一种免仪器的石斛产地可视化溯源方法与流程

1.本发明属于化学分析检测技术领域，具体涉及一种免仪器的石斛产地可视化溯源方法。


背景技术：

2.石斛为我国传统中药，来源于兰科石斛属dendrobium多种植物的茎，味甘、淡，性微寒；功效益胃生津、清热养阴，主治热病伤津、口干烦渴、病后虚热、阴伤目暗。2015版药典收载的石斛包括金钗石斛、鼓槌石斛和流苏石斛等常用品种，2020年版药典将霍山石斛也收入其中。现代药理学研究表明，石斛中含有糖类、生物碱类、联苄类、菲类、香豆素类、茐酮类、甾体皂苷、署芋皂苷、其他苷类、二萜类等化合物，具有免疫调节、抗肿瘤、胃肠道作用、抗氧化、抗衰老、抗疲劳、降血糖、降血脂、降血压等多种药用价值。我国石斛共有76种包括两个变种，其中药用石斛约40多种，主要分布于云南、贵州、四川、安徽、广西、广东。海南等地区，福建、湖南、湖北、河南、江西等地区也有分布。由于来源复杂，长期以来，在其品种、质量评价、功效等方面的认识均存在较多的问题。
3.目前国内外检测石斛不同来源的方法主要依靠大型仪器，如高效液相色谱，气象色谱等，这些方法虽然具有检测准确度高、结果可靠等优点，但是其成本昂贵，操作人员需具备专业的知识技能，样品前处理复杂、耗时长等缺陷仍然大大限制了其在食品药品快速检测中的应用。因此，需要进一步建立一种简单快速、成本低、耗时短的石斛的产地溯源方法以适应市场需求。


技术实现要素：

4.本发明的主要目的在于针对现有技术存在的不足，提供一种免仪器的石斛产地溯源的新方法，利用石斛提取液中多种成分与纳米金的相互作用形成保护，导致基于金属离子诱导的不同产地石斛提取液保护的纳米金聚集程度和颜色的差异，实现对石斛产地的快速准确识别；该方法对保护消费者的健康及利益、对相关部门的检测鉴别工作以及维护良好的市场环境都具有重要意义。
5.为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
6.一种免仪器的石斛产地溯源方法，包括如下步骤：
7.1)将石斛样品进行提取，得石斛提取液；
8.2)依次引入纳米金、石斛提取液和铜盐，混合均匀，并进行室温反应；获取所得反应体系的颜色响应图片；
9.3)按照步骤1)～2)所述方法获得已知产地石斛样品的颜色响应图片，提取其中的颜色信息，根据颜色信息与石斛产地之间的关系，实现对未知石斛样品产地的快速溯源。
10.上述方案中，所述石斛产地包括安徽、浙江、云南或贵州省等。
11.上述方案中，所述颜色信息为rgb值。
12.上述方案中，采用化学计量学方法，建立步骤3)中所述颜色信息与石斛产地之间
的关系，实现对石斛产地的快速溯源。
13.上述方案中，所述化学计量学方法为偏最小二乘判别(plsda)或线性判别分析(lda)分析手段。
14.上述方案中，所述提取步骤采用超声提取工艺；采用的提取剂为浓度为25～50vol％的甲醇水溶液，采用的料液比为50mg:(20～30)ml。
15.上述方案中，步骤2)中所述反应温度为室温25～30℃，反应时间为5～10min。
16.上述方案中，步骤2)中所述球形纳米金以氯金酸为主要原料，柠檬酸三钠作为还原剂，采用微波法合成。
17.上述方案中，所述氯金酸与柠檬酸三钠的摩尔比为1:(10～20)。
18.上述方案中，所述微波工艺参数包括：功率为600～800w，时间为3～5min。
19.上述方案中，步骤2)中所得混合溶液中石斛成分的含量以步骤1)中引入石斛样品的生药计为0.5～1mg/ml。
20.上述方案中，步骤2)中所得混合溶液中引入的纳米金的浓度为3.0～4.0nmol/l，铜盐浓度为2～3
×
10-3
mol/ml。
21.上述方案中，所述铜盐可选用氯化铜或硫酸铜等。
22.优选的，将步骤2)所述反应置于96孔板中并通过手机拍照记录颜色，通过rgb值提取之后进行模式识别，从而实现对石斛产地的免仪器快速、批量溯源。
23.本发明基于不同石斛样本的免仪器色变响应能力，利用铜离子对纳米金的聚集效应(石斛提取液能够保护纳米金免受铜离子引起的聚集)，以及不同产地石斛提取液与铜离子作用后造成的纳米金聚集程度差异，导致不同的石斛样本表现出不同的色变响应；然后通过手机拍照等方式记录颜色变化，并通过photoshop软件等手段进行r,g,b值提取；再结合化学计量学的模式识别进行进一步处理，可表现出对不同产地石斛溯源卓越的鉴别性能。
24.本发明的原理为：
25.本发明基于铜离子能使纳米金发生聚集的特性，通过向铜离子-纳米金溶液体系中引入石斛提取液，石斛提取液中的多种成分可与纳米金表面通过表面电荷、氢键或范德华力等相互作用固定在纳米金表面形成保护，降低铜离子导致的纳米金聚集现象，不同程度的纳米金聚集进一步引起不同的颜色变化；再结合不同石斛样本中化学成分含量的差异性，产生不同聚集程度以及颜色变化，并进一步形成每一个石斛样本的特征颜色信息，最后结合模式识别实现对石斛产地的快速可视化识别。
26.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
27.1)本发明利用铜离子对纳米金的聚集效应以及不同产地石斛提取液与铜离子作用后造成的纳米金聚集程度和色变响应差异，并结合化学计量学的模式识别手段，可实现对不同产地石斛溯源卓越的鉴别性能；
28.2)本发明所述检测方法具有免仪器检测、精度高、响应快，可视化等优点，可快速实现石斛产地的精准判别，有效解决现有检测方法存在的成本高、耗时长、操作复杂等问题。
附图说明
29.图1为本发明所述免仪器的石斛产地溯源方法的检测流程示意图。
30.图2为纳米金不同状态的tem表征图；其中a为原始纳米金条件，b为纳米金 cu
2
条件，c为纳米金 cu
2
条件(倍数放下到20nm下的聚集状态)；d为纳米金 石斛提取液 cu
2
条件。
31.图3为基于纳米金聚集效应的4种不同产地石斛的色变响应测试结果。
32.图4为基于纳米效应的免仪器可视化传感器对4种产地石斛的偏最小二乘判别(plsda)分析结果。
33.图5为基于纳米效应的免仪器可视化传感器对4种产地石斛的线性判别分析(lda)分析结果。
34.图6为不同金属离子和不同产地石斛提取液作用条件下所得纳米金体系的色变响应测试结果。
具体实施方式
35.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
36.以下实施例中，采用的纳米金溶液的制备方法包括如下步骤：
37.取2ml质量浓度为1％的haucl4溶液加入到98ml煮沸的超纯水中，再加入12ml浓度为50mmol/l的二水合柠檬酸三钠(na3c6h5o7·
2h2o)溶液中，然后在功率为800w的微波高热下加热3min，直到颜色变红；将所得产物通过12000r/min高速离心10分钟以除去未反应的化学物质进行纯化，并在4℃下储存。根据朗伯比尔律计算得所得aunps溶液(纳米金溶液)的浓度约为11.8nmol/l。
38.实施例1
39.一种免仪器的石斛产地溯源的方法，包括如下步骤：
40.1)分别取安徽(f01)、浙江(f02)、云南(f03)和贵州省(f04)的石斛样品各10个，使用25vol％的甲醇水溶液进行提取，其中采用的料液比为50mg:20ml，25℃条件下超声30min；分别得不同产地石斛样品的石斛提取液(20ml)；
41.2)取300μl纳米金溶液加入700μl的超纯水定容至1ml作为空白溶液；取300μl纳米金溶液加入250μl氯化铜溶液(1
×
10-2
mol/l)同时加入450μl超纯水定容至1ml作为对照溶液；按顺序加入300μl纳米金溶液、350μl石斛提取液和250μl氯化铜溶液(1
×
10-3
mol/l)并加入100μl水定容至1ml作为实验组，其中每个产地石斛有10个平行样本，反应时间为10min，将反应后的样品置于96孔板中并用相机拍照记录每个样本的色变响应图片；
42.3)通过photoshop 2021版软件提取10
×
10的像素点，通过matlab r2017a平台对提取的像素点进行r,g,b值的提取，最后基于rgb值的数据矩阵对4个产地石斛进行模式识别，主要包括线性判别分析(lda)和偏最小二乘判别分析(plsda)。
43.图2为纳米金溶液不同状态的tem表征图；可以看出在纳米金溶液中引入铜离子可促进纳米金的聚集；但当预先引入石斛提取液时，可保护纳米金免受金属离子引起的聚集。
44.图3为基于安徽、浙江、云南和贵州省不同产地石斛的色变响应图片，可以看出，在
其他条件相同的情况下，不同产地石斛作用后可得到不同的色变响应。
45.步骤3)所述偏最小二乘判别结果如表1、表2以及图4所示，其中表1结果表明基于rgb值的4个产地石斛在plsda判别中训练集样本数量均大于预测集样本数量，表2表明，当state＝2时，选取最佳隐变量(lvm)为3，其训练集和预测集的判别准确率均可达到100％；表3以及图5为基于rgb值的4个产地石斛的线性判别结果，lda判别结果表明4个产地的石斛可达到100％的正确判别，其刀切交叉验证准确率为73％。以上结果表明，基于rgb值的4个产地石斛的模式识别准确率高，能快速有效的识别不同产地石斛。
46.表1 4种不同产地石斛rgb值plsda训练集和预测集的划分结果
[0047][0048]
表2 4种不同产地石斛rgb值plsda判别结果(state＝2)
[0049][0050]
表3 4种不同产地石斛rgb值lda判别结果
[0051][0052][0053]
特异性研究
[0054]
按顺序加入300μl纳米金溶液、350μl石斛提取液和250μl不同金属离子溶液(浓度为(1
×
10-2
mol/l，金属离子分别为mg
2
、zn
2
、mn
2
、k

、fe
3
、sn
2
、cu
2
、ag

)并加入100μl水定容至1ml作为实验组，其中每个产地选择1个样本最为代表，反应时间为10min，将反应后的样品置于96孔板中并用相机拍照记录每个样本的色变响应图片，具体见图6。
[0055]
结果表明，不同产地石斛提取液仅与铜离子作用后，才可造成纳米金聚集程度和色变响应的显著差异，进而实现对石斛产地的有效鉴别。
[0056]
上述实施例仅是为了清楚地说明所做的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或者变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举，因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。