真皮鞘杯细胞的鉴别方法与流程

1.本发明涉及毛发再生的细胞治疗的技术领域。更具体地，本发明涉及在毛发再生的细胞治疗中使用的鉴别真皮鞘杯细胞的方法。


背景技术：

2.作为脱发症、毛发稀少的治疗，主要进行药剂的施与，但需要连续的施与，另一方面根据对象不同有时也得不到充分的效果。另一方面，通过使从对象的头皮组织采集的能够成为毛发的细胞增殖、通过自体移植而返回对象的头皮，可期待安全性更高、更有效地再生毛发。在毛发再生中使用的细胞目前使用毛乳头细胞、真皮鞘杯细胞等。
3.利用自体移植技术的毛发再生治疗正在接近实用化。与此相伴，为了进一步提高安全性和有效性、实现稳定的毛发再生，细胞培养物的品质管理变得重要。在将真皮鞘杯细胞用于移植的情况下，存在于其采集部位的附近的黑素细胞和角质形成细胞可能混入。因此，针对培养真皮鞘杯细胞使其增殖而得的细胞组合物，在向对象移植之前要对于黑素细胞和角质形成细胞的混入进行检查。到目前为止，为了检测角质形成细胞的混入，进行如下试验方法：通过利用流式细胞仪的分析否定角质形成细胞的存在，同时通过酪氨酸酶与底物的反应性来否定黑素细胞的存在。
4.细胞种类的识别一般使用细胞表面标志物。主要的细胞表面标志物作为国际分类以cd分类确定。细胞表面标志物对于细胞种类的识别有用。然而，即使在某细胞种类中表达，如果在混入的细胞种类中也有表达，则不能用于识别。另外也有时根据细胞的状态而细胞表面标志物变化，因而到目前位置尚未特定出将移植前的真皮鞘杯细胞与其他细胞种类识别开的标志物。
5.现有技术文献
6.非专利文献
7.非专利文献1：lee et al.,j.dermatol 2006；155:858-860
8.非专利文献2：poblet et al.,j.dermatol 2008；159:646-652
9.非专利文献3：sorrel et al.,exp dermatol 2003；12:315
10.非专利文献4：park et al.,j cutan pathol.2017；44:909-914.
11.非专利文献5：ernst et al.,plos one.2013；8(12)
12.非专利文献6：huang et al.,sci rep.2016；6
13.非专利文献7：dominici et al.,cytotherapy 2006；8:315-317
14.非专利文献8：wang et al.,j invest dermatol.2014；134:736-745


技术实现要素：

15.发明所要解决的课题
16.在以往进行的黑素细胞和角质形成细胞的否定试验中，阳性对照的制备、试验的实施需要大量的劳动力和时间。另外，该否定试验终究是否定角质形成细胞和黑素细胞的
混入的方法，存在并不直接鉴别真皮鞘杯细胞(dermal sheath cup cells(dscc))这样的问题。因此，要求能够更简便地进行包含真皮鞘杯细胞的细胞组合物的品质管理的方法。
17.用于解决课题的手段
18.本发明者们对于在包含真皮鞘杯细胞的细胞组合物中鉴别真皮鞘杯细胞的方法进行了深入研究，结果发现了能够识别黑素细胞和/或角质形成细胞、与真皮鞘杯细胞的细胞表面标志物，从而完成了本发明。于是，本发明涉及以下[1]～[12]。
[0019]
[1]在包含真皮鞘杯细胞的细胞组合物中鉴别真皮鞘杯细胞的方法，所述方法包括检测选自cd13、cd90、cd10、cd29、cd105、cd49b和ng2中的至少1种细胞表面标志物的步骤。
[0020]
[2]根据项目1所述的方法，所述细胞表面标志物选自cd13、cd90、cd10、cd29、cd105和ng2中，并且能与所述细胞组合物中所包含的角质形成细胞相区别地识别真皮鞘杯细胞。
[0021]
[3]根据项目1所述的方法，所述细胞表面标志物选自cd13、cd90、cd29和cd49b中，并且能与所述细胞组合物中所包含的黑素细胞相区别地识别真皮鞘杯细胞。
[0022]
[4]根据项目1所述的方法，所述细胞表面标志物选自cd13、cd90、和cd29中，并且能与所述细胞组合物中所包含的黑素细胞和角质形成细胞相区别地识别真皮鞘杯细胞。
[0023]
[5]根据项目1～4的任一项所述的方法，所述细胞表面标志物选自cd13和cd90中。
[0024]
[6]根据项目1～5的任一项所述的方法，所述细胞表面标志物通过流式细胞术检测。
[0025]
[7]根据项目1～6的任一项所述的方法，所述细胞组合物是毛发再生用的细胞组合物。
[0026]
[8]根据项目1～7的任一项所述的方法，所述细胞组合物包含经培养的真皮鞘杯细胞。
[0027]
[9]根据项目1～8的任一项所述的方法，细胞组合物是冷冻保存前或冷冻保存后的细胞组合物。
[0028]
[10]根据项目9所述的方法，细胞组合物是冷冻保存后的细胞组合物。
[0029]
[11]细胞组合物的品质的确定方法，其中，通过项目1～10的任一项所述的方法，在包含真皮鞘杯细胞的细胞组合物中鉴别真皮鞘杯细胞，由此确定细胞组合物的品质。
[0030]
[12]经品质管理的细胞组合物的制造方法，所述制造方法包括以下步骤：
[0031]
通过项目11所述的细胞组合物的品质的确定方法，确定包含真皮鞘杯细胞的细胞组合物的品质，然后
[0032]
去除规定品质以下的细胞组合物。
[0033]
发明的效果
[0034]
通过本发明，能够以更短的时间和更少的劳动力进行包含真皮鞘杯细胞的细胞组合物的品质管理。
附图说明
[0035]
图1表示使用细胞表面标志物对于真皮鞘杯细胞(dscc)与角质形成细胞(kc)的识别可能性进行研究而得的流式细胞术的结果。mix表示将dscc与kc以1:1混合而得的样品中
的结果。实线表示使用各抗体时的分布，虚线表示使用与各抗体分别对应的同种型对照抗体时的分布。
[0036]
图2表示使用细胞表面标志物对于真皮鞘杯细胞(dscc)与黑素细胞(mc)的识别可能性进行研究而得的流式细胞术的结果。mix表示将dscc与mc以1:1混合而得的样品中的结果。实线表示使用各抗体时的分布，虚线表示使用与各抗体分别对应的同种型对照抗体时的分布。
[0037]
图3表示显示了细胞表面标志物(cd13、cd29和cd90)分别能够识别真皮鞘杯细胞(dscc)、与角质形成细胞(kc)和黑素细胞(mc)的流式细胞术的结果(a)。图3b表示将图3a的对于dscc、kc和mc得到的曲线图叠合后的曲线图。实线表示使用各抗体时的分布，虚线表示使用与各抗体分别对应的同种型对照抗体时的分布。
[0038]
图4表示对于用cd90和cd13进行了双重染色的真皮鞘杯细胞(dscc)进行流式细胞术的结果(a和b)。实线表示使用各抗体时的分布，虚线表示使用与各抗体分别对应的同种型对照抗体时的分布。图4c表示cd13与cd90双重阳性的细胞的集合。
[0039]
图5表示采用与图4同样的方法、但使用不同批次的dscc而得的结果(a-c)。实线表示使用各抗体时的分布，虚线表示使用与各抗体分别对应的同种型对照抗体时的分布。
[0040]
图6是对dscc混入角质形成细胞20％(a)、10％(b)、5％(c)、0％(d)而进行使用cd90的流式细胞术的结果。实线表示使用各抗体时的分布，虚线表示使用与各抗体分别对应的同种型对照抗体时的分布。图6e表示cd90阳性的细胞率。
具体实施方式
[0041]
本发明涉及在包含真皮鞘杯细胞的细胞组合物中鉴别真皮鞘杯细胞的方法。更具体地，包括在包含真皮鞘杯细胞的细胞组合物中检测选自cd13、cd90、cd10、cd29、cd105、cd49b和ng2中的至少1种细胞表面标志物的步骤。这些细胞表面标志物在真皮鞘杯细胞中表达。这些细胞表面标志物既可以单独使用，也可以组合使用。
[0042]
上述的细胞表面标志物中，角质形成细胞具有cd49b，cd49b不适合从角质形成细胞分离dscc。因此，从在包含真皮鞘杯细胞的细胞组合物中识别真皮鞘杯细胞与角质形成细胞的观点考虑，使用选自cd13、cd90、cd10、cd29、cd105和ng2中的至少1种细胞表面标志物。另一方面，cd29和ng2在dscc中的表达稍低(约90％)，而可见在角质形成细胞中的表达(15.7％、5.34％)。cd105虽然在角质形成细胞中的表达低(0.56％)，但在dscc中的表达低(84.4％)。因此，在更优选的方式中，使用选自cd13、cd90和cd10中的至少1种细胞表面标志物。这些细胞表面标志物既可以单独使用，也可以组合使用。
[0043]
上述的细胞表面标志物中，黑素细胞具有cd10、cd105、ng2，这些标志物不适合从黑素细胞分离dscc。因此，从在包含真皮鞘杯细胞的细胞组合物中识别真皮鞘杯细胞与黑素细胞的观点考虑，使用选自cd13、cd90、cd29和cd49b中的至少1种细胞表面标志物。另一方面，cd29和cd49b在dscc中的表达比较低(92.4％、96.7％)、且在黑素细胞中也可见某种程度表达(17.9％、1.81％)。因此，在更优选的方式中，使用选自cd13和cd90中的至少1种细胞表面标志物。这些细胞表面标志物既可以单独使用，也可以组合使用。
[0044]
从在包含真皮鞘杯细胞的细胞组合物中与黑素细胞和角质形成细胞两者相区别地识别真皮鞘杯细胞的观点考虑，使用选自cd13、cd90和cd29中的细胞表面标志物。更优选
使用选自cd13和cd90中的至少1种细胞表面标志物。
[0045]
本发明中，细胞表面标志物是指存在于细胞表面的抗原。特别可以用通过作为国际分类的cd分类而分类、确定的cd号来表示。cd分类本来是单克隆抗体的分类，但也用于单克隆抗体所识别的表面抗原的名称。针对所期望的细胞表面标志物特异性地结合的抗体可以从各销售商获得。
[0046]
因此，在本发明的其他方式中，本发明涉及使用选自cd13、cd90、cd10、cd29、cd105、cd49b和ng2中的至少1种的单克隆抗体来鉴别真皮鞘杯细胞的方法。可以使用这些单克隆抗体，通过任意的免疫学方法来检测。
[0047]
本发明中言及的细胞表面标志物可以以任意的组合使用，例如组合2种、3种、4种、或4种以上的细胞表面标志物而使用。作为一例，从组合识别力高的细胞表面标志物的观点考虑，可以使用cd13与cd90、cd13与cd29、cd29与cd90的组合。从用一个单克隆抗体高精度地识别角质形成细胞、用另一单克隆抗体高精度地识别黑素细胞的观点考虑，可以使用cd10与cd13、cd10与cd90、cd10与cd29、cd10与cd49b、cd13与cd29、cd13与cd49b、cd90与cd29、cd90与cd49b、cd29与cd49b、cd105与cd13、cd105与cd90、cd105与cd29、cd105与cd49b、ng2与cd10、ng2与cd13、ng2与cd90、ng2与cd29、ng2与cd49b的组合。作为3种的组合，可以使用cd13与cd90与cd29。
[0048]
细胞表面标志物可以使用本技术领域已知的任意的方法进行检测。作为一例，可以通过使用针对各细胞表面标志物进行结合的标记抗体的流式细胞术法来检测。在检测组合的情况下，可以通过使用以具有不同吸收波长和激发波长的荧光标记进行了标记的单克隆抗体进行检测。这样的荧光标记的组合是本领域技术人员周知的，可以适当选择。作为一例，可以使用fitc与pe的组合。在进行流式细胞术法的情况下，基于检测到的荧光标记来分离细胞，从而能够获得实质上仅包含真皮鞘杯细胞的细胞组合物。
[0049]
本发明中，细胞组合物是指包含细胞的任意的组合物。本发明的细胞组合物特别是毛发再生用的细胞组合物或头皮注入用的细胞组合物。本发明的细胞组合物主要包含真皮鞘杯细胞，进而含有微量的角质形成细胞、黑素细胞，也可以含有其他细胞。本发明的毛发再生用的细胞组合物通过将包含人的毛球部的样品切开，与毛乳头细胞区别，获得真皮鞘杯细胞，根据情况进行培养，从而获得。因此，毛发再生用的细胞组合物实质上不包含毛乳头细胞。另一方面，由于在包含毛球部的样品真皮鞘杯细胞的附近存在角质形成细胞和黑素细胞，因而包含真皮鞘杯细胞的细胞组合物中可能包含角质形成细胞和黑素细胞。虽然不限定，但供于本发明的鉴别方法的细胞组合物是使真皮鞘杯细胞增殖(或浓缩)后的细胞组合物，包含通常细胞集团的30％以上、优选为50％以上、进一步更优选为70％以上的真皮鞘杯细胞。可以针对这样的包含真皮鞘杯细胞的细胞组合物，使用本发明的鉴别方法或品质确定方法。由此，可以确定细胞组合物所包含的真皮鞘杯细胞以细胞集团的所期望的比例以上、作为一例为90％以上存在，可以保证细胞组合物的品质。本发明的细胞组合物可以是培养细胞而得的细胞组合物，细胞组合物中可以包含细胞以外的成分、例如培养基等，根据情况可以包含冷冻保护剂、细胞激活剂等。
[0050]
进一步在其他方式中，本发明涉及通过确定包含真皮鞘杯细胞的细胞组合物的品质，从而制造经品质管理的包含真皮鞘杯细胞的细胞组合物的方法。该制造方法具体通过在包含真皮鞘杯细胞的细胞组合物中检测选自cd13、cd90、cd10、cd29、cd105、cd49b和ng2
中的至少1种细胞表面标志物，确定细胞组合物的品质，去除规定的品质以下的细胞组合物，从而能够获得品质经管理了的包含真皮鞘杯细胞的细胞组合物。品质作为一例可以通过将真皮鞘杯细胞的存在比例与规定的阈值进行比较来确定。作为规定的阈值，可使用例如90％、优选为95％、进一步优选为97％、进一步更优选为99％。
[0051]
本发明中，能够在包含真皮鞘杯细胞的细胞组合物中鉴别真皮鞘杯细胞。真皮鞘杯细胞的鉴别是指与细胞组合物所包含的其他细胞种类相区别地识别真皮鞘杯细胞。因此，只要能够与包含真皮鞘杯细胞的细胞组合物中可以包含的不期望的细胞、例如角质形成细胞和/或黑素细胞进行识别即可。
[0052]
在毛发再生的细胞治疗中，有时获得组织，在与移植经培养的细胞的临床现场不同的场所对细胞进行加工培养。作为一例，细胞的加工培养在另外设置的细胞加工培养设施中进行。细胞加工培养设施中制作出的包含真皮鞘杯细胞的组合物进行了品质检查之后，被送到临床现场。本发明的包含真皮鞘杯细胞的细胞组合物中的真皮鞘杯细胞的鉴别方法通常在细胞加工培养后、出货前进行，但在细胞加工、即从组织分离细胞之后，可以在冷冻保存前、冷冻保存后进行。一般在冷冻保存后的细胞组合物中的细胞中，代谢发生变化，因而细胞表面标志物也可能变化。另一方面，本发明中特定的细胞表面标志物、特别是cd90和cd13即使是在刚刚冷冻保存之后，也显示dscc的识别力无差异(数据未刊载)，可以针对冷冻保存前和冷冻保存后的任意细胞组合物使用。
[0053]
在选择本发明中的细胞表面标志物时，以8种表面抗原(cd10、cd13、cd29、cd49b、cd90、cd105、cd274、和ng2)作为了研究对象。关于所研究的8种标志物，在真皮鞘杯细胞中的表达目前尚未被报告。关于这些标志物的知识，在下述陈述。
[0054]
cd10在神经系统、造血系细胞等各种组织中表达。在毛囊中报告了真皮鞘(dermal sheath)中的cd10的表达(非专利文献1：lee et al.,j.dermatol 2006；155:858-860和非专利文献2：poblet et al.,j.dermatol 2008；159:646-652)。另外，是急性淋巴母细胞白血病的共同抗原，作为人膜结合中性内肽酶(nep)已知。
[0055]
cd13是存在于粒细胞、骨髓祖细胞、内皮细胞、上皮细胞等中的氨肽酶-n，在肾近端小管、肠、胎盘等其他组织中也广泛地表达。cd13在毛囊中被报告定位于真皮鞘(非专利文献3：sorrel et al.,exp dermatol2003；12:315和非专利文献4：park et al.,j cutan pathol.2017；44:909-914.)。
[0056]
cd29作为整联蛋白β1链已知。cd29被用作间充质干细胞的标志物，但在真皮鞘中也表达(非专利文献5:ernst et al.,plos one.2013；8(12))。
[0057]
cd49b是整联蛋白α2链，与整联蛋白β1相伴地形成vla-2受体。vla-2由于与胶原、血纤蛋白原、层粘连蛋白等结合，因而发挥将各种细胞系在细胞外基质上的作用。cd49b在文献上在淋巴细胞、活化t细胞单核细胞、上皮细胞、血小板中的表达已经充分被公知。
[0058]
cd90是属于免疫球蛋白超家族的gpi锚定型蛋白质，在间充质类的细胞中广泛表达。
[0059]
cd105也被称为内皮联蛋白，公知作为tgf-β1和tgf-β3的受体发挥作用，在脂肪来源的干细胞中表达(非专利文献6:huang et al.,sci rep.2016；6)。国际细胞治疗学会对于人间充质干细胞的定义采用cd90阳性与cd105阳性(非专利文献7:dominici et al.,cytotherapy 2006；8:315-317)。
[0060]
cd274作为细胞程序性死亡配体1已知，是pd-1的配体之一。pd-1与pd-l1的相互作用与t细胞的活化一起宽容地发挥重要的作用，被称为免疫检查点。2014年被认可的纳武单抗(nivolumab)(商品名：opdivo)是人型抗人pd-1单克隆抗体，是免疫检查点抑制剂之一。通过抑制pd-1与pd-l1、pd-l2的结合从而活化t细胞，显示抗肿瘤效果。另外，现有报告中启示了其在真皮鞘杯细胞(dermal sheath cup cell:dscc)中的表达(非专利文献9:wang et al.,j invest dermatol.2014；134:736-745)。
[0061]
ng2是别名也被称为硫酸软骨素蛋白聚糖4(chondroitin sulfate proteoglycan 4)的神经多糖的一种。在内皮的基底膜上黑色素瘤细胞分化、移动时显示控制细胞基质的相互作用的功能。另外，有暗示其为阻碍轴突再生中的神经突起的伸长和生长端的倒塌的分子。
[0062]
实施例
[0063]
实施例1：真皮鞘杯细胞的识别
[0064]
使用流式细胞仪(guava 8ht-2l(merck millipore))，进行包含真皮鞘杯细胞的细胞组合物的识别。流式细胞术中使用以下表1的抗体。
[0065]
表1
[0066]
抗体标记销售商cd10pebd biosciencecd13pebd biosciencecd29pebd biosciencecd49bfitcbd biosciencecd90fitcbd biosciencecd105fitcbd biosciencecd274fitc/pebd bioscienceng2pebd bioscienceigg1 kpebd bioscienceigg1 kfitcbd bioscienceigg2apebd bioscience
[0067]
真皮鞘杯细胞与角质形成细胞的分离
[0068]
使用真皮鞘杯细胞(dscc)、角质形成细胞、dscc与角质形成细胞的等量混合物3种，将细胞悬浮于各抗体(cd10、cd13、cd29、cd49b、cd90、cd105、cd274、ng2、和相应的同种型对照(igg1k抗体或igg2a))各自的稀释液中，在4℃使其反应30分钟反应。用pbs洗涤之后再悬浮于pbs中，用流式细胞仪进行检测。结果示于图1。在使用cd10、cd13、和cd90的情况下，角质形成细胞与dscc显著分离，能够识别。在使用cd29、cd105和ng2的情况下，角质形成细胞与dscc存在某种程度的重叠，但能中程度地分离，能够大概识别。在使用cd49b和cd274的情况下，角质形成细胞与dscc不能分离。
[0069]
真皮鞘杯细胞与黑素细胞的分离
[0070]
使用真皮鞘杯细胞(dscc)、黑素细胞、dscc与黑素细胞的等量混合物3种，将细胞悬浮于各抗体(cd10、cd13、cd29、cd49b、cd90、cd105、cd274、ng2和相应的同种型对照)各自的稀释液中，在4℃使其反应30分钟反应。用pbs洗涤之后再悬浮于pbs中，用流式细胞仪进
行检测。结果示于图2。在使用cd13和cd90的情况下，黑素细胞与dscc显著分离，能够识别。在使用cd29、和cd49b的情况下，黑素细胞与dscc存在某种程度的重叠，但能中程度地分离，能够大概识别。在使用cd10、cd105、cd274和ng2的情况下，黑素细胞与dscc不能分离。
[0071]
实施例2：再现性的确认
[0072]
使用dscc、角质形成细胞、黑素细胞3种，将细胞悬浮于cd13、cd29、cd90和相应的同种型对照的各抗体的稀释液中，在4℃使其反应30分钟反应。用pbs洗涤之后再悬浮于pbs中，用流式细胞仪进行检测。结果示于图3a，将直方图叠合而得的图示于图3b。利用cd13、cd29和cd90的全部抗体，能够将dscc、与角质形成细胞和黑素细胞分离而检测。
[0073]
实施例3：双重染色的研究
[0074]
使用2个批次的dscc，将细胞悬浮于cd13抗体(pe标记)、cd90抗体(fitc标记)、和cd13抗体(pe标记) cd90抗体(fitc标记)的稀释液中，在4℃使其反应30分钟反应而进行单染色和双重染色。用pbs洗涤之后再悬浮于pbs中，用流式细胞仪进行检测。流式细胞仪实施后，使用单染色的数据进行fitc向pe检测体系的漏过的补偿。结果示于图4和5。通过cd13的单染色(a)、d90的单染色(b)、和cd13和cd90的双重染色(c)，显示了判断为dscc的细胞的比例。另外，对于相同批次的dscc，进行以往施行的角质形成细胞否定试验。在角质形成细胞否定试验中，判定角质形成细胞的比例为0.16％、0.05％。因此，如果假定角质形成细胞以外为dscc，则dscc的比例为99.84％、99.95％，单染色和双重染色的结果显示大概与以往试验同等的dscc比例。
[0075]
实施例4：dscc检测力的验证
[0076]
使用3个批次的dscc，对于混入了角质形成细胞5％、10％、和20％的细胞组合物，分别悬浮于cd90抗体(fitc标记)的稀释液中，在4℃使其反应30分钟反应进行单染色。用pbs洗涤之后再悬浮于pbs中，用流式细胞仪进行检测，所得结果示于图6。是角质形成细胞混入率20％(a)、10％(b)、5％(c)、和0％(d)中的流式细胞仪的结果，cd90阳性的细胞率作为图6e显示。