基于印度梨形孢的白及种苗促生长方法与流程

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于印度梨形孢的白及种苗促生长方法。


背景技术：

2.白及(bletilla striata(thunb.)reichb.f.)，别名连及草，甘根，白给，系兰科白及属多年生草本植物，花紫红色或粉红色不仅具有很高的观赏价值，而且是我国传统中药之一，被《中华人民共和国药典》收录其中，主要以干燥块茎入药，种植4～5年可采收。
3.白及干燥块茎主要含有联苄类(bibenzyls)、菲类(phenanthrenes)及其衍生物，具有收敛止血，消肿生肌等功效，在医学临床上外治创伤出血、烫伤和疗疮，内治吐血、肺病、咳血、慢性胃溃疡以及肿瘤等。现代医学证明，白及还具有较强的抗氧化和抗衰老作用，可用于保健、护肤及美容养颜。除此之外，白及可作糊料，制作高级香烟的烟蒂，工业上用于浆丝绸、浆纱或作涂料等原料以及酿酒等，白及多糖胶还可作为天然涂膜保鲜剂应用于果蔬保鲜，并作为天然食品增稠剂用于食品加工。
4.白及用途广泛，但野生资源由于长期的采挖已濒危，2021年9月7日被列入了《国家重点保护野生植物名录》二级保护植物，同时也是“淳六味”和“衢六味”重点培育的品种之一。由于白及野生资源已列入《国家重点保护野生植物名录》二级保护植物，人工栽培种苗依赖采挖野生资源将变得不可能，而传统的分株繁殖系数低、且易导致品种退化，种苗生产只能依赖种子繁殖或组织培养，茎尖组织培养则周期长成本高，因此白及种苗生产大多采用种子无菌繁殖的方式，但在人工栽培中发现白及组培苗存在生产周期长(通常需6个月以上)、种苗长势弱、生长缓慢、对环境敏感以及花小且开花延迟等问题，严重制约了白及种苗产业化和人工栽培的快速发展。本发明针对上述问题，提出一种基于印度梨形孢的白及种苗促生长方法，以解决白及人工栽培种苗生产的问题，推进白及种苗产业健康发展。
5.专利201510921991.1提供了一种快速生产白及种苗的方法，将白及种子与白及菌根真菌进行液体共培养至白及种子萌发，以及将萌发的白及种子进行白及种苗培养，其中，所述白及菌根真菌为蜡壳菌目(sebacinales sp.)菌根真菌菌株yy-51，所述白及菌根真菌于2015年7月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏号为gcmcc no.11104。本发明制作的白及人工种子或种苗，容易保藏和运输，避免了传统组织培养过程中的操作过程复杂、技术要求高、多次继代培养、移栽或定植过程需要大量人力和物力，生产成本低。该专利中虽然只有菌根真菌培养和与白及种子共培养以及人工种子包埋等需要无菌操作，但白及种子的预处理程序复杂提高了种子被污染的风险，且白及种子与白及菌根真菌的液体培养较固体培养更易污染，该专利所述人工种子育苗所述基质上部喷淋浇灌一层体积比为1∶3∶5的椰汁、香蕉汁和番茄汁形成的混合溶液，是育苗基质中杂菌的丰富营养来源，会导致基质中杂菌大量滋生，造成人工种子腐烂或影响种子萌发和生长，此外只描述了人工种子播种育苗盆中3个月后移栽田间的成活率，而未说明此时移栽的苗的规格，苗的大小影响生
长势以及成药的周期。
6.专利201410265619.5提供了一种文心兰的培养方法：(1)采用ms培养基培养文心兰组培小苗；(2)采用固体pda培养基培养印度梨形孢真菌；(3)文心兰与印度梨形孢真菌的共培养；(4)文心兰组培苗的出瓶培养。本发明的培养方法降低了文心兰出瓶苗移栽病害率，提高抗逆性。


技术实现要素：

7.本发明要解决的技术问题是提供一种基于印度梨形孢的白及种苗促生长方法，其能缩短白及组培种苗驯化周期，提早出圃。
8.为解决上述技术问题，本发明提供一种基于印度梨形孢的白及种苗促生长方法，包括如下步骤：
9.(1)将用于白及苗移栽驯化的基质灭菌，得灭菌后育苗基质；
10.将灭菌后育苗基质分装在口径7cm的塑料小方盆中，待用；
11.(2)配制浓度为25～50g
·
l-1
的印度梨形孢菌液，或者配制浓度为1～3
×
108cfu/ml的印度梨形孢孢子液，待用；
12.(3)选用以下任一方式：
13.方法a：将出瓶的白及实生苗洗净根部琼脂，吸干根部表面水分后，用印度梨形孢菌液或印度梨形孢孢子液浸泡24
±
2h(从而让苗根部充分接触到印度梨形孢)，然后取出用清水洗净粘在根部表面的印度梨形孢菌液或印度梨形孢孢子液，再种植在灭菌后的育苗基质中；
14.方法b：将出瓶的白及实生苗洗净根部琼脂，吸干根部表面水分后，直接种植在灭菌后育苗基质中，用配置好的印度梨形孢菌液或印度梨形孢孢子液浇灌，每株浇灌10
±
1ml印度梨形孢孢子液或印度梨形孢孢子液；
15.(4)白及移栽至基质后，种植(按照常规方式浇水、施肥)直至出圃。
16.作为本发明的基于印度梨形孢的白及种苗促生长方法的改进，步骤(2)中：
17.印度梨形孢菌液的制备方法为：
18.印度梨形孢在pdb培养基上培养后所得的菌丝块，加入水(灭菌水)打散配制成浓度为25～50g
·
l-1
的菌液(用高速匀浆机打散)；
19.印度梨形孢孢子液为：
20.将在pda培养基中培养好的印度梨形孢加入生理盐水制成浓度为1～3
×
108cfu/ml孢子液(用细胞计数器计算孢子浓度)。
21.作为本发明的基于印度梨形孢的白及种苗促生长方法的进一步改进：步骤(4)中，白及移栽基质30d后可浇灌肥料，以后每隔15d浇灌一次肥料直至出圃，肥料采用n：p：k＝20：10：20，浇灌浓度为每1克兑2升水，每株每次浇灌肥料体积一样，均为40ml。
22.作为本发明的基于印度梨形孢的白及种苗促生长方法的进一步改进：步骤(1)中，育苗基质灭菌采用121℃高温灭菌60min；或用市面销售的公认的土壤消毒剂棉隆按常规消毒方法操作。
23.在本发明的步骤(4)中：白及移栽基质后，15d内需根据叶片及基质的干湿程度进行叶面喷雾或浇水；待新根长出后，可施肥，以后每间隔一定时间要进行施肥直至出圃，此
为常规技术。
24.一般而言：出瓶白及苗要求假鳞茎达到5mm、株高达到8cm。
25.本发明通过添加印度梨形孢来实现对白及种苗的促生长，移栽驯化120d即可移栽大田。
26.本发明采用添加合适浓度的印度梨形孢，实现了对白及种苗的促生长作用。
27.作为优选：本发明技术方案利用25～50g
·
l-1
印度梨形孢菌液浸泡白及苗24h或用2
×
108个
·
l-1
印度梨形孢孢子液浓度每株浇灌10ml均有利于印度梨形孢与白及苗共生关系的建立，培养120d白及苗鲜重增长倍数及假鳞茎直径增长倍数分别达到3.777
±
0.761～4.353
±
0.112和1.522
±
0.384～1.627
±
0.208，120d地上部平均高度达到21.10
±
0.69～21.15
±
1.66cm以上，假鳞茎平均直径达到15.582
±
1.609～16.348
±
0.790mm，单株平均根数达到12.6
±
0.7～12.8
±
1.8根，参照db53/t 901-2019白及种苗质量分级标准，则达到了白及实生苗出圃苗一级苗的标准(假鳞茎直径≥15mm，株高≥12cm，健壮、根须完整、无霉烂)常规的白及苗驯化周期至少需180d以上。本发明为今后缩短白及种苗生产周期以及提高白及种苗质量奠定了良好的基础。
具体实施方式
28.下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
29.以下实施例中：
30.育苗基质为：lambert peat moss inc公司生产的型号为lm-2的朗博育苗基质。
31.pdb培养基为常规的pdb培养基(包含200g
·
l-1
土豆，蔗糖20g
·
l-1
)，
32.pda培养基为常规的pda培养基(包含200g
·
l-1
土豆，蔗糖20g
·
l-1
，琼脂10g
·
l-1
)，
33.印度梨形孢的菌株例如可采用论文“印度梨形孢诱导小白菜抗病、促生、抗逆的作用及其机理的初步研究”(浙江大学硕士论文，孙超，2010)中的印度梨形孢菌株。
34.培养皿为常规培养皿。
35.实施例1、添加印度梨形孢对白及组培实生苗的促生效果
36.(1)移栽基质的消毒：将育苗基质高温灭菌放凉后(即，121℃下灭菌60min，再冷却至室温)分装在口径7cm小方盆中；作为灭菌后育苗基质，待用；
37.(2)印度梨形孢菌液/孢子液的制备
38.①
、印度梨形孢菌液的制备：
39.将印度梨形孢的菌株在装有pda固体培养基的培养皿中培养，培养条件为温度25
±
2℃、光周期12h
·
d-1
，10～15天；用直径6mm的不锈钢打孔器在pda固体培养基上培养好的印度梨形孢菌落边缘打孔，得到直径6mm的含生长旺盛菌丝的印度梨形孢菌块。
40.在培养容器中装有pdb培养基300ml，添加直径6mm的印度梨形孢菌块3块，置于摇床振荡培养，培养温度27
±
1℃，180rpm，培养15～20d，黑暗培养；菌液经6000rpm离心5min，取离心所得的位于下层的菌丝块，然后按照25～50g/l的料液比，加入灭菌水，用高速匀浆机打散配制成菌液(即，菌液浓度为25～50g/l)；
41.②
、印度梨形孢孢子液的制备
42.将印度梨形孢的菌株在装有pda固体培养基的培养皿中培养，培养条件为温度25
±
2℃、光周期12h
·
d-1
，10～15天。
43.然后在上述pda固体培养皿中培养好的印度梨形孢中加入10～15ml含有0.5％(体积％)吐温的生理盐水，用边缘较薄的药匙刮擦菌落表面，使孢子脱离菌丝；超声分离后20min用纱布过滤去除杂质，用细胞计数板计算孢子浓度，根据需要稀释成所需的浓度。
44.(3)白及苗的准备：将假鳞茎≥5mm、株高≥8cm符合出瓶标准的白及组培实生苗洗净根部琼脂，吸干根部表面水分后，待用；
45.说明：白及组培实生苗的培养方法参照已公开发表的《白及瓶内假鳞茎诱导试验》，所用培养基配方为ms 30g
·
l-1
蔗糖 6-ba 1.0mg
·
l-1
kt 0.5mg
·
l-1
naa0.2rng
·
l-1
琼脂，直至获得能出瓶的白及组培实生苗(假鳞茎≥5mm、株高≥8cm)，其根的数量一般为3～4根。
46.(4)印度梨形孢的添加：
47.方式a(添加方式为浸泡)：
48.将步骤(3)的白及苗根部用步骤(2)制备的印度梨形孢菌液或孢子液浸泡一段时间(约24小时)，然后取出用清水洗净粘在根部表面的印度梨形孢菌液或孢子液，种植在灭菌后育苗基质中；
49.印度梨形孢菌液浓度分别为25、50、100g
·
l-1
；孢子液浓度为2
×
107、2
×
108、2
×
109个
·
l-1
；
50.方式b(添加方式为浇灌)：
51.将步骤(3)的白及苗根部直接种植在灭菌后育苗基质中，用步骤(2)制备的印度梨形孢菌液或孢子液浇灌，每株浇灌10ml印度梨形孢菌液或孢子液；
52.印度梨形孢菌液浓度为50g
·
l-1
，孢子液浓度为2
×
108个
·
l-1
。
53.(5)白及苗的移栽驯化和管理：
54.将步骤(4)所得的已移栽至育苗基质中的白及苗进行如下的常规处理：
55.15d内需根据叶片及基质的干湿程度进行叶面喷雾或浇水；喷雾或浇水可参照已公开发表的《白及源生地萌发特性及组培苗炼苗技术研究》进行；
56.待新根长出后，可施肥，以后每间隔一定时间要进行施肥直至出圃。本步骤中，白及移栽基质30d后可浇灌肥料，以后每隔15d浇灌一次肥料直至出圃，肥料采用n：p：k质量比为20：10：20(质量比)，浇灌浓度为每1克兑2升水，每株浇灌肥料体积一样，均为40ml/次。
57.(6)白及苗移栽120d后，每组处理随机选取15株测定鲜重、假鳞茎直径、地上部高度、根数等指标，分别计算各指标增长倍数。所得结果如下表1。
58.表1
59.[0060][0061]
本发明以培养的白及组培实生苗为材料，通过筛选合适的印度梨形孢添加浓度和方式，以促进白及苗生长。印度梨形孢添加方式a中以菌液添加浓度25～50g
·
l-1
的最为合适，通过该技术方法，白及组培实生苗移栽驯化120d白及苗鲜重增长倍数及假鳞茎直径增长倍数分别达到3.777
±
0.761～4.353
±
0.112和1.522
±
0.384～1.627
±
0.208；印度梨形孢添加方式b中用孢子液浓度2
×
108个
·
l-1
浇灌白及苗，白及苗鲜重增长倍数和假鳞茎直径增长倍数分别达到4.299
±
0.263和1.714
±
0.089，与菌液添加浓度25～50g
·
l-1
促生长效果相当；通过本发明方法培养120d白及苗假鳞茎直径均可达到15mm，植株高度均可达到20cm以上，参照db53/t 901-2019白及种苗质量分级标准，均达到了白及实生苗出圃苗一级苗的标准(假鳞茎直径≥15mm，株高≥12cm，健壮、根须完整、无霉烂)。
[0062]
空白对比例、未添加印度梨形孢白及组培实生苗的生长
[0063]
按实施例1将白及苗用无菌水浸泡24h后移栽至灭过菌的育苗基质中，驯化和管理以及指标测定均按实施例1，所得结果如上表1。
[0064]
白及组培实生苗移栽120d白及苗鲜重增长倍数和假鳞茎直径增长倍数分别为2.351
±
0.157和1.150
±
0.257，此时地上部平均高度为15.88
±
0.53cm，假鳞茎平均直径达到11.800
±
1.022mm，单株平均根数达到8.6
±
0.7根，明显低于添加印度梨形孢的处理组。
[0065]
对比例1、将实施例1的步骤(4)改为如下方式进行印度梨形孢的添加：
[0066]
将步骤(3)的白及苗根部直接种植在灭菌后育苗基质中，在每株白及苗根部距离0.5～1cm处的基质中埋设一个6mm的印度梨形孢菌块；其余等同于实施例1。
[0067]
所得结果显示：在白及苗根部埋设印度梨形孢菌块，植株生长与空白对照相当，无明显促生效果。
[0068]
根据与对比例1对比可得知：在白及苗根部埋设印度梨形孢菌块，一是费时费力，而本发明的菌液浸泡或孢子液浇灌则方便快捷，在生产上方便操作；二是朗博育苗基质的成分和营养组成可能不适合印度梨形孢的生长，菌丝较难接触到白及根部，因此促生效果不明显。
[0069]
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。