一种可以预防猪伪狂犬病毒感染的纳米抗体疫苗、制备方法和应用与流程

1.本发明涉及生物技术领域中动物病毒学领域。特别是涉及一种可以预防猪伪狂犬病毒(porcine pseudoraibies virus，prv)感染的纳米抗体疫苗、制备方法和应用。


背景技术：

2.猪伪狂犬病(porcine pseudoraibies，pr)是猪的一种急性传染病，又称aujeszky病，由猪伪狂犬病毒(porcine pseudoraibies virus，prv)引起。猪作为prv的天然宿主，对病毒感染更为敏感，是可在急性感染中存活并具有潜伏感染力的唯一动物物种。感染后新生仔猪以高死亡率与神经系统紊乱为特征，怀孕母猪出现流产与繁殖障碍，老年猪以呼吸道疾病为主，以神经症状为特征的仔猪死亡率大于20％，猪感染野生型病毒的几率高达50％，使我国养猪业损失巨大。
3.prv目前已知的只有一种血清型，为线性双链的dna病毒，约145kda大小，gc的含量平均为73.59％。prv共编码70多种蛋白，主要蛋白除gg蛋白外，其余10个(gb、gc、gd、ge、gh、gi、gk、gl、gm、gn)均为囊膜结构蛋白。其中糖蛋白b(gb)，糖蛋白c(gc)，糖蛋白d(gd)与糖蛋白h(gh)在易感动物中，诱导其保护性免疫应答，产生具有中和作用的抗体与抗病毒性的细胞免疫，为主要的具有保护性的抗原。
4.研究表明亚单位疫苗能够给免疫动物提供相应的保护，亚单位疫苗是利用基因工程方法将病原保护性抗原基因克隆到原核或真核表达系统中，使其高效表达而制成的疫苗。目前发现猪伪狂犬病毒糖蛋白中的gb、gc、gd均能使机体产生中和抗体，这些抗体无论是在体内、体外，还是在有无补体存在的情况下都有中和prv的能力。“伪狂犬病亚单位疫苗研究进展”(杨承槐，娄高明，谌南辉《江西畜牧兽医杂志》2004年第3期)公开了在伪狂犬病病毒目前已发现的11种糖蛋白中，gb、gc、gd均能诱导机体产生中和抗体。在没有补体的参与下，gb、gc、gd的单克隆抗体能中和prv。猪和小鼠注射抗gb、gc、gd的单克隆抗体均能抵抗prv强毒的攻击。因此，gb、gc、gd是研制prv亚单位疫苗的首选蛋白。糖蛋白gd是一种重要的中和抗原，也是保护性抗体的主要目标，能诱导较好的保护反应。us6858385和us6521231公开了利用猪伪狂犬病病毒gd蛋白可以制备疫苗用于猪伪狂犬病的预防。现有技术还没有疫苗能够解决针对猪伪狂犬变异株引起的伪狂犬病。
5.单克隆抗体(mab)自问世以来，在医学诊断、制药、治疗与科学研究等领域得到了广泛的应用。而近些年发现的纳米抗体不仅实现了与传统抗体相当的特异性结合力，作为新一代抗体衍生物其具有诸多传统抗体没有的优势。因此，近来纳米抗体被认为是高价值的蛋白，并被应用于包括基础研究、诊断、治疗、食品科学等多个领域中。但是目前关于纳米抗体在prv的疾病预防方法中的应用却未见相关研究报道，也未有商品化产品。


技术实现要素：

6.针对上述现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种可以预防猪伪狂犬病毒感
染的纳米抗体疫苗，以解决上述现有技术存在的问题。
7.为实现上述目的，本发明提供一种可以预防猪伪狂犬病毒感染的纳米抗体疫苗，所述纳米抗体疫苗包括三个有效成分，包括prv的gb蛋白、prv的gc蛋白和特异性识别prvgd蛋白的纳米抗体。
8.进一步的，prv的gb蛋白的蛋白序列如seq id no.4所示；
9.进一步的，所述prv的gc蛋白的蛋白序列如seq id no.5所示；
10.进一步的，所述特异性识别prvgd蛋白的纳米抗体的蛋白序列如seq id no.3所示；
11.进一步的，本发明还提供一种核苷酸分子，所述核苷酸分子编码上述纳米抗体疫苗的氨基酸序列。
12.进一步的，本发明还提供一种含有上述纳米抗体疫苗的表达盒、载体、宿主细胞、表达系统。
13.进一步的，所述的含有上述纳米抗体疫苗的表达盒、载体、宿主细胞、表达系统中包含可以编码上述纳米抗体疫苗的核苷酸序列。
14.进一步的，本发明提供一种上述纳米抗体疫苗的制备方法，包括以下步骤：
15.(1)重组真核表达载体的构建：通过pcr扩增、酶切，将编码包括prv的gb蛋白、prv的gc蛋白和特异性识别prvgd蛋白的纳米抗体的dna序列连接至表达载体中获得阳性质粒；
16.(2)将步骤(1)中阳性质粒转化宿主细胞，诱导表达纳米抗体疫苗。
17.进一步的，所述表达载体可以为真核表达载体或原核表达载体，优选的，所述表达载体为真核表达载体，所述表达载体可选自：pcrii、pcr3和pcdna3.1(invitrogen，san diego，ca)、pb sii(stratagene，la jolla，ca)、pet 15(novagen，madison，wi)、pgex(pharmacia biotech，piscataway，nj)、pegfp-n1(clontech，palo alto，ca)、petl(bluebacii，invitrogen)、pdsr-α(pct pub.no.wo90/14363)和pfastbacdual(gibco-brl，grand island，ny)等。
18.所述宿主细胞为大肠杆菌、酵母或真核细胞，优选的，所述宿主细胞为真核细胞，可选自例如：中国仓鼠的卵巢细胞cho、猴的肾脏细胞cos细胞、人的胚肾细胞hek-293、人的子宫颈癌细胞hela等。
19.进一步的，本发明还提供一种上述纳米抗体疫苗在制备prv疫苗中的应用。
20.进一步的，所述疫苗为治疗和/或预防prv的疫苗，所述疫苗中prv的gb蛋白、prv的gc蛋白和特异性识别prvgd蛋白的纳米抗体，可作为唯一活性成分，也可以作为活性成分之一，优选的，活性成分为上述三种成分的组合。
21.进一步的，本发明还提供一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包含免疫量的本发明的所述纳米抗体疫苗，以及药学上可接受的载体。
22.有益效果
23.本发明制备的可以预防猪伪狂犬病毒感染的纳米抗体疫苗，所述纳米抗体疫苗包括三个有效成分，包括prv的gb蛋白、prv的gc蛋白和特异性识别prvgd蛋白的纳米抗体。由于同时具有三个在prv感染中具有重要作用的蛋白作为抗原，属于多价疫苗，覆盖所有常见血清型抗原，能够比以往报告的prv疫苗诱导更全面的中和性抗体，因此具有较强的中和活性，可用于制备预防和/治疗伪狂犬病的疫苗，弥补了现有疫苗的不足；该疫苗能够对伪狂
犬病病毒经典株和变异株有效中和，可以预防和治疗伪狂犬病病毒经典株和变异株导致的伪狂犬病。
24.本发明提供的特异性纳米抗体，测序结果显示纳米抗体与人的vh高度相似，elisa结果显示其具有很高的结合力，推测有可能是骆驼体内自然存在的vh-hcabs。其既有纳米抗体的特性，又与人源vh具有高度的相似性，可能会拥有很大的应用前景，不但可以作为抗原，而且还可以作为抗原载体，提高机体应答，实现更好的免疫效果。
25.该疫苗具有广谱性的特点，应用对象不受动物种属的限制，其预防和治疗效力在猪、犬的动物实验上显示，效果优良。而且由于序列背景清楚明晰，可以使用商业化成熟手段进行大规模的生产，疫苗更加安全、成本更低。
附图说明
26.图1为prv的gd蛋白表达与纯化，其中，m为marker，1为pet-28a-gd重组阳性质粒sds-page鉴定图，2为镍柱层析法纯化获得可溶性prv-gd蛋白sds-page鉴定图；
27.图2为elisa方法检测双峰驼血清效价，其中，阴性对照为免疫前骆驼血清；
28.图3为3轮淘选后gd蛋白特异性纳米抗体elisa结果；
29.图4为融合蛋白三维结构图；
30.图5为攻毒后仔猪体温曲线，其中横坐标为攻毒后天数(d)，纵坐标为温度(℃)。
具体实施方式
31.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
32.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
33.实施例1猪伪狂犬病毒gd蛋白的可溶性表达及其纯化
34.在生长良好的pk15细胞上接种prv hn1201病毒(hn1201株(pseudorabiesvirus，strainhn1201)，保藏号为cctccno.v201311；保藏于中国典型培养物保藏中心；保藏地址为湖北省武汉武汉大学，保藏日期为2013年5月20日)，利用本领域常规手段分离猪伪狂犬病病毒基因组dna做模板，使用引物进行pcr扩增，利用takara的高保真酶hs dna polymerase with gc buffer，扩增条件为：94℃3min；94℃30s，68℃90s，30cycles；72℃5min。pcr产物命名为prv-gd
35.gd上游扩增引物：ggatccatgcacgtcgca(seq id no.1)
36.gd下游扩增引物：gcggccgcctagcgacgcgg(seq id no.2)
37.经测序正确的pcr产物prv-gd克隆至pet-28a(购自invitrogen公司，货号a11499)，挑取单克隆鉴定插入方向，插入方向正确的质粒送invitrogen公司测序，测序正确的质粒命名为pet-28a-gd。将pet-28a-gd重组阳性质粒进行表达，经sds-page(见图1)验证后经镍柱层析法纯化获得可溶性prv-gd蛋白。
38.实施例2抗prv的gd蛋白的特异性纳米抗体的筛选与鉴定
39.纯化后的可溶性prv-gd蛋白与结合弗氏佐剂充分乳化后，经颈部皮下注射免疫双峰驼，每两次免疫之间每隔2周的时间，前后共进行共6次免疫。抽取第6次免疫后血液分离血清后以gd蛋白为抗原测定抗体效价，监测免疫效果。阴性对照为免疫前骆驼血清，取免疫结束后离心处理过的血清，elisa方法检测其抗体效价(图2)，结果显示血清中抗体效价达到1:256000。利用试剂盒(购自invitrogen公司)提取淋巴细胞rna，以所提取出的rna为模板利用oligo(dt)20引物反转录酶(iii)合成cdna，进一步经过巢式pcr扩增vhh片段。将扩增后的vhh基因片段通过酶切位点克隆入酶切后pcantab 5e噬菌体展示载体。利用噬菌体展示技术经过3轮淘选，筛选针对gd蛋白特异性纳米抗体elisa结果由0.28上升至3.0，表明针对ge重组蛋白的特异性纳米抗体得到了明显的富集(图3)。将通过elisa检测结果确定为的阳性(大于阴性值3倍以上)的单克隆菌液，测序。通过软件megalign进行对测序结果的比对，并进行分类。根据序列分类结果，elisa方法检测所筛选出的纳米抗体粗提物按1：2、1:20、1:200、1:2000倍比稀释，再次测定其效价。利用elisa分析纳米抗体的特异性和亲和力，最终筛选到三株针对prv的gd蛋白的纳米抗体，将其测序后进行抗原抗体中和实验，确定其免疫应答活性，同时利用计算机分析最终确定可以诱发机体免疫的gd蛋白的纳米抗体，其氨基酸序列如seq id no.3所示，将此纳米抗体命名为nd351。
40.实施例3融合纳米抗体蛋白的制备
41.猪伪狂犬病毒gb蛋白抗原表位多肽片段的优化设计
42.首先针对猪伪狂犬病病毒js-2012株、猪伪狂犬hen1株、nvdc-prv-bj株、nvdc-prv-heb株和nvdc-prv-sd株、prv tj株、猪伪狂犬病病毒变异株prv-zj01、猪伪狂犬病病毒变异株hn1201株、猪伪狂犬病病毒变异株hn1202株、猪伪狂犬病病毒fa株、猪伪狂犬病病毒bartha株、猪伪狂犬病病毒kaplan株、猪伪狂犬病病毒becker株的gb基因进行同源性分析，并利用生物分析手段筛选抗原片段候选区域，最终确定选择含gb蛋白的第76位至135位氨基酸以及第576位至640位氨基酸所示序列，并根据生物信息学分析对其中的部分氨基酸残基进行替换或者优化，最终确定其gb抗原表位多肽的氨基酸序列如seq id no.4所示。
43.猪伪狂犬病毒gc蛋白抗原表位多肽片段的优化设计
44.如上所述，同样对已知猪伪狂犬病毒gc蛋白进行同一性分析和计算机模拟，筛选出的gc蛋白抗原表位多肽为52-113位与401-458位的串联，而且进行了相应的优化，最终确定其gc抗原表位多肽的氨基酸序列如seq id no.5所示。
45.串联表达盒的构建
46.利用overlap pcr方法对上述三段多肽序列进行扩增，将gb、gc、nd351序列串联起来，构建gb-gc-nd351表达盒，利用双酶切将其连接到真核表达载体pcdna3.1(invitrogen，san diego，ca)中，构建成pcdna-gb-gc-nd351，酶切测序验证(seq id no.6)正确后保藏，生物分析其高级结构，确定抗原表位的暴露(图4)。同时分别将gb蛋白抗原表位多肽片段、gc蛋白抗原表位多肽片段和两者串联蛋白进行相同操作，分别制备pcdna-gb，pcdna-gc，pcdna-gb-gc表达质粒，验证后保藏。
47.取状态良好的cho细胞铺6孔板，铺板密度为2-3
×
105个细胞/ml，2ml/孔，37℃培养箱培养；镜下观察待细胞达到80％汇合度时，利用脂质法将pcdna-gb-gc-nd351转入到hek-293t细胞中(罗氏x-tremegene hp dnatransfection reagent)，具体操作为：
48.a：转染前2h，弃掉6孔板内旧培养基，1ml pbs/孔，洗1次；弃掉pbs，每孔加入
1.8mlopti-mem，放置37℃培养箱继续培养；
49.b：于超净工作台内取1.5ml ep管，按照200μl/孔的体积加入opti-mem，然后加入质粒，2μg/孔，轻轻吹打混匀；
50.c：向稀释好的质粒中加入转染试剂，按照6μl/孔的量加入；轻轻吹打混匀，室温静置20min；
51.d：将转染复合物加入细胞培养孔中，200μl/孔，轻摇混匀，放入细胞培养箱中继续培养48h。
52.待细胞长满后，在超净工作台内收取细胞上清，12，000g，4℃离心10min，除去细胞碎片，上清转移至新的1.5ml ep管中，分装保存至-80℃，待用；
53.收集细胞培养液，8000g离心30min，取上清，过0.45um滤膜过滤后，负载上ni-nta柱，用10倍柱体积的结合缓冲液(20mmol/l tris-hcl，0.5mol/l nacl，5mmol/l咪唑，ph 8.0)冲洗柱子，收集流出液；用6倍柱体积的洗涤缓冲液(20mmol/l tris-hcl，0.5mol/l nacl，20mmol/l咪唑，ph8.0)冲洗柱子，收集流出液；最后用10倍柱体积的洗脱缓冲液(20mmol/ltris-hcl，0.5mol/l nacl，500mmol/l咪唑，ph8.0)对目的蛋白进行洗脱，收集洗脱液，洗脱至无蛋白检出。将含有目的蛋白的咪唑洗脱液倒入透析袋内，用1
×
pbs透析至少10倍，取90ul留样检测。在生物安全柜中，过0.22um真空滤器，过滤好的蛋白溶液样品存放于-80℃冰箱。蛋白浓度和纯度测定：采用bca法测定蛋白浓度；采用hplc方法检测纯度，纯度都能达到90％以上。
54.对pcdna-gb，pcdna-gc，pcdna-gb-gc进行类似操作，分别制备成相应的纯化蛋白，纯化保藏后进行疫苗保护实验。
55.实施例4纳米抗体疫苗的制备及其临床试验
56.将上述纯化后的纳米抗体融合蛋白定量后，取7号白油1128毫升，再加入司盘-80 720毫升，混匀；再称取硬脂酸铝24克并加入7号白油和司盘-80的混合样品中；将上述3试剂的混合样品用胶体磨充分溶解、混匀、并高压灭菌，即为油相。将纯化的融合蛋白无菌过滤后用无菌水稀释为1mg/ml，得到水相；取油相1000ml和水相500ml混合，10000r/min搅拌2-5min即得纳米抗体融合疫苗。
57.取27只prv阴性猪分为9组进行免疫(试验组共8组，每组3只；空白对照为1组3只)，采用耳后颈部肌肉注射，在左右双耳分别注射上述制备得到的纳米抗体融合疫苗，具体分组如表1；共免疫两次，每次间隔14天(第1天和第15天分别进行第一次免疫和第二次免疫)，第7、14、21、28天分别前腔静脉采血，参照gb/t18641-2002方法血清中和试验的方法测定疫苗组的中和抗体效价，结果见表2。
58.表1疫苗分组情况
[0059][0060]
表2各种猪伪狂犬疫苗候选株免疫仔猪后不同时间的抗体情况
[0061]
组别7d中和抗体效价14d中和抗体效价21d中和抗体效价28d中和抗体效价11:4.21:6.81:16.71:32.421:6.11:15.71:20.41:45.231:6.31:15.71:21.21:44.841:3.51:6.01:11.91:21.551:3.41:5.91:12.01:23.461:4.11:6.21:12.41:20.771:3.81:4.21:111:1581:4.01:4.91:12.81:22.19
‑‑‑‑
[0062]
从上述结果可以看出，上述几种疫苗首选株及其已知的疫苗在免疫仔猪后，能产生较高的中和抗体，且随免疫时间逐渐升高。其中gb、gc蛋白作为单独的亚单位疫苗也可以实现免疫应答，同时，在疫苗的构成中，抗原表位的增多可以明显的提升疫苗的效果，其中gb-gc-nd351》gb-gc》gb/gc，这与之前的研究相符，而且本领域内也存在类似的疫苗，可以在今后的试验中对其抗原表位及其融合蛋白的优化排布进行进一步的深入研究。在gb、gc蛋白的中和表位肽的基础上，增加针对gd蛋白的纳米抗体nd351，可有效提高免疫血清中的抗体效价(第1-3组检测到的效价显著高于第4-6组检测到的效价，其最高效价约为较低效价的2倍)，差异明显。对gb-gc-nd351疫苗候选株而言，免疫效果与免疫计量在一定程度上正相关，但是边际效益明显，注射2ml的效果与4ml效果没有明显差异，而且在后期反而出现副作用，其具体用量需要进一步的实验验证和优化。
[0063]
在免疫后28日后攻毒，攻毒剂量为hn1201株猪伪狂犬病病毒2
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10
8.0
tcid50/头，攻毒后每日测定仔猪体温(图5)，其中第9组阴性对照只记录到第2天，第3天3只实验猪全部死亡。从图中可以看出，各种疫苗候选株都会对猪伪狂犬病毒实现一定的保护，虽然在攻毒后出现了发热等临床症状，但是能为仔猪提供100％(3/3)保护，而对照仔猪攻毒后3日后全部死亡，因此，可以证明上述疫苗候选株都具有很好的保护力。而且从体温变化曲线可以看出，相对于酶活疫苗，本技术的亚单位疫苗和商业化的bartha-k61都可以在一定程度上降低仔猪体温升高幅度和时间，尤其是本技术的gb-gc-nd351候选株，可以使攻毒后的仔猪温度变化幅度降低，缩短变化时间，基本维持在正常水平。
[0064]
在记录温度的同时记录试验猪的其他临床症状，通过观察可以发现，疫苗各组虽然有体温升高的状况，但是并没有其他明显的临床症状，虽然活疫苗组的实验猪出现了个别的初期食欲下降的状况，但是随着时间逐步好转，恢复食欲，没有出现明显的萎靡不振的状况但是阴性对照组出现了明显的食欲减退、精神不振的状况，而且出现了死亡，说明上述各组疫苗候选株对猪伪狂犬病病毒有较强的保护作用。
[0065]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。