
54.在本发明的又一方面，本发明提出了一种筛选药物的方法，所述药物用于治疗高原红细胞增多症。根据本发明的实施例，所述方法包括：将候选药物与造血干细胞和/或红细胞进行接触；以及检测所述接触前后，造血干细胞和/或红细胞中mcur1的表达水平，其
中，所述接触后造血干细胞和/或红细胞中mcur1的表达水平低于所述接触前造血干细胞和/ 或红细胞中mcur1的表达水平，是候选药物为目标药物的指示。根据本发明的实施例，利用本发明的方法可以快速高效准确地筛选适于治疗高原红细胞增多症的药物。
55.生物模型
56.在本发明的又一方面，本发明提出了一种生物模型在筛选药物中的用途，所述生物模型中造血干细胞和/或红细胞的mcur1基因表达升高。这些生物模型可以是细胞模型也可以是动物模型。
57.根据本发明的实施例，所述生物模型中造血干细胞和/或红细胞的mtor信号通路被激活。所述生物模型中造血干细胞和/或红细胞的mcur1基因表达升高，进而引起mtor信号通路被过度激活。
58.根据本发明的实施例，所述生物模型中造血干细胞和/或红细胞的ampk信号通路被抑制。所述生物模型中造血干细胞和/或红细胞的mcur1基因表达升高，进而引起ampk信号通路被抑制。
59.根据本发明的实施例，所述生物模型用于筛选药物，所述药物用于治疗或预防高原红细胞增多症。
60.根据本发明的具体实施例，将候选药物与上述生物模型进行接触；以及检测所述接触前后，所述生物模型中造血干细胞和/或红细胞mcur1的表达水平，其中，所述接触后造血干细胞和/或红细胞中mcur1的表达水平低于所述接触前造血干细胞和/或红细胞中 mcur1的表达水平，是候选药物为目标药物的指示。
61.试剂在制备试剂盒或者设备中的用途、检测高原红细胞增多症的试剂盒
62.在本发明的又一方面，本发明提出了试剂在制备试剂盒或者设备中的用途，所述试剂用于确定mcur1基因的表达量，所述试剂盒或者设备用于诊断高原红细胞增多症。根据本发明的实施例，前面提到的mcur1基因的表达量与高原红细胞增多症的发病密切相关，进而可以将能够用于检测这些mcur1基因的表达量的试剂来制备试剂盒或者设备，所得到的试剂盒或设备能有效筛选出患有高原红细胞增多症的生物样品。
63.根据本发明的实施例，所述试剂包括特异性确定所述mcur1基因表达量的抗体、探针以及质谱检测试剂的至少之一。例如，发明人可通过特异性识别mcur1蛋白的抗体与所述蛋白的特异性结合来检测待测样品中是否存在mcur1基因表达量升高的情况，即通过特异性抗体与抗原的相互作用来检测上述蛋白的含量是否改变；发明人还可以通过预先设计特异性识别mcur1 mrna的探针，通过探针与上述mrna片段发生互补配对，来鉴别mcur1基因的表达量是否改变；发明人还可以通过质谱来检测多肽的m/z来判断，上述蛋白的含量。所提供的抗体、探针、引物以及质谱检测试剂的至少之一，能特异性、高灵敏性地检测出mcur1蛋白的含量，进而特异性、高灵敏性地筛选出患高原红红细胞增多症的生物样品，进而能有效用于制备筛选患高原红细胞增多症的试剂盒或者设备。
64.在本发明的又一方面，本发明提出了一种检测高原红细胞增多症的试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括确定mcur1基因表达量的试剂。根据本发明的实施例，如前所述，前面所述的mcur1基因的表达量与高原红细胞增多症的发病密切相关，进而能用于包含能有效地检测mcur1基因的表达量的试剂的试剂盒能有效筛选出患高原红细胞增多症的生物样品。
65.根据本发明的实施例，所述试剂包括特异性确定所述mcur1基因表达量的抗体、探针以及质谱检测试剂的至少之一。所述试剂包括特异性确定所述mcur1基因表达量的抗体、探针以及质谱检测试剂的至少之一。例如，发明人可通过特异性识别mcur1蛋白的抗体与所述蛋白的特异性结合来检测待测样品中是否存在mcur1基因表达量升高的情况，即通过特异性抗体与抗原的相互作用来检测上述蛋白的含量是否改变；发明人还可以通过预先设计特异性识别mcur1 mrna的探针，通过探针与上述mrna片段发生互补配对，来鉴别mcur1基因的表达量是否改变；发明人还可以通过质谱来检测多肽的m/z来判断，上述蛋白的含量。所提供的抗体、探针、引物以及质谱检测试剂的至少之一，能特异性、高灵敏性地检测出mcur1蛋白的含量，进而特异性、高灵敏性地筛选出患高原红红细胞增多症的生物样品。
66.在本发明的又一方面，本发明提出了造血干细胞和/或红细胞中mcur1的表达量作为高原红细胞增多症的生物标志物的用途。
67.下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。
68.发明人为探索mcur1对红系生成的影响，在低氧条件下进行以下体外细胞功能学的研究
69.实施例1敲低mcur1，红系细胞的比例显著减少
70.高原低氧是高原环境的一项重要特征，低氧可以影响红系生成的过程。我们在低氧条件下探索mcur1对红系生成的影响。首先，我们利用短发夹rna(short hairpin rna， shrna)技术构建了稳定敲低mcur1的cd34

造血干细胞，shrna的序列如seq id no： 1～2所示。mcur1稳定敲低载体包装有gfp，我们可通过分选gfp

/cd34

的细胞，来获得稳定敲低mcur1的cd34 造血干细胞。cd34

造血干细胞在含有促红细胞生成素 (erythropoietin，epo)等细胞因子的培养基中，进行诱导培养，可向红系生长和分化，通过western blotting实验，我们检测了cd34

造血干细胞向红系分化过程的不同时间细胞中 mcur1的表达情况。结果显示，各时间点的细胞中mcur1敲低效果均良好，参考附图1，这保证了后续实验的可靠性。
71.cd71、cd235a和γ-globin均是红系生成的标志物。细胞表面抗原cd71是转铁蛋白受体，约在bfu-e阶段开始表达；cd235a(gpa，glycophorin a)是血型糖蛋白a，在原红细胞阶段开始表达；hbg1基因编码的蛋白γ-globin是血红蛋白重要成分。在蛋白水平，我们通过联苯胺染色检测血红蛋白阳性细胞比例，实验结果显示，敲低mcur1后，联苯胺染色阳性细胞比例显著下调(参考附图2a)；在rna水平，我们通过qrt-pcr检测分化过程中cd235a和hbg1的表达，结果显示，敲低mcur1后，cd235a和hbg1的mrna 表达水平显著下降(参考附图2b-c)。另外，我们通过流式细胞术检测细胞表面标志cd235a 和cd71的表达，结果显示，敲低mcur1后，cd235a

/cd71

细胞百分比显著减少(参考附图2d)。综合以上结果，我们发现敲低mcur1使红系细胞的比例显著减少。该结果提示，mcur1可能发挥促进红系生成的作用。
72.该实验所用蛋白，提取自诱导培养第3、7和10天的gfp

/cd34

的细胞。western blotting 实验结果显示，与对照组相比，敲低mcur1组在不同时间的mcur1的蛋白表达水平均显著降低。
73.实验所用细胞分别收集于诱导培养后第3、7和10天，附图2：(a)通过联苯胺染色实验，检测血红蛋白阳性细胞比例，左边为代表性图片，右边为统计结果；(b-c)通过 qrt-pcr
实验，检测红系生成标志物cd235a和hbg1的表达；(d)通过流式细胞术，检测红系细胞表面标志cd235a和cd71的表达，左边为代表性图片，右边为统计结果。使用student’s t检验进行计算，***代表p《0.001，当p《0.05时，认为差异具有统计学意义。
74.实施例2敲低mcur1，抑制早期红系生成
75.在红系生成的早期阶段，造血干细胞分化成造血祖细胞bfu-e，随后继续分化成 cfu-e。根据gpa，il3r，cd34和cd36四个膜蛋白的表达变化可以观察红系bfu-e和 cfu-e的生成情况。我们收集诱导分化第2天的细胞，通过流式细胞术，检测bfu-e (il3r-gpa-cd34

cd36-)和cfu-e(il3r-gpa-cd34-cd36

)的比例，结果显示在敲低 mcur1的细胞中，cfu-e的比例显著减少，而bfu-e的比例无明显差异(参考附图3a)。进一步，我们通过红系克隆形成实验，验证mcur1对造血祖细胞bfu-e和cfu-e生长的影响，我们根据bfu-e和cfu-e的表面分子，分选富集敲低组和对照组的bfu-e和 cfu-e细胞，然后接种至甲基纤维素半固体培养基中，观察红系克隆形成情况。实验结果显示，敲低mcur1，显著抑制bfu-e和cfu-e克隆形成，无论是克隆的数量，还是克隆的体积，与对照组相比，敲低组均显著减少(参考附图3b-c)。上述结果提示，mcur1促进早期红系生成。
76.附图3：(a)该实验所用细胞收集于诱导培养2天，通过流式细胞术，检测bfu-e和 cfu-e的比例，左边是代表性图片，右边是统计结果；(b)通过流式细胞术，分选bfu-e 细胞群，然后接种至methocult h4434培养基内，于24孔板中培养，接种密度为1000细胞/孔，7天后观察bfu-e克隆形成情况，左边是代表性图片，右边是统计结果；(c)通过流式细胞术，分选cfu-e细胞群，然后接种至methocult h4430培养基内，于24孔板中培养，接种密度为1000细胞/孔，14天后观察cfu-e克隆形成情况，左边是代表性图片，右边是统计结果。使用student’s t检验进行计算，**代表p《0.01，***代表p《0.001，当p《 0.05时，认为差异具有统计学意义。
77.实施例3敲低mcur1，阻碍红系生成进程
78.为进一步验证mcur1促进红系生成的功能，我们拟敲低mcur1后，分析红系生成过程中各成熟阶段的细胞比例。与前面一样，我们通过慢病毒感染的方法在cd34

细胞中敲低mcur1，分别收集诱导后第3、7、10天的细胞进行giemsa染色实验，对红系生成过程中的嗜碱性红细胞(basophilic erythroblasts，bas)、多染性红细胞(polychromatic erythrobsts， pol)、正色性红细胞(orthochromatic erythroblasts，ort)和红细胞(erythrocyte，ery)这四个不同成熟阶段的红细胞进行计数(参考附图4a)，分析结果显示，敲低组与对照组相比，三个时间点的早期红细胞(bas，pol)数量相对增多，晚期红细胞(ort，ery)数量相对减少，总体呈现出抑制红系生成的趋势(参考附图4b-c)，进一步证明mcur1促进红系生成。
79.该实验所用细胞分别收集于诱导培养后第3、7和10天，对细胞进行giemsa染色。(a) giemsa染色实验代表性图片，相比于对照组，敲低mcur1组的细胞体积较大，染色质稀疏，核质比较小，提示红系生成进程减缓；(b)第3、7和10天giemsa染色实验的统计结果，与对照组相比，敲低mcur1组总体上呈现出抑制红系生成进程的趋势；(c)第10 天giemsa染色实验的统计结果，与对照组相比，敲低mcur1组中bas和pol细胞显著增多，而ery细胞显著减少，提示敲低mcur1组红系生成受抑制。使用student’s t检验进行计算，**代表p《0.01，***代表p《0.001，当p《0.05时，认为差异具有统计学意义。
80.实施例4 mcur1基因表达水平与血红蛋白浓度呈显著正相关
81.我们收集了45例高原藏族个体的外周血样本，检测了样本的血红蛋白浓度，并提取样本的rna，然后通过qrt-pcr实验检测样本中mcur1基因的表达水平，结果显示，mcur1 基因表达水平与血红蛋白浓度呈显著正相关(参考图5)。这一结果进一步支持了mcur1 促进红系生成的结论。
82.该分析使用45例高原藏族个体的外周血样本。这些个体来自青海省人民医院于2016 年5月-6月期间在青海省果洛藏族自治州(海拔》4,000米)的一次社区体检。血红蛋白浓度，使用hemocue hb 201 分析仪(恩厄尔霍尔姆，瑞典)检测。mcur1基因的mrna 表达水平，使用qrt-pcr方法得出，并进行log2转换。x轴，代表mcur1基因的mrna 表达水平。y轴，代表相应的血红蛋白浓度。p值使用线性回归分析得出，当p《0.05时，认为差异具有统计学意义。
83.我们进一步发现并证明mcur1依赖于mtor信号通路促进红系生成。
84.实施例5基因集富集分析提示mcur1正向调控mtor信号通路
85.mcur1在高原低氧适应或影响红系生成方面的功能机制研究仍未见报道，为探索 mcur1促进红系生成的分子机制，我们在人cd34

造血干细胞中敲低mcur1，然后诱导细胞向红系生长和分化，在诱导培养的第5天收集细胞，提取rna，进行转录测序。然后对敲低组和对照组表达的mrna进行基因集富集分析(gene set pathway enrichmentanalysis，gsea)，敲低mcur1可导致氧化磷酸化受损(参考图6a)。同时，我们发现敲低mcur1后，mtor信号通路被显著抑制(参考图6b)。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 (mammalian target of rapamycin，mtor)是一类丝/苏氨酸激酶，细胞内存在mtorc1和 mtorc2两种不同的复合体。综合生物信息学分析，我们提出：mcur1依赖于mtor信号通路促进红系生成。
86.将分选得到的敲低mcur1的cd34

造血干细胞，在体外诱导培养，使其向红系生长和分化。图6：(a)在诱导培养5天后，收集细胞提取rna，而后进行转录组测序。结果显示，与对照相比，敲低mcur1组中显著下调的信号通路。nes表示每个基因集的归一化富集得分。(b)对差异表达的mrna进行gsea分析，结果显示，与对照相比，敲低 mcur1组中与mtor信号通路相关的基因集被显著富集，当p《0.05时，认为差异具有统计学意义。
87.实施例6 mcur1依赖mtor信号通路促进红系生成
88.为验证上述生物信息学分析的结果，我们首先检测mcur1对mtor信号通路的影响。在敲低mcur1的情况下，我们观察到mtor的磷酸化显著下调，并且它的关键底物s6k 和4ebp1的磷酸化水平也显著下调(参考图10)，说明敲低mcur1能抑制mtor信号通路。同时我们还发现敲低mcur1时，gata1表达水平下调，gata2表达水平上调，佐证了mcur1促进红系生成。但是，自噬相关分子(ulk1、p62和lc3)和一些线粒体相关转录因子(nrf1、pgc1α、yy1和mttfa)无显著性变化(参考图10)，提示mcur1通过mtor信号通路促进红系生成，不依赖于mtor下游的自噬及线粒体生物合成等过程。
89.进一步，我们利用小干扰rna(small interfering rna，sirna)敲低mtor的上游抑制因子tsc1和tsc2，以此激活mtor信号通路。首先，我们通过联苯胺染色、qrt-pcr 和流式细胞术检测红系细胞的比例的变化情况。在敲低tsc1或tsc2激活mtor活性的情况下，敲低mcur1，联苯胺染色实验结果显示血红蛋白阳性细胞比例减少不显著(参考图7a)，qrt-pcr实验结果显示cd235a和hbg1的mrna表达水平下调不显著(参考图 7b-c)，流式细胞实验结
果显示cd235a

/cd71

细胞百分比减少也不显著(参考图7d)。进一步，我们通过流式细胞术检测bfu-e和cfu-e的比例以观察早期红系生成的变化。结果显示，在敲低tsc1或tsc2的基础上，敲低mcur1，bfu-e和cfu-e的比例下调不显著(参考图8)。然后，我们通过gimesa染色实验观察红系生成进程的改变。结果显示，在敲低tsc1或tsc2的基础上，敲低mcur1，红系生成进程受阻的效应不显著(参考图 9)。上述结果提示mcur1依赖于mtor信号通路促进红系生成。
90.我们通过western blotting实验检测mtor信号通路关键分子(mtor、s6k、4e-bp1) 的表达变化(参考图10)，结果显示，敲低mcur1，p-mtor显著下调，并且mtor底物 s6k和4e-bp1的磷酸化水平显著下调，同时发现gata1表达显著下调，gata2表达显著上调，提示红系生成受抑制。然后在激活mtor活性的情况下，敲低mcur1，p-mtor、 p-s6k、p-4e-bp1、gata1和gata2的变化不显著，这些结果说明mcur1依赖于mtor 信号通路促进红系生成。综合以上结果，我们证明了mcur1依赖mtor信号通路促进红系生成。
91.在敲低mcur1的cd34 造血干细胞中，转染tsc1或tsc2的sirna，以敲低tsc1 和tsc2的表达，从而激活mtor，然后将细胞在体外诱导培养，使其向红系生长和分化。该实验所用细胞收集于诱导培养后第7天，图7：(a)通过联苯胺染色实验，检测血红蛋白阳性细胞比例，左边为代表性图片，右边为统计结果；(b-c)通过qrt-pcr实验，检测红系生成标志物cd235a和hbg1的表达；(d)通过流式细胞术，检测红系细胞表面标志 cd235a和cd71的表达，左边为代表性图片，右边为统计结果。使用student’s t检验进行计算，***代表p《0.001，ns代表无统计学差异，当p《0.05时，认为差异具有统计学意义。
92.在敲低mcur1的cd34 造血干细胞，转染tsc1或tsc2的sirna，以敲低tsc1和 tsc2的表达，从而激活mtor，然后将细胞在体外诱导培养，使其向红系生长和分化。该实验所用细胞收集于诱导培养后第2天，图8：(a)通过流式细胞术，检测bfu-e和cfu-e 的比例，图中为代表性图片；(b)统计bfu-e和cfu-e的比例的结果。使用student’s t 检验进行计算，***代表p《0.001，ns代表无统计学差异，当p《0.05时，认为差异具有统计学意义。
93.在敲低mcur1的cd34 造血干细胞，转染tsc1或tsc2的sirna，以敲低tsc1和 tsc2的表达，从而激活mtor。然后将细胞在体外诱导培养，使其向红系生长和分化。该实验所用细胞收集于诱导培养后第7天，图9：(a)giemsa染色实验代表性图片；(b)giemsa 染色实验统计结果。使用student’s t检验进行计算，*代表p《0.05，***代表p《0.001， ns代表无统计学差异，当p《0.05时，认为差异具有统计学意义。
94.在敲低mcur1的cd34 造血干细胞，转染tsc1或tsc2的sirna，以敲低tsc1和 tsc2的表达，从而激活mtor。然后将细胞在体外诱导培养，使其向红系分化。该实验所用蛋白，提取自诱导7天后的细胞，通过western blotting实验，检测mtor信号通路关键分子的表达变化。
95.实施例7 mcur1维持细胞生物能量代谢，抑制ampk活性
96.在人cd34 造血干细胞中敲低mcur1，能够显着降低线粒体ca2 摄取(参考图11a)，降低氧气消耗率(参考图11b)，降低细胞内atp含量(参考图11c)，并上调atp/amp 比值(参考图11d)，同时线粒体内膜上的电压水平(δψm)(参考图11e)和线粒体内活性氧(mros)含量显著下降(参考图11f)，此外我们通过western blotting实验发现，敲低mcur1的情况下，ampk-α1的thr172的磷酸化水平显著上调(参考图11g)，并且tsc2 在ser1387处的磷酸化和
raptor在ser792处的磷酸化上调，mtorc1磷酸化下调(参考图 15)。
97.我们检测了ampk上游两个激酶lkb1和camkk2的活性变化，结果显示camkk2 磷酸化显著上调，而lkb1无显著变化(参考图11g)。然后，我们利用广谱的磷酸酶抑制剂(okadaic acid)抑制磷酸酶活性，结果发现磷酸酶抑制剂并不能消除敲低mcur1介导的ampk激活(参考图11h)，说明mcur1并不依赖于磷酸酶抑制ampk活性。因此，在缺氧条件下，敲低mcur1可能通过线粒体生物能量代谢，一方面上调atp/amp比值，异构激活ampk活性，另一方面抑制线粒体钙离子摄取，增加胞浆钙离子浓度，激活 camkk2，进而激活ampk活性，然后上调tsc2和raptor的磷酸化水平，从而抑制mtor 活性，并最终抑制红细胞生成。
98.实验所用细胞分别收集于诱导培养后第7天，图11：(a)通过荧光实验，观察细胞中线粒体钙离子摄取的变化情况，利用荧光染料fluo-4标记细胞浆钙离子，rhod-2标记线粒体的钙离子，ionomycin是钙离子激动剂，左边为代表性图片，右边为根据rhod-2荧光值的统计结果，以表示线粒体钙离子浓度平均值的差异；(b)通过线粒体压力测试实验，检测细胞中线粒体呼吸情况，左边统计迹线中的每个点代表3个不同孔的平均值，右边为根据细胞基础氧耗率(basal)、atp合成氧耗率(atp-coulped)和最大氧耗率(maximal)的统计结果；(c)检测细胞中atp含量；(d)检测细胞中amp含量，并统计amp/atp比值； (e)通过荧光实验，观察细胞中线粒体膜电位的变化情况，利用荧光染料rhod123标记线粒体，利用tmrm的荧光值作为膜电位的指标，左边为代表性图片，右边为根据tmrm 荧光值的统计结果，以表示线粒体膜电位平均值的差异；(f)通过荧光实验，观察细胞中线粒体活性氧含量的变化情况，利用荧光染料rhod123标记线粒体，利用mitosox标记线粒体活性氧，左边为代表性图片，右边为根据mitosox荧光值的统计结果，以表示线粒体活性氧含量平均值的差异；(g)提取细胞蛋白，通过western blotting实验，检测mcur1 对ampk及ampk上游激酶lkb1、camkk2的影响；(h)在细胞中加入磷酸酶抑制剂 (okadaic acid)抑制磷酸酶活性，通过western blotting实验，检测mcur1对ampk的影响。使用student’s t检验进行计算，**代表p《0.01，***代表p《0.001，ns代表无统计学差异，当p《0.05时，认为差异具有统计学意义。
99.实施例8 mcur1依赖于ampk信号通路促进红系生成
100.前面我们已经证明了敲低mcur1能够抑制mtor信号通路，并且激活ampk活性，那么mcur1是否依赖于ampk激活mtor信号通路，发挥促进红细胞生成的功能，为验证上述假设，我们利用sirna的方法敲低ampk。首先通过联苯胺染色、qrt-pcr和流式细胞术检测红系细胞的比例的变化情况。在敲低ampk的情况下，敲低mcur1，联苯胺染色实验发现细胞血红蛋白含量减少不显著(参考图12a)，qrt-pcr实验发现cd235a和 hbg1的mrna表达水平下调也不显著(参考图12b-c)，流式细胞实验发现 cd235a /cd71 细胞百分比减少不显著(参考图12d)。进一步，我们通过流式细胞术检测 bfu-e和cfu-e的比例以观察早期红系生成的变化。结果显示，在敲低ampk的基础上，敲低mcur1，bfu-e和cfu-e的比例下调不显著(参考图13)。然后，我们通过gimesa 染色实验观察红系生成进程的改变。结果显示，在敲低ampk的基础上，敲低mcur1，红系生成进程受阻的效应不显著(参考图14)。上述结果提示mcur1依赖于ampk信号通路促进红系生成。
101.进一步，我们通过western blotting实验检测ampk-mtor信号通路关键分子(ampk、 tsc2、raptor、mtor、s6k、4e-bp1)的表达变化(参考图15)，发现敲低mcur1的情况下，p-ampk、p-tsc2和p-raptor显著上调，p-mtor显著下调，并且mtor底物s6k 和4e-bp1的
磷酸化水平显著下调，同时发现gata1表达显著下调，gata2表达显著上调，提示红系生成受抑制。然后，在敲低ampk的情况下，同时敲低mcur1，p-ampk、p-tsc2、 p-raptor、p-mtor、p-s6k、p-4e-bp1、gata1和gata2的变化不显著。
102.综合以上结果，我们证明了mcur1通过维持线粒体钙离子摄取，抑制ampk活性，并且依赖于ampk激活mtor信号通路，发挥促进红系生成的功能。
103.在敲低mcur1的cd34 造血干细胞，转染ampk的sirna，以抑制ampk活性。然后将细胞在体外诱导培养，使其向红系分化。该实验所用细胞收集于诱导培养后第7天，图12：(a)通过联苯胺染色实验，检测血红蛋白阳性细胞比例，左边为代表性图片，右边为统计结果；(b-c)通过qrt-pcr实验，检测红系生成标志物cd235a和hbg1的表达； (d)通过流式细胞术，检测红系细胞表面标志cd235a和cd71的表达，左边为代表性图片，右边为统计结果。使用student’s t检验进行计算，***代表p《0.001，ns代表无统计学差异，当p《0.05时，认为差异具有统计学意义。
104.在敲低mcur1的cd34 造血干细胞，转染ampk的sirna，以抑制ampk活性。然后将细胞在体外诱导培养，使其向红系分化。该实验所用细胞收集于诱导培养后第2天，图13：(a)通过流式细胞术，检测bfu-e和cfu-e的比例，图中为代表性图片；(b)统计bfu-e和cfu-e的比例的结果。使用student’s t检验进行计算，***代表p《0.001，ns 代表无统计学差异，当p《0.05时，认为差异具有统计学意义。
105.在敲低mcur1的cd34 造血干细胞，转染ampk的sirna，以抑制ampk活性。然后将细胞在体外诱导培养，使其向红系分化。实验所用细胞收集于诱导培养后第7天，图 14：(a)giemsa染色实验代表性图片；(b)giemsa染色实验统计结果。使用student’s t 检验进行计算，***代表p《0.001，ns代表无统计学差异，当p《0.05时，认为差异具有统计学意义。
106.在敲低mcur1的cd34 造血干细胞，转染ampk的sirna，以抑制ampk活性。然后将细胞在体外诱导培养，使其向红系分化。该实验所用蛋白，提取自诱导7天后的细胞，通过western blotting实验，检测ampk-mtor信号通路关键分子的表达变化。
107.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
108.尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。