神香草挥发油的分析方法及在制备治疗激素抵抗性哮喘药物中的应用与流程

1.本发明属于医药领域，更具体地，涉及一种神香草挥发油的分析方法及在制备治疗激素抵抗性哮喘药物中的应用。


背景技术：

2.激素抵抗型哮喘(steroid resistant asthma，sra)，是指口服糖皮质激素(glucocorticoids,gc)治疗无效或效果不佳的哮喘。迄今为止，sra的发病机制仍尚未完全明确。已探明的产生gc抵抗效应的机制包括：糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,gr，grα和grβ是gr的两种主要亚型)异常、免疫调剂机制失衡、组蛋白乙酰化酶活性异常、热休克蛋白hsp90异常、转录因子ap-1以及nf-κb异常等。
3.gr异常主要表现为grβ表达升高、gc-grα亲和力下降、grα核易位异常以及gr磷酸化。其中，grα可与gc结合形成gc-grα二聚体复合物，从胞质转移至胞核，并与胞核内gc反应元件上的dna结合，发挥效应。而grβ是grα的内源性拮抗剂，可竞争性结合grα形成异源二聚体，阻碍grα与gc的结合，从而抑制gc效应的正常发挥。
4.免疫失衡的主要表现为t细胞功能异常，包括th17表达增高和th1/th2表达失衡，涉及到多种炎症因子，如il-2、il-4、il-13、il-17、ifn-γ、ige等。其中，th17/il-17可诱导上皮细胞、支气管纤维母细胞、平滑肌细胞等分泌il-6、il-8及g-csf，促进中性粒细胞的产生、成熟、趋化和聚集，诱导气道炎症的发生。此外，th17还可促进grβ的表达导致sra产生。
5.中性粒细胞占比增加是sra病理特征之一。研究表明，中度及重度哮喘患者对gc不敏感，可能是因为gc阻碍了中性粒细胞的凋亡；同时中性粒细胞可分泌大量的tnf-α，大大降低机体对gc的敏感性。
6.sra在临床治疗上尚无特效药。sra患者对gc敏感性低或者不敏感，而使用大剂量的gc类药物又很有可能出现类库欣综合征等副作用。因此，目前可用于暂时缓解sra症状的药物包括：1)支气管扩张类药物，如长效β受体激动剂、吸入抗胆碱能药物、甲氨蝶呤、茶碱、白三烯受体拮抗剂等，主要作用为扩张支气管。但长效β受体激动剂需要与其他非激素抗过敏药物联合应用；吸入抗胆碱能药物、白三烯受体拮抗剂只对部分患者有效；甲氨蝶呤对消化系统、骨髓和肾有损伤，大剂量使用时还具有肝毒性。2)免疫抑制剂，如环孢菌素a、免疫球蛋白等，可减少sra患者的激素用量，但免疫抑制剂价格昂贵，且副作用大。环孢菌素a具有肝肾毒性、高血压、周围神经炎等副作用，且需要长期应用，停用后哮喘便会复发；而免疫球蛋白的使用剂量和频率又缺少大量研究资料的支撑。因此，有必要寻找一种药物，不仅能够从根源上有效治疗sra，减轻患者症状，而且副作用要小。
7.神香草为唇形科植物硬尖神香草(hyssopus cuspidatus boriss.)的干燥地上部分，主产于新疆北部山区(阿尔泰地区盛产)、新疆南部和田地区，是维吾尔医常用药材。《中华本草
·
维吾尔药卷》中记载，神香草有温肺平喘，祛寒止咳，燥湿祛痰，发汗解毒，消炎退肿的功效，主治湿寒性和粘液质性呼吸器官疾病，如寒性哮喘，咳嗽感冒，湿性痰多，乃孜来
毒液流窜胸肺，胸膜炎，气管炎，肺炎及水肿。神香草全株含挥发油，具有痉挛停生物碱样作用，可使支气管痉挛解除，具有止咳、平喘、祛风寒、杀菌的作用。
8.气相色谱和高分辨质谱串联技术是目前挥发性成分的最新分析技术。agilent 7890b gc/7250q-tof系统具有宽动态范围，可为适合气相色谱分析的化合物鉴定和定量提供全谱、高分辨率的精确质量数据。这款高分辨率gc/q-tof可通过gc/ms进行精确质量筛查，并可通过ms/ms、低能量电子轰击电离和互补化学电离技术提供增强的化合物鉴定。agilent7890b gc/7250q-tof是一种混合四极正交飞行时间的质谱，包含了四极(ms-1)的简易性和正交飞行时间分析仪(ms-2)的高效率。q-tof ms通过正交飞行时间来同时检测穿过所有质量范围的离子。仪器的灵敏度可以达到串联四极质谱的100倍。这个强劲微量系统的质荷比在ms和ms/ms模式下都超过m/z 20000，为测试提供了大量的分子作为多电荷离子。高分辨能力(10,000fwhm)提高了多电荷离子电荷状态识别的质量检测准确性,并且能更好的区分等压种类。
9.我们分析发现，神香草挥发油中含有丰富的萜类成分。研究证明，萜类成分具有很好的抗炎活性。而神香草挥发油对sra的治疗作用未见报道。因此，结合sra可能的发病机制，有必要提供一种神香草挥发油的分析方法及在制备治疗激素抵抗性哮喘的药物中的应用，对神香草挥发油治疗激素抵抗性哮喘的疗效做整体评估。


技术实现要素：

10.本发明的目的在于提供一种神香草挥发油的分析方法及在制备治疗激素抵抗性哮喘药物中的应用。采用全二维气相色谱串联高分辨质谱(gc x gc-q/tof ms/fid)解析其化学成分及相对含量；以实验室balb/c小鼠为研究对象，对激素抵抗性哮喘的多个药效学指标进行研究，旨在系统的评价神香草挥发油对激素抵抗性哮喘的治疗效果。
11.根据本发明第一方面，提供了一种神香草挥发油的应用，用于制备治疗激素抵抗性哮喘药物。
12.优选地，所述神香草挥发油用于减少激素抵抗性哮喘炎症细胞数量。
13.优选地，所述神香草挥发油用于抑制激素抵抗性哮喘白细胞介素-17和粒细胞集落刺激因子的表达。
14.优选地，所述神香草挥发油用于抑制激素抵抗性哮喘杯状细胞增生以及气道黏液过度分泌。
15.根据本发明另一方面，提供了一种神香草挥发油化学成分的分析方法，包括以下步骤：
16.(1)采用二维气相色谱与高分辨质谱进行联用对神香草挥发油进行检测，得到二维色谱图和质谱图；所述二维气相色谱在先使用的是db-wax色谱柱，在后使用的是db-17色谱柱；所述二维气相色谱的初始化温度为30℃-80℃，保持1min-10min，然后以1℃/min-10℃/min的升温速率升至200℃-300℃，保持1min-10min；所述db-wax色谱柱和db-17色谱柱通过ssm1800型固态热调制器进行串联，调制周期为1s-30s；
17.所述高分辨质谱为四级杆-高分辨率飞行时间质谱，所述四级杆-高分辨率飞行时间质谱的离子源温度为150℃-300℃，四级杆温度为100℃-250℃，采集范围为40m/z-500m/z，采集速度为10amu/s-1000amu/s；
18.(2)将步骤(1)得到的二维色谱图中的色谱峰进行组分分析，得到可识别的色谱峰表，再单独打开每一个可识别色谱峰对应的质谱图，与nist谱库中的标准谱图进行比较，将相似性匹配阈值的正向匹配值和反向匹配值均大于750的峰鉴定为标准谱图中的标准物质。
19.优选地，所述二维气相色谱与氢火焰离子化检测器连接，并以氮气作为氢火焰离子化检测器的尾吹气；所述氢火焰离子化检测器的加热温度为200℃-300℃，尾吹气流量为10ml/min-50ml/min，空气流量为100ml/min-500ml/min，氢气流量为10ml/min-50ml/min。
20.优选地，鉴定得到的物质中含有31种萜类化合物、31种醇类化合物、17种酮类化合物、3种酯类化合物、7种醛类化合物、5种醚类化合物以及5种酚类化合物。
21.优选地，所述31种萜类为12种单萜和19种倍半萜。
22.总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：
23.(1)本发明提供了一种神香草挥发油的分析方法及在制备治疗激素抵抗性哮喘药物中的应用，实现了神香草挥发油成分的定性和相对定量分析，并通过多个药效学指标对神香草挥发油治疗激素抵抗性哮喘的疗效做出了系统的评价，对神香草挥发油单独或者联合用于治疗激素抵抗性哮喘具有重大意义。
24.(2)本发明提供了一种神香草挥发油的分析方法及在制备治疗激素抵抗性哮喘药物中的应用，阐述了神香草挥发油不仅可以显著减少激素抵抗性哮喘的炎症细胞数量，降低激素抵抗性哮喘il-17和g-csf的表达，减小激素抵抗性哮喘肺支气管和血管周围的炎症细胞浸润面积，还可减少激素抵抗性哮喘肺支气管杯状细胞的增生和气道粘液的过度分泌。
附图说明
25.图1为神香草挥发油二维气相分离的轮廓图(a)和三维图(b)。
26.图2为小鼠激发过程中的体重变化图。
27.图3为小鼠balf和外周血白细胞分类计数图。
28.图4为小鼠balf和肺组织炎症因子il-17和g-csf表达变化图。
29.图5为小鼠肺组织he、pas染色图。
具体实施方式
30.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
31.本发明一种神香草挥发油的分析方法及在制备治疗激素抵抗性哮喘药物中的应用，包括以下步骤：
32.步骤一：神香草挥发油化学成分定性和相对定量分析
33.取神香草的干燥地上部分粉碎，参考2020版《中国药典》四部附录2204挥发油测定法提取挥发油，无水硫酸钠脱水后供gc x gc-q/tof ms/fid分析。gc x gc-q/tof ms/fid
检测数据采用雪景科技的canvas软件进行分析。
34.步骤二：建立激素抵抗性哮喘模型并分组给药
35.取实验雌性balb/c小鼠，适应性喂养一周后，随机等数分为4组，设置正常组、哮喘组、地塞米松组、挥发油组，并根据各组需求分别给药，给药频率为1次/d；
36.步骤三：研究神香草挥发油对激素抵抗性哮喘小鼠肺泡灌洗液balf和外周血中炎症细胞数量的影响
37.连续给药5d后，麻醉小鼠，采集眼球血，制作血涂片进行白细胞分类计数。收集balf，显微镜下进行炎症细胞计数和白细胞分类计数；
38.步骤四：研究神香草挥发油对激素抵抗性哮喘小鼠肺泡灌洗液balf和肺组织中il-17和g-csf浓度的影响
39.收集balf，酶联免疫法检测balf中il-17和g-csf的浓度；取小鼠右肺上叶组织，匀浆离心，取上清液检测il-17、g-csf的浓度；
40.步骤五：研究神香草挥发油对激素抵抗性哮喘小鼠肺组织病理学改变的影响
41.取小鼠左肺，浸泡于4％组织固定液固定48h，石蜡包埋，切片，he染色评定肺组织炎症程度，pas染色评定气道杯状细胞增生和粘液分泌情况；
42.步骤六：依据步骤二到步骤四的检测结果进行综合评估
43.进一步的，本发明中的一种神香草挥发油在制备治疗激素抵抗性哮喘药物中的应用，所述神香草挥发油的制备过程如下：称取约1.5kg神香草干燥药材于10l圆底烧瓶中，加蒸馏水6l后充分浸泡，使用挥发油提取器提取9小时，挥发油得率为0.33％(v/w)。无水硫酸钠干燥后用于gc x gc-q/tof ms/fid分析。0.4％cmc-na稀释后用于小鼠灌胃给药。
44.进一步的，本发明中的一种神香草挥发油在制备治疗激素抵抗性哮喘药物中的应用，gc x gc-q/tof ms/fid检测条件如下：气相色谱使用db-wax柱(30m x 250μm x 0.25μm，美国安捷伦科技公司)和db-17柱(0.78m x 180μm x 0.18μm，美国安捷伦科技公司)，两根色谱柱通过ssm1800型固态热调制器进行串联，调制周期为6s，不分流。程序升温：初始化温度50℃，保持2min，然后以5℃/min的升温速率升至260℃，保持3min。
45.质谱为四级杆-高分辨率飞行时间质谱串联。离子源温度：200℃，四级杆温度：150℃，离子源电压：70ev，质量采集范围：45-400m/z，采集速度：20amu/s，检索谱库为nist 17。
46.同时串联氢火焰离子化检测器。氮气作为尾吹气，加热温度为280℃，尾吹气流量为25ml/min，空气流量为400ml/min，氢气流量为30ml/min。
47.进一步的，本发明中的一种神香草挥发油在制备治疗激素抵抗性哮喘药物中的应用，神香草挥发油化学成分分析条件如下：gc x gc-q/tof ms/fid检测数据采用雪景科技的canvas软件进行分析。先在色谱图上完成色谱峰的化学结构解析，再将检测峰的质谱图和nist谱库中的标准谱图进行比较，相似性匹配阈值为750(最高为1000)，即正向匹配值和反向匹配值均大于750的峰才被认可。此外，精确质量数和保留指数作为辅助定性的手段，精确质量数误差限度为
±
5ppm，相对保留指数(ri＝100n 100(t
x-tn)/(t
n 1-tn),n为碳原子数，t
x
、tn为流出峰的保留时间，tn《t
x
《t
n 1
)误差范围为
±
5％。相对含量通过峰面积的fid检测积分值，进行相对定量分析，使用面积归一化法来计算相对含量。神香草挥发油二维气相分离的轮廓图和三维图如图1所示。
48.进一步的，本发明中的一种神香草挥发油在制备治疗激素抵抗性哮喘药物中的应
用，正常组不做任何处理，实验期间自由饮食饮水。
49.进一步的，本发明中的一种神香草挥发油在制备治疗激素抵抗性哮喘药物中的应用，所述哮喘组的处理手段如下：在第0、7、14d，腹腔注射0.2ml含30μg ova和1mg氢氧化铝的混悬液进行致敏；在第21d，滴鼻吸入20μg/10μl的lps；从第22d起，连续5天雾化吸入1％ova进行激发，30min/d。
50.进一步的，本发明中的一种神香草挥发油在制备治疗激素抵抗性哮喘药物中的应用，所述地塞米松组、挥发油组的处理手段如下：在第0、7、14d，腹腔注射0.2ml含30μg ova和1mg氢氧化铝的混悬液进行致敏；在第21d，滴鼻吸入20μg/10μl的lps；从第22d起，连续5天雾化吸入1％ova进行激发，30min/d。激发前30min给药，地塞米松组以1mg/ml的剂量腹腔注射0.1ml(给药剂量为5mg/kg)，挥发油组以4.8μl/ml的剂量灌胃0.2ml。
51.实验材料：
52.1、药材来源：
53.干燥的神香草药材采集自新疆塔城，经华中科技大学同济医学院药学院中药与天然药物学系方进波副教授鉴定为唇形科神香草属植物硬尖神香草hyssopus cuspidatus boriss.的干燥地上部分，植物标本(no.hcb20211201)存放于同济医学院药学院生药学研究室。
54.2、实验试剂：
[0055][0056][0057]
3、实验仪器：
[0058][0059]
4、实验动物
[0060]
品系balb/c来源购自三峡大学，合格证号为scxk(鄂)2017-0012体重6周龄，约18g性别雌性数量40只，每组10只
[0061]
实验步骤
[0062]
1、神香草挥发油的化学成分定性分析
[0063]
采用gc x gc-q/tof ms/fid对神香草挥发油中的挥发性成分进行检测，选择所匹配的物质正、反向匹配值均大于750的峰进行定性。采用强极性柱db-wax和中极性柱db-17组合，共鉴别出106种挥发性成分，如表1所示，包括31种萜类(12种单萜，19种倍半萜)，31种醇类化合物，17种酮类化合物，3种酯类化合物，7种醛类化合物，5种醚类化合物，5种酚类化合物和7种其他化合物。
[0064]
表1神香草挥发油成分gc x gc-q/tof ms/fid分析
[0065]
[0066][0067]
2、建立激素抵抗性哮喘模型并分组给药
[0068]
取健康的6周龄雌性balb/c小鼠40只，随机分为4组。
①
正常组(control)；
②
哮喘组(ova/lps)；
③
地塞米松组(dexa)；
④
挥发油组(volatile oil)。其中，
②③④
在第0、7、14d，腹腔注射0.2ml含有30μg ova和1mg氢氧化铝的混悬液进行致敏；在第21d，滴鼻吸入20μg/10μl的lps；从第22d起，连续5天雾化吸入1％ova进行激发，30min/d。其中，从第22d起，
③
组激发前30min腹腔注射1mg/ml剂量的地塞米松0.1ml(给药剂量为5mg/kg)；
④
组激发前30min灌胃给药4.8μl/ml剂量的挥发油0.2ml。
[0069]
各组小鼠在激发和给药过程中的体重变化如图2所示。与正常组相比，哮喘组小鼠的体重呈现逐渐降低的趋势。而与哮喘组相比，挥发油组小鼠的体重无显著变化。此外，地塞米松组小鼠体重降低，是因为地塞米松能够促进小鼠体内瘦素的合成，抑制脂肪合成酶的增加，从而阻断糖向脂肪的转化。
[0070]
3、神香草挥发油对激素抵抗性哮喘小鼠balf和外周血中炎症细胞数量的影响
[0071]
末次激发后24h，麻醉小鼠，摘取小鼠眼球取血，肝素钠管收集血液。取5μl滴于载玻片，瑞氏染色，显微镜下记录嗜酸性粒细胞(eosinphil,eos)和中性粒细胞(neutrophil)的百分比。小鼠摘取眼球后，立即进行气管插管。用1ml一次性注射器缓慢注入0.5ml生理盐水，抽洗3次，合并第2和3次balf于ep管中，2000rpm离心10min，取下层细胞重悬于1ml生理盐水中，显微镜下进行炎症细胞计数；取5μl滴于载玻片上，瑞氏染色后，在显微镜下记录eos及neutrophil的百分比。
[0072]
结果如图3所示。炎症细胞总数计数结果表明(图3中的a)，与正常组相比，哮喘组、地塞米松组balf中的白细胞总量均显著升高；与哮喘组相比，挥发油组balf中白细胞总数显著降低。
[0073]
balf中eos分类计数结果表明(图3中的b)，与正常组相比，哮喘组和地塞米松组eos比例显著升高；与哮喘组比较，挥发油组eos比例显著下降(p《0.001)。balf中neutrophil分类计数结果表明(图3中的c)，与正常组相比，哮喘组、地塞米松组neutrophil比例均显著升高(p《0.001)；与哮喘组相比，挥发油组neutrophil比例显著降低(p《0.001)。
[0074]
外周血中eos分类计数结果表明(图3中的d)，与正常组相比，哮喘组及地塞米松组eos比例均显著增多(p《0.001)；与哮喘组比较，挥发油组eos比例显著下降(p《0.001)。neutrophil分类计数结果表明(图3中的e)，与正常组相比，哮喘组、地塞米松组neutrophil比例均显著升高(p《0.001)；与哮喘组相比，挥发油组neutrophil比例明显降低(p《0.01)。
[0075]
4、神香草挥发油对激素抵抗性哮喘小鼠balf和肺组织中il-17、g-csf浓度的影响
[0076]
气管插管后，收集小鼠第1次balf，干冰速冻后，置于-80℃保存。酶联免疫法(elisa)测定balf中il-17、g-csf的浓度，实验步骤严格按照试剂盒操作说明进行。
[0077]
摘取小鼠右肺中叶以及附叶，干冰速冻后，-80℃保存。检测时，取肺组织匀浆，离心，提取上清液，酶联免疫法(elisa)测定上清液中il-17和g-csf的浓度，实验步骤严格按照试剂盒操作说明进行。
[0078]
il-17主要由th17细胞分泌，可直接作用于气道上皮细胞，参与糖皮质激素不敏感的气道高反应性及气道重塑的发生；il-17还可通过多种信号途径诱导下游炎性细胞分泌炎性因子，从而趋化neutrophil向炎症部位的聚集与浸润。g-csf由骨髓基质细胞产生，通过与neutrophil表面的g-csf受体发挥其生物学效应，包括调节neutrophil的增殖、分化、成熟等过程；同时，g-csf还可诱导neutrophil向炎症部位的聚集，提示g-csf作为il-17的下游表达产物，可能与il-17发挥协同作用，共同导致了激素抵抗型哮喘中，neutrophil在气管周围大量聚集的状况。
[0079]
实验结果如图4所示。balf elisa检测结果显示(图4中的a、图4中的b)。与正常组相比，哮喘组与地塞米松组il-17表达水平均明显升高(p《0.01)，g-csf表达水平均显著升高(p《0.001)。与哮喘组相比，挥发油组il-17和c-gsf的表达水平均得到了显著的抑制(p《0.001)。肺组织elisa结果显示(图4中的c、图4中的d)，与正常组相比，哮喘组与地塞米松组il-17、g-csf的表达水平均明显升高(p《0.01)。与哮喘组相比，挥发油组的il-17、c-csf表达水平均得到了明显抑制(p《0.01)。
[0080]
5、神香草挥发油对激素抵抗性哮喘小鼠肺组织病理学改变的影响
[0081]
截取小鼠左肺，浸泡于4％组织固定液固定48h，然后进行石蜡包埋，切片。he染色评定肺组织炎症程度，pas染色评定气道杯状细胞增生和粘液分泌情况；
[0082]
实验结果如图5所示。小鼠肺组织切片he染色结果显示，正常组肺部组织形态无明显异常现象，支气管及血管周围无炎症细胞浸润。与正常组比较，哮喘组及地塞米松组肺泡腔更为狭窄，且支气管及血管周围有大面积炎症细胞浸润。与哮喘组相比，挥发油组肺泡结构破坏情况得到了显著改善，支气管和血管周围的炎症细胞浸润面积显著减小。pas染色结果显示，正常组气管壁以及支气管腔内未被染色，提示无杯状细胞增生情况，腔道内无粘液细胞分泌。与正常组相比，哮喘组与地塞米松组支气管内壁上均有较多细胞染成紫红色，提示存在大量杯状细胞增生，且腔道内黏液分泌增加；与哮喘组相比，挥发油组支气管内壁几乎无染色细胞，提示杯状细胞增生以及气道黏液分泌情况得到了显著改善。
[0083]
综上所述，本研究结果表明，神香草挥发油对激素抵抗性哮喘有较好的治疗效果，其机制可能与减轻哮喘炎症反应有关，这为指导神香草挥发油治疗激素抵抗性的开发及临床用药提供了可靠的药理学依据。
[0084]
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。