一种胎盘保存液及胎盘的保存方法与流程

1.本发明涉及医学技术领域，具体涉及一种胎盘保存液及胎盘的保存方法。


背景技术：

2.胎盘是胎儿与母体之间物质交换的重要器官，是人类妊娠期间由胚胎胚膜和母体子宫内膜联合长成的母子间组织结合器官。孕妇在生产后，胎盘就从身体上脱落。然而，离体的胎盘中含有大量的间充质干细胞；胎盘间充质干细胞(mesenchymal stem cell，msc)是一种多能干细胞，是具有自我复制能力的多潜能细胞；如胎盘间充质干细胞在适宜的条件下分化为：上皮干细胞、神经干细胞、肝干细胞，肌细胞、成骨细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞。其可以用来修复受损或病变的组织器官，治疗心脑血管疾病、神经系统疾病、肝脏疾病、骨组织病、角膜损伤、烧伤烫伤、肌病等多种疾病。
3.但是，离体的胎盘中的胎盘间充质干细胞很快会失去活性；不利于后续胎盘间充质干细胞的分离培养。因此，提供一种能够使得离体的胎盘保持较高胎盘间充质干细胞活性的胎盘保存液具有重要的应用价值。


技术实现要素：

4.为了克服现有技术存在的至少之一的技术问题，本发明提供了一种胎盘保存液。
5.本发明所要解决的上述技术问题，通过以下技术方案予以实现：
6.一种胎盘保存液，其包含如下重量份的组分：pbs缓冲液 100～150份；葡萄糖 3～5份；还原型谷胱苷肽 1～2份；腺苷 2～3份；链霉素 1～2份；大庆霉素 0.5～1份； 中药提取物 1～2份。
7.发明人通过大量的实验研究表明，在上述组成的胎盘保存液中保存离体胎盘；可以使得胎盘中的胎盘间充质干细胞具有较高的存活率。
8.优选地，所述的胎盘保存液，其包含如下重量份的组分：pbs缓冲液100～120份；葡萄糖 4～5份；还原型谷胱苷肽 1～1.5份；腺苷 2～2.5份；链霉素 1～1.5份；大庆霉素 0.5～1份； 中药提取物 1～2份。
9.优选地，所述的中药提取物通过如下步骤的方法制备得到：
10.取中药麻黄和柴胡混合后用乙醇进行加热回流提取，提取结束后将提取液进行浓缩干燥得醇提物，即所述的中药提取物。
11.发明人在此需要说明的是，中药提取物的制备原料对于制备得到的中药提取物是否能有效地提高胎盘间充质干细胞的存活率起着决定性作用；在保存液中并不是随意加入中药提取物都能够提高胎盘间充质干细胞的存活率的。发明人通过大量实验表明，在胎盘保存液中加入由中药麻黄和柴胡为原料提取得到的中药提取物，可以有效地提高胎盘间充质干细胞的存活率。进一步研究表明：在胎盘保存液中加入由中药麻黄和柴胡为原料提取得到的中药提取物，其对胎盘间充质干细胞的存活率的提高程度远远高于加入单独以中药麻黄或柴胡其它中药为原料提取得到的中药提取物。
12.优选地，所述的乙醇选用的是体积分数为30％～50％的乙醇水溶液。
13.最优选地，所述的乙醇选用的是体积分数为40％的乙醇水溶液。
14.优选地，中药麻黄和柴胡的重量比为3～5:1。
15.最优选地，中药麻黄和柴胡的重量比为4:1。
16.优选地，中药麻黄和柴胡的总重量与乙醇的用量比为1g:10～20ml。
17.最优选地，中药麻黄和柴胡的总重量与乙醇的用量比为1g:15ml。
18.优选地，所述的加热回流提取是指在加热至乙醇沸腾的条件下进行回流提取1～2h。
19.进一步地，将醇提物上大孔树脂柱；先用体积分数为3％～5％的乙醇水溶液洗脱除杂；再用体积分数为16％～20％的乙醇水溶液洗脱，收集体积分数为16％～20％的乙醇水溶液洗脱下来的流份，浓缩干燥后即得所述的中药提取物。
20.优选地，先用2～4倍柱体积的体积分数为3％～5％的乙醇水溶液洗脱除杂；再用3～6倍柱体积的体积分数为16％～20％的乙醇水溶液洗脱，收集体积分数为16％～20％的乙醇水溶液洗脱下来的流份，浓缩干燥后即得所述的中药提取物。
21.发明人进一步研究表明：在保存液中加入由上述大孔树脂柱层析方法制备得到的中药提取物，其对胎盘间充质干细胞的存活率有着进一步地大幅提高。
22.本发明还提供一种胎盘的保存方法，其包含如下步骤：将新鲜采集的胎盘浸泡在上述胎盘保存液中，并于0～5℃下进行保存。
23.有益效果：本发明提供了一种全新组成的胎盘保存液，该胎盘保存液通过加入了由中药麻黄和柴胡为原料提取得到的中药提取物，其可以有效地提高胎盘间充质干细胞的存活率。
具体实施方式
24.以下结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。
25.以下实施例中的pbs缓冲液通过如下方法制备得到：称取8.0g nacl、0.2gkcl、1.44g na2hpo4、0.24g kh2po4溶于800ml蒸馏水中，用hcl调节溶液至7.4，最后加蒸馏水定容至1l即可得0.01m pbs缓冲液。
26.实施例1胎盘保存液的制备
27.原料重量份组成：pbs缓冲液 120份；葡萄糖 4份；还原型谷胱苷肽 1.5份；腺苷 2份；链霉素 1.5份；大庆霉素 0.5份； 中药提取物 1.5份；
28.所述的中药提取物通过如下方法制备得到：
29.取中药麻黄和柴胡混合后，加入体积分数为40％的乙醇水溶液，在加热至乙醇水溶液沸腾的条件下进行回流提取1.5h；提取结束后将提取液进行浓缩干燥，即得所述的中药提取物；
30.其中，中药麻黄和柴胡的重量比为4:1；中药麻黄和柴胡的总重量与乙醇水溶液的用量比为1g:15ml。
31.制备方法：将葡萄糖、还原型谷胱苷肽、腺苷、链霉素、大庆霉素以及中药提取物加入到pbs缓冲液中，搅拌均匀后即得所述的胎盘保存液。
32.实施例2胎盘保存液的制备
33.原料重量份组成：pbs缓冲液 150份；葡萄糖 5份；还原型谷胱苷肽 1份；腺苷 2.5份；链霉素 1份；大庆霉素 0.5份； 中药提取物 2份；
34.所述的中药提取物通过如下方法制备得到：
35.取中药麻黄和柴胡混合后，加入体积分数为30％的乙醇水溶液，在加热至乙醇水溶液沸腾的条件下进行回流提取1h；提取结束后将提取液进行浓缩干燥，即得所述的中药提取物；
36.其中，中药麻黄和柴胡的重量比为3:1；中药麻黄和柴胡的总重量与乙醇水溶液的用量比为1g:10ml。
37.制备方法：将葡萄糖、还原型谷胱苷肽、腺苷、链霉素、大庆霉素以及中药提取物加入到pbs缓冲液中，搅拌均匀后即得所述的胎盘保存液。
38.实施例3胎盘保存液的制备
39.原料重量份组成：pbs缓冲液 100份；葡萄糖 3份；还原型谷胱苷肽 1份；腺苷 2份；链霉素 1份；大庆霉素 0.5份； 中药提取物 1份；
40.所述的中药提取物通过如下方法制备得到：
41.取中药麻黄和柴胡混合后，加入体积分数为50％的乙醇水溶液，在加热至乙醇水溶液沸腾的条件下进行回流提取2h；提取结束后将提取液进行浓缩干燥，即得所述的中药提取物；
42.其中，中药麻黄和柴胡的重量比为5:1；中药麻黄和柴胡的总重量与乙醇水溶液的用量比为1g:20ml。
43.制备方法：将葡萄糖、还原型谷胱苷肽、腺苷、链霉素、大庆霉素以及中药提取物加入到pbs缓冲液中，搅拌均匀后即得所述的胎盘保存液。
44.实施例4胎盘保存液的制备
45.原料重量份组成：pbs缓冲液 120份；葡萄糖 4份；还原型谷胱苷肽 1.5份；腺苷 2份；链霉素 1.5份；大庆霉素 0.5份； 中药提取物 1.5份；
46.所述的中药提取物通过如下方法制备得到：
47.取中药麻黄和柴胡混合后，加入体积分数为40％的乙醇水溶液，在加热至乙醇水溶液沸腾的条件下进行回流提取1.5h；提取结束后将提取液进行浓缩干燥，即得醇提物；其中，中药麻黄和柴胡的重量比为4:1；中药麻黄和柴胡的总重量与乙醇水溶液的用量比为1g:15ml；
48.进一步将醇提物上大孔树脂柱(其中装填有型号为hp-20的大孔树脂；大孔树脂的重量用量为醇提物重量的30倍)；先用3倍柱体积的体积分数为4％的乙醇水溶液洗脱除杂；再用5倍柱体积的体积分数为18％的乙醇水溶液洗脱，收集体积分数为18％的乙醇水溶液洗脱下来的流份，浓缩干燥后即得所述的中药提取物。
49.制备方法：将葡萄糖、还原型谷胱苷肽、腺苷、链霉素、大庆霉素以及中药提取物加入到pbs缓冲液中，搅拌均匀后即得所述的胎盘保存液。
50.实施例4与实施例1的区别在于，所述的中药提取物进一步通过大孔树脂柱制备得到。
51.对比例1胎盘保存液的制备
52.原料重量份组成：pbs缓冲液 120份；葡萄糖 4份；还原型谷胱苷肽 1.5份；腺苷 2份；链霉素 1.5份；大庆霉素 0.5份；
53.制备方法：将葡萄糖、还原型谷胱苷肽、腺苷、链霉素以及大庆霉素加入到pbs缓冲液中，搅拌均匀后即得所述的胎盘保存液。
54.对比例1与实施例1的区别在于，对比例1所述的胎盘保存液中不加入中药提取物。
55.对比例2胎盘保存液的制备
56.原料重量份组成：pbs缓冲液 120份；葡萄糖 4份；还原型谷胱苷肽 1.5份；腺苷 2份；链霉素 1.5份；大庆霉素 0.5份； 中药提取物 1.5份；
57.所述的中药提取物通过如下方法制备得到：
58.取中药麻黄，加入体积分数为40％的乙醇水溶液，在加热至乙醇水溶液沸腾的条件下进行回流提取1.5h；提取结束后将提取液进行浓缩干燥，即得所述的中药提取物；
59.其中，中药麻黄与乙醇水溶液的用量比为1g:15ml。
60.制备方法：将葡萄糖、还原型谷胱苷肽、腺苷、链霉素、大庆霉素以及中药提取物加入到pbs缓冲液中，搅拌均匀后即得所述的胎盘保存液。
61.对比例2与实施例1的区别在于，中药提取物的制备原料不同；对比例2仅仅以中药麻黄为原料制备得中药提取物；而实施例1则是以中药麻黄和柴胡为原料制备中药提取物。
62.对比例3胎盘保存液的制备
63.原料重量份组成：pbs缓冲液 120份；葡萄糖 4份；还原型谷胱苷肽 1.5份；腺苷2份；链霉素1.5份；大庆霉素0.5份；中药提取物1.5份；
64.所述的中药提取物通过如下方法制备得到：
65.取中药柴胡，加入体积分数为40％的乙醇水溶液，在加热至乙醇水溶液沸腾的条件下进行回流提取1.5h；提取结束后将提取液进行浓缩干燥，即得所述的中药提取物；
66.其中，中药柴胡与乙醇水溶液的用量比为1g:15ml。
67.制备方法：将葡萄糖、还原型谷胱苷肽、腺苷、链霉素、大庆霉素以及中药提取物加入到pbs缓冲液中，搅拌均匀后即得所述的胎盘保存液。
68.对比例3与实施例1的区别在于，中药提取物的制备原料不同；对比例2仅仅以中药柴胡为原料制备得中药提取物；而实施例1则是以中药麻黄和柴胡为原料制备中药提取物。
69.对比例4胎盘保存液的制备
70.原料重量份组成：pbs缓冲液 120份；葡萄糖 4份；还原型谷胱苷肽 1.5份；腺苷 2份；链霉素 1.5份；大庆霉素 0.5份； 中药提取物 1.5份；
71.所述的中药提取物通过如下方法制备得到：
72.取中药麻黄和柴胡混合后，加入体积分数为40％的乙醇水溶液，在加热至乙醇水溶液沸腾的条件下进行回流提取1.5h；提取结束后将提取液进行浓缩干燥，即得醇提物；其中，中药麻黄和柴胡的重量比为4:1；中药麻黄和柴胡的总重量与乙醇水溶液的用量比为1g:15ml；
73.进一步将醇提物上大孔树脂柱(其中装填有型号为hp-20的大孔树脂；大孔树脂的重量用量为醇提物重量的30倍)；先用3倍柱体积的水洗脱除杂；再用5倍柱体积的体积分数为8％的乙醇水溶液洗脱，收集体积分数为8％的乙醇水溶液洗脱下来的流份，浓缩干燥后即得所述的中药提取物。
74.制备方法：将葡萄糖、还原型谷胱苷肽、腺苷、链霉素、大庆霉素以及中药提取物加入到pbs缓冲液中，搅拌均匀后即得所述的胎盘保存液。
75.对比例4与实施例4的区别在于，大孔树脂柱的洗脱条件不同；对比例4先用水洗脱除杂，再用体积分数为8％的乙醇水溶液洗脱；而实施例4则是先用体积分数为4％的乙醇水溶液洗脱除杂，再用体积分数为18％的乙醇水溶液洗脱。
76.对比例5胎盘保存液的制备
77.原料重量份组成：pbs缓冲液 120份；葡萄糖 4份；还原型谷胱苷肽 1.5份；腺苷 2份；链霉素 1.5份；大庆霉素 0.5份； 中药提取物 1.5份；
78.所述的中药提取物通过如下方法制备得到：
79.取中药麻黄和柴胡混合后，加入体积分数为40％的乙醇水溶液，在加热至乙醇水溶液沸腾的条件下进行回流提取1.5h；提取结束后将提取液进行浓缩干燥，即得醇提物；其中，中药麻黄和柴胡的重量比为4:1；中药麻黄和柴胡的总重量与乙醇水溶液的用量比为1g:15ml；
80.进一步将醇提物上大孔树脂柱(其中装填有型号为hp-20的大孔树脂；大孔树脂的重量用量为醇提物重量的30倍)；先用3倍柱体积的体积分数为20％的乙醇水溶液洗脱除杂；再用5倍柱体积的体积分数为40％的乙醇水溶液洗脱，收集体积分数为40％的乙醇水溶液洗脱下来的流份，浓缩干燥后即得所述的中药提取物。
81.制备方法：将葡萄糖、还原型谷胱苷肽、腺苷、链霉素、大庆霉素以及中药提取物加入到pbs缓冲液中，搅拌均匀后即得所述的胎盘保存液。
82.对比例5与实施例4的区别在于，大孔树脂柱的洗脱条件不同；对比例5先用体积分数为20％的乙醇水溶液洗脱除杂，再用体积分数为40％的乙醇水溶液洗脱；而实施例4则是先用体积分数为4％的乙醇水溶液洗脱除杂，再用体积分数为18％的乙醇水溶液洗脱。
83.实验例
84.将新鲜采集的胎盘分别放入装有实施例1～3以及对比例1～5制备得到的胎盘保存液的胎盘采集盒中浸泡，胎盘保存液的用量为浸没胎盘；并于4℃下进行保存7天；然后分离胎盘间充质干细胞。
85.将刚分离出来的胎盘干细胞，调整至密度为1
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106cells/ml的细胞悬液；然后加入0.4％的台盼蓝染色液，混合均匀；再取加入台盼蓝染色液的细胞悬液20μl，加入到细胞计数板中，用countstar细胞计数器进行细胞活率检测；细胞活率检测结果见表1。
86.表1.细胞活率检测结果
[0087] 细胞活率实施例1胎盘保存液80.32％实施例2胎盘保存液76.44％实施例3胎盘保存液72.18％实施例4胎盘保存液94.45％对比例1胎盘保存液46.18％对比例2胎盘保存液58.49％对比例3胎盘保存液55.37％对比例4胎盘保存液84.18％
对比例5胎盘保存液77.27％
[0088]
从表1细胞活率检测结果可以看出，将离体的胎盘保存在实施例1～4制备得到的胎盘保存液中7天后，其中的胎盘间充质干细胞的细胞活率均在72％以上；远远高于保存在对比例1不加入中药提取物的胎盘保存液中细胞活率。这说明：在胎盘保存液中加入由中药麻黄和柴胡为原料提取得到的中药提取物，可以大幅提高胎盘间充质干细胞的细胞活率。
[0089]
从表1细胞活率检测结果还可以看出，将离体的胎盘保存在实施例4制备得到的胎盘保存液中7天后，其中的胎盘间充质干细胞的细胞活率均达94.45％，与保存在实施例1制备得到的胎盘保存液中相比，有着进一步地大幅提高；这说明：中药提取物进一步经本发明所述的上述大孔树脂柱层析方法处理，可以进一步富集大量的有效成分，进一步大幅提高了胎盘间充质干细胞的细胞活率。
[0090]
从表1细胞活率检测结果还可以看出，将离体的胎盘保存在对比例2和3制备得到的胎盘保存液中7天后，其中的胎盘间充质干细胞的细胞活率与对比例1相比虽有提升，但是幅度不大；远远小于实施例1相对于对比例1的提升幅度。这说明：中药提取物的制备原料对于制备得到的中药提取物是否能有效地提高胎盘间充质干细胞的细胞活率起着决定性作用；在保存液中并不是随意加入中药提取物都能够大幅提高胎盘间充质干细胞的细胞活率的；在胎盘保存液中必须加入由中药麻黄和柴胡为原料提取得到的中药提取物，才能大幅提高胎盘间充质干细胞的细胞活率。
[0091]
从表1细胞活率检测结果还可以看出，将离体的胎盘保存在对比例4制备得到的胎盘保存液中7天后，其中的胎盘间充质干细胞的细胞活率与实施例1相比，提升得并不明显，其提升幅度远远小于实施例4；此外，将离体的胎盘保存在对比例5制备得到的胎盘保存液中7天后，其中的胎盘间充质干细胞的细胞活率与实施例1相比，还有所降低了；这说明：大孔树脂的洗脱条件对于能否制备得到具有更好的提高胎盘间充质干细胞的细胞活率的中药提取物起着决定性作用；只有在本发明所述的大孔树脂洗脱条件下(即先用体积分数为3％～5％的乙醇水溶液洗脱除杂；再用体积分数为16％～20％的乙醇水溶液洗脱，收集体积分数为16％～20％的乙醇水溶液洗脱下来的流份)制备得到的中药提取物才能进一步大幅提高胎盘间充质干细胞的细胞活率；而在其它大孔树脂洗脱条件下制备得到的中药提取物并不能进一步大幅提高胎盘间充质干细胞的细胞活率，甚至还降低了胎盘间充质干细胞的细胞活率。