一种抑制产毒黄曲霉菌的绿色方法与应用与流程

1.本发明涉及农产品或食品霉菌防治绿色方法，具体公开了一种基于可见光催化技术的抑制产毒黄曲霉菌方法与应用。


背景技术：

2.黄曲霉菌(aspergillus flavus)是自然界中最常见的土壤腐生真菌，可污染花生、玉米、棉籽等农作物及其产品，其中花生、玉米等极易被黄曲霉菌侵染。黄曲霉菌在生长过程中可产生多种有毒次级代谢产物，常见的主要包括黄曲霉毒素b1、b2、g1和g2等，它们具有强致癌性、致畸性及致突变性。其中，黄曲霉毒素b1是迄今为止发现的毒性最强真菌毒素，已被国际癌症研究机构列为ⅰ类致癌物。黄曲霉菌及其毒素的污染不仅严重威胁人类健康，而且造成巨大的经济损失，因此，花生等农产品食品中黄曲霉菌的污染防治具有重要意义。
3.防治黄曲霉菌污染的方法主要集中于生物、物理及化学方法。例如，专利cn 108850003 b公布了一种花生防霉剂及其防霉方法，该防霉剂的主要成分是由肉桂精油、茴香精油及牛至油，按一定比例混合成的复合精油，该复合精油能够抑制黄曲霉菌生长。此外，专利cn 107142217 b公布了一种生物农药，该发明提供的黄曲霉突变株可与产毒黄曲霉菌竞争，减轻产毒黄曲霉菌对农产品的污染。但随着高质量发展和产业需求，探寻一种绿色、高效和低能耗的防治黄曲霉菌污染方法具有非常重要的意义。
4.光催化技术是一种经济、温和、绿色技术，在能源、环境、医药、农业等领域有着重要应用前景。同时，研究学者们已开展了光催化技术在大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及黑曲霉等的杀菌或抑菌应用研究，但防治农产品食品真菌研究报道甚少。


技术实现要素：

5.本发明的目的是针对现有技术空白，提出一种基于可见光催化技术的绿色、高效抑制产毒黄曲霉菌的方法和应用，可用于产毒黄曲霉菌的防治。
6.为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
7.提供一种抑制产毒黄曲霉菌的绿色方法，将α-fe2o3纳米棒纳米材料与产毒黄曲霉菌未萌发或萌发后孢子进行接触后，在光源照射下，抑制产毒黄曲霉菌生长，进而降低黄曲霉毒素含量。
8.按上述方案，所述α-fe2o3纳米棒的长度为50-100nm。所述α-fe2o3纳米棒的制备方法为：将铁的前驱物与na2so4通过水热反应制备均匀的α-fe2o3纳米棒。
9.按上述方案，所述的光源包括太阳光、可见光光源、氙灯光源等。
10.按上述方案，采用氙灯光源时，氙灯功率为150～300w，光照波长范围为420～700nm，样品与氙灯光源距离为20～25cm。
11.按上述方案，光源照射时间为4～8h。
12.按上述方案，所述的光催化材料α-fe2o3纳米棒纳米材料的合成方法，将铁的前驱
物与na2so4通过水热反应制备均匀的α-fe2o3纳米棒，所述的水热反应条件为：在160～180℃条件下反应12～16h。具体地，所述铁的前驱物为fecl3·
6h2o，将fecl3·
6h2o和na2so4加入去离子水中，搅拌均匀后转入聚四氟乙烯内胆的反应釜中进行水热反应，将水热反应后所得固体经无水乙醇和水洗涤，然后干燥过夜。
13.按上述方案，所述的fecl3·
6h2o和na2so4的浓度比为1:1～1:1.2。
14.按上述方案，所述的抑菌剂的形式可为α-fe2o3粉末、悬浊液或α-fe2o3成膜分散在载体如sio2非金属载体上。
15.所述的α-fe2o3纳米棒光催化材料还可作为抑菌剂应用于花生产毒黄曲霉菌的防治，效果显著，降低花生中黄曲霉毒素含量。
16.一种抑制花生产毒黄曲霉菌绿色方法，将抑菌剂α-fe2o3纳米棒纳米材料和含产毒黄曲霉菌的花生接触，然后于光照下处理含产毒黄曲霉菌的农产品，抑制产毒黄曲霉菌生长，由此降低黄曲霉毒素污染风险，保障农产品质量安全。
17.上述方案，所述的农产品为花生、玉米等。
18.本发明提供了一种基于可见光催化技术的抑制黄曲霉菌的绿色方法，即通过简单的水热反应制备出稳定的光催化剂，在可见光照射下用于抑制花生等农产品产毒黄曲霉菌生长，减少毒素污染损失，保障花生等农产品质量安全。
19.本发明技术方案的优点：
20.1.本发明提出的方法可利用太阳光等可见光，绿色，低能耗，无污染且可规模化；抑菌剂制备方法简单，成本较低，且可回收利用，性能稳定。
21.2.本发明能高效抑制黄曲霉菌菌丝的生长及孢子萌发，抑制产毒黄曲霉菌生长，有效防治黄曲霉菌对农产品如花生等的污染，降低黄曲霉毒素的含量，用于农产品或食品霉菌的绿色防治，应用前景广阔。
附图说明
22.图1是本发明制备的α-fe2o3纳米材料实物照片。
23.图2是本发明α-fe2o3纳米材料的sem(a)及hrtem(b)图。
24.图3是本发明α-fe2o3纳米材料的xrd图。
25.图4是本发明α-fe2o3纳米材料的xps图。
26.图5是本发明不同浓度α-fe2o3纳米材料对产毒黄曲霉菌丝抑制图。
27.图6是本发明制备的α-fe2o3纳米材料对产毒黄曲霉菌未萌发(a,b,c,d)和萌发期(e,f,g,h)孢子抑制图。
28.图7是本发明制备的α-fe2o3纳米材料在氙灯光源照射不同时间条件下对产毒黄曲霉菌未萌发孢子抑制图。
29.图8是本发明制备的α-fe2o3纳米材料抑制花生产毒黄曲霉菌的效果图。
30.图9是本发明制备的α-fe2o3纳米材料处理的花生中黄曲霉毒素含量图。
31.表1是本发明回收4轮α-fe2o3纳米材料抑制产毒黄曲霉菌重复试验(抑菌圈)。
具体实施方式
32.下面结合具体实施例进一步详细的描述本发明，但不能将方案中所涉及的方法及
技术参数理解为对本发明的限制。
33.实施例1
34.光催化材料的制备：
35.取0.1mol fecl3·
6h2o和0.1mol na2so4均匀分散于200ml去离子水中，超声后取160ml上述混合溶液于聚四氟乙烯内胆的反应釜中，在160℃条件下反应12h。将水热反应后获得的固体用无水乙醇和去离子水洗涤3次，然后在60℃干燥过夜，研磨后即得到具有可见光响应性的氧化铁纳米材料(图1)。
36.图2是本发明制备的α-fe2o3纳米材料的sem及hrtem图，由图可见该纳米材料呈棒状，长度为100-200nm，形态均一。
37.图3是本发明制备的α-fe2o3纳米材料的xrd图，由图可知，制备的纳米材料的衍射峰与标准卡片jcpds no.01-089-0596一致。
38.图4是本发明制备的α-fe2o3纳米材料的xps图，由图可知，制备的纳米材料主要由 3价铁元素和-2价氧元素组成。
39.实施例2
40.产毒黄曲霉菌的活化：
41.将保藏的黄曲霉菌(aspergillus flavus 3.4408，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)孢子液接种于无菌曲霉素琼脂基础(afpa)培养基，于培养箱(28℃，90％rh)培养3d左右，至黄曲霉菌的底部呈橘黄色。
42.孢子悬浮液的制备：
43.用无菌牙签挑取黄曲霉菌丝接种于氯硝胺甘油(dg 18)琼脂培养基上，在培养箱(28℃，90％rh)培养1周左右。用无菌吐温-80(0.1％)收集黄曲霉菌孢子，在光学显微镜下用血球计数板计数，放置于冰箱保存备用。
44.产毒黄曲霉菌菌丝的抑制：
45.取2ml上述孢子悬浮液与198ml马铃薯葡萄糖琼脂(pda)培养基混合均匀，然后等分倒入无菌培养皿中。当培养基凝固后，于皿中心打孔。取100μl不同浓度的α-fe2o3(5、10、20mg ml-1
，分别对应图5a，5b，5c)分别加入孔中，于暗环境放置30min以达到吸附平衡后，置于太阳光下处理(采用可见滤光片控制波长范围420nm～700nm)，对照组用锡箔纸避光处理，7h后观察记录抑菌圈。如图5(d～h)中无明显抑菌圈，其中d条件为太阳光存在，但无催化剂，e，f，g条件为催化剂存在，但无光照，h为催化剂和光照均不存在条件，结果表明催化剂或太阳光缺一不可，单独存在几乎对黄曲霉菌无抑制作用。如图5(a～c)所示，当催化剂被太阳光激发后，其对黄曲霉菌具有明显的抑制作用。光催化剂浓度为10mg ml-1
时，抑菌圈直径为22.3
±
0.2mm，光催化抑菌效果最佳。
46.重复性和稳定性实验：
47.为了证明该光催化材料的抑菌稳定性，本研究进行了四次循环实验(表1)。在太阳光催化抑菌实验后，将α-fe2o3离心回收，用去离子水和乙醇洗涤，在80℃下烘干3h后再次用于光催化抑菌实验，重复4次(光催化剂浓度为10mg ml-1
)，结果如下表1。
48.表1
[0049][0050]
由实验结果可知，在循环使用4次后，α-fe2o3仍然具有较强的抑菌活性，抑菌圈大小差异不明显，性能稳定。
[0051]
实施例3
[0052]
产毒黄曲霉菌未萌发孢子的抑制效果评价：
[0053]
取100μl上述活化后的黄曲霉菌菌液和0.1g制备的α-fe2o3粉末于9.9ml无菌水中，将该混合液于暗环境搅拌30min至吸附平衡，光/暗处理方法同实施例2，光照7h。取1.0ml处理后的孢子悬浮液用无菌水稀释，涂布于麦芽提取物琼脂(mea)培养基上，于28℃培养24-28h后记录菌落数，抑菌率％＝(正常生长组菌落数—实验组菌落数)/正常生长组菌落数
×
100％，其中正常生成组为无光照、无抑菌剂存在条件。
[0054]
如图6a～6d所示，a为有太阳光无催化剂条件，b为催化剂和太阳光均存在，c为催化剂和光照均不存在，d为催化剂存在，但未光照。由图6a,d可知，仅用催化剂或太阳光处理活化后菌液时，菌落数几乎无差异；而图b菌落数较少明显，抑制率达60％，说明在太阳光照射下，α-fe2o3对未萌发孢子抑制率良好。
[0055]
产毒黄曲霉菌萌发期孢子的抑制效果评价：
[0056]
将实施例2中保存于冰箱的孢子接种于马铃薯葡萄糖肉汤(pdb)培养基中孵育8～9h，即得到萌发期黄曲霉菌孢子。取100μl上述萌发期孢子悬浮液和0.1g制备的α-fe2o3粉末于9.9ml无菌水中，将混合液于暗环境搅拌30min至吸附平衡，光/暗处理方法同实施例2。取1.0ml处理后的萌发期孢子悬浮液用无菌水稀释，涂布于麦芽提取物琼脂(mea)培养基上，于28℃培养24-28h后，记录菌落数(图6e～6h)，其中e为有太阳光无催化剂条件，f为催化剂和太阳光均存在，g为催化剂和光照均不存在，h为催化剂存在，但未光照。由图6e,g,h可知，菌落总数无明显差异，说明光照和催化剂缺一不可，而从6f可知，在太阳光照射下，α-fe2o3对萌发期黄曲霉菌孢子有较好的抑菌效果，抑制率≥70％。
[0057]
以上结果表明，该方法对未萌发和处于萌发期的黄曲霉菌孢子具有很好的抑制作用，且对萌发期的黄曲霉菌孢子抑制效果更高，可能是由于处于萌发期的孢子细胞结构发生变化，对外界环境抵御力降低。
[0058]
实施例4
[0059]
氙灯为光源，产毒黄曲霉菌未萌发孢子的抑制效果评价：
[0060]
取100μl上述活化后的黄曲霉菌菌液和0.1g制备的α-fe2o3粉末于9.9ml无菌水中，将该混合液于暗环境搅拌30min至吸附平衡，采用氙灯为光源，氙灯功率为300w，样品与氙灯光源距离为20～25cm。滤光片选取420nm～700nm范围光，然后光/暗处理方法同实施例2，光照不同时间。取1.0ml处理后的孢子悬浮液用无菌水稀释，涂布于麦芽提取物琼脂(mea)培养基上，于28℃培养24-28h后记录菌落数，抑菌率％＝(正常生长组菌落数—实验组菌落数)/正常生长组菌落数
×
100％，其中正常生成组为无光照、无抑菌剂存在条件。
[0061]
如图7所示，在氙灯光源照射下，随着照射时间延长，抑菌效果越来越好，7小时效果最好，而到8小时后，其效果与7小时差异不大，其原因为催化反应可能达到平衡，因此，氙
灯可见光照射7小时对未萌发孢子抑制率良好。
[0062]
实施例5
[0063]
花生产毒黄曲霉菌的抑制实验：
[0064]
收集大小均匀、完整的花生样品，灭菌后将其平均分为4组(10粒/组，约5g)。将黄曲霉菌孢子悬浮液接种于花生表面，自然干燥后，取100mgα-fe2o3粉末均匀撒于花生表面。太阳光处理后7h后，用筛子将花生与α-fe2o3粉末分离。然后将花生样品置于28℃培养1周，观察菌落生长情况。如图8(a,c,d)所示，花生表面被不同程度的覆盖灰绿色孢子，而图8(b)中则仅有少量花生被侵染，且孢子形成数较少，证明该方法能有效抑制花生黄曲霉菌。将培养1周的花生收集并灭菌(121℃，30min)，于烘箱中干燥(80℃，60min)。将干燥后的花生样品粉碎，称取1.00g上述花生粉末用甲醇提取，然后用免疫亲和柱富集，采用高效液相色谱(hplc)法测定上述花生样品中黄曲霉毒素(afb1，afb2，afg1，afg2)的含量(图9)。结果表明，在所有样品中，afb1的含量最高，但是太阳光与α-fe2o3处理的afb1的含量仅为其他的1/10，且低于国家限量标准(20μg kg-1
)。以上结果表明，在太阳照射下，制备的α-fe2o3具有抑制黄曲霉菌生长性能，能有效降低黄曲霉毒素污染。