用于成像流式细胞术的相位校正的制作方法

用于成像流式细胞术的相位校正
1.相关申请的交叉引用
2.本技术涉及于2019年5月14日提交的美国临时专利申请第62/847631号；该申请的公开内容通过引用并入本文。
3.引言
4.生物流体中分析物的表征已经成为医疗诊断和患者的整体健康状况评估的组成部分。生物流体例如人血液或血液衍生产物中的分析物的检测能够提供在确定患有各种疾病状况的患者的治疗方案中起作用的结果。
5.流式细胞术是用来对生物材料，例如血液样本中的细胞或其他类型的生物或化学样本中的感兴趣的颗粒，进行表征和通常地进行分类的技术。流式细胞仪通常包括用于接收流体样本例如血液样本的样本储存器，和含有鞘液的鞘储存器。流式细胞仪将流体样本中的颗粒(包括细胞)作为细胞流输送到流动室，同时也将鞘液输送到流动室。为表征流动流的成分，流动流受到光的照射。流动流中的材料的变化，例如形态或存在荧光标记，可以导致观测到的光的变化，这些变化允许表征和分离。
6.为表征流动流的成分，光必须冲击到流动流并被收集。流式细胞仪的光源能够是广谱灯、发光二极管和单波长激光。光源与流动流对准，并收集和定量分析被照射的颗粒的光学响应。


技术实现要素：

7.本公开的方面包括用于对来自光检测系统(例如在流式细胞仪中)的信号进行相位校正的方法。根据特定实施方案的方法包括用光检测系统检测来自流动流中的具有颗粒的样本的光，该光检测系统包括被配置为生成明场数据信号的明场光电检测器和被配置为生成荧光数据信号的荧光检测器，并基于明场数据信号与荧光数据信号之间的相对相位计算荧光检测器的相位校正。还描述了具有处理器的系统，该处理器具有可操作地耦合到处理器上的其上存储有指令的存储器，该指令在由处理器执行时，使处理器基于明场数据信号和来自荧光检测器的荧光数据信号计算荧光检测器的相位校正。还提供了具有用于实践主题方法的编程的集成电路器件(例如现场可编程门阵列)。
8.在实施方案中，对来自流动流的询问区域中的具有颗粒的样本的光进行检测。在一些实施方案中，颗粒是校准珠粒。在其他实施方案中，颗粒是细胞。根据实施方案的方法包括用明场光电检测器检测光以生成明场数据信号，和用荧光检测器检测光以生成荧光数据信号。在一些实施方案中，方法还包括例如使用前向散射光检测器或侧向散射光检测器检测光散射。荧光检测器的相位校正是基于明场数据信号与来自荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位确定的。在一些实施方案中，主题光检测系统包括两个或多于两个荧光检测器，并且基于明场数据信号和来自每个荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位计算每个荧光检测器的相位校正。
9.在一些实施方案中，方法包括使用明场光电检测器检测来自样本的光以生成明场数据信号，使用在第一电压下工作的第一荧光光电检测器检测来自样本的光以生成第一荧
光数据信号，和在第二电压下工作的第二荧光光电检测器检测来自样本的光以生成第二荧光数据信号。基于明场数据信号与第一荧光数据信号之间的相对相位计算第一荧光检测器的相位校正，基于明场数据信号与第二荧光数据信号之间的相对相位计算第二荧光检测器的相位校正。为校正根据特定实施方案的光检测系统，更改(例如，逐渐增加)第一荧光检测器和第二荧光检测器的工作电压，并基于每个工作电压下的荧光数据信号和明场数据信号之间的相对相位计算第一荧光检测器和第二荧光检测器中的每一个的相位校正。在一些实施方案中，为进行光检测系统的相位校正，方法包括基于对每个荧光检测器确定的相位校正和样本中的荧光团的荧光寿命计算每个荧光检测器在每个工作电压下的寿命相位校正。
10.在特定实施方案中，主题光检测系统包括明场光电检测器和多个荧光检测器。在这些实施方案中，方法包括基于明场数据信号与来自荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位计算每个荧光检测器的相位校正。为进行光检测系统的相位校正，更改(例如增加)每个荧光检测器的工作电压，并计算每个工作电压下的每个荧光检测器的相位校正。在一些情况下，光检测系统中的多个荧光检测器中的每一个的寿命相位校正是基于对每个荧光检测器确定的相位校正和样本的荧光团的荧光寿命来确定的。
11.在一些实施方案中，方法还包括使用光检测系统的荧光检测器从样本中的颗粒生成频率编码的荧光数据，并通过利用每个荧光检测器的所计算的相位校正对频率编码的荧光数据执行变换以计算颗粒的相位校正的空间数据。在一个实例中，跨越流动流(水平轴)的多个位置受到包括本振光束和多个射频偏移激光束的激光的照射，使得跨越流动流的不同位置受到本振光束和射频偏移频移光束之一的照射。在一些情况下，本振光束(local oscillator beam)是来自激光器的光的频移光束。在这种实例中，跨越流动流中的颗粒的每个空间位置由不同的拍频表征，该拍频对应于该位置处本振光束的频率和射频频移光束的频率之间的差异。在一些实施方案中，来自颗粒的频率编码数据包括跨越流动流中的颗粒的水平轴的空间编码的拍频。
12.在实践根据特定实施方案的主题方法时，频率编码的荧光数据可以通过利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行的傅里叶变换进行变换。在一些情况下，频率编码的荧光数据通过利用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行的离散傅里叶变换(dft)进行变换。在其他情况下，相位校正的空间数据是通过利用相位校正对频率编码的荧光数据进行短时傅里叶变换(stft)来计算的。在另外的情况下，相位校正的空间数据利用数字锁定放大器计算，以使频率编码的荧光数据产生外差和解复用频率编码的荧光数据。
13.本公开的方面还包括具有用于表征流动流中样本的颗粒(例如，生物样本中的细胞)的光检测系统的系统。根据特定实施方案的系统包括：光源，其被配置为照射流动流中的具有颗粒的样本；光检测系统，其具有被配置为生成明场数据信号的明场光电检测器和被配置为生成荧光数据信号的一个或多于一个荧光检测器；处理器，其具有可操作地耦合到处理器上的存储器，其中该存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时，使处理器基于明场数据信号与来自每个荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位来计算每个荧光检测器的相位校正。在一些实施方案中，光检测系统包括多个荧光检测器，并且基于明场数据信号与来自该多个荧光检测器中的每一个的荧光数据信号之间的相对相位来计算每个荧光检测器的相位校正。
14.在一些实施方案中，存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时，使
处理器计算第一荧光检测器在第一电压下的相位校正和计算第二荧光处理器在第二电压下的相位校正。在特定实施方案中，为校正光检测系统，该系统被被配置为改变荧光检测器的工作电压(例如，逐渐增加每个检测器的电压)，并基于明场数据信号与来自每个荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位计算荧光检测器中的每一个在每个工作电压下的相位校正。在特定实施方案中，系统包括其上存储有指令的存储器，该指令在由处理器执行时，使处理器基于对每个荧光检测器确定的相位校正和样本中的荧光团的荧光寿命计算每个荧光检测器在每个工作电压下的寿命相位校正。
15.在一些实施方案中，系统被配置为从样本中的颗粒生成频率编码的荧光数据。在一些实施方案中，光源包括光束发生器部件，其被配置为至少生成第一频移光束和第二频移光束。根据特定情况的光束发生器包括激光器(连续波激光器)和声光偏转器(例如，耦合到直接数字合成rf梳状发生器)。在一些情况下，主题系统包括处理器，该处理器具有可操作地耦合到处理器上的存储器，使得存储器包括存储在其上的指令，该指令在由处理器执行时，使处理器通过使用每个荧光检测器的所计算的相位校正对频率编码的荧光数据执行变换以计算颗粒的相位校正的空间数据。在实施方案中，空间数据可以包括颗粒的水平维度尺寸、颗粒的垂直维度尺寸、沿两个不同维度的颗粒尺寸比、颗粒成分的尺寸比(例如，细胞的细胞核的水平尺寸与细胞质的水平维度的比)。在这些实施方案中，为计算相位校正的空间数据，系统被配置为使用所计算的相位校正对频率编码的荧光数据执行傅里叶变换以生成颗粒的相位校正的空间数据。在其他实施方案中，系统被配置为使用所计算的相位校正对频率编码的荧光数据执行离散傅里叶变换(dft)以生成颗粒的相位校正的空间数据。在另外的实施方案中，系统被配置为使用所计算的相位校正对频率编码的荧光数据执行短时傅里叶变换(stft)。在另外的实施方案中，系统被配置为利用数字锁定放大器计算相位校正的空间数据，以使频率编码的荧光数据产生外差和解复用频率编码的荧光数据。
16.本公开的方面还包括集成电路器件，其被编程以基于明场数据信号与来自每个荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位计算一个或多于一个荧光检测器的相位校正。在一些实施方案中，集成电路器件被编程以校正光检测系统中的多个荧光检测器。在这些实施方案中，主题集成电路器件被编程以改变(例如逐渐增加)光检测系统中的每一个荧光检测器的工作电压，并基于明场数据信号与荧光数据信号之间的相对相位计算每个荧光检测器在每个工作电压下的相位校正。每个荧光检测器在每个工作电压下的寿命相位校正也可以基于所计算的相位校正和样本中的荧光团的荧光寿命确定。在特定的方面，感兴趣的集成电路器件可以包括现场可编程门阵列(fpga)、专用集成电路(asic)或复杂可编程逻辑器件(cpld)。
17.在特定的实施方案中，集成电路器件被编程以通过使用所计算的相位校正对频率编码的荧光数据执行变换以计算样本中颗粒的相位校正的空间数据。在一些情况下，集成电路器件被编程使用所计算的相位校正对频率编码的荧光数据执行傅里叶变换，以生成颗粒的相位校正的空间数据。在其他情况下，集成电路器件被编程使用所计算的相位校正对频率编码的荧光数据执行离散傅里叶变换，以生成颗粒的相位校正的空间数据。在另外的情况下，集成电路器件被编程使用所计算的相位校正对频率编码的荧光数据执行短时傅里叶变换，以生成颗粒的相位校正的空间数据。在另外的实施方案中，集成电路器件被编程以利用数字锁定放大器计算相位校正的空间数据，以使频率编码的荧光数据产生外差和解复
用频率编码的荧光数据。
18.本公开的方面还包括用于计算如本文所描述的光检测系统的一个或多于一个荧光检测器的相位校正的组合物。在实施方案中，组合物包括多个颗粒和具有稳定的荧光寿命的荧光染料成分。在一些情况下，颗粒是珠粒，例如聚合物珠粒(例如有孔或无孔聚合物珠粒)。在一些情况下，荧光染料成分包括单种染料。在其他情况下，荧光染料成分包括两种或多于两种染料。例如，荧光染料成分可以包括尼罗红染料或藻红蛋白花青染料(例如pe-cy7)。在特定实施方案中，荧光染料成分包括一种或多于一种聚合物染料。例如，聚合物染料可以是水溶性共轭聚合物。在实施方案中，颗粒与荧光染料成分稳定地结合。在一些情况下，荧光染料成分共价键合到颗粒上。
19.附图简要说明
20.图1描述了计算根据特定实施方案的光检测系统的一个或多于一个检测器的相位校正的流程图。
具体实施方式
21.本公开的方面包括用于对来自光检测系统(例如，在流式细胞仪中)的信号进行相位校正的方法。根据特定实施方案的方法包括用光检测系统检测来自流动流中的具有颗粒的样本的光，该光检测系统包括被配置为生成明场数据信号的明场光电检测器和被配置为生成荧光数据信号的荧光检测器，并基于明场数据信号与荧光数据信号之间的相对相位计算荧光检测器的相位校正。还描述了具有处理器的系统，该处理器具有可操作地耦合到处理器上的其上存储有指令的存储器，该指令在由处理器执行时，使处理器基于明场数据信号和来自荧光检测器的荧光数据信号计算荧光检测器的相位校正。还提供了具有用于实践主题方法的编程的集成电路器件(例如现场可编程门阵列)。
22.在更详细地描述本发明之前，应该理解，本发明不限于所描述的特定实施方案，因此当然可以做出改变。还应该理解的是，本文使用的术语仅仅是出于描述特定实施方案的目的，而不是为了限制，因为本发明的范围将仅由所附权利要求来限制。
23.在提供数值范围的情况下，应当理解的是，除非上下文另外明确指出，否则在该范围的上限和下限与该范围内的任何其他规定值或中间值之间的每一个中间值(到下限单位的十分之一)都包含在本发明中。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小的范围内，并且也包含在本发明内，受限于规定范围内的任何明确排除的界限。在规定范围包括一个或两个界限的情况下，排除那些所包括的界限中的一个或两个的范围也包括在本发明中。
24.本文给出了某些范围，其中数值之前是术语“约”。术语“约”在本文中用于为其之后的确切数字，以及接近或近似该术语之后数字的数字提供文字支持。在确定数字是否接近或近似具体记载的数字时，接近或近似未记载的数字可以是在其出现的上下文中提供具体记载的数字的实质等同物的数字。
25.除非另外限定，本文所使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属技术领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中能够使用与本文所描述的任何方法和材料相似或等同的方法，但是本文描述了有代表型的说明性的方法和材料。
26.本说明书中引用的所有出版物和专利均通过引用并入本文，如同每个单独的出版物或专利被具体地和单独地指明为通过引用并入，并且通过引用并入本文以公开和描述与引用的出版物相关的方法和/或材料。任何出版物的引用是针对在申请日之前的公开内容，并且不应该被解释为承认本发明由于在先发明而无权先于这种出版物。此外，所提供的公布日期可能与实际出版日期不同，这需要独立确认。
27.应注意，如在本文和权利要求中所使用的，没有数量词修饰的情况包括复数指示物，除非文中另外明确地规定。还应注意，权利要求可撰写为排除任何可选的要素。因此，这种陈述旨在作为在陈述权利要求的要素时使用诸如“单独”、“仅”等排他性术语或使用“否定”限定的先行基础。
28.本领域的技术人员在阅读本公开后将显而易见的是，本文描述和示出的每个单独的实施方案具有分立的部件和特征，其可以容易地与任何其他几个实施方案中的特征分离或组合，而不脱离本发明的范围或精神。任何所述的方法都能够按所叙述的事件的顺序或以逻辑上可能的任何其他顺序来执行。
29.虽然为了语法的流畅性，已经或将要用功能解释来描述装置和方法，应明确理解的是，除非根据35 u.s.c.
§
112明确规定，否则权利要求不得被解释为必须受到“手段”或“步骤”限制的任何解释的限制，而应被赋予同等司法原则下的权利要求所提供的定义的全部意义和同等意义，在根据35 u.s.c.
§
112明确表述权利要求的情况下，应根据35 u.s.c.
§
112被赋予完全的法定同等权利。
30.如上文所述，本公开提供了用于表征(例如，成像)流动流中的样本的颗粒的系统和方法。为进一步描述本公开的实施方案，首先更详细地描述了用于对来自光检测系统的信号进行相位校正和计算流动流中的颗粒的相位校正的空间数据的方法。接下来，描述了用于使用相位校正信号实时表征流动流中的样本的颗粒的系统。还提供了集成电路器件，例如现场可编程门阵列，其被编程以对光检测系统的信号进行相位校正，并计算颗粒的相位校正的空间数据。
31.用于对来自光检测系统的信号进行相位校正的方法
32.本公开的方面包括用于对来自光检测系统的信号进行相位校正的方法。在实践根据特定实施方案的方法时，来自流动流中具有颗粒的样本的光被光检测系统检测，该光检测系统包括被配置为响应于检测到的光生成明场数据信号的明场光电检测器，和被配置为响应于检测到的信号生成荧光数据信号的一个或多于一个荧光检测器，并基于明场数据信号与来自光检测系统中的荧光检测器中的每一个的荧光数据信号之间的相对相位计算荧光检测器中的每一个的相位校正。
33.在实践主题方法时，在流动流中的具有颗粒(例如在下文中更详细描述的校正组合物的珠粒)的样本受到来自光源的光的照射。在一些实施方案中，光源是宽带光源，其发射具有宽波长范围的光，例如跨越50nm或大于50nm，例如100nm或大于100nm，例如150nm或大于150nm，例如200nm或大于200nm，例如250nm或大于250nm，例如300nm或大于300nm，例如350nm或大于350nm，例如400nm或大于400nm，并包括跨越500nm或大于500nm。例如，一个合适的宽带光源发射具有200nm至1500nm的波长的光。合适的宽带光源的另一个实例包括发射具有400nm至1000nm的波长的光的光源。当方法包括使用宽带光源进行照射时，感兴趣的宽带光源的协议包括但不限于卤素灯、氘弧灯、氙弧灯、稳定光纤耦合宽带光源、具有连续
光谱的宽带led、超辐射发光二极管、半导体发光二极管、宽光谱led白光源、多led集成白光源以及其他宽带光源或其任何组合。
34.在其他实施方案中，方法包括使用发射特定波长或窄波长范围的窄带光源进行照射，例如使用发射如50nm或小于50nm，例如40nm或小于40nm，例如30nm或小于30nm，例如25nm或小于25nm，例如20nm或小于20nm，例如15nm或小于15nm，例如10nm或小于10nm，例如5nm或小于5nm，例如2nm或小于2nm的窄波长范围的光的光源，并包括发射特定波长的光(即单色光)的光源。当方法包括使用窄带光源进行照射时，感兴趣的窄带光源的协议包括但不限于窄波长led、激光二极管、与一个或多于一个光学带通滤波器、衍射光栅、单色器或其任何组合耦合的宽带光源。
35.在特定的实施方案中，方法包括用一个或多于一个激光器照射流动流。激光器的类型和数量根据样本以及收集的所需光而变化，并可以是脉冲激光器或连续波激光器。例如，激光器可以是气体激光器，例如氦氖激光器、氩激光器、氪激光器、氙激光器、氮激光器、co2激光器、co激光器、氩氟(arf)准分子激光器、氪氟(krf)准分子激光器、氙氯(xecl)准分子激光器或氙氟(xef)准分子激光器或其组合；染料激光器，例如二苯乙烯，香豆素或罗丹明激光器；金属蒸气激光器，例如氦镉(hecd)激光器、氦汞(hehg)激光器、氦硒(hese)激光器、氦银(heag)激光器、锶激光器、氖铜(necu)激光器、铜激光器或金激光器及其组合；固态激光器，例如红宝石激光器、nd:yag激光器、ndcryag激光器、er:yag激光器、nd:ylf激光器、nd:yvo4激光器、nd:yca4o(bo3)3激光器、nd:ycob激光器、钛蓝宝石激光器、铥yag激光器、镱yag激光器、yb2o3激光器或铈掺杂激光器及其组合；半导体二极管激光器、光泵浦半导体激光器(opsl)或上述任何激光器的倍频或三倍频实现品。
36.流动流中的样本可以被上述的光源中的一个或多于一个照射，例如2个或多于2个光源，如3个或多于3个光源，如4个或多于4个光源，如5个或多于5个光源，并包括10个或多于10个光源。光源可以包括光源类型的任意组合。例如，在一些实施方案中，方法包括用激光器阵列照射流动流中的样本，例如具有一个或多于一个气体激光器、一个或多于一个染料激光器和一个或多于一个固态激光器的阵列。
37.样本可以被200nm至1500nm，例如250nm至1250nm，例如300nm至1000nm，例如350nm至900nm和包括400nm至800nm的光照射。例如，当光源是宽带光源，样本可以被200nm至900nm的波长照射。在其他情况下，当光源包括多个窄带光源，样本可以被200nm至900nm的特定波长的光照射。例如，光源可以是多个窄带lde(1nm至25nm)，每个独立地发射200nm至900nm的波长的光。在其他实施方案中，窄带光源包括一个或多于一个激光器(例如激光器阵列)，并且使用200nm至700nm的特定波长照射样本，例如使用如上文所述的具有气体激光器、准分子激光器、染料激光器、金属蒸气激光器和固态激光器的激光器阵列照射。
38.当使用多于一个光源时，样本可以同时被光源照射、依次被光源照射，或其组合。例如，样本可以被光源中的每一个同时照射。在其他实施方案中，流动流被光源中的每一个依次照射。当多于一个光源被用于依次照射样本时，每个光源照射样本的时间可以独立地是0.001微秒或大于0.001微秒，例如0.01微秒或大于0.01微秒，例如0.1微秒或大于0.1微秒，例如1微秒或大于1微秒，例如5微秒或大于5微秒，例如10微秒或大于10微秒，例如30微秒或大于30微秒，并包括60微秒或大于60微秒。例如，方法可以包括用光源(例如激光器)照射样本，持续时间为0.001微秒至100微秒，例如0.01微秒至75微秒，例如0.1微秒至50微秒，
例如1微秒至25微秒，并且包括5微秒至10微秒。在样本被两个或多于两个光源依次照射的实施方案中，样本被每个光源照射的持续时间可以是相同或不同的。
39.被每个光源照射之间的时间段可以根据需要变化，通过0.001微秒或大于0.001微秒的延迟独立地分开，延迟例如是0.01微秒或大于0.01微秒，例如0.1微秒或大于0.1微秒，例如1微秒或大于1微秒，例如5微秒或大于5微秒，例如10微秒或大于10微秒，例如15微秒或大于15微秒，例如30微秒或大于30微秒，并包括60微秒或大于60微秒。例如，被每个光源照射之间的时间段可以是0.001微秒至60微秒，例如0.01微秒至50微秒，例如0.1微秒至35微秒，例如1微秒至25微秒，并且包括5微秒至10微秒。在特定的实施方案中，被每个光源照射之间的时间段是10微秒。在样本被多于两个(即，3个多于3个)光源依次照射的实施方案中，在被每个光源照射之间的延迟可以是相同或不同的。
40.样本可以被连续或以离散的间隔照射。在一些情况下，方法包括用光源连续照射样本。在其他情况下，样本被光源以离散的间隔照射，例如每0.001毫秒照射一次、每0.01毫秒照射一次、每0.1毫秒照射一次、每1毫秒照射一次、每10毫秒照射一次、每100毫秒照射一次，并包括每1000毫秒照射一次，或者其他间隔。
41.取决于光源，可以从变化的的距离照射样本，该距离例如为0.01mm或大于0.01mm，例如0.05mm或大于0.05mm，例如0.1mm或大于0.1mm，例如0.5mm或大于0.5mm，例如1mm或大于1mm，例如2.5mm或大于2.5mm，例如5mm或大于5mm，例如10mm或大于10mm，例如15mm或大于15mm，例如25mm或大于25mm并包括50mm或大于50mm。同时，照射的角度也可以从10
°
至90
°
变化，例如15
°
至85
°
，例如20
°
至80
°
，例如25
°
至75
°
，并包括30
°
至60
°
，例如是90
°
角。
42.在实践主题方法中，测量来自被照射的样本的光，例如通过在特定波长范围(例如，200nm至1000nm)收集来自样本的光。在实施方案中，方法可以包括测量样本的光吸收(例如，明场光数据)、测量光散射(例如，前向或侧向散射光数据)和测量样本的光发射(例如，荧光光数据)的一种或多于一种。
43.如上文所述，可以使用具有激光器和用于频移激光的声光器件的光束发生器部件。在这些实施方案中，方法包括用激光器照射声光器件。取决于输出激光束(例如用于照射流动流中的样本)中产生的光的所需波长，激光器的特定波长可以从200nm至1500nm变化，例如250nm至1250nm，例如300nm至1000nm，例如350nm至900nm，并包括400nm至800nm。声光器件可以被一个或多于一个激光器照射，例如2个或多于2个激光器，如3个或多于3个激光器，例如4个或多于4个激光器，例如5个或多于5个激光器，并包括10个或多于10个激光器。激光器可以包括激光器类型的任意组合。例如，在一些实施方案中，方法包括用激光器阵列照射声光器件，例如具有一个或多于一个气体激光器、一个或多于一个染料激光器和一个或多于一个固态激光器的阵列。
44.当使用多于一个激光器时，声光器件可以同时被激光器照射、依次被激光器照射，或其组合。例如，声光器件可以被激光器中的每一个同时照射。在其他实施方案中，声光器件被激光器中的每一个依次照射。当多于一个激光器被用于依次照射声光器件时，每个激光器照射声光器件的时间可以独立地是0.001微秒或大于0.001微秒，例如0.01微秒或大于0.01微秒，例如0.1微秒或大于0.1微秒，例如1微秒或大于1微秒，例如5微秒或大于5微秒，例如10微秒或大于10微秒，例如30微秒或大于30微秒，并包括60微秒或大于60微秒。例如，方法可以包括用激光器照射声光器件，持续时间为0.001微秒至100微秒，例如0.01微秒至
75微秒，例如0.1微秒至50微秒，例如1微秒至25微秒，并且包括5微秒至10微秒。在声光器件被两个或多于两个激光器依次照射的实施方案中，声光器件被每个激光器照射的持续时间可以是相同或不同的。
45.被每个激光器照射之间的时间段可以根据需要变化，通过0.001微秒或大于0.001微秒的延迟独立地分开，延迟例如是0.01微秒或大于0.01微秒，例如0.1微秒或大于0.1微秒，例如1微秒或大于1微秒，例如5微秒或大于5微秒，例如10微秒或大于10微秒，例如15微秒或大于15微秒，例如30微秒或大于30微秒，并包括60微秒或大于60微秒。例如，被每个光源照射之间的时间段可以是0.001微秒至60微秒，例如0.01微秒至50微秒，例如0.1微秒至35微秒，例如1微秒至25微秒，并且包括5微秒至10微秒。在特定的实施方案中，被每个激光器照射之间的时间段是10微秒。在声光器件被多于两个(即，3个多于3个)激光器依次照射的实施方案中，在被每个激光器照射之间的延迟可以是相同或不同的。
46.声光器件可以被连续或以离散的间隔照射。在一些情况下，方法包括用激光器连续照射声光器件。在其他情况下，声光器件被激光器以离散的间隔照射，例如每0.001毫秒照射一次、每0.01毫秒照射一次、每0.1毫秒照射一次、每1毫秒照射一次、每10毫秒照射一次、每100毫秒照射一次，并包括每1000毫秒照射一次，或者其他间隔。
47.取决于激光器，可以从变化的距离照射声光器件，该距离例如为0.01mm或大于0.01mm，例如0.05mm或大于0.05mm，例如0.1mm或大于0.1mm，例如0.5mm或大于0.5mm，例如1mm或大于1mm，例如2.5mm或大于2.5mm，例如5mm或大于5mm，例如10mm或大于10mm，例如15mm或大于15mm，例如25mm或大于25mm并包括50mm或大于50mm。同时，照射的角度也可以从10
°
至90
°
变化，例如15
°
至85
°
，例如20
°
至80
°
，例如25
°
至75
°
，并包括30
°
至60
°
，例如是90
°
角。
48.在实施方案中，方法包括将射频驱动信号施加到声光器件以生成角度偏转激光束。可以将两个或多于两个射频驱动信号施加到声光器件以生成具有所需数量的角度偏转激光束的输出激光束，例如3个或多于3个射频驱动信号，例如4个或多于4个射频驱动信号，例如5个或多于5个射频驱动信号，例如6个或多于6个射频驱动信号，例如7个或多于7个射频驱动信号，例如8个或多于8个射频驱动信号，例如9个或多于9个射频驱动信号，例如10个或多于10个射频驱动信号，例如15个或多于15个射频驱动信号，例如25个或多于25个射频驱动信号，例如50个或多于50个射频驱动信号，并包括100个或多于100个射频驱动信号。
49.由射频驱动信号产生的角度偏转激光束各自具有基于施加的射频驱动信号的振幅的强度。在一些实施方案中，方法包括施加具有足以产生具有所需强度的角度偏转激光束的振幅的射频驱动信号。在一些情况下，每个施加的射频驱动信号独立地具有的振幅为约0.001v至约500v，例如约0.005v至约400v，例如约0.01v至约300v，例如约0.05v至约200v，例如约0.1v至约100v，例如约0.5v至约75v，例如约1v至约50v，例如约2v至约40v，例如约3v至约30v，并包括约5v至约25v。在一些实施方案中，每个施加的射频驱动信号具有的频率为约0.001mhz至约500mhz，例如约0.005mhz至约400mhz，例如约0.01mhz至约300mhz，例如约0.05mhz至约200mhz，例如约0.1mhz至约100mhz，例如约0.5mhz至约90mhz，例如约1mhz至约75mhz，例如约2mhz至约70mhz，例如约3mhz至约65mhz，例如约4mhz至约60mhz，并包括约5mhz至约50mhz。
50.在一些实施方案中，流动流的样本被来自声光器件的包括角度偏转激光束的输出
激光束照射，每个角度偏转激光束具有基于施加的射频驱动信号的振幅的强度。例如，用于照射流动流中的颗粒的输出激光束可以包括2个或多于2个角度偏转激光束，例如3个或多于3个，例如4个或多于4个，例如5个或多于5个，例如6个或多于6个，例如7个或多于7个，例如8个或多于8个，例如9个或多于9个，例如10个或多于10个，并包括25个或多于25个角度偏转激光束。在实施方案中，角度偏转激光束中的每一个具有不同的频率，其频率通过预定的射频从输入激光束的频率偏移。
51.每个角度偏转激光束也在空间上相互偏移。取决于施加的射频驱动信号和输出激光束所需的照射轮廓，角度偏转激光束可以被分隔0.001μm或多于0.001μm，例如0.005μm或多于0.005μm，例如0.01μm或多于0.01μm，例如0.05μm或多于0.05μm，例如0.1μm或多于0.1μm，例如0.5μm或多于0.5μm，例如1μm或多于1μm，例如5μm或多于5μm，例如10μm或多于10μm，例如100μm或多于100μm，例如500μm或多于500μm，例如1000μm或多于1000μm，并包括5000μm或多于5000μm。在一些实施方案中，角度偏转激光束例如与沿输出激光束的水平轴的相邻的角度偏转激光束重叠。相邻的角度偏转激光束之间的重叠(例如光束点的重叠)可以重叠0.001μm或多于0.001μm，例如重叠0.005μm或多于0.005μm，例如重叠0.01μm或多于0.01μm，例如重叠0.05μm或多于0.05μm，例如重叠0.1μm或多于0.1μm，例如重叠0.5μm或多于0.5μm，例如重叠1μm或多于1μm，例如重叠5μm或多于5μm，例如重叠10μm或多于10μm，并包括重叠100μm或多于100μm。
52.当颗粒穿过由两个光束叠加形成的激发光束的部分时，其暴露于它们的电场叠加中。颗粒发射的荧光由对应于入射光束的光频率之间的差异的拍频频率编码。例如，由通过由第一光束和第二光束的叠加形成的激发光束的左水平边缘的颗粒发射的频率编码荧光，将表现出对应于第二光束和第一光束的频率之间的差异的拍频，即f
第一光束-f
第二光束
的拍频。以这种方式，通过激发光束的颗粒的位置能够通过与这些颗粒发射的辐射相关的rf拍频编码。在一些实施方案中，这种颗粒的位置的编码能够用于将检测到的由这些颗粒发射的辐射的强度相对于光束的强度的变化归一化，例如，跨越其水平方向。
53.在一些实施方案中，由颗粒发射的频率编码荧光是对应于本振光束的频率(f
lo
)和射频偏移光束的频率之间的差异的拍频。例如，频率编码的荧光数据包括f
lo-f
rf偏移光束
的拍频。当流动流的照射包括跨越流动流的宽度(例如，整个水平轴)的本振光束，频率编码的荧光数据包括对应于本振光束的频率(f
lo
)与每个射频偏移光束的频率(f1、f2、f3、f4、f5、f6等)之间的差异的拍频。在这些实施方案中，频率编码的荧光数据可以包括多个拍频，每个拍频对应于跨越流动流的水平轴的位置。
54.如下文更详细地讨论的，在一个工作模式中，流动流中的颗粒能够被多个激发频率同时照射，其中的每一个例如能够通过偏移激光束的中心频率获得。更具体地，多个样本位置能够被激光束同时照射，该激光束通过将参照激光束(例如本振光束)与多个射频偏移激光束混合形成的，使得每个样本位置被参照激光束与射频偏移光束之一照射，从而在该位置激发感兴趣的荧光团(如果存在)。在一些实施方案中，参照本振光束能够通过对光束(例如，来自激光器，例如连续波激光器)射频偏移获得。在这些实施方案中，流动流中的被光照射的颗粒的每个空间位置被不同的拍频“标记”，该拍频对应于参照光束的频率和射频偏移光束的频率之间的差异。在这些情况下，由荧光团发射的荧光辐射将对拍频进行空间编码。
55.在特定的情况下，流动流被多个频移光束照射，并且使用射频标记发射(fire)通过荧光成像对流动流中的细胞进行成像，以生成频率编码图像，例如diebold等人，nature photonics vol.7(10)；806-810(2013)所描述的，以及如美国专利第9423353号、第9784661号和第10006852号、美国专利公布第2017/0133857号和第2017/0350803号所描述的，其全部内容通过引用并入本文。
56.在实践主题方法时，来自样本的光被光检测系统所检测。如下文中更详细地描述的，光检测系统包括明场光电检测器和一个或多于一个荧光检测器。在特定的方面，光检测系统还包括光散射检测器，例如前向光散射检测器、侧向光散射检测器或其组合。收集的光可以被连续检测或者以离散的间隔检测。在一些情况下，方法包括连续检测光。在其他情况下，光以离散的间隔检测，例如光每0.001毫秒测量一次、每0.01毫秒测量一次、每0.1毫秒测量一次、每1毫秒测量一次、每10毫秒测量一次、每100毫秒测量一次，并包括每1000毫秒测量一次，或者其他间隔。
57.在该方法期间，检测到的光的测量可以进行一次或多于一次，例如2次或多于2次，例如3次或多于3次，例如5次或多于5次，并包括10次或多于10次。在特定的实施方案中，来自样本的光被测量2次或多于2次，在特定的情况下对数据进行平均。
58.在一些实施方案中，方法还包括在检测光之前调整来自样本的光。例如，来自样本源的光可以通过一个或多于一个透镜、镜子、针孔、狭缝、光栅、光折射器及其任何组合。在一些情况下，收集的光通过一个或多于一个聚焦透镜，例如以减小光的轮廓。在其他情况下，样本发射的光通过一个或多于一个准直仪以减少光束发散。
59.在实施方案中，方法包括用明场光电检测器检测光以生成明场数据信号。来自样本的光可以用明场光电检测器以一个或多于一个波长检测，例如5个或多于5个不同波长，例如10个或多于10个不同波长，例如25个或多于25个不同波长，例如50个或多于50个不同波长，例如100个或多于100个不同波长，例如200个或多于200个不同波长，例如300个或多于300个不同波长，并包括以400个或多于400个不同波长检测。光可以使用明场光电检测器以200nm至1200nm的波长范围中的一个或多于一个检测。在一些情况下，方法包括用明场光电检测器在一定的波长范围检测来自样本的光，例如200nm至1200nm，例如300nm至1100nm，例如400nm至1000nm，例如500nm至900nm，并包括600nm至800nm。
60.明场光电检测器被配置为响应于检测到的光生成一个或多于一个明场数据信号，例如响应于检测到的光生成2个或多于2个，例如3个或多于3个，例如4个或多于4个，例如5个或多于5个，并包括10个或多于10个明场数据信号。当明场光电检测器被配置为检测多个光波长的光(例如400nm至800nm)，在一些情况下方法可以包括响应于每个检测到的光的波长生成一个或多于一个明场数据信号。在其他情况下，响应于明场光电检测器在整个波长范围内检测到的光生成单个明场数据信号。
61.本发明的方法还可以包括用一个或多于一个荧光检测器检测来自样本的荧光。如下文中更详细地描述的，光检测系统可以包括一个或多于一个荧光检测器，例如2个或多于2个，例如3个或多于3个，例如4个或多于4个，例如5个或多于5个，例如6个或多于6个，例如7个或多于7个，例如8个或多于8个，例如9个或多于9个，例如10个或多于10个，例如15个或多于15个，并包括25个或多于25个荧光检测器。在实施方案中，荧光检测器中的每一个被配置为生成荧光数据信号。来自样本的荧光可以通过每个荧光检测器独立地以200nm至1200nm
的波长范围中的一个或多于一个波长检测。在一些情况下，方法包括在一定的波长范围检测来自样本的荧光，例如200nm至1200nm，例如300nm至1100nm，例如400nm至1000nm，例如500nm至900nm，并包括600nm至800nm。在其他情况下，方法包括用每个荧光检测器在一个或多于一个特定波长检测荧光。例如，取决于目标光检测系统的不同荧光检测器的数量，荧光可以在450nm、518nm、519nm、561nm、578nm、605nm、607nm、625nm、650nm、660nm、667nm、670nm、668nm、695nm、710nm、723nm、780nm、785nm、647nm、617nm或其组合的一个或多于一个检测。在特定的实施方案中，方法包括检测对应于存在于样本中的特定荧光团的荧光峰的波长的光波长。
62.在实践主题方法时，基于明场数据信号和每个荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位，为光检测系统中的一个或多于一个荧光检测器计算相位校正。在一个实例中，方法包括用明场光电检测器检测光，该明场光电检测器被配置为响应于检测到的光生成明场数据信号；用第一荧光检测器检测光，该第一荧光检测器被配置为响应于检测到的光生成第一荧光数据信号，并且用第二荧光检测器检测光，该第二荧光检测器被配置为响应于检测到的光生成第二荧光数据信号；基于明场数据信号与第一荧光数据信号之间的相对相位计算第一荧光检测器的相位校正；基于明场数据信号与第二荧光数据信号之间的相对相位计算第二荧光检测器的相位校正。在另一个实例中，方法包括用明场光电检测器检测光，该明场光电检测器被配置为响应于检测到的光生成明场数据信号；用多个荧光检测器检测光，并基于明场数据信号与来自该多个荧光检测器中的每一个的荧光数据信号之间的相对相位计算每个荧光检测器的相位校正。
63.在特定的实施方案中，基于明场数据信号与荧光数据信号之间的相对相位，根据下式为荧光检测器中的每一个计算相位校正：
[0064][0065]
其中％表示模函数，所有相位用弧度表示。
[0066]
在其他的实施方案中，基于明场数据信号与荧光数据信号之间的相对相位，根据下式为荧光检测器中的每一个计算相位校正：
[0067][0068]
其中所有相位均表示为复相位单位向量。
[0069]
在实施方案中，光通过在预定电压下工作的每个荧光检测器检测。在一些实施方案中，方法包括在多个不同的工作电压下计算每个荧光检测器的相位校正。在这些实施方案中，方法包括在第一组工作电压下用每个荧光检测器检测光以生成第一组荧光数据信号；更改荧光检测器中的一个或多于一个的工作电压为第二组工作电压；在第二组工作电压下用每个荧光检测器检测光以生成第二组荧光数据信号。工作电压可以以任何增量改变(即，增加或减小)，该增量例如0.01vv或多于0.01vv，例如0.05vv或多于0.05vv，例如0.1vv或多于0.1vv，例如0.5v或多于0.5v，例如1v或多于1v，例如2v或多于2v，例如3v或多于3v，例如5v或多于5v，例如10v或多于10v，例如25v或多于25v，例如50v或多于50v，例如100v或多于100v，例如250v或多于250v，例如500v或多于500v，并包括1000v或多于1000v。
[0070]
在一个实例中，每个荧光检测器的工作电压增加0.01v或多于0.01v，例如0.05v或
多于0.05v，例如0.1v或多于0.1v，例如0.5v或多于0.5v，例如1v或多于1v，例如2v或多于2v，例如3v或多于3v，例如5v或多于5v，例如10v或多于10v，例如25v或多于25v，例如50v或多于50v，例如100v或多于100v，例如250v或多于250v，例如500v或多于500v，并包括每个荧光检测器的工作电压增加1000v或多于1000v。在另一个实例中，每个荧光检测器的工作电压减小0.01v或多于0.01v，例如0.05v或多于0.05v，例如0.1v或多于0.1v，例如0.5v或多于0.5v，例如1v或多于1v，例如2v或多于2v，例如3v或多于3v，例如5v或多于5v，例如10v或多于10v，例如25v或多于25v，例如50v或多于50v，例如100v或多于100v，例如250v或多于250v，例如500v或多于500v，并包括每个荧光检测器的工作电压减小1000v或多于1000v。
[0071]
根据光检测系统的相位校正的需要，可以在任何数量的工作电压下从每个荧光检测器收集荧光数据信号，例如在2个或多于2个不同工作电压下，例如3个或多于3个不同工作电压下，例如5个或多于5个不同工作电压下，例如10个或多于10个不同工作电压下，例如25个或多于25个不同工作电压下从每个荧光检测器收集荧光数据信号，并包括在50个或多于50个不同工作电压下从每个荧光检测器收集荧光数据信号。
[0072]
每个荧光检测器的工作电压可以改变相同或者不同的量。在一些情况下，光检测系统中的每一个荧光检测器的工作电压改变相同的量。在其他情况下，光检测系统中的每一个荧光检测器的工作电压改变不同的量。在另外的情况下，光检测系统中的两个或多于两个荧光检测器的工作电压可以改变相同的量，光检测系统中的两个或多于两个荧光检测器的工作电压可以改变不同的量。在每个工作电压下，基于明场数据信号与荧光数据信号之间的相对相位计算每个荧光检测器的相位校正。
[0073]
如下文中更详细地描述的，根据特定实施方案的感兴趣的系统包括可变增益放大器。在一些情况下，可变增益放大器可被配置为在-100db至100db工作，例如-75db至75db，例如-50db至50db，例如-25db至25db，并包括0db至50db。在一些实施方案中，方法包括改变电子增益设置(例如，放大器的增益)，并计算每个荧光检测器的相位校正。在一些情况下，方法包括改变放大器的增益，例如改变0.01db或多于0.01db，例如0.05db或多于0.05db，例如0.1db或多于0.1db，例如0.5db或多于0.5db，例如1db或多于1db，例如2db或多于2db，例如3db或多于3db，例如5db或多于5db，例如10db或多于10db，并包括25db或多于25db。在一个实例中，方法包括逐渐增加放大器的增益并计算相位校正，例如逐渐增加放大器的增益0.01db或多于0.01db，例如0.05db或多于0.05db，例如0.1db或多于0.1db，例如0.5db或多于0.5db，例如1db或多于1db，例如2db或多于2db，例如3db或多于3db，例如5db或多于5db，例如10db或多于10db，并包括25db或多于25db。在另一个实例中，方法包括逐步减小放大器的增益并计算相位校正，例如逐步减小放大器的增益0.01db或多于0.01db，例如0.05db或多于0.05db，例如0.1db或多于0.1db，例如0.5db或多于0.5db，例如1db或多于1db，例如2db或多于2db，例如3db或多于3db，例如5db或多于5db，例如10db或多于10db，并包括25db或多于25db。
[0074]
在一些实施方案中，计算光检测系统的荧光检测器中的每一个的相位校正包括计算寿命相位校正分量。寿命相位校正的计算基于如上所述的在荧光检测器在每个工作电压下计算的相位校正和样本中的荧光团的荧光寿命。取决于荧光团的特定类型和存在的荧光团的数量，可以使用一个或多于一个荧光寿命以计算寿命相位校正分量，例如2个或多于2个，例如3个或多于3个，例如4个或多于4个，并包括5个或多于5个不同的荧光寿命可以用来
计算寿命相位校正分量。在一些实施方案中，在荧光团的峰值发射波长计算每个荧光寿命。在这些实施方案中，可以检测每个荧光寿命并使用来自不同检测通道的信号计算每个荧光寿命。
[0075]
在特定的实施方案中，基于样本中荧光团的荧光寿命，根据下式计算荧光检测器中的每一个的寿命相位校正：
[0076][0077]
τ＝荧光寿命
[0078]
f＝频率
[0079]
图1描述了计算根据特定实施方案的光检测系统的一个或多于一个荧光检测器的相位校正的流程图。在步骤101，用明场光电检测器和一个或多于一个荧光检测器检测来自流动流中的颗粒的光。在步骤102，生成明场数据信号和来自荧光检测器的数据信号。在步骤103，基于明场数据信号与来自每个荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位计算每个荧光检测器的相位校正。在步骤104，使用在步骤103中计算的相位校正分量和流动流中的样本的荧光团的寿命计算寿命相位校正。(步骤106)在改变每个荧光检测器的工作电压后可以重复步骤101和步骤104。在步骤105，将计算的相位校正应用到每个荧光检测器。在步骤107生成频率编码数据，在步骤108通过执行频率编码的荧光数据的变换，例如利用离散傅里叶变换，计算相位校正的空间数据。在步骤109，空间数据能够用于生成图像。
[0080]
在特定的实施方案中，方法还可以包括使用如上所述的每个荧光检测器的计算的相位校正，由频率编码的荧光数据计算颗粒的相位校正的空间数据。在这些实施方案中，方法还包括使用光检测系统中的荧光检测器中的一个或多于一个从样本中的颗粒生成频率编码的荧光数据；并通过利用每个荧光检测器的所计算的相位校正对频率编码的荧光数据执行变换以计算颗粒的相位校正的空间数据。在一个实例中，相位校正的空间数据是通过利用所计算的相位校正对频率编码的荧光数据执行傅里叶变换(ft))来计算的。在另一个实例中，相位校正的空间数据是通过利用所计算的相位校正对频率编码的荧光数据执行离散傅里叶变换(dft)来计算的。在另一个实例中，相位校正的空间数据是通过利用所计算的相位校正对频率编码的荧光数据执行短时傅里叶变换(stft)来计算的。在另一个实例中，相位校正的空间数据利用数字锁定放大器进行计算，以使频率编码的荧光数据产生外差和解复用频率编码的荧光数据。通过在执行频率编码数据到空间数据的变换之前考虑相位校准，与执行原始频率数据到空间数据的变换(即，不首先考虑相位)相比，变换的输出的计算复杂性更低。在一些实施方案中，方法包括在不执行任何的数学虚计算(即，只执行变换的数学实计算的计算)的情况下执行频率编码的荧光数据的变换，从而从频率编码的荧光数据生成空间数据。
[0081]
在一些实施方案中，空间数据包括颗粒的水平维度尺寸、颗粒的垂直维度尺寸、沿两个不同维度的颗粒尺寸比、颗粒成分的尺寸比(例如，细胞的细胞核的水平尺寸与细胞质的水平维度的比)。
[0082]
在特定的实施方案中，方法包括由频率编码荧光生成流动流中的颗粒的图像。在一些实施方案中，颗粒的图像可以由频率编码荧光结合检测到的光吸收、检测到的光散射或其组合生成。在特定的情况下，颗粒的图像仅由频率编码荧光生成。在其他情况下，目标
的图像由频率编码荧光和从样本检测到的光吸收生成，该光吸收例如来自明场光电检测器。在其他情况下，颗粒的图像由频率编码荧光以及从样本检测到的光散射生成，该光散射例如来自侧向散射检测器、前向散射检测器或侧向散射检测器和前向散射检测器的组合。在其他情况下，颗粒的图像可以由频率编码荧光和检测到的光吸收、检测到的光散射和检测到的光发射的组合生成。
[0083]
可以由频率编码的荧光数据生成颗粒的一个或多于一个图像。在一些实施方案中，频率编码的荧光数据生成颗粒的单个图像。在其他的实施方案中，频率编码的荧光数据生成颗粒的两个或多于两个图像，例如3个或多于3个，例如4个或多于4个，例如5个或多于5个，并包括10个或多于10个图像，或其组合。
[0084]
用于对来自光检测系统的信号进行相位校正的系统
[0085]
如上所述，本公开的各方面还包括具有光检测系统的系统，该光检测系统用于表征流动流中的样本颗粒(例如，生物样本中的细胞)。根据某些实施方案的系统包括配置成照射在流动流中具有颗粒的样本的光源、具有配置成产生明场数据信号的明场光电检测器和配置成产生荧光数据信号的一个或多于一个荧光检测器的光检测系统以及处理器，该处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，其中存储器包括存储在其上的指令，当由处理器执行时，该指令使处理器基于明场数据信号和来自每个荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位计算荧光检测器中的每一个的相位校正。
[0086]
感兴趣的系统包括配置成照射流动流中的样本的光源。在实施方案中，光源可以是任何合适的宽带光源或窄带光源。基于样本中的成分(例如，细胞、珠粒、非细胞颗粒等)，光源可以被配置为发射200nm到1500nm，例如250nm至1250nm，例如300nm至1000nm，例如350nm至900nm和包括400nm至800nm的波长的光。例如，光源可以包括发射具有200nm到900nm的波长的光的宽带光源。在其他情况下，光源包括发射200nm到900nm的波长的窄带光源。例如，光源可以是发射200nm到900nm的波长的光的窄带led(1nm至25nm)。
[0087]
在一些实施方案中，光源是激光器。感兴趣的激光器可以包括脉冲激光器或连续波激光器。例如，激光器可以是气体激光器，例如氦氖激光器、氩激光器、氪激光器、氙激光器、氮激光器、co2激光器、co激光器、氩氟(arf)准分子激光器、氪氟(krf)准分子激光器、氯氙(xecl)准分子激光器或氙氟(xef)准分子激光器或它们的组合；染料激光器，例如二苯乙烯、香豆素或罗丹明激光器；金属蒸汽激光器，例如氦镉(hecd)激光器、氦汞(hehg)激光器、氦硒(hese)激光器、氦银(heag)激光器、锶激光器、氖铜(necu)激光、铜激光器或金激光器及它们的组合；固体激光器，例如红宝石激光器、nd:yag激光器、ndcryag激光器、er:yag激光器、nd:ylf激光器、nd:yvo4激光器、nd:yca4o(bo3)3激光器、nd:ycob激光器、钛蓝宝石激光器、铥yag激光器、镱yag激光器、y2o3激光器或掺铈激光器及它们的组合；半导体二极管激光器、光泵半导体激光器(opsl)或上述任何激光器的倍频或三倍频施用。
[0088]
在其他实施方案中，光源是非激光光源，例如灯，包括但不限于卤素灯、氘弧灯、氙弧灯、发光二极管，例如具有连续光谱的宽带led、超发光二极管、半导体发光二极管、宽光谱led白光光源、多led集成。在一些情况下，非激光光源是稳定的光纤耦合宽带光源、白光源，以及其他光源或它们的任何组合。
[0089]
在某些实施方案中，光源是光束发生器，其被配置为产生两束或多于两束频移光。在一些情况下，光束发生器包括激光器、被配置为将射频驱动信号施加到声光装置以产生
两个或多于两个角度偏转的激光束的射频发生器。在这些实施方案中，激光器可以是脉冲激光器或连续波激光器。例如，感兴趣的光束发生器中的激光器可以是气体激光器，例如氦氖激光器、氩激光器、氪激光器、氙激光器、氮激光器、co2激光器、co激光器、氩氟(arf)准分子激光器、氪氟(krf)准分子激光器、氯氙(xecl)准分子激光器或氙氟(xef)准分子激光器或它们的组合；染料激光器，例如二苯乙烯、香豆素或罗丹明激光器；金属蒸汽激光器，例如氦镉(hecd)激光器、氦汞(hehg)激光器、氦硒(hese)激光器、氦银(heag)激光器、锶激光器、氖铜(necu)激光器、铜激光器或金激光器及它们的组合；固体激光器，例如红宝石激光器、nd:yag激光器、ndcryag激光器、er:yag激光器、nd:ylf激光器、nd:yvo4激光器、nd:yca4o(bo3)3激光器、nd:ycob激光器、钛蓝宝石激光器、铥yag激光器、镱yag激光器、y2o3激光器或掺铈激光器及它们的组合。
[0090]
声光器件可以是配置为使用施加的声波对激光进行频移的任何方便的声光协议。在某些实施方案中，声光器件是声光偏转器。主题系统中的声光器件被配置为从来自激光器的光和所施加的射频驱动信号产生角度偏转的激光束。射频驱动信号可以通过任何合适的射频驱动信号源施加到声光器件，该射频驱动信号源例如是直接数字合成器(dds)、任意波形发生器(awg)或电脉冲发生器。
[0091]
在实施方案中，控制器被配置为向声光器件施加射频驱动信号以在输出激光束中产生期望数量的角度偏转的激光束，例如被配置为施加3个或多于3个射频驱动信号、例如4个或多于4个射频驱动信号、例如5个或多于5个射频驱动信号、例如6个或多于6个射频驱动信号、例如7个或多于7个射频驱动信号、例如8个或多于8个射频驱动信号、例如9个或多于9个射频驱动信号、例如10个或多于10个射频驱动信号、例如15个或多于15个射频驱动信号、例如25个或多于25个射频驱动信号、例如50个或多于50个射频驱动信号、并且包括被配置为施加100个或多于100个射频驱动信号。
[0092]
在一些情况下，为了在输出激光束中产生某一强度分布的角度偏转的激光束，控制器被配置为施加具有某一幅度的射频驱动信号，该幅度例如约0.001v至约500v，例如约0.005v至约400v，例如约0.01v至约300v，例如约0.05v至约200v，例如约0.1v至约100v，例如约0.5v至约75v，例如约1v至50v，例如约2v至40v，例如3v至约30v并且包括约5v至约25v。在一些实施方案中，每个施加的射频驱动信号具有约0.001mhz至约500mhz，例如约0.005mhz至约400mhz，例如约0.01mhz至约300mhz，例如约0.05mhz至约200mhz，例如约0.1mhz至约100mhz，例如约0.5mhz至约90mhz，例如约1mhz至约75mhz，例如约2mhz至约70mhz，例如约3mhz至约65mhz，例如约4mhz至约60mhz并且包括约5mhz至约50mhz的频率。
[0093]
在某些实施方案中，控制器具有处理器，该处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，使得存储器包括存储在其上的指令，当由处理器执行时，该指令使处理器产生具有角度偏转的激光束的输出激光束，该角度偏转的激光束具有期望的强度分布。例如，存储器可以包括指令以产生具有相同强度的2个或多于2个角度偏转的激光束，例如3个或多于3个、例如4个或多于4个、例如5个或多于5个、例如10个或多于10个、例如25个或多于25个、例如50个或多于50个，并且包括存储器可以包括产生具有相同强度的100个或多于100个角度偏转的激光束的指令。在其他实施方案中，可以包括指令以产生具有不同强度的2个或多于2个角度偏转的激光束，例如3个或多于3个、例如4个或多于4个、例如5个或多于5个、例如10个或多于10个、例如25个或多于25个、例如50个或多于50个，并且包括存储器可以包括产生
具有不同强度的100个或多于100个角度偏转的激光束的指令。
[0094]
在某些实施方案中，控制器具有处理器，该处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，使得存储器包括存储在其上的指令，当由处理器执行时，该指令使处理器产生具有沿水平轴从输出激光束的边缘到中心增加的强度的输出激光束。在这些情况下，输出光束的中心处的角度偏转的激光束的强度可以是沿水平轴在输出激光束边缘处的角度偏转的激光束强度的0.1％到约99％，例如是沿水平轴在输出激光束边缘处的角度偏转的激光束强度的0.5％至约95％，例如1％至约90％，例如约2％至约85％，例如约3％至约80％，例如约4％至约75％，例如约5％至约70％，例如约6％至约65％，例如约7％至约60％，例如约8％至约55％并且包括约10％至约50％。在其他实施方案中，控制器具有处理器，该处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，使得存储器包括存储在其上的指令，当由处理器执行时，该指令使处理器产生具有沿水平轴从输出激光束的边缘到中心增加的强度的输出激光束。在这些情况下，输出光束边缘处的角度偏转的激光束的强度可以是沿水平轴在输出激光束中心处的角度偏转的激光束强度的0.1％至约99％，例如是沿水平轴在输出激光束中心处的角度偏转的激光束强度的0.5％至约95％，例如1％至约90％，例如约2％至约85％，例如约3％至约80％，例如约4％至约75％，例如约5％至约70％，例如约6％至约65％，例如约7％至约60％，例如约8％至约55％并且包括约10％至约50％。在又一些其他实施方案中，控制器具有处理器，该处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，使得存储器包括存储在其上的指令，当由处理器执行时，该指令使处理器产生具有沿水平轴的高斯分布的强度分布的输出激光束。在又一些其他实施方案中，控制器具有处理器，该处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，使得存储器包括存储在其上的指令，当由处理器执行时，该指令使处理器产生具有沿水平轴的顶帽强度分布的输出激光束。
[0095]
在实施方案中，感兴趣的光束发生器可以被配置为在输出激光束中产生空间分离的角度偏转的激光束。取决于施加的射频驱动信号和输出激光束所需的照射分布，角度偏转的激光束可以被分隔0.001μm或大于0.001μm，例如0.005μm或大于0.005μm、例如0.01μm或大于0.01μm、例如0.05μm或大于0.05μm、例如0.1μm或大于0.1μm、例如0.5μm或大于0.5μm、例如1μm或大于1μm、例如5μm或大于5μm、例如10μm或大于10μm、例如100μm或大于100μm、例如500μm或大于500μm、例如1000μm或大于1000μm并且包括5000μm或大于5000μm。在一些实施方案中，系统被配置为在输出激光束中产生角度偏转的激光束，该角度偏转的激光束例如与沿输出激光束的水平轴的相邻的角度偏转的激光束重叠。相邻的角度偏转的激光束之间的重叠(例如光束点的重叠)可以是0.001μm或大于0.001μm的重叠，例如0.005μm或大于0.005μm的重叠，例如0.01μm或大于0.01μm的重叠，例如0.05μm或大于0.05μm的重叠，例如0.1μm或大于0.1μm的重叠，例如0.5μm或大于0.5μm的重叠，例如1μm或大于1μm的重叠，例如5μm或大于5μm的重叠，例如10μm或大于10μm的重叠并且包括100μm或大于100μm的重叠。
[0096]
在某些情况下，被配置为产生两个或多于两个频移光束的光束发生器包括例如美国专利第9423353号、第9784661号和第10006852号以及美国专利公布第2017/0133857号和第2017/0350803号中所述的激光激发模块，这些专利的公开内容通过引用并入本文。
[0097]
在实施方案中，系统包括光检测系统，该光检测系统具有明场光电检测器和用于检测和测量来自样本的光的一个或多于一个荧光检测器。感兴趣的主题明场和荧光检测器可以包括但不限于光学传感器，例如有源像素传感器(aps)、雪崩光电二极管、图像传感器、
电荷耦合器件(ccd)、增强电荷耦合器件(iccd)、发光二极管、光子计数器、辐射热计、热释电检测器、光敏电阻、光伏电池、光电二极管、光电倍增管、光电晶体管、量子点光电导体或光电二极管及它们的组合、以及其他光电检测器。在某些实施方案中，利用电荷耦合器件(ccd)、半导体电荷耦合器件(ccd)、有源像素传感器(aps)、互补金属氧化物半导体(cmos)图像传感器或n型金属氧化物半导体(nmos)图像传感器来测量来自样本的光。在某些实施方案中，明场光电检测器包括雪崩光电二极管(apd)。在某些情况下，一个或多于一个荧光检测器是雪崩光电二极管。
[0098]
在一些实施方案中，感兴趣的光检测系统包括多个荧光检测器。在一些情况下，光检测系统包括多个固态检测器，例如光电二极管。在某些情况下，光检测系统包括荧光光电检测器阵列，例如光电二极管阵列。在这些实施方案中，光电检测器阵列可以包括4个或多于4个光电检测器，例如10个或多于10个光电检测器，例如25个或多于25个光电检测器，例如50个或多于50个光电检测器，例如100个或多于100个光电检测器，例如250个或多于250个光电检测器，例如500个或多于500个光电检测器，例如750个或多于750个光电检测器并且包括1000个或多于1000个光电检测器。例如，检测器可以是具有4个或多于4个光电二极管的光电二极管阵列，例如10个或多于10个光电二极管，例如25个或多于25个光电二极管，例如50个或多于50个光电二极管，例如100个或多于100个光电二极管，例如250个或多于250个光电二极管，例如500个或多于500个光电二极管，例如750个或多于750个光电二极管并且包括1000个或多于1000个光电二极管。
[0099]
可以根据需要以任何几何配置布置光电检测器，其中感兴趣的布置包括但不限于正方形配置、矩形配置、梯形配置、三角形配置、六边形配置、七边形配置、八边形配置、九边形配置、十边形配置、十二边形配置、圆形配置、椭圆形配置以及不规则图案配置。光电检测器阵列中的光电检测器可以相对于另一个(如在xz平面中所指)以10
°
至180
°
例如15
°
至170
°
、例如20
°
至160
°
、例如25
°
至150
°
、例如30
°
至120
°
并且包括45
°
至90
°
的角度定向。光电检测器阵列可以是任何合适的形状并且可以是直线形状(例如正方形、矩形、梯形、三角形、六边形等)、曲线形状(例如圆形、椭圆形)、以及不规则形状(例如耦合至平面顶部的抛物线底部)。在某些实施方案中，光电检测器阵列具有矩形有源表面。
[0100]
阵列中的每一个光电检测器(例如，光电二极管)可以具有宽度为5μm至250μm例如10μm至225μm、例如15μm至200μm、例如20μm至175μm、例如25μm至150μm、例如30μm至125μm并且包括50μm至100μm和长度为5μm至250μm例如10μm至225μm、例如15μm到200μm、例如20μm到175μm、例如25μm到150μm、例如30μm到125μm并且包括50μm到100μm的有源表面，其中阵列中每个光电检测器(例如光电二极管)的表面积为25μm2至10000μm2，例如50μm2至9000μm2、例如75μm2至8000μm2、例如100μm2至7000μm2、例如150μm2至6000μm2并且包括200μm2至5000μm2。
[0101]
光电检测器阵列的尺寸可以根据光的数量和强度、光电检测器的数量和所需的灵敏度而变化，并且可以具有0.01mm至100mm例如0.05mm至90mm、例如0.1mm至80mm、例如0.5mm至70mm、例如1mm至60mm、例如2mm至50mm、例如3mm至40mm、例如4mm至30mm并且包括5mm至25mm的长度。光电检测器阵列的宽度也可以是0.01mm至100mm，例如0.05mm至90mm、例如0.1mm至80mm、例如0.5mm至70mm、例如1mm至60mm、例如2mm至50mm、例如3mm至40mm、例如4mm至30mm并且包括5mm至25mm。因此，光电检测器阵列的有源表面的面积可以是0.1mm2至10000mm2，例如0.5mm2至5000mm2，例如1mm2至1000mm2，例如5mm2至500mm2并且包括10mm2至
100mm2。
[0102]
感兴趣的光电检测器被配置成在一个或多于一个波长处测量收集到的光，例如在2个或多于2个波长处、例如在5个或多于5个不同波长处、例如在10个或多于10个不同波长处、例如在25个或多于25个不同波长处、例如在50个或多于50个不同波长处、例如在100个或多于100个不同波长处、例如在200个或多于200个不同波长处、例如在300个或多于300个不同波长处测量收集到的光，并且包括在400或多于400个不同波长处测量由流动流中的样本发射的光。
[0103]
在实施方案中，光检测系统包括被配置为产生明场数据信号的明场光电检测器。明场光电检测器可以配置为在一个或多于一个波长处检测来自样品的光，例如在5个或多于5个不同波长、例如在10个或多于10个不同波长、例如在25个或多于25个不同波长、例如在50个或多于50个不同波长、例如在100个或多于100个不同波长、例如在200个或多于200个不同波长、例如在300个或多于300个并且包括在400个或多于400个不同波长处检测来自样品的光。明场光电检测器可以被配置为在200nm至1200nm的波长范围中的一个或多于一个波长范围上检测光。在某些情况下，方法包括用明场光电检测器在波长范围上检测来自样本的光，该波长范围例如200nm至1200nm、例如300nm至1100nm、例如400nm至1000nm、例如500nm至900nm并且包括600nm至800nm。
[0104]
在某些实施方案中，感兴趣的光检测系统中的明场光电检测器被配置为响应于检测到的光产生一个或多于一个明场数据信号，例如2个或多于2个、例如3个或多于3个、例如4个或多于4个、例如5个或多于5个明场数据信号并且包括10个或多于10个明场数据信号。当明场光电检测器被配置为在多个光波长(例如，400nm至800nm)处检测光时，在一些情况下，方法可以包括响应于检测到的每个光波长产生一个或多于一个明场数据信号。在其他情况下，响应于由明场光电检测器在整个波长范围上检测到的光，生成单个明场数据信号。
[0105]
光检测系统包括一个或多于一个荧光检测器，例如2个或多于2个、例如3个或多于3个、例如4个或多于4个、例如5个或多于5个、例如6个或多于6个、例如7个或多于7个、例如8个或多于8个、例如9个或多于9个、例如10个或多于10个、例如15个或多于15个并且包括25个或多于25个荧光检测器。在实施方案中，荧光检测器中的每一个被配置为产生荧光数据信号。每个荧光检测器可以独立地在200nm至1200nm的波长范围中的一个或多于一个波长范围上检测来自样本的荧光。在一些情况下，一个或多于一个荧光检测器被配置为在一个波长范围上检测来自样本的光，该波长范围例如200nm至1200nm、例如300nm至1100nm、例如400nm至1000nm、例如500nm至900nm并且包括600nm至800nm。在其他情况下，一个或多于一个荧光检测器被配置为在一个或多于一个特定波长处检测光。例如，可以在450nm、518nm、519nm、561nm、578nm、605nm、607nm、625nm、650nm、660nm、667nm、670nm、668nm、695nm、710nm、723nm、780nm、785nm、647nm、617nm及其任何组合中的一个或多于一个波长处检测荧光，这取决于主题光检测系统中不同荧光检测器的数量。在某些实施方案中，一个或多于一个荧光检测器被配置为检测与样本中某些荧光团的荧光峰波长相对应的光的波长。
[0106]
光检测系统被配置为连续或以离散间隔测量光。在一些情况下，光检测系统的检测器被配置为连续测量收集的光。在其他情况下，光检测系统被配置为以离散间隔进行测量，例如每0.001毫秒、每0.01毫秒、每0.1毫秒、每1毫秒、每10毫秒、每100毫秒并且包括每1000毫秒、或其他一些间隔测量光。
[0107]
在一些实施方案中，系统被配置为通过照射流动流中具有颗粒的样本来生成频率编码的荧光数据。在一些实施方案中，光源包括产生多个角度偏转的激光束的光发生器组件，每个激光束的强度基于所施加的(例如来自耦合到声光器件的直接数字合成器的)射频驱动信号的幅度。例如，主题系统可以包括产生2个或多于2个，例如3个或多于3个，例如4个或多于4个，例如5个或多于5个，例如6个或多于6个，例如7个或多于7个，例如8个或多于8个，例如9个或多于9个，例如10个或多于10个角度偏转的激光束并且包括25个或多于25个角度偏转的激光束的光发生器组件。在实施方案中，角度偏转的激光束中的每一个具有不同的频率，这些频率从输入激光束的频率偏移预定射频。
[0108]
根据某些实施方案，主题系统被配置为产生角度偏转的激光束，这些激光束也在空间上彼此偏移。取决于所施加的射频驱动信号和输出激光束所需的照射分布，主题系统可以被配置为产生被分隔0.001μm或大于0.001μm，例如0.005μm或大于0.005μm、例如0.01μm或大于0.01μm、例如0.05m或大于0.05μm、例如0.1μm或大于0.1μm、例如0.5μm或大于0.5μm、例如1μm或大于1μm、例如5μm或大于5μm、例如10μm或大于10μm、例如100μm或大于100μm、例如500μm或大于500μm、例如1000μm或大于1000μm并且包括5000μm或大于5000μm的角度偏转的激光束。在一些实施方案中，角度偏转的激光束例如与沿输出激光束的水平轴的相邻角度偏转的激光束重叠。相邻的角度偏转的激光束之间的重叠(例如光束点的重叠)可以是0.001μm或大于0.001μm的重叠、例如0.005μm或大于0.005μm的重叠、例如0.01μm或大于0.01μm的重叠、例如0.05μm或大于0.05μm的重叠、例如0.1μm或大于0.1μm的重叠、例如0.5μm或大于0.5μm的重叠、例如1μm或大于1μm的重叠、例如5μm或大于5μm的重叠、例如10μm或大于10μm的重叠并且包括100μm或大于100μm的重叠。
[0109]
在一些实施方案中，系统包括具有处理器，该处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，其中存储器包括存储在其上的指令，当由处理器执行时，该指令使处理器通过计算流动流上的入射重叠光束的光学频率之间的差异来生成频率编码的荧光数据。在一个实例中，系统包括处理器，该处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，其中存储器包括存储在其上的指令，当由处理器执行时，该指令使处理器计算跨过流动流的水平轴的每个位置的拍频。在这些实施方案中，颗粒发射的频率编码的荧光是与本振光束(f
lo
)的频率和射频偏移光束的频率之间的差异相对应的拍频。例如，频率编码的荧光数据包括f
lo-f
rf偏移光束
的拍频。在流动流的照射包括跨越流动流的宽度(例如，整个水平轴)的本振光的情况下，频率编码的荧光数据包括对应于本振光束(f
lo
)的频率和每个射频偏移光束(f1、f2、f3、f4、f5、f6等)的频率之差的拍频。在这些实施方案中，频率编码的荧光数据可以包括多个拍频，每个拍频对应于横跨流动流的水平轴的位置。
[0110]
在实施方案中，系统包括处理器，该处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，其中存储器包括存储在其上的指令，当由处理器执行时，该指令使处理器基于明场数据信号和来自每个荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位计算每个荧光检测器的相位校正。在一个实例中，系统配置为使用明场光电检测器检测光以生成明场数据信号，使用被配置为产生第一荧光数据信号的第一荧光检测器的检测光来检测光，用被配置为产生第二荧光数据信号的第二荧光检测器来检测光；基于明场数据信号和第一荧光数据信号之间的相对相位计算第一荧光检测器的相位校正；基于明场数据信号和第二荧光数据信号之间的相对相位计算第二荧光检测器的相位校正。在另一个实例中，系统被配置为使用被配置为产
生明场数据信号的明场光电检测器来检测光；使用多个荧光检测器来检测光，并基于明场数据信号和来自多个荧光检测器的荧光数据信号中的每一个之间的相对相位来计算每个荧光检测器的相位校正。
[0111]
在某些实施方案中，系统包括处理器，该处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，其中存储器包括存储在其上的指令，当由处理器执行时，该指令使处理器根据明场数据信号和荧光数据信号之间的相对相位、根据以下公式来计算荧光检测器中的每一个的相位校正：
[0112][0113]
其中％表示模函数，所有相位均以弧度表示。
[0114]
在其他实施方案中，系统被配置为基于明场数据信号和荧光数据信号之间的相对相位、根据以下公式来计算每个荧光检测器的相位校正：
[0115][0116]
其中所有相位都表示为复相位单位向量。
[0117]
光检测系统被配置为在预定电压下操作检测器中的每一个。在一些实施方案中，主题系统被配置为在多个不同的工作电压下计算每个荧光检测器的相位校正。主题系统被配置为通过在第一组工作电压下用每个荧光检测器来检测光来对光检测系统进行相位校正，以产生第一组荧光数据信号；基于明场数据信号和来自每个荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位，计算在第一组工作电压下每个荧光检测器的相位校正；将一个或多于一个荧光检测器的工作电压改变为第二组工作电压；在第二组工作电压下用每个荧光检测器检测光以产生第二组荧光数据信号；基于明场数据信号和来自每个荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位，计算在第二组工作电压下每个荧光检测器的相位校正。
[0118]
根据某些实施方案，主题系统包括处理器，该处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，其中存储器包括存储在其上的指令，当由处理器执行时，该指令使处理器改变每个荧光检测器的工作电压并计算每个荧光检测器在每个工作电压下的相位校正。在这些实施方案中，系统可以被配置为改变每个荧光检测器的工作电压，例如0.01v或高于0.01v、例如0.05v或高于0.05v、例如0.1v或高于0.1v、例如0.5v或高于0.5v、例如1v或高于1v、例如2v或高于2v、例如3v或高于3v、例如5v或高于5v、例如10v或高于10v、例如25v或高于25v、例如50v或高于50v、例如100v或高于100v、例如250v或高于250v、例如500v或高于500v并且包括1000v或高于1000v。在一个实例中，系统被配置为逐渐增加每个荧光检测器的工作电压并计算每个工作电压下的相位校正，例如将工作电压逐渐增加0.01v或多于0.01v、例如0.05v或多于0.05v、例如0.1v或多于0.1v、例如0.5v或多于0.5v、例如1v或多于1v、例如2v或多于2v、例如3v或多于3v、例如5v或多于5v、例如10v或多于10v、例如25v或多于25v、例如50v或多于50v、例如100v或多于100v、例如250v或多于250v、例如500v或多于500v并且包括1000v或多于1000v。在另一个实例中，系统被配置为逐渐降低每个荧光检测器的工作电压并计算每个工作电压下的相位校正，例如将工作电压逐渐降低0.01v或多于0.01v、例如0.05v或多于0.05v、例如0.1v或多于0.1v、例如0.5v或多于0.5v、例如1v或多于1v、例如2v
或多于2v、例如3v或多于3v、例如5v或多于5v、例如10v或多于10v、例如25v或多于25v、例如50v或多于50v、例如100v或多于100v、例如250v或多于250v、例如500v或多于500v并且包括1000v或多于1000v。
[0119]
感兴趣的系统可以被配置为在任意数量的工作电压下从每个荧光检测器收集荧光数据信号以对光检测系统进行相位校正，例如在2个或多于2个不同的工作电压下、例如3个或多于3个不同的工作电压、例如5个或多于5个不同的工作电压、例如10个或多于10个不同的工作电压、例如25个或多于25个不同的工作电压从每个荧光检测器收集荧光数据信号并且包括在50个或多于50个不同的工作电压下从每个荧光检测器收集荧光数据信号。在某些实施方案中，系统被配置为在用于从样本(例如，生物样本)收集光信号的每个工作电压下计算每个荧光检测器的相位校正。
[0120]
在实施方案中，主题系统可以被配置为将每个荧光检测器的工作电压改变相同或不同的量。在一些情况下，系统被配置为将光检测系统中的每一个荧光检测器的工作电压改变相同的量。在其他情况下，系统被配置为将光检测系统中的每一个荧光检测器的工作电压改变不同的量。在又一些其他情况下，系统被配置成将光检测系统中的2个或多于2个荧光检测器的工作电压改变相同的量并且将光检测系统中的2个或多于2个荧光检测器的工作电压改变不同的量。在每个工作电压下，系统被配置为基于明场数据信号和荧光数据信号之间的相对相位来计算每个荧光检测器的相位校正。
[0121]
在一些实施方案中，感兴趣的系统包括可变增益放大器。在一些情况下，可变增益放大器可以被配置为在-100db至100db下工作，例如-75db至75db，例如-50db至50db，例如-25db至25db，并且包括0db至50db。在一些实施方案中，系统包括处理器，该处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，其中存储器包括存储在其上的指令，当由处理器执行时，该指令使处理器改变电子增益设置(例如，放大器的增益)并计算每个荧光检测器的相位校正。在一些实施方案中，系统可以被配置为改变放大器的增益，例如改变0.01db或多于0.01db、例如改变0.05db或多于0.05db、例如改变0.1db或多于0.1db、例如改变0.5db或多于0.5db、例如改变1db或多于1db、例如改变2db或多于2db、例如改变3db或多于3db、例如改变5db或多于5db、例如改变10db或多于10db并且包括改变25db或多于25db。在一个实例中，系统被配置为逐渐增加放大器的增益并计算相位校正，例如将放大器的增益逐渐增加0.01db或多于0.01db、例如0.05db或多于0.05db、例如0.1db或多于0.1db、例如0.5db或多于0.5db、例如1db或多于1db、例如2db或多于2db、例如3db或多于3db、例如5db或多于5db、例如10db或多于10db并且包括25db或多于25db。在另一个实例中，系统被配置为逐渐减小放大器的增益并计算相位校正，例如将放大器的增益逐渐减小0.01db或多于0.01db、例如0.05db或多于0.05db、例如0.1db或多于0.1db、例如0.5db或多于0.5db、例如1db或多于1db、例如2db或多于2db、例如3db或多于3db、例如5db或多于5db、例如10db或多于10db并且包括25db或多于25db。
[0122]
在一些实施方案中，系统包括处理器，该处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，其中存储器包括存储在其上的指令，当由处理器执行时，该指令使处理器计算寿命相位校正分量。寿命相位校正是基于如上所述的在荧光检测器的每个工作电压下计算的相位校正和样本中荧光团的荧光寿命来计算的。取决于荧光团的具体类型和存在的荧光团的数量，一个或多于一个例如2个或多于2个、例如3个或多于3个、例如4个或多于4个的荧光寿命
可用于计算寿命相位校正分量，并且包括5个或多于5个不同的荧光寿命可用于计算寿命相位校正分量。在一些实施方案中，系统被配置为计算荧光团峰值发射波长处的每个荧光寿命。在这些实施方案中，每个荧光团的寿命可以用光检测系统来检测并使用来自不同检测器通道的信号来计算。
[0123]
在某些实施方案中，系统包括处理器，该处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，其中存储器包括存储在其上的指令，当由处理器执行时，该指令使处理器基于样本中的荧光团的荧光寿命根据以下公式计算每个荧光检测器的寿命相位校正：
[0124][0125]
τ＝荧光寿命
[0126]
f＝频率
[0127]
在一些实施方案中，系统还被配置为使用本文描述的针对每个荧光检测器计算的相位校正由频率编码的荧光数据计算颗粒的相位校正空间数据。在一些情况下，系统包括处理器，该处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，其中存储器包括存储在其上的指令，当由处理器执行时，该指令使处理器通过利用计算的相位校正对频率编码的荧光数据执行傅里叶变换(ft)来计算相位校正的空间数据。由系统通过利用本文描述的计算的相位校正对频率编码的荧光数据执行变换来对根据本公开的实施方案的空间数据进行相位校正。在一些实施方案中，空间数据包括颗粒的水平维度尺寸、颗粒的垂直维度尺寸、沿两个不同维度的颗粒尺寸比、颗粒成分的尺寸比(例如，细胞核的水平维度与细胞质的水平维度之比)。
[0128]
在一些实施方案中，主题系统包括处理器，该处理器具有可操作地耦合到处理器的存储器，使得存储器包括存储在其上的指令，当由处理器执行时，该指令使处理器通过利用针对光检测系统中的每一个荧光检测器计算的相位校正对频率编码的荧光数据执行傅里叶变换来计算颗粒的相位校正的空间数据。在其他实施方案中，系统被配置为使用计算的相位校正对频率编码的荧光数据执行离散傅里叶变换(dft)以生成颗粒的相位校正的空间数据。在又一些其他实施方案中，系统被配置为使用计算的相位校正对频率编码的荧光数据执行短时傅里叶变换(stft)。在又一些其他实施方案中，系统被配置为利用数字锁定放大器计算相位校正的空间数据，以使频率编码的荧光数据产生外差和解复用频率编码的荧光数据。
[0129]
在一些实施方案中，系统被配置为在执行频率编码数据到相位校正的空间数据的变换之前考虑计算的相位校正，使得与执行原始频率数据到空间数据的变换(即，无需首先考虑计算的相位)相比，变换的输出在计算上不太复杂。在一些实施方案中，系统被配置为在不执行任何数学虚数计算(即，仅执行变换的数学实数计算的计算)的情况下执行频率编码的荧光数据的变换以由频率编码的荧光数据生成空间数据。
[0130]
主题系统可以被配置为由频率编码的荧光生成流动流中的颗粒的一个或多于一个图像。在一些实施方案中，颗粒的图像可以由频率编码的荧光结合检测到的光吸收、检测到的光散射或其组合产生。在某些情况下，颗粒的图像仅由相位校正的频率编码荧光产生。在其他情况下，物体的图像是由相位校正的频率编码荧光和从样本中检测到的光吸收产生的，该光吸收例如从明场光电检测器中检测到的光吸收。在又一些其他情况下，颗粒的图像由相位校正的频率编码荧光和从样本检测到的光散射产生，该光散射例如来自侧向散射检
测器、前向散射检测器或侧向散射检测器和前向散射检测器的组合。在又一些其他情况下，颗粒的图像由相位校正的频率编码荧光以及检测到的光吸收、检测到的光散射和检测到的光发射的组合产生。
[0131]
根据一些实施方案的系统可以包括显示器和操作员输入设备。操作员输入设备例如可以是键盘、鼠标等。处理模块包括处理器，该处理器可以访问存储器，该存储器上存储有用于执行主题方法的步骤的指令。处理模块可以包括操作系统、图形用户界面(gui)控制器、系统存储器、存储器存储设备和输入输出控制器、高速缓冲存储器、数据备份单元和许多其他设备。处理器可以是商业上可用的处理器，或者它可以是现有或将变得可用的其他处理器之一。处理器以众所周知的方式执行操作系统和操作系统与固件和硬件的接口，并促进处理器协调和执行可以用如本领域已知的的各种编程语言(例如java、perl、c 、其他高级或低级语言、以及它们的组合)编写的各种计算机程序的功能。操作系统通常与处理器协作、协调和执行计算机的其他组件的功能。该操作系统还提供根据已知技术的调度、输入输出控制、文件和数据管理、存储器管理以及通信控制和相关服务。处理器可以是任何合适的模拟或数字系统。在一些实施方案中，处理器包括提供反馈控制的模拟电子设备，例如负反馈控制。
[0132]
系统存储器可以是多种已知的或未来的存储器存储设备中的任何一种。实例包括任何常用的随机存取存储器(ram)、磁介质(例如常驻硬盘或磁带)、光学介质(例如读写光盘)、闪存设备或其他存储器存储设备。存储器存储设备可以是多种已知或未来设备中的任何一种，包括光盘驱动器、磁带驱动器、可移动硬盘驱动器或软盘驱动器。这种类型的存储器存储设备通常从程序存储介质(未示出)读取和/或写入程序存储介质，程序存储介质例如分别为压缩盘、磁带、可移动硬盘或软盘。这些程序存储介质中的任何一个，或其他现在使用的或以后可能开发的，都可以被认为是计算机程序产品。如将理解的，这些程序存储介质通常存储计算机软件程序和/或数据。计算机软件程序，也称为计算机控制逻辑，通常存储在系统存储器和/或与存储器存储设备结合使用的程序存储设备中。
[0133]
在一些实施方案中，描述了一种计算机程序产品，该计算机程序产品包括其中存储有控制逻辑(计算机软件程序，包括程序代码)的计算机可用介质。控制逻辑在由计算机的处理器执行时使处理器执行本文所述的功能。在其他实施方案中，一些功能主要在使用例如硬件状态机的硬件中实现。实现硬件状态机以执行本文描述的功能对于相关领域的技术人员来说将是明显的。
[0134]
存储器可以是处理器可以在其中存储和检索数据的任何合适的设备，例如磁性、光学或固态存储设备(包括磁盘或光盘或磁带或ram，或任何其他合适的固定或便携式设备)。处理器可以包括由携带必要程序代码的计算机可读介质适当地编程的通用数字微处理器。编程可以通过通信信道远程提供给处理器，或者可以使用与存储器相关的那些设备中的任何一个预先保存在诸如存储器或一些其它便携式或固定计算机可读存储介质的计算机程序产品中。例如，磁盘或光盘可以承载编程，并且可以被磁盘写入器/读取器读取。本发明的系统还包括编程，例如，以计算机程序产品的形式，用于实践上述方法的算法。根据本发明的编程可以记录在计算机可读介质上，例如计算机可以直接读取和访问的任何介质。此类介质包括但不限于：磁存储介质，例如软盘、硬盘存储介质和磁带；光存储介质，例如cd-rom；电子存储介质，例如ram和rom；便携式闪存驱动器；以及这些类别的混合体，例如
磁/光存储介质。
[0135]
处理器还可以访问通信信道以与远程位置的用户通信。远程位置是指用户不直接与系统接触，并将输入信息从外部设备中继到输入管理器，外部设备例如是连接到广域网(“wan”)、电话网络、卫星网络、或包括移动电话(即智能电话))的任何其他合适的通信信道的计算机。
[0136]
在一些实施方案中，根据本公开的系统可以被配置为包括通信接口。在一些实施方案中，通信接口包括用于与网络和/或另一设备通信的接收器和/或发射器。通信接口可以被配置用于有线或无线通信，包括但不限于射频(rf)通信(如射频识别(rfid))、zigbee通信协议、wifi、红外、无线通用串行总线(usb)、超宽带(uwb)、蓝牙通信协议和蜂窝通信(例如码分多址(cdma)或全球移动通信系统(gsm))。
[0137]
在一个实施方案中，通信接口被配置为包括一个或多于一个通信端口，例如物理端口或接口(例如usb端口、rs-232端口、或任何其他合适的电连接端口)，以允许在主题系统和其他外部设备之间进行数据通信，该外部设备例如是配置用于类似补充数据通信的(例如，在医生办公室或医院环境中的)计算机终端。
[0138]
在一个实施方案中，通信接口被配置用于红外通信、蓝牙通信或任何其他合适的无线通信协议，以使主题系统能够与其他设备进行通信，该其他设备例如是计算机终端和/或网络、支持通信的移动电话、个人数字助手或用户可以结合使用的任何其他通信设备。
[0139]
在一个实施方案中，通信接口被配置为使用互联网协议(ip)通过蜂窝电话网络、短消息服务(sms)、到连接到因特网的局域网(lan)上的个人计算机(pc)的无线连接、或在wifi热点处到因特网的wifi连接来提供用于数据传输的连接。
[0140]
在一个实施方案中，主题系统被配置为通过通信接口(例如使用例如802.11或rf协议或irda红外协议的通用标准)与服务器设备进行无线通信服务器设备可以是另一便携式设备，例如智能电话、个人数字助理(pda)或笔记本计算机；或更大的设备，如台式计算机、装备等。在一些实施方案中，服务器设备具有显示器例如液晶显示器(lcd)，以及输入设备例如按钮、键盘、鼠标或触摸屏。
[0141]
在一些实施方案中，通信接口被配置为使用上述通信协议和/或机制中的一种或多于一种来与网络或服务器设备自动或半自动地传送存储在主题系统的(例如在可选的数据存储单元)中的数据。
[0142]
输出控制器可以包括用于向用户呈现信息的各种已知显示设备中的任何一个的控制器，该用户无论是人还是机器、无论是本地的还是远程的都可以。如果显示设备中的一个提供视觉信息，则通常可以将该信息在逻辑上和/或物理上组织为图片元素的阵列。图形用户界面(gui)控制器可以包括用于在系统和用户之间提供图形输入和输出接口以及用于处理用户输入的多种已知或未来软件程序中的任一种。计算机的功能元件可以通过系统总线相互通信。这些通信中的一些可以在替代实施方案中使用网络或其他类型的远程通信来完成。输出管理器还可以根据已知技术，例如通过因特网、电话或卫星网络，将由处理模块生成的信息提供给位于远程位置的用户。可以根据多种已知技术来实现输出管理器对数据的呈现。例如，数据可能包括sql、html或xml文档、电子邮件或其他文件、或其他形式的数据。数据可能包括因特网url地址，以便用户可以从远程源检索其他的sql、html、xml或其他文档或数据。主题系统中存在的一个或多于一个平台可以是任何类型的已知计算机平台或
将在未来开发的类型，尽管它们通常是被称为服务器的一类计算机。但是，它们也可以是大型计算机、工作站或其他计算机类型。它们可以通过任何已知或未来类型的电缆或其他通信系统(包括无线系统)连接，无论是联网的还是其他方式。它们可以在同一地点，也可以是物理上分开的。可以在任何计算机平台上采用各种操作系统，这取决于所选择的计算机平台的类型和/或品牌。合适的操作系统包括windows 10、windowswindows xp、windows 7、windows 8、ios、sun solaris、linux、os/400、compaq tru64 unix、sgi irix、siemens reliant unix、ubuntu、zorin os等。
[0143]
在某些实施方案中，主题系统包括一个或多于一个光学调整组件，该组件用于调节光，例如照射到样本上的光(例如，来自激光)或从样本收集的光(例如，荧光)。例如，光学调整可以是增加光的尺寸、光的焦点或准直光。在一些情况下，光学调整是放大协议，以便增加光(例如，光斑)的尺寸，例如将尺寸增加5％或多于5％、例如增加10％或多于10％、例如增加25％或多于25％、例如增加50％或多于50％并且包括将尺寸增加75％或多于75％。在其他实施方案中，光学调整包括聚焦光以减小光尺寸，例如减小5％或多于5％、例如减小10％或多于10％、例如减小25％或多于25％、例如减小50％或多于50％并且包括将光斑的尺寸减小75％或多于75％。在某些实施方案中，光学调整包括准直光。术语“准直”在其传统意义上是指通过光学方式调整光传播的共线性或减少来自共同传播轴的光的发散。在某些情况下，准直包括使光束的空间横截面变窄(例如，减小激光器的光束轮廓)
[0144]
在一些实施方案中，光学调整组件是聚焦透镜，该聚焦透镜具有0.1至0.95的放大率，例如0.2至0.9的放大率、例如0.3至0.85的放大率、例如0.35至0.8的放大率、例如0.5至0.75的放大率，并且包括0.55至0.7的放大率(例如0.6的放大率)。例如，在某些情况下，聚焦透镜是放大率约为0.6的双消色差的缩小透镜。聚焦透镜的焦距可以是5mm至20mm，例如6mm至19mm、例如7mm至18mm、例如8mm至17mm、例如9mm至16mm，并且包括10mm至15mm的焦距。在某些实施方案中，聚焦透镜具有约13mm的焦距。
[0145]
在其他实施方案中，光学调整组件是准直器。准直器可以是任何方便的准直协议，例如一个或多于一个反射镜或曲面透镜或其组合。例如，准直器在某些情况下是单个准直透镜。在其他情况下，准直器是准直镜。在又一些其他情况下，准直器包括两个透镜。在又一些其他情况下，准直器包括反射镜和透镜。在准直器包括一个或多于一个透镜的情况下，准直透镜的焦距可以是5mm至40mm，例如6mm至37.5mm、例如7mm至35mm、例如8mm至32.5mm、例如9mm至30mm、例如10mm至27.5mm、例如12.5mm至25mm并且包括15mm至20mm的焦距。
[0146]
在一些实施方案中，主题系统包括具有喷嘴孔的流动池喷嘴，该喷嘴孔被配置为使流动流流过流动池喷嘴。主题流动池喷嘴具有将流体样本传播到样本询问区域的孔口，其中在一些实施方案中，流动池喷嘴包括限定纵向轴线的近端圆柱形部分和终止于具有平坦表面的远截头圆锥部分的横向于纵轴的喷嘴孔。近端圆柱形部分的(例如沿纵向轴线测量的)长度可以是1mm至15mm，例如1.5mm至12.5mm、例如2mm至10mm、例如3mm至9mm并且包括4mm至8mm。远端截头圆锥部分的(如沿纵向轴线测量的)长度也可以是1mm至10mm，例如2mm至9mm、例如3mm至8mm并且包括4mm至7mm。在一些实施方案中，流动池喷嘴室的直径可以是1mm至10mm，例如2mm至9mm、例如3mm至8mm并且包括4mm至7mm。
[0147]
在某些情况下，喷嘴室不包括圆柱形部分并且整个流动池喷嘴室是截头圆锥形的。在这些实施方案中，截头圆锥形喷嘴室的(例如沿横向于喷嘴孔的纵轴测量)的长度可
以是1mm至15mm，例如1.5mm至12.5mm、例如2mm至10mm、例如3mm到9mm并且包括4mm至8mm。截头圆锥形喷嘴室的近端部分的直径可以是1mm到10mm，例如2mm至9mm、例如3mm至8mm并且包括4mm至7mm。
[0148]
在实施方案中，样本流动流从流动池喷嘴的远端处的孔口发出。取决于流动流的期望特性，流动池喷嘴孔可以是任何合适的形状，其中感兴趣的横截面形状包括但不限于：直线横截面形状，例如正方形、矩形、梯形、三角形、六边形等；曲线横截面形状，例如圆形、椭圆形；以及不规则形状，例如耦合至平面顶部的抛物线底部。在某些实施方案中，感兴趣的流动池喷嘴具有圆形孔口。在一些实施方案中，喷嘴孔的尺寸可以是1μm至20000μm，例如2μm至17500μm、例如5μm至15000μm、例如10μm至12500μm、例如15μm至10000μm、例如25μm至7500μm、例如50μm至5000μm、例如75μm至1000μm、例如100μm至750μm并且包括150μm至500μm。在某些实施方案中，喷嘴孔为100μm。
[0149]
在一些实施方案中，流动池喷嘴包括样本注入口，其被配置为向流动池喷嘴提供样本。在实施方案中，样本注射系统被配置为向流动池喷嘴室提供合适的样本流。取决于流动流的期望特性，通过样本注入口传送到流动池喷嘴室的样本的速率可以是1μl/sec或高于1μl/sec，例如2μl/sec或高于2μl/sec、例如3μl/sec或高于3μl/sec、例如5μl/sec或高于5μl/sec、例如10μl/sec或高于10μl/sec、例如15μl/sec或高于15μl/sec、例如25μl/sec或高于25μl/sec、例如50μl/sec或高于50μl/sec或、例如100μl/sec或高于100μl/sec、例如150μl/sec或高于150μl/sec、例如200μl/sec或高于200μl/sec、例如250μl/sec或高于250μl/sec、例如300μl/sec或高于300μl/sec、例如350μl/sec或高于350μl/sec、例如400μl/sec或高于400μl/sec、例如450μl/sec或高于450μl/sec并且包括500μl/sec或高于500μl/sec。例如，样本流速可以是1μl/sec至约500μl/sec，例如2μl/sec至约450μl/sec，例如3μl/sec至约400μl/sec，例如4μl/sec至约350μl/sec，例如5μl/sec至约300μl/sec，例如6μl/sec至约250μl/sec，例如7μl/sec至约200μl/sec，例如8μl/sec至约150μl/sec，例如9μl/sec至约125μl/sec并且包括10μl/sec至约100μl/sec。
[0150]
样本注入口可以是位于喷嘴室壁中的孔口，或者可以是位于喷嘴室近端的导管。在样本注入口是位于喷嘴室壁中的孔口的情况下，样本注入口孔口可以是任何合适的形状，其中感兴趣的横截面形状包括但不限于：直线横截面形状，例如正方形、矩形、梯形、三角形、六边形等；曲线横截面形状，例如圆形、椭圆形等；以及不规则形状，例如耦合至平面顶部的抛物线底部。在某些实施方案中，样本注入口具有圆形孔口。样本注入口孔口的尺寸可以根据形状而变化，在某些情况下，其开口范围为0.1mm至5.0mm，例如0.2mm至3.0mm、例如0.5mm至2.5mm、例如0.75mm至2.25mm、例如1mm至2mm并且包括1.25mm至1.75mm(例如1.5mm)。
[0151]
在某些情况下，样本注入口是位于流动池喷嘴室近端的导管。例如，样本注入口可以是导管，该导管定位成使样本注入口的孔口与流动池喷嘴孔口对齐。在样本注入口是与流动池喷嘴孔对齐的导管的情况下，样本注入管的横截面形状可以是任何合适的形状，其中感兴趣的横截面形状包括但不限于：直线交叉截面形状，例如正方形、矩形、梯形、三角形、六边形等；曲线截面形状，例如圆形、椭圆形；以及不规则形状，例如耦合至平面顶部的抛物线底部。导管的孔口可以根据形状而变化，在某些情况下，其开口范围为0.1mm至5.0mm，例如0.2至3.0mm、例如0.5mm至2.5mm、例如0.75mm至2.25mm、例如1mm至2mm并且包括
1.25mm至1.75mm(例如1.5mm)。样本注入口的尖端的形状与样本注入管的截面形状可以相同也可以不同。例如，样本注入口的孔口可以包括具有1
°
至10
°
，例如2
°
至9
°
、例如3
°
至8
°
、例如4
°
至7
°
并且包括5
°
的斜角的斜面尖端。
[0152]
在一些实施方案中，流动池喷嘴还包括鞘液注入口，该鞘液注入口被配置为向流动池喷嘴提供鞘液。在实施方案中，鞘液注射系统被配置为向流动池喷嘴室提供鞘液流，例如与样本结合以产生包围样本流的层状鞘液流。取决于流动流的期望特性，输送到流动池喷嘴室的鞘液的速率可以是25μl/sec或高于25μl/sec，例如50μl/sec或高于50μl/sec、例如75μl/sec或高于75μl/sec、例如100μl/sec或高于100μl/sec、例如250μl/sec或高于250μl/sec、例如500μl/sec或高于500μl/sec、例如750μl/sec或高于750μl/sec、例如1000μl/sec或高于1000μl/sec并且包括2500μl/sec或者高于2500μl/sec。例如，鞘液流速可以是1μl/sec至约500μl/sec，例如2μl/sec到约450μl/sec，例如3μl/sec到约400μl/sec，例如4μl/sec至约350μl/sec，例如5μl/sec至约300μl/sec，例如6μl/sec至约250μl/sec，例如7μl/sec至约200μl/sec，例如8μl/sec到约150μl/sec，例如9μl/sec到约125μl/sec并且包括10μl/sec至约100μl/sec。
[0153]
在一些实施方案中，鞘液注入口是定位在喷嘴室的壁中的孔口。鞘液注入口孔口可以是任何合适的形状，其中感兴趣的横截面形状包括但不限于：直线横截面形状，例如正方形、矩形、梯形、三角形、六边形等；曲线横截面形状，例如圆形、椭圆形；以及不规则形状，例如耦合至平面顶部的抛物线底部。样本注入口孔口的尺寸可以根据形状而变化，在某些情况下，其开口范围为0.1mm至5.0mm，例如0.2mm至3.0mm、例如0.5mm至2.5mm、例如0.75mm至2.25mm、例如1mm至2mm并且包括1.25mm至1.75mm(例如1.5mm)。
[0154]
在某些情况下，主题系统包括与流动池喷嘴孔流体连通的样本询问区域。在这些情况下，样本流动流从流动池喷嘴的远端处的孔口发出，并且流动流中的颗粒可以在样本询问区域用光源照射。询问区域的大小可能会根据流动喷嘴的特性而有所不同，该特性例如是喷嘴孔的大小和样本注入口的大小。在实施方案中，询问区域的宽度可以是0.01mm或大于0.01mm，例如0.05mm或大于0.05mm、例如0.1mm或大于0.1mm、例如0.5mm或大于0.5mm、例如1mm或大于1mm、例如2mm或大于2mm、例如3mm或大于3mm、例如5mm或大于5mm并且包括10mm或大于10mm。在一些情况下，询问区域的长度也可以是0.01mm或大于0.01mm，例如0.1mm或大于0.1mm、例如0.5mm或大于0.5mm、例如1mm或大于1mm、例如1.5mm或大于1.5mm、例如2mm或大于2mm、例如3mm或大于3mm、例如5mm或大于5mm、例如10mm或大于10mm、例如15mm或大于15mm、例如20mm或大于20mm、例如25mm或大于25mm并且包括50mm或大于50mm。
[0155]
询问区域可以被配置为有助于照射出射流动流的平面横截面，或者可以被配置为有助于照射预定长度的漫射场(例如，使用漫射激光或灯)。在一些实施方案中，询问区域包括透明窗口，该透明窗口有助于照射预定长度的出射流，例如1mm或长于1mm、例如2mm或长于2mm、例如3mm或长于3mm、例如4mm或长于4mm、例如5mm或长于5mm并且包括10mm或长于10mm。取决于用于照射出射流的光源(如下所述)，询问区域可以被配置为通过100nm至1500nm的光，例如150nm至1400nm、例如200nm至1300nm、例如250nm至1200nm、例如300nm至1100nm、例如350nm至1000nm、例如400nm至900nm并且包括500nm至800nm的光。因此，询问区域可由通过所需波长范围的任何透明材料形成，包括但不限于光学玻璃、硼硅酸盐玻璃、派热克斯玻璃、紫外线石英、红外线石英、蓝宝石以及塑料例如聚碳酸酯、聚氯乙烯(pvc)、聚
氨酯、聚醚、聚酰胺、聚酰亚胺或这些热塑性塑料的共聚物(例如petg(乙二醇-改性的聚对苯二甲酸乙二醇酯))，以及其他聚合塑料材料，包括聚酯，其中感兴趣的聚酯可以包括但不限于聚(对苯二甲酸亚烷基酯)，例如聚(对苯二甲酸乙二醇酯)(pet)、瓶级pet(一种共聚物基于单乙二醇、对苯二甲酸和其他共聚单体如间苯二甲酸、环己烯二甲醇等)、聚(对苯二甲酸丁二醇酯)(pbt)和聚(对苯二甲酸六亚甲基酯)；聚(己二酸亚烷基酯)如聚(己二酸乙二酯)、聚(1,4-己二酸丁二醇酯)和聚(己二酸六亚甲基酯)；聚(辛二酸亚烷基酯)，例如聚(辛二酸亚乙酯)；聚(癸二酸亚烷基酯)，例如聚(癸二酸乙二酯)；聚(ε-己内酯)和聚(β-丙内酯)；聚(间苯二甲酸亚烷基酯)，例如聚(间苯二甲酸乙二醇酯)；聚(2,6-萘二甲酸亚烷基酯)，例如聚(2,6-萘二甲酸乙二酯)；聚(亚烷基磺酰基-4,4'-二苯甲酸酯)例如聚(亚乙基磺酰基-4,4'-二苯甲酸酯)；聚(对亚苯基亚烷基二羧酸盐)，例如聚(对亚苯基亚乙基二羧酸盐)；聚(反式-1,4-环己烷二亚烷基二羧酸酯)，例如聚(反式-1,4-环己烷二亚乙基二羧酸酯)；聚(1,4-环己烷-二亚甲基亚乙基二羧酸盐)，例如聚(1,4-环己烷-二亚甲基亚乙基二羧酸盐)；聚([2.2.2]-二环辛烷-1,4-二亚甲基亚烷基二羧酸酯)，例如聚([2.2.2]-二环辛烷-1,4-二亚甲基亚乙基二羧酸酯)；(s)-聚丙交酯、(r,s)-聚丙交酯、聚(四甲基乙交酯)和聚(丙交酯-共-乙交酯)等乳酸聚合物和共聚物；以及双酚a、3,3'-二甲基双酚a、3,3',5,5'-四氯双酚a、3,3',5,5'-四甲基双酚a的聚碳酸酯；聚酰胺，例如聚(对苯二甲酰胺)；聚酯，例如聚对苯二甲酸乙二醇酯，例如mylartm聚对苯二甲酸乙二酯等等；在一些实施方案中，主题系统包括定位在样本询问区域中的比色皿。在实施方案中，比色皿可以通过100nm至1500nm的光，例如150nm至1400nm、例如200nm至1300nm、例如250nm至1200nm、例如300nm至1100nm、例如350nm至1000nm、例如400nm至900nm并且包括500nm至800nm的光。
[0156]
在一些实施方案中，主题系统包括用于分选样本的颗粒(例如，细胞)的颗粒分选组件。在某些情况下，颗粒分选组件是颗粒分选模块，例如在2017年3月28日提交的美国专利公开第2017/0299493号和2018年10月30日提交的美国临时专利申请第62/752793号中描述的那些，上述两个专利的公开内容通过引用并入本文。在某些实施方案中，颗粒分选组件包括一个或多于一个液滴偏转器，例如于2017年6月14日提交的美国专利公开第2018/0095022号中描述的那些，该专利的公开内容通过引用并入本文。
[0157]
在一些实施方案中，主题系统是流式细胞仪系统。合适的流式细胞术系统可以包括但不限于以下中描述的那些：ormerod(ed.),flow cytometry:a practical approach,oxford univ.press(1997)；jaroszeski et al.(eds.),flow cytometry protocols,methods in molecular biology no.91,humana press(1997)；practical flow cytometry,3rd ed.,wiley-liss(1995)；virgo,et al.(2012)ann clin biochem.jan；49(pt 1):17-28；linden,et.al.,semin throm hemost.2004oct；30(5):502-11；alison,et al.j pathol,2010dec；222(4):335-344和herbig,et al.(2007)crit rev ther drug carrier syst.24(3):203-255，上述中的公开内容通过引用并入本文。在某些情况下，感兴趣的流式细胞仪系统包括bd biosciences facscanto
tm ii流式细胞仪、bd accuri
tm
流式细胞仪、bd biosciences facscelesta
tm
流式细胞仪、bd biosciences facslyric
tm
流式细胞仪、bd biosciences facsverse
tm
流式细胞仪、bd biosciences facsymphony
tm
流式细胞仪、bd biosciences lsrfortessa
tm
流式细胞仪、bd biosciences lsrfortess
tm x-20流式细胞仪和bd biosciences facscalibur
tm
细胞分选机、bd biosciences facscount
tm
细胞
分选机、bd biosciences facslyric
tm
细胞分选机和bd biosciences via
tm
细胞分选机、bd biosciences influx
tm
细胞分选机、bd biosciences jazz
tm
细胞分选机、bd biosciences aria
tm
细胞分选机和bd biosciences facsmelody
tm
细胞分选机等。
[0158]
在一些实施方案中，主题颗粒分选系统是流式细胞仪系统，例如在美国专利号第10006852号、第9952076号、第9933341号、第9784661号、第9726527号、第9453789号、第9200334号、第9097640号、第9095494号、第9092034号、第8975595号、第8753573号、第8233146号、第8140300号、第7544326号、第7201875号、第7129505号、第6821740号、第6813017号、第6809804号、第6372506号、第5700692号、第5643796号、第5627040号、第5620842号、第5602039号中描述的那些；上述专利的公开的内容通过整体引用并入本文。
[0159]
在某些情况下，主题系统是流式细胞术系统，该流式细胞术系统被配置用于通过使用射频标记发射(fire)的荧光成像来对流动流中的颗粒进行表征和成像，该射频标记发射的荧光成像例如在diebold等人在nature photonics vol.7(10)；806-810(2013)以及美国专利第9423353号和第9784661号和10006852号、美国专利公开第2017/0133857号和第2017/0350803号中描述的那些，其公开内容通过引用并入本文。
[0160]
集成电路器件
[0161]
本公开的方面还包括被编程以对具有明场光电检测器和一个或多于一个荧光检测器的光检测系统进行相位校正的集成电路器件。在实施方案中，主题集成电路器件被编程以接收来自明场光电检测器的明场数据信号和来自一个或多于一个荧光检测器的数据信号，并基于明场数据信号和来自每个荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位计算每个荧光光电检测器的相位校正。在实施方案中，集成电路器件被编程以接收来自一个或多于一个荧光检测器(例如一个或多于一个检测通道)的数据信号，例如2个或多于2个，例如3个或多于3个，例如4个或多于4个，例如5个或多于5个，例如6个或多于6个并且包括8个或多于8个荧光检测器(例如，8个或多于8个检测通道)。在某些情况下，感兴趣的集成电路器件可以包括现场可编程门阵列(fpga)、专用集成电路(asic)或复杂可编程逻辑器件(cpld)。
[0162]
在一个实施例中，集成电路器件被编程以接收来自明场光电检测器的明场数据信号，接收来自第一荧光检测器的第一荧光数据信号，接收来自第二荧光检测器的第二荧光数据信号；基于明场数据信号和第一荧光数据信号之间的相对相位计算第一荧光检测器的相位校正；根据明场数据信号和第二荧光数据信号之间的相对相位计算第二荧光检测器的相位校正。在另一个实施例中，集成电路器件被编程以接收来自明场光电检测器的明场数据信号；接收来自多个荧光检测器的数据信号并基于明场数据信号和来自多个荧光检测器的荧光数据信号中的每一个之间的相对相位计算每个荧光检测器的相位校正。
[0163]
在一些实施方案中，集成电路器件被编程为在多个不同的工作电压下计算每个荧光检测器的相位校正。在这些实施方案中，集成电路器件被编程以通过在第一组工作电压下接收来自每个荧光检测器的荧光数据信号来对光检测系统进行相位校正；基于明场数据信号和来自每个荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位，计算在第一组工作电压下每个荧光检测器的相位校正；将一个或多于一个荧光检测器的工作电压改变为第二组工作电压；在第二组工作电压下接收来自每个荧光检测器的荧光数据信号以产生第二组荧光数据信号；基于明场数据信号和来自每个荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位，计算在第二组工作电压下每个荧光检测器的相位校正。
[0164]
可以对主题集成电路器件进行编程以改变每个荧光检测器的工作电压并计算每个荧光检测器在每个工作电压下的相位校正。在这些实施方案中，可以对集成电路器件进行编程以改变每个荧光检测器的工作电压，例如0.01v或多于0.01v，例如0.05v或多于0.05v，例如0.1v或多于0.1v，例如0.5v或多于0.5v，例如1v或多于1v，例如2v或多于2v，例如3v或多于3v，例如5v或多于5v，例如10v或多于10v，例如25v或多于25v，例如50v或多于50v，例如100v或多于100v，例如250v或多于250v，例如500v或多于500v并且包括1000v或多于1000v。在一个实施例中，可以对集成电路器件进行编程以逐渐增加每个荧光检测器的工作电压并在每个工作电压处计算相位校正，例如将工作电压逐渐增加0.01v或多于0.01v，例如0.05v或多于0.05v，例如0.1v或多于0.1v，例如0.5v或多于0.5v，例如1v或多于1v，例如2v或多于2v，例如3v或多于3v，例如5v或多于5v，例如10v或多于10v，例如25v或多于25v，例如50v或多于50v，例如100v或多于100v，例如250v或多于250v，例如500v或多于500v并且包括1000v或多于1000v。在另一个实施例中，可以对集成电路器件进行编程以逐步降低每个荧光检测器的工作电压并在每个工作电压处计算相位校正，例如将工作电压逐步降低0.01v或多于0.01v，例如0.05v或多于0.05v，例如0.1v或多于0.1v，例如0.5v或多于0.5v，例如1v或多于1v，例如2v或多于2v，例如3v或多于3v，例如5v或多于5v，例如10v或多于10v，例如25v或多于25v，例如50v或多于50v，例如100v或多于100v，例如250v或多于250v，例如500v或多于500v并且包括1000v或多于1000v。
[0165]
可以对感兴趣的集成电路器件进行编程，以在任意数量的工作电压下从每个荧光检测器收集荧光数据信号，从而对光检测系统进行相位校正，例如在2个或多于2个不同的工作电压下，例如3个或多于3个不同的工作电压下，例如5个或多于5个不同的工作电压下，例如10个或多于10个不同的工作电压下，例如25个或多于25个不同的工作电压下，集成电路器件从每个荧光检测器收集荧光数据信号，并且包括在50个或多于50个不同的工作电压下从每个荧光检测器收集荧光数据信号。在某些实施方案中，集成电路器件被编程为在被用于从样本(例如，生物样本)收集光信号的每个工作电压下计算荧光检测器中的每一个的相位校正。
[0166]
在实施方案中，集成电路器件可以被编程以将每个荧光检测器的工作电压改变相同或不同的量。在一些情况下，集成电路器件被编程以将光检测系统中每个荧光检测器的工作电压改变相同的量。在其他情况下，集成电路器件被编程以将光检测系统中每个荧光检测器的工作电压改变不同的量。在其他情况下，集成电路器件被编程为以相同的量改变光检测系统中的两个或多于两个荧光检测器的工作电压，并且以不同的量改变光检测系统中的两个或多于两个荧光检测器的工作电压。在每个工作电压下，集成电路器件被编程为基于明场数据信号和荧光数据信号之间的相对相位计算每个荧光检测器的相位校正。
[0167]
在一些实施方案中，集成电路器件被编程以计算寿命相位校正分量。寿命相位校正是基于上述在荧光检测器的每个工作电压下计算的相位校正和样本中荧光团的荧光寿命来计算的。根据荧光团的具体类型和存在的荧光团数量，一个或多于一个荧光寿命可以用于计算寿命相位校正分量，例如2个或多于2个，例如3个或多于3个，例如4个或多于4个，并且包括5个或多于5个不同的荧光寿命可以用于计算寿命相位校正分量。在一些实施方案中，集成电路器件被编程以计算荧光团峰值发射波长处的每个荧光寿命。在这些实施方案中，每个荧光团的寿命都可以用光检测系统检测，并使用来自不同检测器通道的信号进行
计算。
[0168]
在一些实施方案中，集成电路器件被编程以利用荧光检测器从样本中的颗粒产生频率编码的荧光数据；并且通过用计算的每个荧光检测器的相位校正对频率编码的荧光数据进行变换，来计算颗粒的相位校正的空间数据。在一些情况下，频率编码的荧光数据包括从来自其他检测器的光中获取(或导出)的数据分量，例如检测到的光吸收或检测到的光散射。在一些情况下，系统被配置为根据从样本例如从明场光电检测器检测到的光吸收产生频率编码的荧光数据的一个或多于一个数据分量。在一些情况下，频率编码的荧光数据的一个或多于一个数据分量由从样本检测到的光散射产生，例如从侧向散射检测器、前向散射检测器或侧向散射检测器和前向散射检测器的组合中产生。
[0169]
在实施方案中，主题集成电路器件被编程为从频率编码的荧光数据计算相位校正的空间数据。根据本公开的实施方案，通过用本文描述的计算的相位校正对频率编码的荧光数据进行变换来对空间数据进行相位校正。在一些实施方案中，空间数据包括颗粒的水平维度尺寸、颗粒的垂直维度尺寸、沿两个不同维度的颗粒尺寸比、颗粒成分的尺寸比(例如细胞核的水平维度与细胞质的水平维度的比值)。
[0170]
在实施方案中，主题集成电路器件被编程为通过对计算的光检测系统中的每一个荧光检测器的相位校正对频率编码的荧光数据进行变换来计算颗粒的相位校正的空间数据。在一些实施方案中，为了计算相位校正的空间数据，集成电路器件被编程为用计算的相位校正对频率编码的荧光数据进行傅里叶变换，以生成颗粒的相位校正的空间数据。在其他实施方案中，集成电路器件被编程为用计算的相位校正对频率编码的荧光数据进行离散傅里叶变换(dft)，以生成颗粒的相位校正的空间数据。在其他实施方案中，集成电路器件被编程为用计算的相位校正对频率编码的荧光数据进行短时傅里叶变换(stft)。在其他实施方案中，集成电路器件被编程为使用数字锁定放大器计算相位校正的空间数据，以使频率编码的荧光数据产生外差和解复用频率编码的荧光数据。
[0171]
用于对光检测系统进行相位校正的组合物
[0172]
本公开的方面包括用于对光检测系统进行相位校正的组合物，例如通过使主题组合物在流动流中流动并根据本文描述的方法计算光检测系统的一个或多于一个荧光检测器的相位校正。根据实施方案的组合物包括多个颗粒和荧光染料成分，使得荧光染料成分具有稳定的荧光寿命。在本文中，术语“稳定的荧光寿命”以其常规意义使用，指荧光寿命几乎没有变化的荧光团，例如响应于不同的实验条件(例如温度、激光照射、气体组合物等)。在一些情况下，感兴趣的荧光染料成分的荧光寿命表现出1ns或短于1ns的荧光寿命变化，例如0.5ns或短于0.5ns，例如0.1ns或短于0.1ns，例如0.05ns或短于0.05ns，例如0.01ns或短于0.01ns，例如0.005ns或短于0.005ns，例如0.001ns或短于0.001ns并且包括0.0001ns或短于0.0001ns。在这些情况下，荧光染料成分表现出荧光寿命变化5％或小于5％，例如3％或小于3％，例如2％或小于2％，例如1％或小于1％，例如0.5％或小于0.5％，例如0.1％或小于0.1％，例如0.05％或小于0.05％，例如0.01％或小于0.01％，例如0.005％或小于0.005％并且包括荧光寿命变化0.001％或小于0.001％
[0173]
在实施方案中，组合物包括荧光染料成分。在某些情况下，荧光染料成分包括基于例如荧光发射最大值、荧光偏振、荧光寿命或其组合而可检测的可检测部分或标记。在某些实施方案中，可检测标记是荧光团(即荧光标记、荧光染料等)。感兴趣的荧光团可以包括但
不限于适用于分析应用(例如流式细胞术、成像等)的染料。例如，荧光染料成分可以包括化合物，例如罗丹明、香豆素、花青、氧杂蒽、聚甲炔、芘、二吡咯亚甲基二氟化硼、萘酰亚胺、藻胆蛋白、多甲藻叶绿素蛋白、其缀合物及其组合。在某些实施方案中，荧光染料成分包括尼罗红染料。在其他实施方案中，荧光染料成分包括选自以下的染料：4-乙酰氨基-4'-异硫氰酸芪-2,2'二磺酸；吖啶及其衍生物，如吖啶、吖啶橙、吖啶黄、吖啶红、吖啶异硫氰酸酯；5-(2'-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(edans)；4-氨基-n-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘酰亚胺-3,5二磺酸盐(lucifer yellow vs)；n-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺；邻氨基苯甲酰胺；brilliant yellow；香豆素及其衍生物，例如香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素(amc，coumarin 120)、7-氨基-4-三氟甲基香豆素(coumaran 151)；花青及其衍生物，例如花青、cy3、cy3.5、cy5、cy5.5和cy7；4’,6-二氨基-2-苯基吲哚(dapi)；5’,5
”‑
二溴邻苯三酚-磺酞(bromopyrogallol red)；7-二乙氨基-3-(4'-异硫氰基苯基)-4-甲基香豆素；二乙氨基香豆素；二亚乙基三胺五乙酸酯；4,4'-二异硫氰酸根合二氢芪-2,2'-二磺酸；4,4'-二异硫氰基芪-2,2'-二磺酸；5-[二甲氨基]萘-1-磺酰氯(dns，丹磺酰氯)；4-(4'-二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(dabcyl)；4-二甲基氨基苯基偶氮苯基-4'-异硫氰酸酯(dabitc)；曙红及其衍生物，例如曙红和曙红异硫氰酸酯；赤藓红及其衍生物，例如赤藓红b和异硫氰酸赤藓红；乙锭；荧光素及其衍生物，例如5-羧基荧光素(fam)、5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(dtaf)、2'7'-二甲氧基-4'5'-二氯-6-羧基荧光素(joe)、异硫氰酸荧光素(fitc)、氯三嗪基荧光素、萘并荧光素和qfitc(xritc)；荧光胺；ir144；ir1446；绿色荧光蛋白(gfp)；reef coral fluorescent protein(rcfp)；lissamine
tm
；丽丝胺罗丹明，萤虫黄；孔雀石绿分子；4-甲基伞形酮；邻甲酚酞；硝基酪氨酸；副品红；尼罗红；俄勒冈绿；酚红；b-藻红蛋白(pe)；邻苯二甲醛；芘及其衍生物，例如芘、芘丁酸酯和琥珀酰亚胺基1-芘丁酸酯；活性红4(cibacron
tm brilliant red 3b-a)；罗丹明及其衍生物，例如6-羧基-x-罗丹明(rox)、6-羧基罗丹明(r6g)、4,7-二氯罗丹明丽丝胺、罗丹明b磺酰氯、罗丹明(rhod)、罗丹明b、罗丹明123、罗丹明x异硫氰酸酯、磺基罗丹明b、磺基罗丹明101、磺基罗丹明101的磺酰氯衍生物(texas red)、n,n,n',n'-四甲基-6-羧基罗丹明(tamra)、四甲基罗丹明和四甲基罗丹明异硫氰酸酯(tritc)；核黄素；甲酚酸和铽螯合衍生物；氧杂蒽；类胡萝卜素-蛋白质复合物，例如多甲藻叶绿素蛋白(percp)；别藻蓝蛋白(apc)；或其组合。
[0174]
在一些情况下，荧光染料成分包括聚合物染料(例如荧光聚合物染料)。在一些情况下，聚合物染料包括共轭聚合物。共轭聚合物(cp)的特征在于离域电子结构，其包括交替的不饱和键(例如双键和/或三键)和饱和(例如单键)键的主链，其中π电子可以从一个键移动到另一个键。因此，共轭主链可以在聚合物染料上赋予延伸的线性结构，在聚合物的重复单元之间具有有限的键角。例如，蛋白质和核酸虽然也是聚合的，但在某些情况下不会形成延长棒结构，而是折叠成更高阶的三维形状。此外，cp可能会形成“刚性棒”聚合物主链，并在沿聚合物主链的单体重复单元之间经历有限的扭曲(例如，扭转)角。在一些情况下，聚合物染料包括具有刚性棒结构的cp。聚合物染料的结构特性会对分子的荧光特性产生影响。
[0175]
在某些实施方案中，感兴趣的聚合物染料包括但不限于gaylord等人在美国专利公开第20040142344号、第20080293164号、第20080064042号、第20100136702号、第20110256549号、第20110257374号、第20120028828号、第20120252986号、第20130190193号中描述的那些染料，其公开内容通过引用整体并入本文；和gaylord等人,j.am.chem.soc.,
2001,123(26),pp6417-6418；feng等人,chem.soc.rev.,2010,39,2411-2419和traina等人,j.am.chem.soc.,2011,133(32),pp 12600-12607中描述的那些染料，其公开内容以引用的方式整体并入本文。
[0176]
感兴趣的组合物还包括多个颗粒。在一些实施方案中，荧光染料成分与颗粒稳定结合。稳定缔合是指荧光染料成分例如在与液体介质例如水性介质接触时不易从颗粒上解离。因此，当存在于流动流中时(例如，当用于计算如本文所述的一种或多于一种荧光检测器的相位校正时)，荧光染料成分保持与其颗粒结合。在某些情况下，荧光染料成分与颗粒共价键合。
[0177]
在一些实施方案中，主题组合物中的颗粒是珠粒，例如直径在纳米到微米范围内的结构，例如直径为0.01μm至1000μm，例如直径为0.1μm至100μm，并且包括直径1μm至100μm，并且用于流式细胞术，包括直径约1μm到10μm。这些颗粒可以是任何形状，并且在某些情况下是近似球形的。这些颗粒可以由任何合适的材料(或其组合)制成，包括但不限于聚合物，例如聚苯乙烯；含有其他共聚物如二乙烯基苯的聚苯乙烯；聚甲基丙烯酸甲酯(pmma)；聚乙烯基甲苯(pvt)；共聚物，例如苯乙烯/丁二烯、苯乙烯/乙烯基甲苯；乳胶；玻璃；或其他材料，例如二氧化硅(例如sio2)。在一些实施方案中，感兴趣的是具有低自发荧光或没有自发荧光的颗粒，例如珠粒，例如玻璃珠粒。
[0178]
在一些实施方案中，珠粒是金属有机聚合物基质，例如具有包含金属如铝、钡、锑、钙、铬、铜、铒、锗、铁、铅、锂、磷、钾、硅、钽、锡、钛、钒、锌或锆的主链结构的有机聚合物基质。在一些实施方案中，多孔金属有机基质为有机硅氧烷聚合物，包括但不限于甲基三甲氧基硅烷、二甲基二甲氧基硅烷、四乙氧基硅烷、甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷、双(三乙氧基甲硅烷基)乙烷、双(三乙氧基甲硅烷基)丁烷、双(三乙氧基甲硅烷基)戊烷、双(三乙氧基甲硅烷基)己烷、双(三乙氧基甲硅烷基)庚烷、双(三乙氧基甲硅烷基)辛烷及其组合。
[0179]
感兴趣的组合物中的颗粒可以是多孔的或无孔的。在一些实施方案中，颗粒是无孔的。在其他实施方案中，可以是多孔的，例如其中颗粒具有直径0.01nm至1000nm的孔，例如0.05nm至750nm的孔，例如0.1nm至500nm的孔，例如0.5nm至250nm的孔，例如1nm至100nm的孔，例如5nm至75nm的孔，并且包括具有直径10nm至50nm的孔的颗粒。
[0180]
在某些实施方案中，感兴趣的荧光标记的珠粒包括但不限于荧光标记的聚苯乙烯珠粒、荧光素珠粒、罗丹明珠粒和其他用荧光染料标记的珠粒。荧光标记的珠粒的其他实例在美国专利第6,350,619号、第7,738,094号和第8,248,597号中进行了描述，其中每一个的公开内容通过引用以其整体并入本文。
[0181]
套件
[0182]
本公开的方面还包括套件，其中套件包括上述部件中的一种或多于一种，例如集成电路器件、相位校准组合物等，例如本文所述。在一些实施方案中，套件还可以包括用于主题系统的程序，例如以计算机可读介质(例如，闪存驱动器、usb存储设备、光盘、dvd、蓝光光盘等)或用于从互联网网络协议或云服务器下载程序的指令的形式。套件还可以包括一种或多于一种用于对光检测系统进行相位校正的组合物。套件还可包括用于实践主题方法的指令。这些指令可以多种形式存在于主题套件中，其中一种或多于一种形式可以存在于套件中。这些指令可以存在的一种形式是作为印刷信息呈现在合适的介质或基材上，例如，在其上印刷信息的纸、在套件的包装中、在包装插页等中。这些指令的又一种形式是计算机
可读介质，例如磁盘、光盘(cd)、便携式闪存驱动器等，其中信息已被记录在其上。这些指令可能存在的另一种形式是网站地址，该地址可用于通过互联网访问远离的站点上的信息。
[0183]
实用性
[0184]
主题系统、方法和计算机系统可用于各种应用中，其中需要分析和分类流体介质中的样本中的颗粒成分，例如生物样本。在一些实施方案中，本文描述的系统和方法可用于用荧光标签标记的生物样本的流式细胞术表征。在其他实施方案中，系统和方法可用于发射光的光谱学。另外，主题系统和方法可用于增加从收集自样本(例如，在流动流中)的光中获得的信号。本公开的实施方案可用于需要提供具有改进的细胞分选精度、增强的颗粒收集、颗粒充电效率、更准确的颗粒充电和在细胞分选期间增强的颗粒偏转的流式细胞仪的情况。
[0185]
本公开的实施方案还可用于从生物样本制备的细胞可能需要用于研究、实验室测试或用于治疗的应用。在一些实施方案中，主题方法和装置可有助于获得从目标流体或组织生物样本制备的单个细胞。例如，本发明的方法和系统有助于从流体或组织样本中获得细胞，以用作例如癌症等疾病的研究或诊断样本。同样，主题方法和系统可有助于从流体或组织样本中获得细胞以用于治疗。与传统的流式细胞术系统相比，本公开的方法和装置使得能够以提高的效率和低成本从生物样本(例如，器官、组织、组织片段、流体)中分离和收集细胞。
[0186]
尽管有所附权利要求，本公开也由以下条款定义：
[0187]
1.一种方法，其包括：
[0188]
用光检测系统检测来自包含流动流中的颗粒的样本的光，所述光检测系统包括：
[0189]
明场光电检测器，配置为响应于检测到的光产生明场数据信号；和
[0190]
荧光检测器，配置为响应检测到的光产生荧光数据信号；
[0191]
基于明场数据信号和荧光数据信号之间的相对相位计算荧光检测器的相位校正。
[0192]
2.根据条款1所述的方法，其中在第一配置下计算荧光检测器的相位校正。
[0193]
3.根据条款1-2中任一项所述的方法，其中所述方法还包括：
[0194]
在第二配置下，使用荧光检测器检测来自样本的光；和
[0195]
基于明场数据信号和来自在第二配置下荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位计算荧光检测器的相位校正。
[0196]
4.根据条款3所述的方法，其中所述方法还包括：
[0197]
在第三配置下，使用荧光检测器检测来自样本的光；和
[0198]
基于明场数据信号和来自在第三配置下荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位计算荧光检测器的相位校正。
[0199]
5.根据条款2-4中任一项所述的方法，其中配置是电压。
[0200]
6.根据条款5所述的方法，其中所述方法包括：
[0201]
在第一电压下，使用荧光检测器检测来自样本的光；
[0202]
基于明场数据信号和来自在第一电压下荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位计算荧光检测器的相位校正；
[0203]
在第二电压下，使用荧光检测器检测来自样本的光；和
[0204]
基于明场数据信号和来自在第二电压下荧光检测器的荧光数据信号之间的相对
相位计算荧光检测器的相位校正。
[0205]
7.根据条款2-4中任一项所述的方法，其中配置是电子增益设置。
[0206]
8.根据条款7所述的方法，其中所述方法包括：
[0207]
在第一电子增益设置下，使用荧光检测器检测来自样本的光；
[0208]
基于明场数据信号和来自在第一电子增益设置下荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位计算荧光检测器的相位校正；
[0209]
在第二电子增益设置下，使用荧光检测器检测来自样本的光；和
[0210]
基于明场数据信号和来自在第二电子增益设置下荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位计算荧光检测器的相位校正。
[0211]
9.根据条款1-8中任一项所述的方法，其还包括：
[0212]
基于计算的荧光检测器的相位校正和样本中荧光团的荧光寿命计算荧光检测器的寿命相位校正。
[0213]
10.根据条款1-9中任一项所述的方法，其中所述光检测系统包括多个荧光检测器，其中每个荧光检测器配置为响应于检测到的光独立地产生荧光数据信号。
[0214]
11.根据条款10所述的方法，其中所述方法包括基于明场数据信号和来自每个荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位计算每个荧光检测器的相位校正。
[0215]
12.根据条款11所述的方法，其中针对包括预定配置的每个荧光检测器计算相位校正。
[0216]
13.根据条款12所述的方法，其中所述预定配置为电压。
[0217]
14.根据条款13所述的方法，其中所述方法包括：
[0218]
在第一电压下，使用每个荧光检测器检测来自样本的光；
[0219]
基于明场数据信号和来自在第一电压下每个荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位计算每个荧光检测器的相位校正；
[0220]
在第二电压下，使用每个荧光检测器检测来自样本的光；和
[0221]
基于明场数据信号和来自在第二电压下每个荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位计算每个荧光检测器的相位校正。
[0222]
15.根据条款14所述的方法，其中对于光检测系统中的所有荧光检测器而言，预定电压是相同的。
[0223]
16.根据条款14所述的方法，其中对于荧光检测器中的每一个而言，预定电压是不同的。
[0224]
17.根据条款12所述的方法，其中所述预定配置为电子增益设置。
[0225]
18.根据条款17所述的方法，其中所述方法包括：
[0226]
在第一电子增益设置下，使用每个荧光检测器检测来自样本的光；
[0227]
基于明场数据信号和来自在第一电子增益设置下每个荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位计算每个荧光检测器的相位校正；
[0228]
在第二电子增益设置下，使用每个荧光检测器检测来自样本的光；和
[0229]
基于明场数据信号和来自在第二电子增益设置下每个荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位计算每个荧光检测器的相位校正。
[0230]
19.根据条款18所述的方法，其中对于光检测系统中的所有荧光检测器而言，预定
电子增益设置是相同的。
[0231]
20.根据条款18所述的方法，其中对于荧光检测器中的每一个而言，预定电子增益设置是不同的。
[0232]
21.根据条款10-20中任一项所述的方法，其还包括基于计算的每个荧光检测器的相位校正和样本中荧光团的荧光寿命计算荧光检测器中的每一个的寿命相位校正。
[0233]
22.根据条款1-21中任一项所述的方法，其还包括：
[0234]
使用荧光检测器从样本中的颗粒生成频率编码的荧光数据；和
[0235]
通过用计算的每个荧光检测器的相位校正对频率编码的荧光数据进行变换，计算颗粒的相位校正的空间数据。
[0236]
23.根据条款22所述的方法，其中空间数据通过使用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行傅里叶变换来计算。
[0237]
24.根据条款23所述的方法，其中空间数据通过使用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行离散傅里叶变换来计算。
[0238]
25.根据条款23所述的方法，其中空间数据通过使用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行短时傅里叶变换(stft)来计算。
[0239]
26.根据条款22所述的方法，其中空间数据使用数字锁定放大器计算，以使频率编码的荧光数据产生外差和解复用频率编码的荧光数据。
[0240]
27.根据条款1-26中任一项所述的方法，其中用光源照射流动流中的样本。
[0241]
28.根据条款27所述的方法，其中光源包括光束发生器部件，所述光束发生器部件配置为至少产生第一束频移光和第二束频移光。
[0242]
29.根据条款28所述的方法，其中光束发生器包括声光偏转器。
[0243]
30.根据条款28-29中任一项所述的方法，其中光束发生器包括直接数字合成器(dds)射频梳状发生器。
[0244]
31.根据条款28-30中任一项所述的方法，其中光束发生器部件配置为产生频移的本振光束。
[0245]
32.根据条款27-31中任一项所述的方法，其中光源包括激光器。
[0246]
33.根据条款32所述的方法，其中激光器是连续波激光器。
[0247]
34.根据条款1-33中任一项所述的方法，其中每个荧光检测器的相位校正由集成电路器件计算。
[0248]
35.根据条款34所述的方法，其中集成电路器件是现场可编程门阵列(fpga)。
[0249]
36.根据条款34所述的方法，其中集成电路器件是专用集成电路(asic)。
[0250]
37.根据条款34所述的方法，其中集成电路器件是复杂可编程逻辑器件(cpld)。
[0251]
38.根据条款1-37中任一项所述的方法，其还包括生成流动流中的颗粒的图像。
[0252]
39.一种系统，其包括：
[0253]
光源，其配置为照射包含流动流中的颗粒的样本；
[0254]
光检测系统，包括：
[0255]
明场光电检测器，配置为响应于检测到的光产生明场数据信号；和
[0256]
荧光检测器，配置为响应检测到的光产生荧光数据信号；和
[0257]
处理器，包括可操作地耦合到处理器的存储器，其中存储器包括存储在其上的指
令，当由处理器执行时，使处理器：
[0258]
基于明场数据信号和荧光数据信号之间的相对相位计算荧光检测器的相位校正。
[0259]
40.根据条款39所述的系统，其中存储器包括存储在其上的指令，当由处理器执行时，使处理器计算在第一配置下荧光检测器的相位校正。
[0260]
41.根据条款39所述的系统，其中存储器包括存储在其上的指令，当由处理器执行时，使处理器：
[0261]
在第二配置下，使用荧光检测器检测来自样本的光；和
[0262]
基于明场数据信号和来自在第二配置下荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位计算荧光检测器的相位校正。
[0263]
42.根据条款41所述的系统，其中存储器包括存储在其上的指令，当由处理器执行时，使处理器：
[0264]
在第三配置下，使用荧光检测器检测来自样本的光；和
[0265]
基于明场数据信号和来自在第三配置下荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位计算荧光检测器的相位校正。
[0266]
43.根据条款40-42中任一项所述的系统，其中配置是电压。
[0267]
44.根据条款43所述的系统，其中存储器包括存储在其上的指令，当由处理器执行时，使处理器：
[0268]
在第一电压下，使用荧光检测器检测来自样本的光；
[0269]
基于明场数据信号和来自在第一电压下荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位计算荧光检测器的相位校正；
[0270]
在第二电压下，使用荧光检测器检测来自样本的光；和
[0271]
基于明场数据信号和来自在第二电压下荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位计算荧光检测器的相位校正。
[0272]
45.根据条款40-42中任一项所述的系统，其中配置是电子增益设置。
[0273]
46.根据条款45所述的系统，其中存储器包括存储在其上的指令，当由处理器执行时，使处理器：
[0274]
在第一电子增益设置下，使用荧光检测器检测来自样本的光；
[0275]
基于明场数据信号和来自在第一电子增益设置下荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位计算荧光检测器的相位校正；
[0276]
在第二电子增益设置下，使用荧光检测器检测来自样本的光；和
[0277]
基于明场数据信号和来自在第二电子增益设置下荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位计算荧光检测器的相位校正。
[0278]
47.根据条款39所述的系统，其中存储器包括存储在其上的指令，当由处理器执行时，使处理器：
[0279]
基于计算的荧光检测器的相位校正和样本中荧光团的荧光寿命计算荧光检测器的寿命相位校正。
[0280]
48.根据条款39-47中任一项所述的系统，其中所述光检测系统包括多个荧光检测器，其中每个荧光检测器配置为响应于检测到的光独立地产生荧光数据信号。
[0281]
49.根据条款48所述的系统，其中存储器包括存储在其上的指令，当由处理器执行
时，使处理器基于明场数据信号和来自每个荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位计算每个荧光检测器的相位校正。
[0282]
50.根据条款49所述的系统，其中存储器包括存储在其上的指令，当由处理器执行时，使处理器针对包括预定配置的每个荧光检测器计算相位校正。
[0283]
51.根据条款50所述的系统，其中所述预定配置为电压。
[0284]
52.根据条款51所述的系统，其中存储器包括存储在其上的指令，当由处理器执行时，使处理器：
[0285]
在第一电压下，使用每个荧光检测器检测来自样本的光；
[0286]
基于明场数据信号和来自在第一电压下每个荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位计算每个荧光检测器的相位校正；
[0287]
在第二电压下，使用每个荧光检测器检测来自样本的光；和
[0288]
基于明场数据信号和来自在第二电压下每个荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位计算每个荧光检测器的相位校正。
[0289]
53.根据条款52所述的系统，其中对于光检测系统中的所有荧光检测器而言，预定电压是相同的。
[0290]
54.根据条款52所述的系统，其中对于荧光检测器中的每一个而言，预定电压是不同的。
[0291]
55.根据条款50所述的系统，其中所述预定配置为电子增益设置。
[0292]
56.根据条款55所述的系统，其中存储器包括存储在其上的指令，当由处理器执行时，使处理器：
[0293]
在第一电子增益设置下，使用每个荧光检测器检测来自样本的光；
[0294]
基于明场数据信号和来自在第一电子增益设置下每个荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位计算每个荧光检测器的相位校正；
[0295]
在第二电子增益设置下，使用每个荧光检测器检测来自样本的光；和
[0296]
基于明场数据信号和来自在第二电子增益设置下每个荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位计算每个荧光检测器的相位校正。
[0297]
57.根据条款56所述的系统，其中对于光检测系统中的所有荧光检测器而言，预定电子增益设置是相同的。
[0298]
58.根据条款56所述的系统，其中对于荧光检测器中的每一个而言，预定电子增益设置是不同的。
[0299]
59.根据条款48-58中任一项所述的系统，其中存储器包括存储在其上的指令，当由处理器执行时，使处理器基于计算的荧光检测器中的每一个的相位校正和样本中荧光团的荧光寿命计算荧光检测器中的每一个的寿命相位校正。
[0300]
60.根据条款39-59中任一项所述的系统，其中存储器包括存储在其上的指令，当由处理器执行时，使处理器：
[0301]
使用荧光检测器从样本中的颗粒生成频率编码的荧光数据；和
[0302]
通过用计算的每个荧光检测器的相位校正对频率编码的荧光数据进行变换，计算颗粒的相位校正的空间数据。
[0303]
61.根据条款60所述的系统，其中存储器包括存储在其上的指令，当由处理器执行
时，使处理器用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行傅里叶变换，以生成颗粒的相位校正的空间数据。
[0304]
62.根据条款61所述的系统，其中存储器包括存储在其上的指令，当由处理器执行时，使处理器用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行离散傅里叶变换，以生成颗粒的相位校正的空间数据。
[0305]
63.根据条款61所述的系统，其中存储器包括存储在其上的指令，当由处理器执行时，使处理器用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行短时傅里叶变换(stft)。
[0306]
64.根据条款60所述的系统，其中存储器包括存储在其上的指令，当由处理器执行时，使处理器使用数字锁定放大器计算相位校正的空间数据，以使频率编码的荧光数据产生外差和解复用频率编码的荧光数据。
[0307]
65.根据条款39-64中任一项所述的系统，其中光源包括光束发生器部件，所述光束发生器部件配置为至少产生第一束频移光和第二束频移光。
[0308]
66.根据条款65所述的系统，其中光束发生器包括声光偏转器。
[0309]
67.根据条款65-66中任一项所述的系统，其中光束发生器包括直接数字合成器(dds)射频梳状发生器。
[0310]
68.根据条款65-67中任一项所述的系统，其中光束发生器部件配置为产生频移的本振光束。
[0311]
69.根据条款39-68中任一项所述的系统，其中光源包括激光器。
[0312]
70.根据条款69所述的系统，其中激光器是连续波激光器。
[0313]
71.根据条款39-70中任一项所述的系统，其包含编程用于以下的集成电路部件：
[0314]
基于明场数据信号和荧光数据信号之间的相对相位计算荧光检测器的相位校正。
[0315]
72.根据条款71所述的系统，其中集成电路器件是现场可编程门阵列(fpga)。
[0316]
73.根据条款71所述的系统，其中集成电路器件是专用集成电路(asic)。
[0317]
74.根据条款71所述的系统，其中集成电路器件是复杂可编程逻辑器件(cpld)。
[0318]
75.根据条款39-74中任一项所述的系统，其中所述系统为流式细胞仪。
[0319]
76.根据条款39-75中任一项所述的系统，其中存储器包括存储在其上的指令，当由处理器执行时，使处理器生成样本中颗粒的图像。
[0320]
77.一种集成电路，其编程为基于明场数据信号和荧光数据信号之间的相对相位计算荧光检测器的相位校正。
[0321]
78.根据条款77所述的集成电路，其中所述集成电路进行电通信以接收来自光检测系统的数据信号，所述光检测系统包括：
[0322]
明场光电检测器，配置为响应于检测到的光产生明场数据信号；和
[0323]
荧光检测器，配置为响应检测到的光产生荧光数据信号。
[0324]
79.根据条款77所述的集成电路，其中集成电路被编程为计算在第一配置下荧光检测器的相位校正。
[0325]
80.根据条款79所述的集成电路，其中集成电路被编程为基于明场数据信号和来自在第二配置下荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位计算荧光检测器的相位校正。
[0326]
81.根据条款80所述的集成电路，其中集成电路被编程为基于明场数据信号和来自在第三配置下荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位计算荧光检测器的相位校正。
[0327]
82.根据条款79-81中任一项所述的集成电路，其中配置是电压。
[0328]
83.根据条款82所述的集成电路，其中集成电路被编程为：
[0329]
基于明场数据信号和来自在第一电压下荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位计算荧光检测器的相位校正；和
[0330]
基于明场数据信号和来自在第二电压下荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位计算荧光检测器的相位校正。
[0331]
84.根据条款79-81中任一项所述的集成电路，其中配置是电子增益设置。
[0332]
85.根据条款84所述的集成电路，其中集成电路被编程为：
[0333]
基于明场数据信号和来自在第一电子增益设置下荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位计算荧光检测器的相位校正；
[0334]
基于明场数据信号和来自在第二电子增益设置下荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位计算荧光检测器的相位校正。
[0335]
86.根据条款77所述的集成电路，其中集成电路被编程为：
[0336]
基于计算的荧光检测器的相位校正和样本中荧光团的荧光寿命计算荧光检测器的寿命相位校正。
[0337]
87.根据条款78所述的集成电路，其中所述光检测系统包括多个荧光检测器，其中每个荧光检测器配置为响应于检测到的光独立地产生荧光数据信号。
[0338]
88.根据条款87所述的集成电路，其中集成电路被编程为基于明场数据信号和来自每个荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位计算每个荧光检测器的相位校正。
[0339]
89.根据条款88所述的集成电路，其中所述集成电路被编程为针对包括预定配置的每个荧光检测器计算相位校正。
[0340]
90.根据条款89所述的集成电路，其中所述预定配置为电压。
[0341]
91.根据条款90所述的集成电路，其中集成电路被编程为：
[0342]
基于明场数据信号和来自在第一电压下每个荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位计算每个荧光检测器的相位校正；和
[0343]
基于明场数据信号和来自在第二电压下每个荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位计算每个荧光检测器的相位校正。
[0344]
92.根据条款91所述的集成电路，其中对于光检测系统中的所有荧光检测器而言，预定电压是相同的。
[0345]
93.根据条款91所述的集成电路，其中对于荧光检测器中的每一个而言，预定电压是不同的。
[0346]
94.根据条款89所述的集成电路，其中所述预定配置为电子增益设置。
[0347]
95.根据条款94所述的集成电路，其中集成电路被编程为：
[0348]
基于明场数据信号和来自在第一电子增益设置下每个荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位计算每个荧光检测器的相位校正；和
[0349]
基于明场数据信号和来自在第二电子增益设置下每个荧光检测器的荧光数据信号之间的相对相位计算每个荧光检测器的相位校正。
[0350]
96.根据条款95所述的集成电路，其中对于光检测系统中的所有荧光检测器而言，预定电子增益设置是相同的。
[0351]
97.根据条款95所述的集成电路，其中对于荧光检测器中的每一个而言，预定电子增益设置是不同的。
[0352]
98.根据条款87-97中任一项所述的集成电路，其中集成电路被编程为基于计算的每个荧光检测器的相位校正和样本中荧光团的荧光寿命计算荧光检测器中的每一个的寿命相位校正。
[0353]
99.根据条款77-98中任一项所述的集成电路，其中集成电路被编程为：
[0354]
使用荧光检测器从样本中的颗粒生成频率编码的荧光数据；和
[0355]
通过用计算的每个荧光检测器的相位校正对频率编码的荧光数据进行变换，计算颗粒的相位校正的空间数据。
[0356]
100.根据条款99所述的集成电路，其中集成电路被编程为用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行傅里叶变换，以生成颗粒的相位校正的空间数据。
[0357]
101.根据条款100所述的集成电路，其中集成电路被编程为用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行离散傅里叶变换，以生成颗粒的相位校正的空间数据。
[0358]
102.根据条款101所述的集成电路，其中集成电路被编程为用相位校正分量对频率编码的荧光数据进行短时傅里叶变换，以生成颗粒的相位校正的空间数据。
[0359]
103.根据条款99所述的集成电路，其中集成电路被编程为使用数字锁定放大器计算相位校正的空间数据，以使频率编码的荧光数据产生外差和解复用频率编码的荧光数据。
[0360]
104.根据条款77-103中任一项所述的集成电路，其中集成电路器件是现场可编程门阵列(fpga)。
[0361]
105.根据条款77-103中任一项所述的集成电路，其中集成电路器件是专用集成电路(asic)。
[0362]
106.根据条款77-103中任一项所述的集成电路，其中集成电路器件是复杂可编程逻辑器件(cpld)。
[0363]
107.根据条款77-106中任一项所述的集成电路，其中集成电路被编程为根据相位校正的空间数据生成颗粒的图像。
[0364]
108.一种用于流式细胞仪的一个或多于一个荧光检测器的相位校准的组合物，所述组合物包含：
[0365]
多个颗粒；和
[0366]
荧光染料成分，其中所述荧光染料成分具有稳定的荧光寿命。
[0367]
109.根据条款108所述的组合物，其中荧光染料成分包含单一染料。
[0368]
110.根据条款108所述的组合物，其中荧光染料成分包含两种或多于两种染料。
[0369]
111.根据条款108-110中任一项所述的组合物，其中荧光染料成分包含尼罗红染料。
[0370]
112.根据条款108-111中任一项所述的组合物，其中荧光染料成分包含藻红蛋白花青染料。
[0371]
113.根据条款112所述的组合物，其中荧光染料成分包含pe-cy7。
[0372]
114.根据条款108-113中任一项所述的组合物，其中荧光染料成分包含一种或多于一种聚合物染料。
[0373]
115.根据条款114所述的组合物，其中聚合物染料是水溶性共轭聚合物。
[0374]
116.根据条款108-115中任一项所述的组合物，其中荧光染料成分与颗粒稳定结合。
[0375]
117.根据条款116所述的组合物，其中荧光染料成分与颗粒共价键合。
[0376]
118.根据条款108-117中任一项所述的组合物，其中颗粒是多孔的。
[0377]
尽管为了清楚理解的目的已经通过说明和实施例的方式对前述发明进行了一些详细的描述，但是根据本发明的教导，本领域的普通技术人员很容易明白，在不背离所附权利要求的精神或范围的情况下，可以对其进行某些改变和修改。
[0378]
因此，前述仅阐明了本发明的原理。应当理解，本领域技术人员将能够设计出各种布置，这些布置尽管在此没有明确地描述或示出，但体现了本发明的原理并且被包括在其精神和范围内。此外，本文引用的所有实施例和条件语言主要旨在帮助读者理解本发明的原理和发明人为促进本领域贡献的概念，并且应被解释为不限于这些具体引用的实施例和条件。此外，本文中引用本发明的原理、方面和实施方案及其具体实施例的所有陈述旨在涵盖其结构和功能等效物。此外，此类等效物旨在包括当前已知的等效物和未来开发的等效物，即，无论结构如何，开发的执行相同功能的任何元件。此外，本文所公开的任何内容均不旨在献给公众，无论此类公开内容是否在权利要求中明确记载。
[0379]
因此，本发明的范围不旨在限于本文所示和描述的示例性实施方案。相反，本发明的范围和精神由所附权利要求来体现。在权利要求中，35 u.s.c.
§
112(f)或35 u.s.c.
§
112(6)被明确定义为仅当在权利要求中的这种限制的开头引用了确切短语“用于
……
的装置”或确切短语“用于
……
的步骤”时才援引权利要求中的限制；如果在权利要求的限制中没有使用这样的确切短语，则不援引35 u.s.c.
§
112(f)或35 u.s.c.
§
112(6)。