一种干细胞上清液滴眼液及其制备方法与流程

1.本发明属于滴眼液技术领域，具体涉及一种干细胞上清液滴眼液及其制备方法。


背景技术：

2.随着人用眼过度，会造成眼干、眼涩、眼睛酸胀充血甚至头晕恶心等眼疲劳综合征也越来越多，各种眼科疾病，比如近视、远视、白内障、青光眼、角膜溃疡等的发病率也逐渐增高，危害着眼睛的正常功能，现有的滴眼液普遍是各种药物很合，对于眼睛的修复问题十分的有限，只能怪缓解眼疲劳，对于眼睛的修复能力不强，然而市面上各种的滴眼液仍存在各种各样的问题。
3.如授权公告号为cn111658607a所公开的一种脐带间充质干细胞缓释滴眼液及其制备方法，其虽然实现了滞留性好、不易变质的同时避免加入化学保护成分和大量抑菌剂的脐带间充质干细胞缓释滴眼液，但是并未解决现有滴眼液存在的不能够实现对眼睛进行修复，减弱用眼疲劳，抑制细胞生长等的问题，为此我们提出一种干细胞上清液滴眼液及其制备方法。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种干细胞上清液滴眼液及其制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
5.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种干细胞上清液滴眼液，包括有以下组成成份，按重量份计：2-8份干细胞上清液、5-10份溶媒液和0.05-0.08份防腐剂，剩余量为生理盐水。
6.优选的，所述溶媒液中包括有透明质酸钠、牛磺酸、薄荷脑、维生素和植物提取液，所述透明质酸钠、所述牛磺酸、所述薄荷脑、所述维生素和所述植物提取液之间的比例为4：2：0.5：2：1.5。
7.优选的，所述维生素中包括维生素a、维生素b12、维生素b6和维生素e，所述维生素e为天然维生素e，所述维生素a、所述维生素b12、所述维生素b6和所述维生素e之间的比例为1：3：3：3。
8.优选的，所述植物提取液中包括芦荟提取液、人参提取液、黄芪提取液、洋甘菊提取液和枸杞提取液，所述芦荟提取液、所述人参提取液、所述黄芪提取液、所述洋甘菊提取液和所述枸杞提取液的比例为4：0.3：1：2：2.7。
9.优选的，所述芦荟提取液、所述人参提取液、所述黄芪提取液、所述洋甘菊提取液和所述枸杞提取液的制备过程如下：
10.第一步：将芦荟、人参、黄芪、洋甘菊和枸杞进行清洗灰尘和去除渣叶，然后通过90％的乙醇进行浸泡三分钟消毒，再采用流动水冲洗五分钟；
11.第二步：然后再将芦荟、人参、黄芪、洋甘菊和枸杞进行低温烘干，蒸发芦荟、人参、黄芪、洋甘菊和枸杞中的水分；
12.第三步：将芦荟、人参、黄芪、洋甘菊和枸杞进行粉碎研磨，使得芦荟、人参、黄芪、洋甘菊和枸杞研磨成粉末；
13.第四步：将芦荟、人参、黄芪、洋甘菊和枸杞等粉末进行混合，通过蒸馏水进行蒸馏提取植物混合提取液。
14.优选的，所述防腐剂中包括羟苯乙酯、羟苯甲酯和山梨酸，所述羟苯乙酯、所述羟苯甲酯和所述山梨酸的质量比例为4：2：4。
15.一种干细胞上清液滴眼液的制备方法，包括有以下方法步骤：
16.s1、对干细胞进行提取和培养：获取围产组织干细胞、脐带血造血干细胞或者外周血造血干细胞，并且实现对围产组织干细胞、脐带血造血干细胞或者外周血造血干细胞进行培养，且在血清培养基中进行培养，获取大量的干细胞；
17.s2、获取悬浮细胞继续进行培养：去除原有培养基，并用pbs清洗1-3遍，获得贴壁细胞和悬浮细胞，然后在300xg，4℃，10min条件下收集悬浮细胞，再使用不含外泌体的培养基或者无血清培养基对悬浮细胞并继续培养，48
–
72h；
18.s3、获取干细胞的上清液：将s2中培养后的细胞液进行700xg，4℃，离心10min；小心吸取上清，注意避免吸入细胞或者细胞碎片；然后再次在9000xg，4℃，再次离心15min，确保将细胞或者细胞碎片去除干净；最后提取上清液，注意避免吸入细胞或者细胞碎片，装入无菌的玻璃瓶，可在4℃短期保存1-2天，长期保存可冻存于-80℃；
19.s4、将干细胞上清液和溶媒液混合：将提取的干细胞上清液注入到存储有溶媒液的反应釜中，并且通过反应釜上的搅拌机构进行搅拌混合，且搅拌机构的转速为100r/min，且搅拌时长为5-10min，获得混合液；
20.s5、最后将防腐剂进行加入混合，然后添加生理盐水：将防腐剂加入到混合液中，且在加入防腐剂的时候，一边进行加入一边进行搅拌，搅拌机构的转速的转速为300r/min，在防腐剂混合后，静置2-3h，然后将生理盐水进行加入，且搅拌机构的转速的转速为200r/min，搅拌时长为1-2h，使得干细胞上清液滴眼液中的成份能够充分的混合。
21.优选的，所述s1中获取大量的干细胞既是在血清培养基中培养得到贴壁细胞密度在70％-80％；悬浮细胞密度在60％-70％，且在围产组织干细胞、脐带血造血干细胞或者外周血造血干细胞进行培养前，要保证围产组织干细胞、脐带血造血干细胞或者外周血造血干细胞无病毒感染，并且需要做支原体检测，避免支原体干扰。
22.优选的，所述干细胞的培养在无菌环境下，并且在恒温、恒湿和恒压的保养箱中进行培养处理，并且采用0.22μm滤头过滤细胞培养上清，进一步去除体积较大的悬浮微粒。
23.优选的，s4中的反应釜在进行使用前先通过无水乙醇进行冲洗消毒，然后在使用生理盐水进行清洗无水乙醇残留液，最后进行高温蒸汽消毒，然后冷却后进行恒温恒压混合干细胞上清液滴眼液的配置混合。
24.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
25.本发明通过干细胞上清液实现对制备滴眼液，使得滴眼液能够实现对眼睛具有修复的作用，并且能够有效的抑制眼疲劳，且上清液中含有大量的活性物质，能够有效的实现和增加修复的效果，并且在溶媒液中添加有维生素和植物提取液，能够有效的实现杀菌消毒，并且能够保护眼睛，抑制眼疲劳，补充水分，减少血丝，补充眼睛营养成分，以及保持干细胞上清液的活性，提高干细胞上清液滴眼液的活性和效果，且制备方式简单，过程无菌干
净，制备快速。
附图说明
26.图1为本发明的方法步骤流程示意图；
27.图2为本发明的植物提取液的步骤流程示意图。
具体实施方式
28.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
29.请参阅图1-图2，本发明提供一种技术方案：
30.实施例一：
31.一种干细胞上清液滴眼液，包括有以下组成成份，按重量份计：8份干细胞上清液、5份溶媒液和0.05份防腐剂，剩余量为生理盐水。
32.为了实现对滴眼液具有润湿和保护眼睛的作用，并且实行对干细胞液进行混合溶液，提高干细胞上清液的活性，本实施例中，优选的，所述溶媒液中包括有透明质酸钠、牛磺酸、薄荷脑、维生素和植物提取液，所述透明质酸钠、所述牛磺酸、所述薄荷脑、所述维生素和所述植物提取液之间的比例为4：2：0.5：2：1.5。
33.为了提高滴眼液的效果，能够实现润湿和保护的作用，本实施例中，优选的，所述维生素中包括维生素a、维生素b12、维生素b6和维生素e，所述维生素e为天然维生素e，所述维生素a、所述维生素b12、所述维生素b6和所述维生素e之间的比例为1：3：3：3。
34.为了提高滴眼液的营养成分，实现对眼睛进行修复和保养，本实施例中，优选的，所述植物提取液中包括芦荟提取液、人参提取液、黄芪提取液、洋甘菊提取液和枸杞提取液，所述芦荟提取液、所述人参提取液、所述黄芪提取液、所述洋甘菊提取液和所述枸杞提取液的比例为4：0.3：1：2：2.7。
35.为了实现对织物提取液进行制备，并且便于实现添加，固实现对植物药进行提蒸馏提取，本实施例中，优选的，所述芦荟提取液、所述人参提取液、所述黄芪提取液、所述洋甘菊提取液和所述枸杞提取液的制备过程如下：
36.第一步：将芦荟、人参、黄芪、洋甘菊和枸杞进行清洗灰尘和去除渣叶，然后通过90％的乙醇进行浸泡三分钟消毒，再采用流动水冲洗五分钟；
37.第二步：然后再将芦荟、人参、黄芪、洋甘菊和枸杞进行低温烘干，蒸发芦荟、人参、黄芪、洋甘菊和枸杞中的水分；
38.第三步：将芦荟、人参、黄芪、洋甘菊和枸杞进行粉碎研磨，使得芦荟、人参、黄芪、洋甘菊和枸杞研磨成粉末；
39.第四步：将芦荟、人参、黄芪、洋甘菊和枸杞等粉末进行混合，通过蒸馏水进行蒸馏提取植物混合提取液。
40.为了实现对滴眼液进行保护，防止真菌感染，本实施例中，优选的，所述防腐剂中包括羟苯乙酯、羟苯甲酯和山梨酸，所述羟苯乙酯、所述羟苯甲酯和所述山梨酸的质量比例
为4：2：4。
41.一种干细胞上清液滴眼液的制备方法，包括有以下方法步骤：
42.s1、对干细胞进行提取和培养：获取围产组织干细胞、脐带血造血干细胞或者外周血造血干细胞，并且实现对围产组织干细胞、脐带血造血干细胞或者外周血造血干细胞进行培养，且在血清培养基中进行培养，获取大量的干细胞；
43.s2、获取悬浮细胞继续进行培养：去除原有培养基，并用pbs清洗1-3遍，获得贴壁细胞和悬浮细胞，然后在300xg，4℃，10min条件下收集悬浮细胞，再使用不含外泌体的培养基或者无血清培养基对悬浮细胞并继续培养，48h；
44.s3、获取干细胞的上清液：将s2中培养后的细胞液进行700xg，4℃，离心10min；小心吸取上清，注意避免吸入细胞或者细胞碎片；然后再次在9000xg，4℃，再次离心15min，确保将细胞或者细胞碎片去除干净；最后提取上清液，注意避免吸入细胞或者细胞碎片，装入无菌的玻璃瓶，可在4℃短期保存1-2天，长期保存可冻存于-80℃；
45.s4、将干细胞上清液和溶媒液混合：将提取的干细胞上清液注入到存储有溶媒液的反应釜中，并且通过反应釜上的搅拌机构进行搅拌混合，且搅拌机构的转速为100r/min，且搅拌时长为5min，获得混合液；
46.s5、最后将防腐剂进行加入混合，然后添加生理盐水：将防腐剂加入到混合液中，且在加入防腐剂的时候，一边进行加入一边进行搅拌，搅拌机构的转速的转速为300r/min，在防腐剂混合后，静置2h，然后将生理盐水进行加入，且搅拌机构的转速的转速为200r/min，搅拌时长为1h，使得干细胞上清液滴眼液中的成份能够充分的混合。
47.为了实现对干细胞进行培养，并且防止病毒干扰，干细胞要进行检测，确定干细胞的无菌性，本实施例中，优选的，所述s1中获取大量的干细胞既是在血清培养基中培养得到贴壁细胞密度在70％；悬浮细胞密度在60％，且在围产组织干细胞、脐带血造血干细胞或者外周血造血干细胞进行培养前，要保证围产组织干细胞、脐带血造血干细胞或者外周血造血干细胞无病毒感染，并且需要做支原体检测，避免支原体干扰。
48.为了实现对干细胞进行有效的培养，并且实现对干细胞上清液进行过滤，本实施例中，优选的，所述干细胞的培养在无菌环境下，并且在恒温、恒湿和恒压的保养箱中进行培养处理，并且采用0.22μm滤头过滤细胞培养上清，进一步去除体积较大的悬浮微粒。
49.为了使得干细胞上清液滴眼液能够在无菌的环境下进行生产制备，本实施例中，优选的，s4中的反应釜在进行使用前先通过无水乙醇进行冲洗消毒，然后在使用生理盐水进行清洗无水乙醇残留液，最后进行高温蒸汽消毒，然后冷却后进行恒温恒压混合干细胞上清液滴眼液的配置混合。
50.实施例二：
51.一种干细胞上清液滴眼液，包括有以下组成成份，按重量份计：8份干细胞上清液、10份溶媒液和0.08份防腐剂，剩余量为生理盐水。
52.为了实现对滴眼液具有润湿和保护眼睛的作用，并且实行对干细胞液进行混合溶液，提高干细胞上清液的活性，本实施例中，优选的，所述溶媒液中包括有透明质酸钠、牛磺酸、薄荷脑、维生素和植物提取液，所述透明质酸钠、所述牛磺酸、所述薄荷脑、所述维生素和所述植物提取液之间的比例为4：2：0.5：2：1.5。
53.为了提高滴眼液的效果，能够实现润湿和保护的作用，本实施例中，优选的，所述
维生素中包括维生素a、维生素b12、维生素b6和维生素e，所述维生素e为天然维生素e，所述维生素a、所述维生素b12、所述维生素b6和所述维生素e之间的比例为1：3：3：3。
54.为了提高滴眼液的营养成分，实现对眼睛进行修复和保养，本实施例中，优选的，所述植物提取液中包括芦荟提取液、人参提取液、黄芪提取液、洋甘菊提取液和枸杞提取液，所述芦荟提取液、所述人参提取液、所述黄芪提取液、所述洋甘菊提取液和所述枸杞提取液的比例为4：0.3：1：2：2.7。
55.为了实现对织物提取液进行制备，并且便于实现添加，固实现对植物药进行提蒸馏提取，本实施例中，优选的，所述芦荟提取液、所述人参提取液、所述黄芪提取液、所述洋甘菊提取液和所述枸杞提取液的制备过程如下：
56.第一步：将芦荟、人参、黄芪、洋甘菊和枸杞进行清洗灰尘和去除渣叶，然后通过90％的乙醇进行浸泡三分钟消毒，再采用流动水冲洗五分钟；
57.第二步：然后再将芦荟、人参、黄芪、洋甘菊和枸杞进行低温烘干，蒸发芦荟、人参、黄芪、洋甘菊和枸杞中的水分；
58.第三步：将芦荟、人参、黄芪、洋甘菊和枸杞进行粉碎研磨，使得芦荟、人参、黄芪、洋甘菊和枸杞研磨成粉末；
59.第四步：将芦荟、人参、黄芪、洋甘菊和枸杞等粉末进行混合，通过蒸馏水进行蒸馏提取植物混合提取液。
60.为了实现对滴眼液进行保护，防止真菌感染，本实施例中，优选的，所述防腐剂中包括羟苯乙酯、羟苯甲酯和山梨酸，所述羟苯乙酯、所述羟苯甲酯和所述山梨酸的质量比例为4：2：4。
61.一种干细胞上清液滴眼液的制备方法，包括有以下方法步骤：
62.s1、对干细胞进行提取和培养：获取围产组织干细胞、脐带血造血干细胞或者外周血造血干细胞，并且实现对围产组织干细胞、脐带血造血干细胞或者外周血造血干细胞进行培养，且在血清培养基中进行培养，获取大量的干细胞；
63.s2、获取悬浮细胞继续进行培养：去除原有培养基，并用pbs清洗1-3遍，获得贴壁细胞和悬浮细胞，然后在300xg，4℃，10min条件下收集悬浮细胞，再使用不含外泌体的培养基或者无血清培养基对悬浮细胞并继续培养，72h；
64.s3、获取干细胞的上清液：将s2中培养后的细胞液进行700xg，4℃，离心10min；小心吸取上清，注意避免吸入细胞或者细胞碎片；然后再次在9000xg，4℃，再次离心15min，确保将细胞或者细胞碎片去除干净；最后提取上清液，注意避免吸入细胞或者细胞碎片，装入无菌的玻璃瓶，可在4℃短期保存1-2天，长期保存可冻存于-80℃；
65.s4、将干细胞上清液和溶媒液混合：将提取的干细胞上清液注入到存储有溶媒液的反应釜中，并且通过反应釜上的搅拌机构进行搅拌混合，且搅拌机构的转速为100r/min，且搅拌时长为10min，获得混合液；
66.s5、最后将防腐剂进行加入混合，然后添加生理盐水：将防腐剂加入到混合液中，且在加入防腐剂的时候，一边进行加入一边进行搅拌，搅拌机构的转速的转速为300r/min，在防腐剂混合后，静置3h，然后将生理盐水进行加入，且搅拌机构的转速的转速为200r/min，搅拌时长为2h，使得干细胞上清液滴眼液中的成份能够充分的混合。
67.为了实现对干细胞进行培养，并且防止病毒干扰，干细胞要进行检测，确定干细胞
的无菌性，本实施例中，优选的，所述s1中获取大量的干细胞既是在血清培养基中培养得到贴壁细胞密度在80％；悬浮细胞密度在70％，且在围产组织干细胞、脐带血造血干细胞或者外周血造血干细胞进行培养前，要保证围产组织干细胞、脐带血造血干细胞或者外周血造血干细胞无病毒感染，并且需要做支原体检测，避免支原体干扰。
68.为了实现对干细胞进行有效的培养，并且实现对干细胞上清液进行过滤，本实施例中，优选的，所述干细胞的培养在无菌环境下，并且在恒温、恒湿和恒压的保养箱中进行培养处理，并且采用0.22μm滤头过滤细胞培养上清，进一步去除体积较大的悬浮微粒。
69.为了使得干细胞上清液滴眼液能够在无菌的环境下进行生产制备，本实施例中，优选的，s4中的反应釜在进行使用前先通过无水乙醇进行冲洗消毒，然后在使用生理盐水进行清洗无水乙醇残留液，最后进行高温蒸汽消毒，然后冷却后进行恒温恒压混合干细胞上清液滴眼液的配置混合。
70.本发明的工作原理及使用流程：
71.干细胞上清液滴眼液，包括有以下组成成份，按重量份计：2-8份干细胞上清液、5-10份溶媒液和0.05-0.08份防腐剂，剩余量为生理盐水；
72.制备流程如下：
73.第一步、对干细胞进行提取和培养：获取围产组织干细胞、脐带血造血干细胞或者外周血造血干细胞，并且实现对围产组织干细胞、脐带血造血干细胞或者外周血造血干细胞进行培养，且在血清培养基中进行培养，获取大量的干细胞；
74.第二步、获取悬浮细胞继续进行培养：去除原有培养基，并用pbs清洗1-3遍，获得贴壁细胞和悬浮细胞，然后在300xg，4℃，10min条件下收集悬浮细胞，再使用不含外泌体的培养基或者无血清培养基对悬浮细胞并继续培养，48
–
72h；
75.第三步、获取干细胞的上清液：将s2中培养后的细胞液进行700xg，4℃，离心10min；小心吸取上清，注意避免吸入细胞或者细胞碎片；然后再次在9000xg，4℃，再次离心15min，确保将细胞或者细胞碎片去除干净；最后提取上清液，注意避免吸入细胞或者细胞碎片，装入无菌的玻璃瓶，可在4℃短期保存1-2天，长期保存可冻存于-80℃；
76.第四步、将干细胞上清液和溶媒液混合：将提取的干细胞上清液注入到存储有溶媒液的反应釜中，并且通过反应釜上的搅拌机构进行搅拌混合，且搅拌机构的转速为100r/min，且搅拌时长为5-10min，获得混合液；
77.第五步、最后将防腐剂进行加入混合，然后添加生理盐水：将防腐剂加入到混合液中，且在加入防腐剂的时候，一边进行加入一边进行搅拌，搅拌机构的转速的转速为300r/min，在防腐剂混合后，静置2-3h，然后将生理盐水进行加入，且搅拌机构的转速的转速为200r/min，搅拌时长为1-2h，使得干细胞上清液滴眼液中的成份能够充分的混合。
78.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。