三尖杉酯碱用于制备抗新型冠状病毒药物的应用的制作方法

1.本发明属于抗病毒药物制备技术领域，具体涉及三尖杉酯碱用于制备抗新 型冠状病毒药物的应用。


背景技术：

2.由新型冠状病毒(sars-cov-2)引发的疾病临床分型为轻型、普通型、重 型和危重型，以发热、干咳、乏力等为主要表现，少数患者伴有鼻塞、流涕、 腹泻等上呼吸道和消化道症状，临床病死率高，预后极差。sars-cov-2入侵宿 主细胞的第一步是“膜融合”，具体过程是病毒s蛋白通过与血管紧张素转化酶 2(ace2)结合，并且被宿主细胞ii型跨膜丝氨酸蛋白酶(tmprss2)裂解后， 启动入侵宿主细胞过程。
3.新冠病毒变异株b.1.1529，主要因为病毒s蛋白上出现了30多个突变点， 其中受体结合区rbd就有10个。该新冠病毒变异株可能“逃逸”由现有疫苗 产生的抗体识别，而“顺利”入侵宿主细胞，造成更迅速、更严重的传播。而 新冠病毒持续变异对疫苗和抗体药物将产生显著降效影响，但对小分子药物尤 其针对新冠病毒s蛋白的药物将不受此影响。所以，目前要大力开发小分子拮 抗剂，或多靶标阻断剂。目前针对入胞关键蛋白的药物以大分子中和抗体为主， 临床疗效不确定，已有的抗新冠病毒小分子药物研发主要针对病毒入胞后的复 制环节，在病毒进入宿主细胞后发挥作用，暂未发现以sars-cov-2入胞关键 蛋白为靶标的小分子有效药物。因此，急需开发有效抑制病毒入胞的小分子治 疗药物，可在病毒入侵初期拒病毒于宿主细胞之外。
4.三尖杉又称榧子、白头杉、崖头杉或岩杉，为粗榧科植物。三尖杉枝叶含 有生物碱，从中提取分离获得三尖杉酯碱，分子式为c
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o9n，可抑制真核细 胞内蛋白质的合成，使多聚核糖体解聚，是干扰蛋白质合成的抗癌药物，并且 与烷化剂及嘌呤类无交叉耐药。临床用于治疗急性早幼粒细胞白血病、急性单 核细胞性白血病、急性粒细胞性白血病及恶性淋巴瘤等。
5.但是，三尖杉酯碱作为抗sars-cov-2肺炎药物的用途当前研究的空白点。


技术实现要素：

6.为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供三尖杉酯碱用于制 备抗新型冠状病毒药物的应用。
7.为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
8.本发明公开了三尖杉酯碱在制备抗sars-cov-2的药物中的应用。
9.优选地，所述的药物为能够与细胞tmprss2酶和/或sars-cov-2的s蛋 白特异性结合的药物。
10.进一步优选地，所述的药物为以细胞tmprss2酶为靶标的抗病毒药物。
11.进一步优选地，所述的药物为以sars-cov-2的s蛋白为靶标的抗病毒药 物。
12.进一步优选地，所述的药物为以细胞tmprss2酶及sars-cov-2的s蛋 白作为双靶
标的抗病毒药物。
13.优选地，所述的药物为抑制sars-cov-2病毒侵染vero e6细胞的药物。
14.优选地，所述的药物为抑制sars-cov-2病毒delta 630毒株侵染vero e6 细胞的药物。
15.优选地，所述药物为抑制sars-cov-2假病毒侵染ace2高表达细胞能力 的药物。
16.优选地，所述药物为抑制sars-cov-2假病毒侵染ace2/tmprss2共同 高表达细胞能力的药物。
17.本发明公开了一种抗新型冠状病毒的药物，所述药物是由三尖杉酯碱和药 学上可接受的辅料制成的制剂。
18.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
19.本发明公开了三尖杉酯碱在制备抗sars-cov-2药物中的应用，药物通过 sars-cov-2-sh/cmc模型及tmprss2h/cmc模型分析，确定了三尖杉酯碱与 sars-cov-2的s蛋白和细胞tmprss2酶的结合特异性；利用sars-cov-2假 病毒侵染ace2高表达细胞和ace2/tmprss2共同高表达细胞，证实药物具 有双靶标的特性；利用sars-cov-2原始株及delta 630突变株感染vero e6细 胞，证实药物具有显著抗sars-cov-2效果，且对delta 630突变株的抑制作用 更为敏感。以上实验结果充分明确了三尖杉酯碱能够与sars-cov-2的s蛋白 和tmprss2酶特异性结合，可阻止sars-cov-2与宿主细胞膜融合，具备抗 sars-cov-2肺炎药物的功效，能够用于抗sars-cov-2药物的制备。
具体实施方式
20.为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明的实 施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅 仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例， 本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例， 都应当属于本发明保护的范围。
21.需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书中涉及的术语“包括”和“具有
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以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤 或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单 元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的 其它步骤或单元。
22.本发明所用到的三尖杉酯碱，分子式为c
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o9n，cas号26833-85-2。 购买自宝鸡辰光生物科技有限公司；
23.ace2高表达细胞购自吉满生物科技(上海)有限公司；
24.sars-cov-2的s蛋白高表达的hek293t细胞购自上海诺百生物科技有 限公司；
25.tmprss2高表达的hek293t细胞购自上海诺百生物科技有限公司；
26.tmprss2慢病毒购自上海诺百生物科技有限公司；
27.sars-cov-2的s蛋白和绿色荧光蛋白共高表达的hek293t细胞购自上 海诺百生物科技有限公司；
28.sars-cov-2假病毒来源于上海诺百生物科技有限公司；
29.delta 630突变株来源于中国科学院武汉病毒研究所。
30.实施例1三尖杉酯碱与sars-cov-2的s蛋白和细胞tmprss2蛋白有 特异性结合
31.cmc是一种亲和色谱，以特定受体过表达细胞膜为固定相，可以实现仿生条件下高通量筛选与膜受体特异性结合的组分，是筛选中药有效成分的可靠手段。分别使用sars-cov-2的s蛋白和细胞tmprss2酶高表达的hek293t细胞，制备细胞膜，与活化的硅胶吸附制备细胞膜色谱固定相，湿法装柱后分别得到sars-cov-2-sh/cmc色谱柱和tmprss2h/cmc色谱柱进行hplc检测，hek293t/cmc为蛋白特异性结合的cmc对照。结果如表1所示：
32.表1三尖杉酯碱在多种细胞膜色谱上的保留时间
[0033][0034]
从表1中可以看出，三尖杉酯碱在sars-cov-2的s蛋白和细胞tmprss2酶高表达细胞膜色谱柱上有保留，在hek293t/cmc对照色谱柱上无保留。上述结果表明，三尖杉酯碱与sars-cov-2的s蛋白和细胞tmprss2酶均有良好的特异性结合作用。
[0035]
实施例2三尖杉酯碱抑制s蛋白与ace2结合诱导的细胞膜融合
[0036]
ace2高表达细胞接种于96孔板，每孔补齐培养基至50μl。37℃，5％co2培养箱中培养2个小时贴壁。分别加入用培养基配制的浓度分别为0、0.625、1.25、2.5、5和10μm的三尖杉酯碱，并且加入50μl高表达s蛋白和绿色荧光蛋白(gfp)的hek293t细胞，继续感染8h后，进行荧光显微镜观察。观察可见，未给药组ace2高表达细胞与高表达s蛋白和gfp的hek293t细胞发生膜融合形成多个细胞的合胞体。当给药组三尖杉酯碱药物浓度达到1μm后，合胞体数量显著减少，单个细胞之间界限清晰。表明三尖杉酯碱在浓度达到1μm时，具有明显的抑制sars-cov-2的s蛋白与ace2结合诱导的细胞膜融合。
[0037]
实施例3三尖杉酯碱抑制sars-cov-2假病毒侵染ace2高表达细胞
[0038]
ace2高表达细胞接种于96孔板，每孔补齐培养基至50μl。37℃，5％co2培养箱中培养2个小时贴壁。分别加入用培养基配制的不同浓度的三尖杉酯碱，每孔加入5μlsars-cov-2假病毒感染4h，补足至100μl培养体积，继续感染6-8h后，换为200μl新的完全培养基，继续37℃培养48h。luciferaseassaysystem试剂盒检测luciferase发光值。结果参见表2：
[0039]
表2三尖杉酯碱抑制sars-cov-2假病毒侵染ace2高表达细胞
[0040][0041]
从表2中可以看出，三尖杉酯碱对sars-cov-2假病毒侵染能力具有抑制作用且具有剂量依赖性，其ic
50
为0.78
±
0.46μm。
[0042]
实施例4三尖杉酯碱抑制sars-cov-2假病毒侵染ace2/tmprss2共同高表达细胞
[0043]
将ace2高表达细胞以70％-80％密度接种于24孔板，每孔补齐培养基至500μl。贴
壁过夜后，加入50μl tmprss2慢病毒，表达48小时后，成功构 建ace2/tmprss2共同高表达细胞。
[0044]
ace2/tmprss2共同高表达细胞接种于96孔板，每孔补齐培养基至50μl。 37℃，5％co2培养箱中培养2个小时贴壁。分别加入用培养基配制的不同浓度 的三尖杉酯碱，每孔加入5μl sars-cov-2假病毒感染4h，补足至100μl培 养体积，继续感染6-8h后，换为200μl新的完全培养基，继续37℃培养48 h。luciferase assay system试剂盒检测luciferase发光值。
[0045]
结果如表3所示：
[0046]
表3三尖杉酯碱抑制sars-cov-2假病毒侵染ace2/tmprss2共同高表达细胞
[0047][0048]
可以看出，三尖杉酯碱可显著抑制sars-cov-2假病毒侵染 ace2/tmprss2共同高表达细胞，且具有剂量依赖性，其ic
50
为0.42
±
0.47μm， 小于实施例2中tmprss2低表达ace2细胞的ic
50
。充分说明三尖杉酯碱以 s蛋白和tmprss2为靶标发挥拮抗作用，协同抑制sars-cov-2假病毒侵染 ace2/tmprss2共同高表达细胞，相比单一靶点，三尖杉酯碱的双靶点阻断作 用使其发挥更好的抗病毒活性。
[0049]
实施例5三尖杉酯碱抑制sars-cov-2病毒侵染vero e6细胞
[0050]
vero e6细胞接种于96孔板，每孔补齐培养基至50μl。37℃，5％co2培 养箱中培养2个小时贴壁。分别加入用培养基配制的不同浓度的三尖杉酯碱与 sars-cov-2病毒或delta 630毒株共同培养72h。通过rt-pcr法检测病毒载 量，拍照观察细胞病变效应(cytopathic effect,cpe)评价三尖杉酯碱对sars
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cov-2病毒及delta 630毒株侵染vero e6细胞的抑制效果。
[0051]
vero e6细胞在经sars-cov-2或其delta 630突变株感染后，大量细胞死 亡，而在三尖杉酯碱干预后，sars-cov-2或其delta 630毒株对细胞的影响较 小，细胞状态良好，可显著抑制sars-cov-2病毒及delta 630毒株侵染造成的 细胞死亡，如表4所示：
[0052]
表4三尖杉酯碱抑制sars-cov-2病毒原始株及delta 630突变株侵染vero e6细胞
[0053][0054]
从表4中结果可以看出，三尖杉酯碱可显著抑制被感染细胞中病毒载量。
[0055]
综上所述，通过sars-cov-2-sh/cmc模型及tmprss2h/cmc模型分析， 确定了三尖杉酯碱与sars-cov-2的s蛋白和细胞tmprss2酶的结合特异性； 利用sars-cov-2假病毒侵染
ace2高表达细胞和ace2/tmprss2共同高表 达细胞，证实药物具有双靶标的特性；利用sars-cov-2原始株及delta 630突 变株感染vero e6细胞，证实药物具有显著抗sars-cov-2效果。以上技术明 确了三尖杉酯碱具备抗sars-cov-2肺炎药物的功效，能够用于抗sars-cov
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2药物的制备三尖杉酯碱能够与sars-cov-2的s蛋白及细胞tmprss2酶特 异性结合，具有良好的抗sars-cov-2能力，可用于抗sars-cov-2病毒药物 的制备。
[0056]
以上内容仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围， 凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入 本发明权利要求书的保护范围之内。