一种酶标抗溶菌酶金抗体、检测溶菌酶酶联免疫试剂盒及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物检测技术领域，尤其是涉及一种酶标抗溶菌酶金抗体及检测溶菌酶酶联免疫试剂盒及其应用，应用于溶菌酶定量检测技术领域。


背景技术：

2.溶菌酶是一种具备很强杀菌能力的碱性酶，通过水解细菌细胞壁肽聚糖层中存在的n-乙酰基-d-葡萄糖胺和n-乙酰基尿酸残基之间的β-1,4键达到杀菌的效果。鸡蛋清溶菌酶(hen egg-white lysozyme，hewl)是目前研究和应用最广的一类溶菌酶，存在范围广，目前在食品、化妆品和医疗领域都有广泛应用。且鸡蛋清溶菌酶作为一种常见的食物过敏原，据统计，有1.6％的儿童对蛋制品过敏。
3.目前已有的测定溶菌酶的方法有高效液相色谱或液相色谱-质谱法等，这些方法均有所使用仪器价格昂贵、复杂，检测成本高等缺点，酶联免疫吸附测定法具有良好的灵敏度和准确性，且兼具检测成本相对较低的优点。但是，天然抗体所具有的稳定性差，成本高等缺点，一定程度上限制了酶联免疫吸附测定法的应用。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术问题，本发明的目的在于克服已有技术存在的不足，提供一种酶标抗溶菌酶金抗体、检测溶菌酶酶联免疫试剂盒及其应用，同时具有结合溶菌酶能力及具备辣根过氧化物酶特性的酶标抗溶菌酶金抗体，并且将其用于酶联免疫试剂盒以检测鸡蛋清溶菌酶含量，具有高灵敏度，特异性强，操作简便等优点。
5.为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
6.一种酶标抗溶菌酶金抗体，利用金纳米粒子结合多肽，形成抗溶菌酶金抗体，同时投加标记了巯基聚乙二醇(hs-peg)的辣根过氧化物酶(hrp)，通过一步法合成酶标抗溶菌酶金抗体。
7.优选地，将标记了巯基聚乙二醇(hs-peg)的辣根过氧化物酶(hrp)与多肽同时投加，使hrp-peg上的-sh基与金纳米粒子形成au-s键，在形成金抗体的同时，将金抗体结合hrp，形成酶标抗溶菌酶金抗体，hrp接在单个金纳米粒子上的数量为1-20个。应用于酶联免疫分析直接法中，酶标抗溶菌酶金抗体作为检测抗体，还具备了部分间接法的优势，即hrp-peg大致相当于间接法中的酶标二抗，且价格低于酶标二抗，既降低了生产成本，也避免了交叉反应。同时，单个酶标抗溶菌酶金抗体连接多个hrp可提高检测灵敏度。
8.优选地，将hs-peg-cooh与辣根过氧化物酶(hrp)通过edc-nhs反应，使peg上的羧基与hrp的氨基反应，形成hs-peg-hrp。
9.一种检测溶菌酶酶联免疫试剂盒，包括本发明述酶标抗溶菌酶金抗体、空白酶标板、溶菌酶标准品、稀释液、显色液、洗涤液和终止液。
10.优选地，使用酶标抗溶菌酶金抗体，以酶联免疫直接法对溶菌酶进行检测，具体方
法步骤为：
11.将溶菌酶预先包被在空白酶标板上，加入酶标抗溶菌酶金抗体，孵育设定时间后将溶菌酶和酶标抗溶菌酶金抗体两者结合后，通过加入辣根过氧化物酶的底物产生显色反应，反应设定时间后，加入终止液终止反应，并将酶标板放入多功能酶标仪进行检测，得到不同溶菌酶浓度对应的od
450nm
值，并做出标准曲线，确定待测溶菌酶样品浓度。
12.一种本发明检测溶菌酶酶联免疫试剂盒的应用，用于实施检测溶菌酶的方法，包括如下步骤：
13.(1)包被：在酶标板上每孔加入20-200μl不同浓度溶菌酶，采用碳酸盐缓冲溶液作为稀释液，并在4℃下静置过夜，洗板并拍干；
14.(2)封闭：每孔20-200μl的bsa，采用碳酸盐缓冲溶液或磷酸盐缓冲液作为稀释液，室温振荡0.5-2h，洗板并拍干；
15.(3)结合酶标金抗体:加入每孔20-200μl酶标抗溶菌酶金抗体，在室温振荡0.5-3h，洗板并拍干；
16.(4)显色反应:加入每孔20-200μl底物显色液，在避光静置反应5-20min后，加入终止液终止反应；
17.(5)检测分析:使用多功能酶标仪，测定每孔的信号值od
495nm
，分析检测结果，以x轴为溶菌酶浓度，y轴为495nm处的od值，绘制检测溶菌酶的标准曲线。
18.优选地，稀释液为ph为9-11的缓冲溶液。
19.优选地，底物显色液为四甲基联苯胺(tmb)或邻苯二胺(opd)。
20.优选地，终止液采用硫酸或盐酸，终止液的酸浓度不大于2m。
21.本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点：
22.1.本发明检测溶菌酶的酶联免疫试剂盒使用金抗体代替天然抗体用于检测，不仅避免了天然抗体稳定性差的缺点，而且酶标金抗体作为检测抗体，还具备了部分间接法的优势，即hrp-peg大致相当于间接法中的酶标二抗，且价格低于酶标二抗，既降低了生产成本，也避免了交叉反应；
23.2.本发明酶标抗溶菌酶金抗体特异性好，灵敏度高，可以进行结果准确的定量检测，操作简单，快捷，检测成本低等优点；
24.3.本发明采用酶链免疫分析法中的直接法原理，能对鸡蛋清中的溶菌酶进行定量检测；本发明试剂盒使用金抗体代替天然抗体进行检测，既降低了生产成本，也避免了交叉反应，且兼具酶联免疫试剂盒的其他优点。
附图说明
25.图1为本发明优选实施例酶标抗溶菌酶金抗体的示意图。
26.图2为本发明优选实施例检测溶菌酶的原理示意图。
27.图3为本发明优选实施例检测溶菌酶的标准曲线。
具体实施方式
28.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于
本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
29.本发明优选实施例使用了公开号为cn105884888a的专利文献公开的，根据cab-lys3的cdr3的多肽片段设计的pep1，通过s-au键嫁接到金纳米粒子上，制备出与天然抗体相同特异性的抗溶菌酶金抗体。在此基础上，如图1所示，将标记了巯基聚乙二醇的辣根过氧化物酶(hrp)与多肽同时投加，同样通过au-s键嫁接到金纳米粒子上，从而一步合成酶标抗溶菌酶金抗体。
30.本发明优选实施例使用上述酶标抗溶菌酶金抗体，按照酶联免疫分析法中的直接法原理对溶菌酶进行检测。如图2所示，其检测原理为：将不同浓度的溶菌酶预先包被在孔板上，如图2中的a部分，加入酶标金抗体并温育一段时间后，如图2中的b部分，由于孔板上溶菌酶的浓度不同，使得滞留在孔板上的酶标金抗体的数量也不相同，利用金抗体耦联的hrp与相对应的底物反应，如图2中的c部分，孔板上的吸光值od
495nm
与溶菌酶的浓度呈正相关，从而可以绘制出一条标准曲线。
31.本发明试剂盒，它包括：酶标抗溶菌酶金抗体、空白酶标板、溶菌酶标准品、稀释液、显色液、洗涤液和终止液。
32.本发明进行检测溶菌酶的步骤如下:
33.(1)包被：在酶标板上每孔加入20-200μl不同浓度溶菌酶，并在4℃静置过夜，洗板并拍干；
34.(2)封闭：每孔20-200μl bsa，室温振荡0.5-2h，洗板并拍干；
35.(3)每孔20-200μl酶标抗溶菌酶金抗体，室温振荡0.5-3h，洗板并拍干；
36.(4)每孔20-200μl现配底物opd，避光静置反应5-20min后，加入终止液终止反应；
37.(5)使用多功能酶标仪测定每孔的信号值od
495nm
，分析检测结果。
38.本发明优选实施例所述稀释液为ph 9-11的缓冲溶液,底物显色液为四甲基联苯胺(tmb)或邻苯二胺(opd),终止液使用硫酸或盐酸。
39.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
40.以下结合具体的实施例子对上述方案做进一步说明，本发明的优选实施例详述如下：
41.实施例一：
42.在本实施例中，一种聚乙二醇耦联辣根过氧化物酶的制备方法如下：
43.分别称取1.2mg hs-peg-cooh溶于6ml磷酸盐缓冲液中(40mm,ph 7.4)，称取10mg nhs溶于50μl超纯水中，称取10mg edc溶于50μl超纯水中，称取8mg hrp溶于2ml超纯水中。在4℃搅拌下，将30μl edc溶液滴加至5ml hs-peg-cooh溶液中，避光反应10min后，加入30μl nhs溶液避光反应30min，将2ml hrp溶液滴加至混合溶液中，避光反应过夜。反应完毕后使用截留分子量为10kda的超滤管，在10℃ 300g的条件下离心超滤除去未反应物，并用磷酸盐缓冲液(40mm ph 7.4)洗涤三次，将所得上清液进行冷冻干燥，得到最终产物即为hrp-peg-sh。
44.实施例二：
45.本实施例与实施例一基本相同，特别之处在于：
46.在本实施例中，酶标金抗体的构建，方法如下：
47.13nm金纳米粒子按如下方法合成：在500ml圆底烧瓶中加入240ml超纯水及25ml 39.47mm柠檬酸三钠溶液后置于120℃恒温油浴中.冷凝回流，反应20min后，迅速加入10ml25mm氯金酸溶液.均匀搅拌约5min后取出，自然冷却至室温，即得13nm金纳米粒子。
48.金纳米粒子耦联多肽及辣根过氧化物酶：将合成好的金纳米粒子使用0.22μm的滤膜过滤后，取6ml金纳米粒子溶液加入到装有15
×
8mm的菱形聚四氟磁力搅拌子的10ml玻璃瓶中，放在多位点磁力搅拌器上以650rpm的转速下均匀搅拌，确保全过程无气泡产生。搅拌稳定后，加入10μl 0.2m的柠檬酸三钠溶液，将1ml多肽溶液(含有2mm naoh)逐滴加入正在搅拌的溶液中，在室温下持续搅拌1h。将1ml标记了hs-peg(5k)的辣根过氧化物酶溶液逐滴加入正在搅拌的溶液中，持续搅拌1h。制备所得的酶标金抗体存放于4℃冰箱备用。
49.实施例三：
50.本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：
51.在本实施例中，绘制溶菌酶标准曲线：
52.将溶菌酶标准品使用稀释液稀释，稀释液采用20mm ph 10.7碳酸盐缓冲溶液，最终浓度为32，16，8，4，2，1，0.5μg/ml，然后按以下步骤开始检测：
53.1)包被:每孔100μl不同浓度溶菌酶，稀释液采用20mm ph 10.7碳酸盐缓冲溶液，4℃静置过夜，洗板并拍干，重复4次，每次洗板洗液停留30s；
54.2)封闭:每孔200μl 5％bsa，稀释液采用20mm ph 7.4碳酸盐缓冲溶液，室温振荡1h，洗板并拍干，重复4次，每次洗板洗液停留30s；
55.3)结合酶标金抗体:每孔100μl相应检测抗体，室温振荡2h，洗板并拍干，重复4次，每次洗板洗液停留30s)；
56.4)显色反应:每孔100μl现配底物opd，避光静置反应15min后每孔100μl 2m的h2so4终止反应；
57.5)检测分析:多功能酶标仪测定每孔的信号值，以x轴为溶菌酶浓度，y轴为495nm处的od值，绘制检测溶菌酶的标准曲线，图3即为得到的检测溶菌酶标准曲线。
58.实施例四：
59.本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：
60.在本实施例中，复杂环境中检测溶菌酶，方法如下：
61.为检验酶标金抗体elisa法在复杂溶液条件中检测溶菌酶的效果，选择与hewl性质相似的带正电的rnase a和血液中大量存在的带负电的白蛋白(bsa)作为代表性杂蛋白.先分别配置hewl、rnase a和bsa纯溶液，并通过测定吸收度确定三者各自的浓度.然后按一定比例混合得到加标样品.最终样品中hewl的浓度分别为1.5μg
·
ml-1
，4.6μg
·
ml-1
及10μg
·
ml-1
，对应的rnase a浓度为hewl浓度的10倍即15μg
·
ml-1
，46μg
·
ml-1
及100μg
·
ml-1
，对应的bsa设置为hewl浓度的100倍即150μg
·
ml-1
，460μg
·
ml-1
及1000μg
·
ml-1
.将三个样品分别以传统直接法和酶标金抗体直接法来进行加标回收测定，分析测定值及加标回收率。表1为检测结果，酶标金抗体检测的三个样品，其回收率均在90％-110％以内，符合检测标准，且其准确度高于传统elisa直接法。
62.表1.酶标金抗体elisa和传统直接法elisa对不同溶菌酶加标样品的回收率
[0063][0064]
实施例五：
[0065]
本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：
[0066]
在本实施例中，检测鸡蛋清中的溶菌酶，方法如下：
[0067]
将新鲜鸡蛋中的蛋清人工分离，使用稀释液，稀释液采用20mm ph 10.7碳酸盐缓冲溶液，将鸡蛋清稀释500和1000倍，并按照实施例3中检测溶菌酶的步骤对稀释后的样品进行检测，检测所得od值代入标准曲线即可得检测值，其与稀释倍数的乘积为蛋清中溶菌酶的含量。与此同时，使用传统酶联免疫直接法试剂盒对鸡蛋清中的溶菌酶进行检测。检测结果如表2所示，酶标金抗体elisa法对不同稀释倍数的样品检测结果的一致性要优于传统elisa直接法检测结果。
[0068]
表2.酶标金抗体elisa和传统直接法elisa对蛋清中溶菌酶的检测结果
[0069][0070]
上述实施例酶标抗溶菌酶金抗体及检测溶菌酶酶联免疫试剂盒及其应用。该酶标抗溶菌酶金抗体同时具有结合溶菌酶能力及辣根过氧化物酶的特性，并将其应用于酶联免疫中检测鸡蛋清溶菌酶。该酶联免疫试剂盒包括：酶标抗溶菌酶金抗体、酶标板、溶菌酶标准品、标准品稀释液、包被有溶菌酶特异性抗体的酶标板、显色液、样品稀释液、洗涤液和终
止液。本发明还公开了利用该试剂盒进行样品检测的方法。上述实施例试剂盒采用酶链免疫分析法中的直接法原理，能对鸡蛋清中的溶菌酶进行定量检测。上述实施例试剂盒使用金抗体代替天然抗体进行检测，既降低了生产成本，也避免了交叉反应，且兼具酶联免疫试剂盒的其他优点
[0071]
上面结合附图对本发明实施例进行了说明，但本发明不限于上述实施例，还可以根据本发明的发明创造的目的做出多种变化，凡依据本发明技术方案的精神实质和原理下做的改变、修饰、替代、组合或简化，均应为等效的置换方式，只要符合本发明的发明目的，只要不背离本发明的技术原理和发明构思，都属于本发明的保护范围。