用于诊断和分期结直肠癌的生物标记物的制作方法

1.本发明涉及肿瘤学领域。具体而言，本发明涉及结直肠癌的生物标记物及其用于诊断或分期结直肠癌的用途。


背景技术：

2.结直肠癌(colorectal cancer,crc)的发病率在全球位居全部恶性肿瘤的第三位，年新发病例数超过135万人。在我国，结直肠癌的发病率自2000年开始至2011年持续上升，2015年新增病例37.6万人，死亡19.1万人。目前结直肠癌筛查的主要方法包括粪便潜血测试、肠镜检查、ct成像等，但有些方法在经济和医疗条件较差的地区无法应用。肠镜是一种高敏感性的方法，但依赖于检查者的水平、花费较高，患者也承受一定的风险。结直肠癌通常会转移到多个器官，就诊时，超过25％的患者会出现肝转移(同时转移)，其余25-30％的患者在接下来的2-3年内也会出现肝转移(异时转移)。结直肠癌患者生存期主要由肝部转移灶进程决定，而非原发灶。在不经过治疗的情况下，结直肠癌肝转移患者生存期少于1年。肝部肿瘤会增加右上腹或整个腹部的疼痛，此外，还会使体重下降和代谢紊乱加重。随着疾病的进程，会出现肝腹水、黄疸、门脉高压等症状，预示着不良预后。目前对结直肠癌肝转移的诊断方法主要依赖于肝脏超声和ct检查。但这两种方法对于长期监测结直肠癌肝转移花费较高，且需要频繁进出医院。
3.综上所述，目前临床上缺乏有效监测结直肠癌以及结肠癌肝转移的生物标志物。


技术实现要素：

4.本技术的发明人经过大量实验和反复摸索，出人意料地发现了用于诊断和分期结直肠癌的生物标记物，该生物标记物可灵敏、准确地诊断结直肠癌并且区分未转移和转移性结直肠癌，由此完成了本发明。
5.用于诊断结直肠癌的生物标记物
6.本发明第一方面提供了用于确定受试者是否患有或有风险患有结直肠癌(crc)的方法，其包括：
7.(1)检测来自受试者的液体样品中生物标记物的水平，所述生物标记物选自coro1c、aprc5、rad23b、bhmt、dcp1b、tpm3、cald1、atp5f1a中的一种或多种(例如1种，2种，3种，4种，5种，6种，7种或全部8种)；
8.(2)将所述水平与参考值比较。
9.在某些实施方案中，所述生物标记物包含选自coro1c、aprc5、rad23b中的一种或多种(例如1种，2种或全部3种)。
10.在某些实施方案中，所述生物标记物包含coro1c、aprc5和rad23b。
11.在某些实施方案中，所述生物标记物还可以包含选自bhmt、dcp1b、tpm3、cald1、atp5f1a中的一种或多种(例如1种，2种，3种，4种，或全部5种)。
12.应理解步骤(1)和(2)中所述的“水平”包括所述生物标记物的绝对量、相对量或浓
度以及与其相关或可以从其衍生的任何值或参数。
13.应理解步骤(2)中所述的“比较”通常指对应参数或值的比较，例如将绝对量与绝对参考量比较，而将浓度与参考浓度比较，或者将获自样品中生物标志物的强度信号与获自参考样品的相同类型的强度信号比较。比较可以手动或计算机辅助进行。获自个体或患者的样品中生物标志物的测量的或检测的水平和参考水平的值可以例如彼此比较，并且所述比较可以通过执行用于比较的算法的计算机程序自动进行。
14.应理解步骤(2)中所述的“参考值”指允许区分处于患有结直肠癌风险中或不处于这样的风险中的对象的值，例如允许区分健康对照和结直肠癌患者的值。参考值可以是预先测定的，并设定以满足在例如特异性和/或灵敏性方面的常规要求。
15.基于本发明中给出的教导，获得这样的参考值在本领域普通技术人员的能力范围内。例如，可以对代表性群体测定本发明所述的生物标记物的水平，并通过合适的统计学方法(例如中值、平均值、分位数、pls-da、逻辑回归方法、随机森林分类或者其他给出阈值的方法)计算参考值。阈值应当考虑诊断和预后测试的灵敏性和特异性的希望的临床设定。在一个实施方案中，参考值可以在患有结直肠癌的患者的一种或多种参考样品中测定。在另一个实施方案中，参考值可以在来自不处于结直肠癌风险中的受试者(例如健康对照)的一种或多种参考样品中测定。
16.在某些实施方案中，所述参考值代表未患结直肠癌的健康人群的体液样品中该生物标记物的水平。在某些实施方案中，如果步骤(1)中测定的水平高于参考值的话，则判断所述受试者患有结直肠癌或处于患有结直肠癌的风险中。
17.在一些实施方案中，通过免疫学检测来测定所述生物标记物的水平。在某些实施方案中，所述免疫学检测选自elisa、elispot、蛋白斑点印迹(dot blot)或蛋白质印迹(western blot)。
18.在某些实施方案中，所述免疫学检测包括使用能够特异性结合所述生物标记物的一级抗体。
19.在某些实施方案中，所述一级抗体带有可检测的标记。
20.在某些实施方案中，所述免疫学检测还包含使用对所述一级抗体特异性的二级抗体，所述二级抗体带有可检测的标记。
21.在本文中，所述二级抗体对一级抗体所来自的物种(例如小鼠、大鼠、羊、兔等)的抗体是特异的。在某些实施方案中，所述二级抗体选自抗免疫球蛋白抗体，例如抗igg抗体、抗igm抗体或抗iga抗体。
22.在某些实施方案中，所述可检测的标记选自酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)、荧光染料或生物素。
23.在另一些实施方案中，通过质谱法来测定所述生物标记物的水平。
24.在某些实施方案中，所述结直肠癌包括未转移的结直肠癌(非转移性结直肠癌)或者转移性结直肠癌。在某些实施方案中，所述转移性结直肠癌包括淋巴结转移。在某些实施方案中，所述转移性结直肠癌包括远处转移，例如肝转移。
25.在某些实施方案中，所述体液样品选自血液、血清、血浆、尿液和唾液。在某些实施方案中，所述体液样品是尿液。
26.在某些实施方案中，所述受试者是人。
27.本发明另一方面涉及能够检测生物标记物的试剂在制备用于确定受试者是否患有或有风险患有结直肠癌(crc)的试剂盒中的用途，所述生物标记物如第一方面的任一实施方案中定义。
28.在某些实施方案中，所述试剂通过免疫学检测来测定所述生物标记物的水平。在某些实施方案中，所述免疫学检测选自elisa、elispot、蛋白斑点印迹(dot blot)或蛋白质印迹(western blot)。
29.在某些实施方案中，所述试剂包含能够特异性结合所述生物标记物的一级抗体。
30.在某些实施方案中，所述一级抗体带有可检测的标记。
31.在某些实施方案中，所述试剂还包含对所述一级抗体特异性的二级抗体，所述二级抗体带有可检测的标记。
32.在某些实施方案中，所述可检测的标记选自酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)、荧光染料或生物素。
33.在某些实施方案中，所述试剂通过质谱法来测定所述生物标记物的水平。
34.在某些实施方案中，所述试剂盒还包括一种或多种选自下列的试剂或装置：(i)用于收集或贮存来自受试者的体液样品(例如尿)的装置；(ii)用于进行所述测定(例如免疫学检测或质谱法)所需的其他试剂(例如缓冲液，稀释液，洗脱液，封闭液，和/或标准品)。
35.在某些实施方案中，所述试剂盒通过第一方面中所述的方法来确定受试者是否患有或有风险患有结直肠癌(crc)。
36.本发明另一方面提供了一种生物标记物组合，其包括选自coro1c、aprc5和rad23b中的至少两种。在某些实施方案中，所述生物标记物组合包含coro1c、aprc5和rad23b。在某些实施方案中，所述生物标记物组合还可以包含选自bhmt、dcp1b、tpm3、cald1、atp5f1a中的一种或多种(例如1种，2种，3种，4种，或全部5种)。
37.本发明另一方面提供了一种试剂盒，其包含如上所述的生物标记物组合，和/或能够检测所述生物标记物组合中的每种生物标记物的试剂。
38.在某些实施方案中，所述试剂通过免疫学检测来测定所述生物标记物的水平。
39.在某些实施方案中，所述试剂包含用于质谱法检测所述生物标记物的试剂。在此类实施方案中，所述的生物标记物组合可以作为质谱法中的对照样品。
40.在某些实施方案中，所述试剂盒还包括一种或多种选自下列的试剂或装置：(i)用于收集或贮存来自受试者的体液样品(例如尿)的装置；(ii)用于进行所述测定所需的其他试剂(例如缓冲液，稀释液，洗脱液，封闭液，和/或标准品)。
41.在一些实施方案中，(ii)所述的试剂选自用于进行免疫学检测所需的其他试剂(例如缓冲液，稀释液，洗脱液，封闭液，和/或标准品)。
42.在另一些实施方案中，(ii)所述的试剂选自用于进行质谱法所需的其他试剂(例如缓冲液，稀释液，洗脱液，封闭液，和/或标准品)。
43.用于分期结直肠癌的生物标记物
44.本发明第二方面提供了用于在受试者中区分结直肠癌状态的方法，其包括：
45.(1)检测来自受试者的液体样品中生物标记物的水平，所述生物标记物选自coro1c、rad23b、gspt2、ndn、krt7、proz、prdx1、pam、aprc5中的一种或多种(例如1种，2种，3种，4种，5种，6种，7种，8种或全部9种)；
46.(2)将所述水平与参考值比较。
47.在某些实施方案中，所述方法用于区分非转移性结直肠癌和转移性结直肠癌(例如，淋巴结转移和/或远处转移(例如肝转移))。在此类实施方案中，所述生物标记物优选地包含选自coro1c、rad23b、gspt2、ndn中的一种或多种(例如1种，2种，3种或全部4种)。在某些实施方案中，所述生物标记物包含coro1c、rad23b、gspt2和ndn。在某些实施方案中，所述生物标记物还可以包含选自krt7、proz、prdx1、pam、aprc5中的一种或多种(例如1种，2种，3种，4种，或全部5种)。
48.在某些实施方案中，所述方法用于分期结直肠癌。在此类实施方案中，所述生物标记物优选地包含选自coro1c、rad23b、gspt2、ndn、aprc5中的一种或多种(例如1种，2种，3种，4种，或全部5种)。术语“分期结直肠癌”优选地指区分结直肠癌的多种阶段。结直肠癌阶段的一般分类是本领域技术人员熟知的。在某些实施方案中，所述分期是tnm分期，例如i、ii、iii或iv期。在某些实施方案中，所述分期是m分期，例如m0、m1期。
49.应理解步骤(1)和(2)中所述的“水平”包括所述生物标记物的绝对量、相对量或浓度以及与其相关或可以从其衍生的任何值或参数。
50.应理解步骤(2)中所述的“比较”通常指对应参数或值的比较，例如将绝对量与绝对参考量比较，而将浓度与参考浓度比较，或者将获自样品中生物标志物的强度信号与获自参考样品的相同类型的强度信号比较。比较可以手动或计算机辅助进行。获自个体或患者的样品中生物标志物的测量的或检测的水平和参考水平的值可以例如彼此比较，并且所述比较可以通过执行用于比较的算法的计算机程序自动进行。
51.应理解步骤(2)中所述的“参考值”指允许在患结直肠癌的受试者中确定结直肠癌状态(例如区分非转移性或转移性结直肠癌，或区分结直肠癌的不同阶段)的值。参考值可以是预先测定的，并设定以满足在例如特异性和/或灵敏性方面的常规要求。
52.基于本发明中给出的教导，获得这样的参考值在本领域普通技术人员的能力范围内。例如，可以对代表性群体测定本发明所述的生物标记物的水平，并通过合适的统计学方法(例如中值、平均值、分位数、pls-da、逻辑回归方法、随机森林分类或者其他给出阈值的方法)计算参考值。阈值应当考虑诊断和预后测试的灵敏性和特异性的希望的临床设定。
53.参考值可以来源于患不同阶段的结直肠癌的受试者的样品。例如，如果要区分非转移性结直肠癌和转移性结直肠癌，那么参考值可以来源于(i)患非转移性结直肠癌的受试者和/或(ii)患转移性结直肠癌的受试者的样品。例如，如果要区分不同tnm分期的结直肠癌，那么参考值可以来源于(i)处于i期的受试者，(ii)处于ii期的受试者，(iii)处于iii期的受试者，和/或(iv)处于iv期的受试者的样品。
54.在某些实施方案中，当所述方法用于区分非转移性结直肠癌和转移性结直肠癌时，所述参考值代表患有未转移结直肠癌的受试者的体液样品中该生物标志物的水平。在某些实施方案中，如果所述水平高于参考值的话，则判断所述受试者患有转移性结直肠癌或处于患有转移性结直肠癌的风险中。
55.在某些实施方案中，当所述方法用于区分不同分期的结直肠癌时，所述参考值可以代表患不同阶段的结直肠癌的受试者的体液样品中该生物标志物的水平。
56.在一些实施方案中，通过免疫学检测来测定所述生物标记物的水平。在某些实施方案中，所述免疫学检测选自elisa、elispot、蛋白斑点印迹(dot blot)或蛋白质印迹
(western blot)。
57.在某些实施方案中，所述免疫学检测包括使用能够特异性结合所述生物标记物的一级抗体。
58.在某些实施方案中，所述一级抗体带有可检测的标记。
59.在某些实施方案中，所述免疫学检测还包含使用对所述一级抗体特异性的二级抗体，所述二级抗体带有可检测的标记。
60.在本文中，所述二级抗体对一级抗体所来自的物种(例如小鼠、大鼠、羊、兔等)的抗体是特异的。在某些实施方案中，所述二级抗体选自抗免疫球蛋白抗体，例如抗igg抗体、抗igm抗体或抗iga抗体。
61.在某些实施方案中，所述可检测的标记选自酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)、荧光染料或生物素。
62.在另一些实施方案中，通过质谱法来测定所述生物标记物的水平。
63.在某些实施方案中，所述体液样品选自血液、血清、血浆、尿液和唾液。在某些实施方案中，所述体液样品是尿液。
64.在某些实施方案中，所述受试者是人。在某些实施方案中，所述受试者患有或被确诊有结直肠癌。
65.本发明另一方面还涉及能够检测生物标记物的试剂在制备用于在受试者中区分结直肠癌状态的试剂盒中的用途，所述生物标记物如第二方面的任一实施方案中定义。
66.在某些实施方案中，所述试剂通过免疫学检测来测定所述生物标记物的水平。在某些实施方案中，所述免疫学检测选自elisa、elispot、蛋白斑点印迹(dot blot)或蛋白质印迹(western blot)。
67.在某些实施方案中，所述试剂包含能够特异性结合所述生物标记物的一级抗体。
68.在某些实施方案中，所述一级抗体带有可检测的标记。
69.在某些实施方案中，所述试剂还包含对所述一级抗体特异性的二级抗体，所述二级抗体带有可检测的标记。
70.在某些实施方案中，所述可检测的标记选自酶(例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、化学发光试剂(例如吖啶酯类化合物)、荧光染料或生物素。
71.在某些实施方案中，所述试剂通过质谱法来测定所述生物标记物的水平。
72.在某些实施方案中，所述试剂盒还包括一种或多种选自下列的试剂或装置：(i)用于收集或贮存来自受试者的体液样品(例如尿)的装置；(ii)用于进行所述测定(例如免疫学检测或质谱法)所需的其他试剂(例如缓冲液，稀释液，洗脱液，封闭液，和/或标准品)。
73.在某些实施方案中，所述试剂盒通过第二方面中所述的方法来在受试者中区分结直肠癌状态。
74.本发明另一方面还涉及一种生物标记物组合，其包括选自coro1c、rad23b、gspt2、ndn中的至少两种(例如2种，3种或全部4种)。在某些实施方案中，所述生物标记物组合包含coro1c、rad23b、gspt2、ndn。在某些实施方案中，所述生物标记物还可以包含选自krt7、proz、prdx1、pam、aprc5中的一种或多种(例如1种，2种，3种，4种，或全部5种)。
75.本发明另一方面还涉及一种生物标记物组合，其包含选自coro1c、rad23b、gspt2、ndn、aprc5中的至少两种(例如2种，3种，4种，或全部5种)。在某些实施方案中，所述生物标
记物组合包含coro1c、rad23b、gspt2、ndn、aprc5。
76.本发明另一方面还涉及一种试剂盒，其包含如上所述的生物标记物组合，和/或能够检测所述生物标记物组合中的每种生物标记物的试剂。
77.在某些实施方案中，所述试剂通过免疫学检测来测定所述生物标记物的水平。
78.在某些实施方案中，所述试剂包含用于质谱法检测所述生物标记物的试剂。在此类实施方案中，所述的生物标记物组合可以作为质谱法中的对照样品。
79.在某些实施方案中，所述试剂盒还包括一种或多种选自下列的试剂或装置：(i)用于收集或贮存来自受试者的体液样品(例如尿)的装置；(ii)用于进行所述测定所需的其他试剂(例如缓冲液，稀释液，洗脱液，封闭液，和/或标准品)。
80.在一些实施方案中，(ii)所述的试剂选自用于进行免疫学检测所需的其他试剂(例如缓冲液，稀释液，洗脱液，封闭液，和/或标准品)。
81.在另一些实施方案中，(ii)所述的试剂选自用于进行质谱法所需的其他试剂(例如缓冲液，稀释液，洗脱液，封闭液，和/或标准品)。
82.术语定义
83.在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的肿瘤学、分子遗传学、核酸化学、细胞培养、生物化学、细胞生物学等操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
84.如本文中所使用的，术语“coro1c”是指人冠蛋白1c，又名coronin3。coro1c的序列是本领域已知的，例如参见genbank：nm_014325。
85.如本文中所使用的，术语“arpc5”是指肌动蛋白相关蛋白2/3复合物亚单位5(actin-related protein 2/3complex subunit 5)。arpc5的序列是本领域已知的，例如参见genbank：nm_005717。
86.如本文中所使用的，术语“gspt2(g1 to s phase transition 2)”又称为真核肽链释放因子gtp结合亚基(erf3b)。gspt2的序列是本领域已知的，例如参见genbank：nm_018094。
87.如本文中所使用的，术语“rad23b”是紫外线切除修复蛋白rad23同源物b。rad23b的序列是本领域已知的，例如参见genbank：nm_002874。
88.如本文中所使用的，术语“ndn”也称为necd(necdin)。ndn的序列是本领域已知的，例如参见genbank：nm_002487。
89.如本文中所使用的，术语“bhmt”是指甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶。bhmt的序列是本领域已知的，例如参见genbank：nm_001713。
90.如本文中所使用的，术语“dcp1b”是mrna脱帽复合体的核心成分。dcp1b的序列是本领域已知的，例如参见genbank：nm_152640。
91.如本文中所使用的，术语“tpm3”是指人原肌球蛋白-3(tropomyosin-3)。tpm3的序列是本领域已知的，例如参见genbank：nm_152263。
92.如本文中所使用的，术语“cald1”是指caldesmon-1。cald1的序列是本领域已知的，例如参见genbank：nm_033138。
93.如本文中所使用的，术语“atp5f1a”是指atp合成酶f1亚基α。atp5f1a的序列是本
领域已知的，例如参见genbank：nm_004046。
94.如本文中所使用的，术语“krt7”是指keratin 7。krt7的序列是本领域已知的，例如参见genbank：nm_005556。
95.如本文中所使用的，术语“proz”是指蛋白z。proz的序列是本领域已知的，例如参见genbank：nm_003891。
96.如本文中所使用的，术语“prdx1”是指peroxiredoxin 1。prdx1的序列是本领域已知的，例如参见genbank：nm_002574。
97.如本文中所使用的，术语“pam”是指肽基甘氨酸α酰胺化单加氧酶。pam的序列是本领域已知的，例如参见genbank：nm_000919。
98.如本文中所使用的，术语“可检测的标记”可以是可通过荧光、光谱、光化学、生物化学、免疫学、电学、光学或化学手段检测的任何物质。特别优选的是，此类标记能够适用于免疫学检测(例如，酶联免疫测定法、放射免疫测定法、荧光免疫测定法、化学发光免疫测定法等)。这类标记是本领域熟知的，包括但不限于，酶(例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶，等)、放射性核素(例如，3h、
125
i、
35
s、
14
c或
32
p)、荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素(fitc)、荧光素、异硫氰酸四甲基罗丹明(tritc)、藻红蛋白(pe)、德克萨斯红、罗丹明、量子点或花菁染料衍生物(例如cy7、alexa 750))、发光物质(例如化学发光物质，如吖啶酯类化合物)、磁珠(例如，)、测热标记物例如胶体金或有色玻璃或塑料(例如，聚苯乙烯、聚丙烯、乳胶，等)珠、以及用于结合上述标记物修饰的亲和素(例如，链霉亲和素)的生物素。
99.如本文中所使用的，术语“特异性结合”是指，两分子(即结合分子与靶分子)之间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。两分子之间的结合亲和力可用kd值描述。kd值是指由kd(特定的结合分子-靶分子相互作用的解离速率；亦称为koff)与ka(特定结合分子-靶分子相互作用的缔合速率；亦称为kon)之比得到的解离常数，或者指表示为摩尔浓度(m)的kd/ka。kd值越小，两分子结合越紧密，亲和力越高。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10-5
m，例如小于大约10-6
m、10-7
m、10-8
m、10-9
m或10-10
m或更小的亲和力(kd)结合该抗原。kd值可通过本领域熟知的方法确定，例如使用表面等离子体共振术(spr)在biacore仪中测定。
100.如本文中所使用的，术语“免疫学检测”或“免疫学方法检测”是指，利用抗原-抗体之间的特异性相互作用/结合亲和力来进行的测定，其一般可用于检测特定抗原或者抗体在样品中的存在或水平。此类免疫学测定是本领域技术人员公知的，包括但不限于，elisa检测，elispot检测，western印迹，表面等离子共振法等。关于免疫学测定的详细描述，可参见例如，fundamental immunology,ch.7paul,w.,ed.，第2版，raven press,n.y.(1989)。
101.如本文中所使用的，术语“转移”意指癌细胞从其原发位置扩散到身体的另一部分。术语“转移”包含“远处转移”，其是指远离原发肿瘤和局部淋巴结系统的转移。转移性肿瘤的细胞与原发肿瘤中的一样。这意味着，例如，如果结直肠癌转移到肝，则转移性肿瘤由异常的结直肠细胞(而非异常的肝细胞)组成。此时，肝中的肿瘤被称为转移性结直肠癌，而非肝癌。根据本发明，转移性结直肠癌可以包括淋巴结中的癌、肝中的癌、肺中的癌、骨中的癌和脑中的癌。
102.如本文中所使用的，术语“受试者”可以是任何哺乳动物，优选为人类，无论其年龄
或性别如何。在某些实施方案中，所述受试者患有或被确诊有结直肠癌，如何评估受试者是否患结直肠癌是本领域已知的。
103.发明的有益效果
104.本发明首次发现用于诊断和分期crc的尿蛋白生物标志物，该生物标记物可灵敏、准确地诊断结直肠癌并且区分未转移和转移性结直肠癌，具有重大的临床价值。
105.下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得显然。
附图说明
106.图1：文氏图分析健康个体和结直肠癌患者尿蛋白质组差异。crc：结直肠癌无转移；crc-lnm：结直肠癌伴有淋巴转移；crc-dm：结直肠癌伴有肝转移；hc：健康对照。
107.图2a：crc患者和健康对照的差异尿蛋白在肿瘤相关通路中的ipa分析结果。分组中每个节点的颜色表示该路径的-log10(p值)，每个节点的大小代表该途径/疾病/功能中差异蛋白的数量。配对路径之间的相互作用用曲线表示。
108.图2b：crc转移相关差异尿蛋白在肿瘤进展相关通路中的ipa分析结果。分组中每个节点的颜色表示该路径的-log10(p值)，每个节点的大小代表该途径/疾病/功能中差异蛋白的数量。配对路径之间的相互作用用曲线表示。
109.图3a：基于prm数据的健康对照与crc患者中的41种差异蛋白的无监督聚类分析结果。
110.图3b：基于prm数据的由随机森林算法生成的变量重要性图，以每个变量的平均精度下降为衡量标准。最重要的预测变量具有最高的平均精度下降(mean decrease accuracy)值。左图为诊断模型(区分crc患者与健康对照)；右图为转移模型(区分有无转移的crc患者)。
111.图3c：基于prm数据的单个蛋白区分crc患者与健康对照(左)以及有转移和无转移的crc患者(右)的roc曲线下面积(auc)分析结果。
112.图3d：基于prm数据的诊断模型中联合两个变量的auc的矩阵图。表现出卓越的辨别力和互补性的蛋白以红色标记。
113.图3e：基于prm数据的转移模型中联合两个变量的auc的矩阵图。表现出卓越的辨别力和互补性的蛋白以红色标记。
114.图4a：基于prm数据的诊断模型中单个蛋白及其联合的roc曲线。
115.图4b：基于prm数据的诊断模型中单个蛋白及其联合用于分别区分hc与crc-nm、crc-lnm或crc-dm的roc曲线。
116.图5a：基于prm数据的转移模型中单个蛋白及其联合的roc曲线。
117.图5b：基于prm数据的转移模型中单个蛋白及其联合用于分别区分crc-nm与crc-lnm或crc-dm的roc曲线。
118.图6a：coro1c、arpc5、rad23b、gspt2、ndn分别在健康对照(hc)、结直肠癌未转移(nm)、淋巴结转移(lnm)、肝转移(dm)组中的代表性dot blot结果图以及尿液水平散点图。
std，标准品；＊，p《0.05；＊＊，p《0.01；＊＊＊，p《0.001；＊＊＊＊，p《0.0001；ns，不显著。
119.图6b：基于dot blot数据的coro1c、arpc5、rad23b、gspt2、ndn丰度与tnm分期和m分期的相关性的箱线图。tnm,tnm分期；m0,无远处转移；m1,有远处转移；＊,p《0.05；＊＊,p《0.01；＊＊＊,p《0.001；＊＊＊＊,p《0.0001,ns,不显著。
120.图7a：基于dot blot数据的诊断模型训练集中coro1c、aprc5、rad23b、三者组成的panel以及panel与血清cea的联合用于区分健康对照和crc患者的roc曲线。panel：coro1c、aprc5、rad23b组成的诊断组。
121.图7b：基于dot blot数据的诊断模型的验证集中coro1c、aprc5、rad23b、三者组成的panel以及panel与血清cea、ca19-9的联合用于区分健康对照和crc患者的roc曲线。panel：corro1c、aprc5、rad23b组成的诊断组。
122.图8：基于dot blot数据的诊断模型训练集和验证集中单独panel对cea判别错误个体的检测阳性率。
123.图9：基于dot blot数据的诊断模型中coro1c、arpc5、rad23b组成的组合(panel)及其与cea联合，用于分别区分hc与crc-dm，crc-lnm和crc-nm的roc曲线。
124.图10a：基于dot blot数据的转移模型训练集中coro1c、gspt2、ndn、rad23b、四者的组合(panel)以及panel与cea联合用于区分无转移和转移性crc的roc曲线。
125.图10b：基于dot blot数据的转移模型验证集中coro1c、gspt2、ndn、rad23b、四者的组合(panel)以及panel与cea联合用于区分无转移和转移性crc的roc曲线。
126.图11：基于dot blot数据的转移模型训练集和验证集中单独panel对cea判别错误个体的转移预测阳性率。
127.图12：基于dot blot数据的转移模型中coro1c、gspt2、ndn、rad23b组成的组合(panel)及其与cea的联合，分别用于区分未转移crc crc-dm与crc-lnm或crc-nm的roc曲线。
具体实施方式
128.现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
129.除非特别指明，否则基本上按照本领域内熟知的以及在各种参考文献中描述的常规方法进行实施例中描述的实验和方法。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。本文中提及的全部公开案和其他参考资料以其全文通过引用合并入本文。
130.以下实施例涉及的主要试剂的来源如下：
[0131][0132]
实施例1：尿蛋白标记物的初步筛选及验证
[0133]
1.1基于tmt定量蛋白质组分析的初步筛选
[0134]
收集来自受试者的尿液标本，并富集洗脱尿蛋白，经bradford法测定蛋白浓度后，尿蛋白样品于-80℃冰箱保存。crc尿液样本来自中国医学科学院肿瘤医院结直肠外科和介入治疗科的住院病人，样本采集和使用经医院伦理委员会批准，所有患者经过至少两位资深病理专家诊断为crc-nm(未转移)、crc-lnm(淋巴结转移)、crc-dm(肝转移)。健康对照(hc)尿液样本部分采集自中国医学科学院肿瘤医院志愿者，部分由中国医学科学院基础医学研究所中心实验室提供。
[0135]
对各组样品进行tmt(tandem mass tag)定量蛋白质组学检测。简言之，尿蛋白样品经酶解后，使用tmt-10plex试剂盒进行tmt标记，并经离线高ph反相高效液相色谱分离tmt多肽，随后用lc-ms/ms进行蛋白质谱鉴定。原始数据经proteome discover检索，与swissprot人类蛋白质组数据库比对，结果如图1所示，hc、crc-nm、crc-lnm以及crc-dm组鉴定到单肽非冗余蛋白分别为1976、2151、2635、2772个，四组中共有的蛋白为995个。
[0136]
对各组蛋白进行无监督聚类(unsupervised clustering)分析，以差异大于1.5倍作为标准，三个crc组(nm、lnm、dm)与hc组相比分别发现273、337和355个差异蛋白，对肿瘤相关差异蛋白进行ipa分析(ingenuity pathway analysis)，结果如图2a所示。此外，在相同的标准下，三个crc组之间(nm与lnm、dm与nm、lnm与dm)分别发现93、69和114个差异蛋白，对肿瘤相关差异蛋白进行ipa分析(ingenuity pathway analysis)，结果如图2b所示。所获得的差异蛋白将作为候选标志物进行prm验证。
[0137]
1.2基于平行反应监测(parallel reaction monitoring,prm)靶向定量蛋白质组方法的初步验证
[0138]
在prm验证阶段，重新收集82份独立样本(hc：25，nm：21，lnm：13，dm：23)，crc尿液样本来自中国医学科学院肿瘤医院结直肠外科、肝胆外科和检验科的住院病人，样本采集和使用经医院伦理委员会批准；crc转移情况分组经资深病理专家判读。hc尿液样本部分采集自国家癌症中心检验科。
[0139]
硝酸纤维素膜富集然后将尿蛋白从膜上洗脱，采用bradford法对尿蛋白定量，准备进行prm靶向定量验证。尿蛋白经酶解后，采用lc-ms/ms进行分析鉴定。采用skyline 3.6软件来对prm产生的数据进行分析。将结果导入skyline软件，手动选择正确的峰，并输出所有样品中的所有肽结果。通过progenesis软件提取每个样品的 2- 5电荷的总离子强度(tic)。将每个样品的每种肽的质谱信号强度用样品的总离子强度均一化，以校正样品上样量大小和质谱信号的误差。定量分析每种肽的结果，筛选不同组之间的差异蛋白，并与tmt结果进行比较。
[0140]
结果显示prm靶向质谱共鉴定到来自41个差异蛋白的66个多肽，这些蛋白呈现与tmt结果相符的趋势。对这41个差异蛋白进行无监督聚类分析，结果如图3a所示，18个蛋白在crc组中显著下调，23个蛋白在crc组中上调，随疾病进程呈逐渐升高的趋势。
[0141]
进一步对23个上调蛋白进行分析，排除显示与五种以上其他蛋白中等程度的相关性的蛋白(斯皮尔曼等级相关系数≥0.6)，通过随机森林算法对剩余的14个候选蛋白进行评价，特征重要性排序结果如图3b所示。
[0142]
此外，通过roc分析考察了上述候选蛋白在crc诊断预测(hc vs crc)及crc转移预测(lnm/dm vs nm)中的分类性能，其中以尿液中候选蛋白含量为检验变量，以已知的诊断结果作为状态变量，绘制roc曲线，并计算曲线下面积auc，结果如图3c所示。综合图3b和3c的排序结果，在crc诊断模型(区分健康对照与crc患者)中表现良好的蛋白包括：rad23b、coro1c、arpc5、bhmt、dcp1b、tpm3、cald1、atp5f1a，在crc转移模型(区分未转移或转移性crc)中表现良好的蛋白包括：ndn、coro1c、rad23b、gspt2、krt7、proz、prdx1、pam。
[0143]
进一步通过比较联合检测的auc值来评价上述任意两种蛋白的互补性能，crc诊断模型和转移模型的结果分别如图3d和图3e所示，coro1c、aprc5、rad23b在诊断模型中，coro1c、rad23b、gspt2、ndn在转移模型中，表现出更优的辨别力和互补性。由此建立分别由三个尿蛋白coro1c、aprc5、rad23b组成的诊断模型，以及由四个尿蛋白coro1c、rad23b、gspt2、ndn组成的转移预测模型。
[0144]
分别绘制coro1c、aprc5、rad23b单独或联合(即，coro1c、aprc5、rad23b组成的诊断panel)用于区分hc与crc样本的roc曲线，结果如图4a所示，该诊断panel的auc为0.887，特异性为80.0％，敏感度为86.0％。此外，图4b显示了该诊断panel用于区分hc与crc-nm、crc-lnm或crc-dm的性能，其auc分别为0.800、0.948、0.935。
[0145]
分别绘制coro1c、rad23b、gspt2、ndn单独或联合(即，coro1c、rad23b、gspt2、ndn组成的转移panel)用于区分有或无转移的crc患者的roc曲线，结果如图5a所示，该转移panel的auc为0.784，特异性为70.0％，敏感度为81.1％。此外，图5b显示了该转移panel用于区分crc-nm与crc-lnm或crc-dm的性能，其auc分别为0.723和0.827。
[0146]
实施例2：尿蛋白标记物的定量dot blot分析验证
[0147]
2.1尿蛋白dot blot定量分析方法
[0148]
裁剪过滤器大小适中的滤纸(13x 10cm)、pvdf膜(12x 9cm)。将pvdf膜放入干净的
器皿里先用甲醇溶液浸泡20min活化，再换成1x pbs溶液浸泡10min；滤纸在组装过滤器装置前2-3min时浸泡即可(如果是硝酸纤维素膜直接用pbs浸泡10min，不需要甲醇活化)。
[0149]
准备样品：每孔液体总体积用pbs配至500μl以保证点阵均匀，标准品用梯度稀释的方法获得不同浓度梯度。震荡混匀样品，然后静置于冰上。
[0150]
仪器组装：按说明书组装过滤器装置，确保2层滤纸之间、滤纸与pvdf膜之间没有气泡。
[0151]
加样：向小孔中加样500μl/孔，避免加入气泡，整张膜上样时长不宜超过5min。同时连接真空泵，低速抽真空(吸引量为100ul/min，真空泵压力为7kpa)。待所有样品孔里都抽滤完成，向每个孔中加入200μl 2％的bsa静置5min，低速抽真空，封闭小孔未结合蛋白部分(该步主要对上样孔进行预封闭)。
[0152]
封闭：取下硝酸纤维素膜或pvdf膜放入干净的器皿里用10％的脱脂奶粉室温封闭4-5h或者4℃过夜(注意正面向上，由于膜经真空抽滤之后样品孔部分会鼓起来，所以封闭液稍微多加点)。
[0153]
孵一抗：用3％的脱脂奶粉按一定比例稀释目的一抗，4℃过夜或室温4h。
[0154]
洗膜：1x tbst洗膜，每次5-8min，洗3-4次。
[0155]
孵二抗：用3％的脱脂奶粉按适当比例稀释二抗，室温孵育1h左右。1x tbst洗膜，每次5-8min，洗3-4次。
[0156]
曝光：将两种显色底物1：1混合，将混合液体均匀覆盖在膜表面，同时在膜表面覆盖一层透明的玻璃纸(玻璃纸的作用：1.利用玻璃纸与液体间的张力以保证发光液均匀覆盖在每一个加样孔的地方；2.避免膜表面的液体局部蒸发干燥影响实验结果)，放入曝光仪中曝光，采集图像。
[0157]
灰度扫描：
[0158]
dot blot实验结果通过ecl显色液和las4000获得结果图像。将得到的结果进行灰度扫描，灰度扫描步骤如下：首先将图片转换成灰度图片，其次消除背景并设置定量参数，设置单位，然后将图片转换为亮带，用freehand selection圈取圆点，点击m，得到intden灰度值。每次实验间要有同一个样本用于校正各个实验间灰度值。
[0159]
结果定量和统计分析：
[0160]
采用scion image软件对整张膜上的96个斑点印记进行灰度值分析。为纵坐标，标准品的浓度为横坐标，采用microsoft office excel 2016软件绘制标准曲线并计算各尿液样本中检测蛋白的含量。精密度分析：将同一尿液样本按照本研究所建立的方法平行处理10份，计算检测样本的cv值。
[0161]
2.2尿肌酐校正样本中蛋白质含量
[0162]
通过elisa法检测尿肌酐含量，通过将上述方法获得的每个样本中候选蛋白的含量除以尿肌酐，即可得到不同样本间相同稀释度情况下该候选蛋白的含量。
[0163]
2.3统计学分析
[0164]
用graphpad prism 6软件非参数检验即mann-whitney检验完成统计学分析。用spss 16.0软件完成受试者工作特征曲线(receiver operator characteristic curve,roc)，以p《0.05为差异有统计学意义。
[0165]
2.4临床样本
[0166]
重新收集434份独立样本(hc：255，nm：46，lnm：75，dm：58)，crc尿液样本来自中国医学科学院肿瘤医院结直肠外科、肝胆外科和检验科的住院病人，样本采集和使用经医院伦理委员会批准；crc转移情况分组经资深病理专家判读。hc尿液样本部分采集自国家癌症中心检验科。
[0167]
2.5检测结果
[0168]
样本中尿蛋白标记物经dot blot杂交，结果经灰度扫描获得的原始数值经标准曲线计算得到每个样本中生物标记物含量，再经同一样本的尿肌酐值校正后，获得检测样本中生物标记物的最终含量。
[0169]
coro1c、aprc5、rad23b、gspt2和ndn的dot blot测定结果分别如图6a所示，crc患者尿液中的coro1c、aprc5、rad23b、gspt2和ndn的浓度显着高于健康对照组的尿液(p《0.0001)。在三个crc组中，这五种尿蛋白的水平随疾病进展呈梯度增加趋势。lnm组的尿rad23b和gspt2浓度显著高于nm组(p《0.05)。此外，对于远处转移的患者，其尿液中这五种蛋白的含量相比于无转移的crc患者相比均显著升高(p《0.001)，并且同时也高于仅具有淋巴结转移的患者(p《0.01)。此外，尿液中这五种蛋白的丰度与tnm分期和m分期呈显着正相关(图6b)。
[0170]
实施例3：尿蛋白标记物及其组合用于区分健康对照与crc患者的效能评价
[0171]
通过实施例2所述的dot blot定量分析方法，分别对训练集和验证集中的尿样本进行coro1c、aprc5、rad23b含量测定，以考察区分健康对照与crc患者的能力(以下可简称为诊断模型)。其中，训练集包含103个hc样本和105个crc样本，验证集包含51个hc样本和53个crc样本，这些样本均已具有对应的血清cea检测结果。
[0172]
分别绘制coro1c、aprc5、rad23b单独或联合(三者组成的诊断panel)用于区分hc与crc样本的roc曲线。训练集的结果如图7a所示，coro1c、arpc5、rad23b联合检测的roc曲线下面积为0.828，在验证集中，coro1c、arpc5、rad23b联合检测的auc可达0.875(图7b)。以上结果表明，这些生物标记物及其组合能够用于区分健康对照与crc患者。
[0173]
目前临床常用的crc标志物是血清癌胚抗原(cea)。因此进一步考察上述尿蛋白标记物联合血清cea的诊断能力。根据匹配的血清cea检测结果，绘制roc曲线。训练集和验证集的结果分别如图7a-7b所示，coro1c、aprc5、rad23b结合血清cea达到了极好的诊断预测能力，在训练组和验证组中的auc值分别为0.927和0.892。特别地，coro1c、aprc5、rad23b组成的诊断panel可以补充血清cea的判别结果(≥5ng/ml为阳性)，在训练组和验证组中，对于诊断为cea阴性(cea《5ng/ml)的患者，通过上述诊断panel可以正确诊断出训练集中61.2％(30/49)和验证组中56.3％(18/32)的患者(图8)。此外，与cea结合使用的诊断panel在区分hc与三种crc(crc-nm，crc-lnm和crc-dm)方面显示出卓越的诊断预测能力，auc分别为0.825、0.929和0.965(图9)。
[0174]
实施例4：尿蛋白标记物及其组合用于区分未转移和转移性crc的效能评价
[0175]
通过实施例2所述的dot blot分析方法，分别对训练集和验证集中的尿样本进行coro1c、ad23b、gspt2、ndn含量测定，以考察区分未转移和转移性crc的能力(以下可简称为转移模型)。其中，训练集包含27个crc-nm样本(重复两次，实际共81个crc-nm样本)和78个转移性crc样本，验证集包含14个crc-nm和39个转移性crc样本，这些样本均已具有对应的血清cea检测结果。
[0176]
分别绘制coro1c、ad23b、gspt2、ndn单独或联合(四者组成的转移panel)用于区分未转移和转移性crc样本的roc曲线。训练集和验证集的结果如图10a-10b所示，联合使用的roc曲线下面积分别为0.773和0.676。
[0177]
进一步考察上述尿蛋白标记物联合血清cea的诊断能力。根据匹配的血清cea检测结果，绘制roc曲线。训练集和验证集的结果分别如图10a-10b所示，在训练组和验证组中，结合血清cea的转移panel分别具有0.854和0.736的良好预测效果。此外，对于cea阴性crc患者(cea《5ng/ml)，在训练集和验证集中分别有57.6％(19/33)和52.6％(13/19)的患者被coro1c、ad23b、gspt2、ndn组成的转移panel准确诊断出来(图11)。与cea联合的转移panel在区分crc-nm与crc-dm方面表现出明显更好的预测能力，其auc为0.906，高于区分crc-nm与crc-lnm的0.784(图12)。
[0178]
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。