一种化妆品或其原料中添加物的检测方法与流程

1.本发明属于检测技术领域，具体涉及一种化妆品或其原料中添加物的检测方法。


背景技术：

2.随着化妆品配方的研制开发和工艺的不断进步，各种功能性化妆品和原料应用普遍，产品中的配伍降解产物及残留物质的引入等，都是影响产品安全性的因素。视黄醇类物质是近年来新兴的祛痘及抗皱原料，包括视黄醇、视黄酸、视黄醛及视黄酯等，这类物质能够改善上皮细胞异常角化和皮脂排泄，临床作为祛痘和抗皱用药。虽然视黄醇是人体必需的活性物质，且在体内会转化为视黄酸，但过量摄入有肝肿大、钙流失、致畸等危害。视黄酸和异视黄酸刺激性强，且有致畸性和胚胎毒性，只能作为处方用药，是化妆品中的禁用成分。有研究显示，这些衍生物只有在体内转化为视黄酸后才能起到改善衰老的作用，在可预见的使用环境下，视黄醇类物质与化妆品其他基质原料相互作用，会转化为视黄酸或其他未知化合物，这类原料的风险评估，将重点考察转化产物对毒性结果的影响。
3.视黄醇、视黄醛和视黄酯类是化妆品中祛皱、抗衰老的常用成分，在《已使用化妆品原料名称目录》中，收录有8种视黄醇类物质。文献报道的维生素a类衍生物的检测方法主要针对食品，化妆品中检测方法仅包含维甲酸和视黄醇等极个别衍生物的检测方法。


技术实现要素：

4.为了克服上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种化妆品或其原料中添加物的检测方法。
5.为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：一种化妆品或其原料中添加物的检测方法，包括以下步骤：采用高效液相色谱法对化妆品或化妆品原料的待测液进行检测，所述添加物包含视黄酸、异视黄酸、羟基频哪酮视黄酸酯、视黄醛、视黄醇乙酸酯、视黄醇棕榈酸酯、视黄醇、视黄醇丙酸酯、视黄醇视黄酸酯中的至少一种。
6.优选地，所述添加物包含视黄酸、异视黄酸、羟基频哪酮视黄酸酯、视黄醛、视黄醇乙酸酯、视黄醇棕榈酸酯、视黄醇、视黄醇丙酸酯、视黄醇视黄酸酯。
7.优选地，所述色谱条件为：色谱柱为：c18色谱柱；进样量为：4～6μl；流速为：0.8～1.2ml/min；流动相为：流动相a为乙腈；流动相b为四氢呋喃；流动相c为乙酸铵溶液，采用梯度洗脱的方式进行洗脱。
8.优选地，所述进样量为：4.5～5.5μl；进一步优选地，所述进样量为：5μl。
9.优选地，所述流速为：1～1.2ml/min；进一步优选地，所述流速为：1ml/min；
10.优选地，所述梯度洗脱的洗脱程序为：
11.0min，流动相a的体积百分比为35％，流动相b的体积百分比为35％，流动相c的体积百分比为30％；
12.4～20min，流动相a的体积百分比为38％，流动相b的体积百分比为38％，流动相c的体积百分比为24％；
13.21～41min，流动相a的体积百分比为45％，流动相b的体积百分比为45％，流动相c的体积百分比为10％；
14.41.01～46min，流动相a的体积百分比为35％，流动相b的体积百分比为35％，流动相c的体积百分比为30％。
15.优选地，所述流动相c的浓度为4～6mmol/l；进一步优选地，所述流动相c的浓度为5mmol/l。
16.优选地，所述流动相的ph值为6～7；进一步优选地，所述流动相的ph值为6.5～7；再进一步优选地，所述流动相的ph值为6.5。
17.优选地，所述c18色谱柱的直径为4～5mm，长度为200～300mm，填料粒径为4～6μm。
18.优选地，所述c18色谱柱为：titank c18(250
×
4.6mm，5μm)或zorbax eclispse plus c18(250
×
4.6mm，5μm)。
19.优选地，所述c18色谱柱的柱温为：24～36℃；进一步优选地，所述c18色谱柱的柱温为：25～30℃；再进一步优选地，所述c18色谱柱的柱温为：30℃。
20.优选地，所述化妆品或化妆品原料的待测液包括样品溶液；所述样品溶液是由化妆品或化妆品原料的样品与提取溶剂混合提取得到；所述提取溶剂为甲醇、乙腈、异丙醇、四氢呋喃中的至少一种。
21.优选地，所述混合提取是采用涡旋混合，采用超声提取。
22.优选地，所述涡旋混合时间为24～36s；进一步优选地，所述涡旋混合时间为25～30s。
23.优选地，所述超声提取时间为12～18min；进一步优选地，所述超声提取时间为15～18min。
24.优选地，所述样品溶液在检测前进行过滤。
25.优选地，所述过滤采用0.30～0.65μm的滤膜过滤；进一步优选地，所述过滤采用0.45μm的滤膜过滤。
26.优选地，所述提取溶剂为乙腈和四氢呋喃的混合液，所述混合液中乙腈和四氢呋喃的体积比为(3～5):1；进一步优选地，所述提取溶剂为乙腈和四氢呋喃的混合液，所述混合液中乙腈和四氢呋喃的体积比为(3.5～4.5):1；再进一步优选地，所述提取溶剂为乙腈和四氢呋喃的混合液，所述混合液中乙腈和四氢呋喃的体积比为4:1。
27.优选地，所述色谱的检测器为pda检测器，检测波长为：325nm。
28.优选地，所述待测液还包括标准工作液。
29.优选地，所述标准工作液采用以下方法进行配制：将标准品使用甲醇配制成质量浓度为1000mg/l的标准储备溶液，然后稀释成3种以上不同质量浓度的标准工作液；进一步优选地，所述标准工作液采用以下方法进行配制：将标准品使用甲醇配制成质量浓度为1000mg/l的标准储备溶液，然后稀释成5种以上不同质量浓度的标准工作液；再进一步优选地，所述标准工作液采用以下方法进行配制：将标准品使用甲醇配制成质量浓度为1000mg/l的标准储备溶液，然后稀释成0.5mg/l、5mg/l、10mg/l、20mg/l、50mg/l、100mg/l共6种不同质量浓度的标准工作液。所述标准品为视黄酸、异视黄酸、羟基频哪酮视黄酸酯、视黄醛、视黄醇乙酸酯、视黄醇棕榈酸酯、视黄醇、视黄醇丙酸酯、视黄醇视黄酸酯的标准品。
30.本发明的有益效果是：本发明中的检测方法首次建立了化妆品或其原料中视黄
酸、异视黄酸、视黄醇、视黄醛、视黄醇乙酸酯、羟基频哪酮视黄酸酯、视黄醇丙酸酯、视黄醇视黄酸酯、视黄醇棕榈酸酯等9种视黄醇类物质的高效液相色谱检测法，检测范围涵盖化妆品及其使用原料目录中的7种视黄醇类物质(视黄醇、视黄醛、视黄醇乙酸酯、羟基频哪酮视黄酸酯、视黄醇丙酸酯、视黄醇视黄酸酯、视黄醇棕榈酸酯)与其两种降解产物(视黄酸、异视黄酸)，检测方法准确，稳定性高。
31.本发明中的检测方法在对9种视黄醇相关组分检测时，在0.5-100mg/l范围内线性良好，相关系数大于0.99，检出浓度为0.4mg/kg(s/n＝3)。空白基质加标回收率为85.3％-116.1％，相对标准偏差0.7％-9.8％，可以为监测视黄醇类原料的的降解情况、原料的稳定性研究和风险评价提供技术支撑。
附图说明
32.图1为9种视黄醇类物质混合标准工作液的液相色谱图；
33.图2为9种视黄醇类物质在异丙醇体系中的液相色谱图；
34.图3为9种视黄醇类物质在四氢呋喃体系中的液相色谱图；
35.图4为9种视黄醇类物质在不同ph条件下的液相色谱图；
36.图5为9种视黄醇类物质在不同柱温条件下的液相色谱图；
37.图6为9种视黄醇类物质的加标样品的液相色谱图。
具体实施方式
38.以下结合附图和实例对本发明的具体实施作进一步详细说明，但本发明的实施和保护不限于此。需要指出的是，以下若为有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。
39.实施例1
40.仪器与试剂
41.采用的仪器为：agilent 1260infinity高效液相色谱仪，配有g1329b自动进样器、g1316a柱温箱、g1315c二极管阵列检测器；elma s300h超声波清洗器；ikalabdancer型涡旋混合器；millipore milli q reference型超纯水发生器，mettler msdu电子天平(1/100000)。
42.采用的试剂为：视黄酸(99.90％，中国药品生物制品检定研究院)；异视黄酸(99.80％，中国药品生物制品检定研究院)；羟基频哪酮视黄酸酯(99.00％，麦克林)；视黄醛(98.17％，aladin)；视黄醇乙酸酯(98.80％，bepure)；视黄醇棕榈酸酯(97.60％，bepure)；视黄醇(99.30％，坛墨质检)；视黄醇丙酸酯(90.00％，trc)；视黄醇视黄酸酯(98.46％，麦克林)；乙酸铵(分析纯)；乙腈、四氢呋喃(均为色谱纯)；实验用水为一级纯化水。
43.本例中的化妆品或其原料中添加物的测试方法包括以下步骤：
44.(1)配制标准工作液
45.分别称取9种视黄醇类物质(视黄酸、异视黄酸、羟基频哪酮视黄酸酯、视黄醛、视黄醇乙酸酯、视黄醇棕榈酸酯、视黄醇、视黄醇丙酸酯、视黄醇视黄酸酯)的标准品各10mg
(精确至0.1mg)于10ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容(其中：视黄醇棕榈酸酯、视黄醇丙酸酯和视黄醇视黄酸酯需要先加入适量的异丙醇，使标准品溶解后，再加甲醇定容)，配成质量体积为1000mg/l的标准储备溶液。取适量的标准储备溶液，用甲醇稀释成质量浓度为5mg/l、10mg/l、20mg/l、50mg/l、100mg/l共5种不同质量浓度的标准工作液，4℃避光保存。
46.(2)样品前处理
47.取1g膏状样品(精确到0.001g)于10ml具塞比色管中，加乙腈：四氢呋喃(体积比80:20)至刻度，涡旋30s，使样品与提取溶剂充分混匀，超声提取15min，放至室温，经0.45μm滤膜过滤，滤液作为待测溶液。乳状样品、霜状样品的前处理步骤同膏状样品。水剂样品可以直接用甲醇提取。
48.(3)使用高效液相色谱仪进行测试
49.色谱测试条件为：色谱柱：c18，250mm*4.6mm，5μm；柱温：30℃；进样量：5μl；流速：1.0ml/min；检测波长：325nm；流动相a：乙腈；流动相b：四氢呋喃；流动相c：5mmol/l乙酸铵溶液，洗脱方式为梯度洗脱，具体洗脱程序见表1:
50.表1梯度洗脱程序
51.时间(min)流动相a(％)流动相b(％)流动相c(％)0353530438382420383824214545104145451041.0135353046353530
52.按照上述梯度洗脱程序进行洗脱，得到9种视黄醇类物质的混合标准工作液的液相色谱图，具体见图1，从图1中可以看出：色谱峰a1为视黄酸(5.240min)；色谱峰a2为异视黄酸(5.981min)；色谱峰a7为视黄醇(8.145min)；色谱峰a5为视黄醇乙酸酯(14.425min)；色谱峰a4为视黄醛(15.105min)；色谱峰a3为羟基频哪酮视黄酸酯(16.209min)；色谱峰a8为视黄醇丙酸酯(17.659min)；色谱峰a9为视黄醇视黄酸酯(32.545min)；色谱峰a6为视黄醇棕榈酸酯(35.452min)。
53.检测条件优化：
54.1、色谱条件的选择
55.色谱柱的选择：
56.c18色谱柱适用于非极性、弱极性和中等极性化合物分析，适用于分析分子量较小化合物。因此，本发明选择常规的c18色谱柱进行分离，分别考察了titank c18(250
×
4.6mm，5μm，菲罗门)和zorbax eclispse plus c18(250
×
4.6mm，5μm，安捷伦)两种品牌的c18色谱柱，结果显示，在同一色谱条件下，9种视黄醇类物质在两种c18色谱柱上均可得到良好的分离效果和色谱峰形，均能满足系统适应性要求，本发明实施例中选择zorbax eclispse plus c18作为分析色谱柱。
57.流动相的选择：
58.反相高效色谱中以水作为流动相主体，以甲醇、乙腈、四氢呋喃、异丙醇作为改性
剂。其中乙腈洗脱能力强，黏度低，同等条件下柱背压低于甲醇，在短波长上吸收和干扰均较甲醇低。因此，本发明采用乙腈作为三元流动相的组成之一。
59.本发明分别考察了乙腈-异丙醇-水、乙腈-四氢呋喃-水、乙腈-异丙醇-乙酸铵、乙腈-四氢呋喃-乙酸铵、乙腈-四氢呋喃-甲酸铵、乙腈-四氢呋喃-磷酸二氢钾、乙腈-四氢呋喃-磷酸二氢钠，共7种流动相体系对9种视黄醇类物质色谱行为的影响，具体结果见图2和图3所示，图2为9种视黄醇类物质在异丙醇体系中的液相色谱图，其中，图2(a)为9种视黄醇类物质在乙腈-异丙醇-水体系中的液相色谱图；图2(b)为9种视黄醇类物质在乙腈-异丙醇-乙酸铵体系中的液相色谱图。从图2(a)和图2(b)中可以看出：在异丙醇体系中，视黄醛和视黄醇乙酸酯、羟基频哪酮视黄酸酯未能有效分离，色谱峰形差。图3为9种视黄醇类物质在四氢呋喃体系中的液相色谱图；其中，图3(a)为9种视黄醇类物质在乙腈-四氢呋喃-水体系中的液相色谱图；图3(b)为9种视黄醇类物质在乙腈-四氢呋喃-乙酸铵体系中的液相色谱图；图3(c)为9种视黄醇类物质在乙腈-四氢呋喃-磷酸二氢钠体系中的液相色谱图；图3(d)为9种视黄醇类物质在乙腈-四氢呋喃-磷酸二氢钾体系中的液相色谱图；图3(e)为9种视黄醇类物质在乙腈-四氢呋喃-甲酸铵体系中的液相色谱图。从图3中可以看出，在四氢呋喃体系中，磷酸二氢钾或磷酸二氢钠为缓冲溶液时，均出现视黄酸与异视黄酸未能有效分离。乙酸铵为缓冲溶液时，各组分的分离效果、峰形均优于甲酸铵和水。最终选择乙腈-四氢呋喃-乙酸铵作为流动相体系，采用梯度洗脱程序进行洗脱。
60.缓冲溶液ph值的选择：
61.在反相高效液相色谱法中，调整流动相的ph值，可以抑制化合物的解离，减少拖尾，改善峰形，提高分离的选择性。本发明考察了缓冲溶液ph值为4.5、5.5、6.5、7.5和8.5时，对各组分色谱行为的影响，具体结果见图4所示，其中：图4(a)为9种视黄醇类物质在ph为4.5条件下的液相色谱图；图4(b)为9种视黄醇类物质在ph为5.5条件下的液相色谱图；图4(c)为9种视黄醇类物质在ph为6.5条件下的液相色谱图；图4(d)为9种视黄醇类物质在ph为7.5条件下的液相色谱图；图4(e)为9种视黄醇类物质在ph为8.5条件下的液相色谱图。从图4中可以看出，ph值为4.5时，视黄酸、异视黄酸和视黄醇三种物质未能有效分离。而其他ph值条件下，9种视黄醇类物质均未出现明显差异。综合考虑色谱柱的适用条件、视黄醇类物质的性能以及缓冲盐的pka值，最终选择缓冲溶液的ph值为6.5。
62.柱温的选择：
63.一般而言，在色谱分析过程中，色谱柱温可以影响流动相中的化合物与固定相的结合与分离。在色谱柱允许范围内，色谱柱填料的活性会随着柱温的增加而增强，化合物的洗脱能力增强，化合物的保留时间缩短。因此，本发明分别考察了不同柱温(25℃、30℃、35℃、40℃)对9种视黄醇类物质色谱行为的影响，具体结果见图5所示，其中，图5(a)为9种视黄醇类物质在柱温为25℃条件下的液相色谱图；图5(b)为9种视黄醇类物质在柱温为30℃条件下的液相色谱图；图5(c)为9种视黄醇类物质在柱温为35℃条件下的液相色谱图；图5(d)为9种视黄醇类物质在柱温为40℃条件下的液相色谱图。从图5中可以看出，在25℃、35℃和40℃时，视黄酸和异视黄酸的相对保留时间均较30℃时前移；其余7个组分的相对保留时间均随柱温的增加而前移，因此，本发明最终选择柱温为30℃。
64.2、样品提取溶液的选择
65.本发明选取了膏霜、水剂样品，分别考察了甲醇、乙腈、甲醇：四氢呋喃(80：20)、乙
腈：四氢呋喃(80：20)四种提取溶剂的提取效果。试验结果显示：膏霜类样品在甲醇或乙腈中提取效果差；在乙腈：四氢呋喃(80：20)中分散效果好，提取效果良好。水剂类样品在上述四种提取溶剂均获得较好的提取效果。
66.3、线性方程、方法检出限和定量限
67.取9种视黄醇类物质(视黄酸、异视黄酸、羟基频哪酮视黄酸酯、视黄醛、视黄醇乙酸酯、视黄醇棕榈酸酯、视黄醇、视黄醇丙酸酯、视黄醇视黄酸酯)的不同浓度梯度的标准工作液，具体浓度梯度为：0.5mg/l、5mg/l、10mg/l、20mg/l、50mg/l、100mg/l，按照本发明实施例中的测试条件进行测试，以峰面积对其质量浓度进行线性回归，以3倍信噪比(s/n)计算检出限(lod)，以10倍信噪比(s/n)计算定量限(loq)。9种视黄醇类物质的方法检出限为0.4mg/kg，方法定量限为1mg/kg，在0.5mg/l～100mg/l线性范围内，相关系数大于0.99，表明9种视黄醇类物质均具有良好的线性关系。9种视黄醇类物质的线性回归方程、相关系数、方法检出浓度如表2所示。
68.表2 9种视黄醇类物质的线性回归方程、相关系数和方法检出浓度
[0069][0070][0071]
4、方法精密度和回收率
[0072]
选取膏霜、水剂两种化妆品常见剂型的阴性样品进行回收率和精密度试验。添加浓度分别为500mg/kg和100mg/kg，对样品进行前处理，每种基质类型平行配制6份，按照实施例中的测试条件进行测试并记录色谱图，计算9种视黄醇类物质的回收率和精密度，具体测试结果如图6和表3所示，结果表明，精密度结果为0.1％～1.4％；方法回收率为85.3％～116.1％，相对标准偏差为0.7％～9.8％，能够满足检测要求。
[0073]
表3回收率和精密度测定结果
[0074][0075]
6、稳定性试验：
[0076]
取高低2个水平质量浓度(5mg/l和100mg/l)的标准工作液，按本发明实施例中的测试条件分别在0、8、12、18、24、48h时测定9种视黄醇类物质的色谱峰面积，其中，24h内的rsd作为日内稳定性，48h内的rsd作为日间稳定性，测试结果具体见表6。
[0077]
表6标准工作液稳定性试验结果
[0078][0079]
由上表6可以看出：9种视黄醇类物质在48h内均稳定，进而表明本发明中的检测方法稳定性和可重复性高。
[0080]
上面对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。