一种靶向miR-493/HIF-1α/PDK1制备药耐药性药物的应用的制作方法

一种靶向mir-493/hif-1
α
/pdk1制备药耐药性药物的应用
技术领域
1.本发明涉及生物制药以及肿瘤耐药性检测应用技术领域，具体涉及一种靶向mir-493/hif-1α/pdk1制备药耐药性药物的应用。


背景技术：

2.铬广泛存在于自然界，其存在的主要形式分别为三价铬和六价铬，其中六价铬cr(vi)具有毒性，cr(vi)的产生大部分源于工业生产，如不锈钢生产、焊接、镀铬、颜料和染料以及铬酸盐化合物等，诱发的癌症有肺癌、鼻癌和鼻窦癌等。目前，cr(vi)已被国际癌症研究机构(iarc)确认为i类致癌物。cr(vi)可通过等电和等结构阴离子转移通道进入细胞，在细胞中cr(vi)被还原成三价铬，三价铬可与核酸和蛋白质形成稳定的络合物，导致dna损伤且干扰dna修复，从而诱导癌症的发生。相关研究报道，cr(vi)致癌的机制包括cr(vi)诱导的氧化应激、dna损伤和调控表观遗传修饰等。基于已有的cr(vi)的致癌机制，有研究表明cr(vi)可通过调节关键信号通路、microrna失调、组蛋白修饰和dna甲基化等影响癌症的发生发展。
3.微小rnas(micrornas、mirnas)是约为21-22个核苷酸长的非编码rna家族，通过与靶基因的3’非翻译区(3
’‑
utr)中的互补序列结合，调控靶基因的转录。mirnas通过抑制靶基因的表达进而调控肿瘤的发生发展。研究表明，mir-143通过调节il-6/hif-1α及其下游信号通路抑制crt细胞的增殖和血管生成，即cr(vi)能够导致mirnas的失调从而调控细胞的恶性转化。以往研究中，mir-493的表达水平在肝癌、大肠癌、舌鳞癌、肺癌及结直肠癌等癌症中显著降低。
4.有研究表明丙酮酸脱氢激酶1(pdk1)在乳腺癌、卵巢癌、胶质瘤、大肠癌和胃癌等多种人类恶性肿瘤中的表达水平显著升高，并调控肿瘤细胞的发生发展，且是糖酵解过程中的主要调控分子。pdk1是pdk家族的一员，是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是磷酸化和失活丙酮酸脱氢酶(pdh)e1α的主要成员。pdk1抑制pdh a1，阻断丙酮酸生成乙酰辅酶a，无法进入tca循环量，而促使丙酮酸主要转化为乳酸。缺氧诱导因子-1α(hif-1α)是一种转录因子，在肿瘤的发生发展中起重要作用，在多种肿瘤中显著高表达。
5.我们的研究发现，人肺支气管上皮细胞beas-2b(b2b)经cr(vi)长期诱导后得到的人肺支气管上皮恶性转化的细胞beas-cr(crt)，其与b2b细胞相比，丙酮酸脱氢酶激酶1(pdk1)的表达水平显著升高。crt细胞中糖酵解水平较b2b细胞显著升高。同时mir-493在crt细胞中较b2b细胞表达水平显著降低，且mir-493的低表达介导了hif-1α和pdk1的表达水平升高。本研究通过探究pdk1、mir-493和hif-1α对crt细胞的葡萄糖摄取、乳酸产生、细胞增殖、细胞迁移和克隆形成等生物学功能的影响，为铬接触职业病的早期诊断和预防癌变提供新思路。


技术实现要素：

6.为解决上述技术问题，本发明提供一种靶向mir-493/hif-1α/pdk1制备药耐药性
药物的应用，包括mir-493、hif-1α和pdk1在制备治疗铬暴露导致的肺癌药物中的应用。
7.优选的：所述治疗铬暴露导致的肺癌药物包含靶向mir-493、hif-1α和pdk1的药物、载体和助剂。
8.优选的：所述逆转肿瘤多药耐药性药物可制备成片剂、颗粒、胶囊或溶液形态。
9.优选的：所述肿瘤耐药性检测包括以mir-493、hif-1α和pdk1为靶点或者以下游主要调控分子为靶点的检测试剂或检测试剂盒。
10.优选的：所述载体优选自乳糖、淀粉、明胶、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮和水中的一种或两种以上。
11.优选的：所述助剂包括蹦解剂、抗黏剂、润滑剂、黏合剂和助溶剂中的一种或两种以上。
12.优选的：所述崩解剂优选淀粉或微晶纤维素。
13.优选的：所述抗黏剂和润滑剂优选滑石粉、胶体硅胶、硬脂酸甘油酯、硬脂酸钙或镁粉。
14.优选的：所述助溶剂优选甲磺酸、富马酸、山梨醇单月桂酸酯、单硬脂酸酯或单油酸酯。
15.本发明的技术效果和优点：
16.(1)、pdk1能够促进crt细胞的葡萄糖摄取、乳酸产生、细胞增殖、细胞迁移和克隆形成。
17.(2)、在crt细胞中mir-493靶向调控pdk1，mir-493的低表达增强crt细胞的葡萄糖摄取、乳酸产生、细胞增殖、细胞迁移和克隆形成能力。
18.(3)、在crt细胞中mir-493通过调节hif-1α促进pdk1的表达水平，进一步增强crt细胞的葡萄糖摄取、乳酸产生、细胞增殖、细胞迁移和克隆形成能力。
19.(4)、cr(vi)通过mir-493/hif-1α/pdk1信号通路调控细胞的沃伯格效应和肿瘤生长。
附图说明
20.图1为b2b和crt细胞中pdk1的表达水平及pdk1与肺癌患者总生存期的关系；
21.图2为b2b和crt细胞中葡萄糖的摄取和乳酸的产生；
22.图3为沉默pdk1抑制crt细胞葡萄糖摄取及乳酸产生；
23.图4为沉默pdk1抑制crt细胞的增殖能力；
24.图5为双荧光素酶报告基因实验验证mir-493靶向调节pdk1；
25.图6为过表达mir-493抑制pdk1的表达水平；
26.图7为双荧光素酶报告基因实验验证mir-493靶向调节hif-1α；
27.图8为hif-1α在crt细胞中的表达水平显著升高；
28.图9为过表达mir-493抑制hif-1α的表达水平；
29.图10为过表达mir-493在体内抑制crt细胞的生长；
30.图11为过表达mir-493后细胞对ddp的药物敏感性。
具体实施方式
31.下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。本发明的实施例是为了示例和描述起见而给出的，而并不是无遗漏的或者将本发明限于所公开的形式。很多修改和变化对于本领域的普通技术人员而言是显而易见的。选择和描述实施例是为了更好说明本发明的原理和实际应用，并且使本领域的普通技术人员能够理解本发明从而设计适于特定用途的带有各种修改的各种实施例。
32.实施例1：
33.请参阅图1～10，在本实施例中提供一种靶向mir-493/hif-1α/pdk1制备药耐药性药物的应用，为了寻找cr(vi)致癌的关键因子，我们提取亲本细胞b2b和cr(vi)长期诱导并恶性转化的crt细胞的蛋白质并进行质谱分析，筛选出差异蛋白。实验结果显示，在crt细胞中pdk1的表达水平较b2b细胞升高最为显著(图1a)。
34.为了验证pdk1在crt细胞中的高表达，我们通过western blot检测了b2b和crt细胞中pdk1的表达水平，结果表明与b2b细胞相比pdk1在crt细胞中的蛋白表达水平显著升高(图1b)。我们利用kaplan-meier(http://kmplot.com/)数据库进行生存分析，研究pdk1的表达水平与肺癌患者总生存期的关系，结果表明pdk1异常高表达的肺癌患者总体生存期较短(图1c)。
35.实施例2：
36.pdk1是糖酵解过程中关键的调节因子，可抑制丙酮酸生成乙酰辅酶a通过三羧酸循环产生能量，促使葡萄糖代谢为乳酸。我们利用葡萄糖检测试剂盒检测了b2b和crt细胞中葡萄糖的摄取水平，结果显示与b2b细胞相比crt细胞中葡萄糖的摄取水平显著增加(图2a)。葡萄糖的摄取和乳酸的产生水平增加是糖酵解的两个主要表现，因此，我们利用乳酸检测试剂盒检测了b2b和crt细胞中乳酸的产生水平，发现与b2b细胞相比crt细胞中乳酸的产生水平显著增加(图2b)。以上结果提示，crt细胞的糖酵解水平升高可能与pdk1的表达水平升高有关。
37.实施例3：
38.为了进一步探讨pdk1在crt细胞中对葡萄糖摄取和乳酸产生的影响，我们在crt细胞中沉默了pdk1后检测细胞内葡萄糖摄取和乳酸产生的水平，如图3a所示，在crt细胞中沉默pdk1后，pdk1的蛋白表达水平显著降低。葡萄糖检测试剂盒检测crt细胞中葡萄糖摄取水平，结果显示与siscr对照组相比沉默pdk1显著抑制了crt细胞中葡萄糖摄取水平(图3b)。利用乳酸检测试剂盒检测crt细胞的乳酸产生水平，结果表明与siscr对照组相比沉默pdk1显著抑制了crt细胞的乳酸产生(图3c)。
39.实施例4：
40.为了探讨pdk1对crt细胞增殖能力的影响，我们在crt中沉默pdk1后检测了细胞的增殖能力，结果显示在crt细胞中sipdk1组细胞的增殖能力显著低于siscr对照组细胞(图4)。
41.实施例5：
42.为了探讨mir-493能否靶向调节pdk1在crt细胞中的表达，我们通过targetscan(http://kmplot.com/)在线数据库预测了mir-493与pdk13
’‑
utr的结合位点，结果显示在pdk1的3
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utr区域存在mir-493的结合位点(图5a)。我们将野生型pdk13
’‑
utr区及其突变
序列克隆到pmirglo报告载体中。双荧光素酶报告实验结果表明，过表达mir-493后pdk1的野生型(wt)荧光素酶报告基因活性显著降低，而对突变型(mt)荧光素酶报告基因荧光素酶活性无明显变化(图5b)，差异具有统计学意义(**p《0.01)。以上结果表明mir-493通过靶向pdk1的3
’‑
utr区域直接抑制pdk1的表达水平。
43.实施例6：
44.为了探究mir-493对pdk1表达水平的影响，我们构建了稳定过表达mir-nc和mir-493的crt细胞(crt/mir-nc和crt/mir-493)，通过qpcr实验验证构建效果(图6a)。利用westernblot实验检测crt/mir-493稳定过表达细胞株中pdk1的表达水平，结果显示与crt/mir-nc对照组细胞株相比，在crt细胞中过表达mir-493显著抑制了pdk1的蛋白表达水平(图6b)。
45.实施例7：
46.为了研究mir-493对hif-1α的调控作用，我们通过targetscan预测到mir-493能与hif-1α的3
’‑
utr区域结合，将hif-1α的3
’‑
utr区域野生型序列及其突变序列分别克隆到pmirglo报告载体中(图7a)。为了验证mir-493是否直接靶向hif-1α，我们利用双荧光素酶报告实验检测，结果表明过表达mir-493后hif-1α的野生型荧光素酶报告基因活性显著降低，而对突变型荧光素酶报告基因活性无明显变化(图7b)，差异具有统计学意义(*p《0.05)。以上结果表明mir-493通过靶向hif-1α的3
’‑
utr区域直接抑制hif-1α的表达水平。
47.实施例8：
48.在b2b和crt细胞中我们检测了hif-1α的蛋白表达水平，如图8a-b显示，相比于b2b细胞hif-1α在crt细胞中的蛋白水平显著升高。
49.实施例9：
50.为了明确mir-493对hif-1α表达水平的调控作用，我们在crt细胞中过表达mir-493后检测了hif-1α的表达水平，研究结果显示过表达mir-493显著抑制了hif-1α的蛋白表达水平(图9a-b)。
51.实施例10：
52.为了研究mir-493在体内对crt细胞生长的影响，将稳定过表达crt/mir-493细胞株和crt/mir-nc对照细胞株皮下注射到裸鼠两侧腋下。在注射后第4天到第21天每天测量并记录肿瘤大小，实验结束后收集各组crt移植瘤组织。实验结果显示，过表达mir-493显著抑制了crt细胞在裸鼠体内的生长(图10a-c)，差异具有统计学意义(*p《0.05)。
53.实施例11：
54.为了研究mir-493对crt细胞生长的影响，我们在crt细胞中过表达mir-493后，通过cck8的方法检测细胞对ddp敏感性的变化。如图11所示，在crt细胞中过表达mir-493后，细胞对ddp的敏感性显著增加，差异具有统计学意义(*p《0.05)。
55.本发明通过体外和体内实验，从功能、细胞、蛋白等多个水平进行实验，证明靶向mir-493、hif-1α和pdk1介导铬暴露引起的肺癌的发生发展。
56.显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域及相关领域的普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应属于本发明保护的范围。本发明中未具体描述和解释说明的结构、装置以及操作方法，如无特别说明和限定，均按照本领域的常规手段进行实施。