一种替格瑞洛中N-亚硝胺类杂质的分离及检测方法与流程

一种替格瑞洛中n-亚硝胺类杂质的分离及检测方法
技术领域
1.本发明属于分析检测技术领域，具体涉及分离并检测替格瑞洛合成过程中n-亚硝胺类杂质的方法。


背景技术：

2.替格瑞洛(ticagrelor)结构如式(i)所示，化学名称：(1s,2s,3r,5s)-3-[7-[[(1r,2s)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基]氨基]-5-丙硫基三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基]-5-(2-羟乙氧基)-1,2-环戊二醇，是由美国阿斯利康(astrazeneca)公司开发的一种新型血小板聚集抑制剂，商品名为倍林达(brilinta)。替格瑞洛为非前体药，无须经肝脏代谢激活即可直接起效，与p2y12 adp受体可逆性结合。临床用于急性冠脉综合征(acs)患者的抗血小板治疗，或用于降低高危冠状动脉疾病(cad)患者初发心脏病或卒中风险。
[0003][0004]
截至目前，对于替格瑞洛合成过程中杂质的检测多集中在起始原料(1r,2s)-rel-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺(sm2)杂质、异构体杂质等。
[0005]
cn105424822b公开了一种hplc法检测替格瑞洛中(1r,2s)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺的方法。
[0006]
cn106841413a公开了采用hplc法对替格瑞洛对映异构体(1s，2s，3r，5s)-3-(7-(((1s，2r)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基氨基)-5-(丙硫基)-3氢-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-5-(2-羟基乙氧基)环戊烷1,2-二醇，以及非对映异构体(1r，2r，3s，5r)-3-(7-(((1s，2r)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基氨基)-5-(丙硫基)-3氢-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-5-(2-羟基乙氧基)环戊烷1,2-二醇、(1s，2s，3r，5s)-3-(7-(((1s，2r)-2-(3,4-二氟苯基)环丙基氨基)-5-(丙硫基)-3氢-[1,2,3]三唑并[4,5-d]嘧啶-3-基)-5-(2-羟基乙氧基)环戊烷1,2-二醇进行分离鉴定的方法。
[0007]
替格瑞洛在形成三氮唑结构过程中引入了亚硝酸钠，从而极大地增加了产生n-亚硝胺类杂质(如ndea、ndma、n-亚硝基哌啶等)的可能性。目前，对于n-亚硝胺类杂质的检测还未纳入替格瑞洛药品的质量控制标准体系，而n-亚硝胺类杂质属于公认的基因毒警示结构，具有很强的遗传毒性及致癌性。因此，对于这类杂质的分离检测对于替格瑞洛药物质量控制至关重要，且对保障替格瑞洛的安全用药也具有重要意义。


技术实现要素：

[0008]
本发明的目的之一在于提供一种替格瑞洛的n-亚硝胺类杂质的分离检测方法，具体为：采用气相色谱-质谱联用(gc-ms)法，对替格瑞洛及其中间体中的n-亚硝胺类杂质进行检测。
[0009]
本发明的优选技术方案中，所述n-亚硝胺类杂质选自n-亚硝基二甲胺(ndma)、n-亚硝基二乙胺(ndea)、n-亚硝基哌啶中的一种或其组合。
[0010]
本发明的优选技术方案中，所述方法包括以下步骤：1)溶液配制；2)采用气相色谱-质谱联用(gc-ms)法进行检测。
[0011]
本发明的优选技术方案中，所述步骤1)的溶液包含对照品溶液和供试品溶液。
[0012]
本发明的优选技术方案中，所述对照品溶液的配制方法为：精密称取n-亚硝胺类杂质适量，采用适宜溶剂溶解后定量稀释，作为对照品溶液。
[0013]
本发明的优选技术方案中，所述对照品溶液的浓度为500-1000ng/ml。
[0014]
本发明的优选技术方案中，所述溶剂选自n-甲基吡咯烷酮、dmso、dmf中的一种或其组合。
[0015]
本发明的优选技术方案中，所述供试品溶液的配制方法为：精密称取替格瑞洛或其中间体样品，精密加入一定量溶剂溶解，密封，作为待测样品溶液。
[0016]
本发明的优选技术方案中，供试品溶液的浓度为50-200mg/ml。
[0017]
本发明的优选技术方案中，所述溶剂选自n-甲基吡咯烷酮、dmso、dmf中的一种或其组合。
[0018]
本发明的优选技术方案中，所述步骤2)的检测条件为：起始温度为35-50℃，维持0.5-2分钟，以每分钟10-30℃的速率升温至150-200℃，维持0-5分钟，以每分钟5-30℃的速率升温至200-300℃，维持1-5分钟；后进样口温度为200-250℃；氦气为载气，流速为每分钟1.0-5.0ml；分流进样，分流比为3-10:1，传输线温度为100-250℃；顶空进样，20ml顶空瓶装样1ml，顶空平衡温度100-150℃，定量环温度150-200℃，传输线温度150-200℃，平衡时间10-20min；采用单级四级杆质谱检测器，温度为100-200℃；离子源为ei源，温度为200-250℃，溶剂为n-甲基吡咯烷酮(nmp)、dmso或dmf；选择离子监测(sim)模式下进行检测，定量、定性离子见表1。
[0019]
表1
[0020]
名称定量离子(m/z)定性离子(m/z)ndma7442、43ndea10244、57n-亚硝基哌啶11442、55
[0021]
本发明的优选技术方案中，色谱柱选自(14％-氰丙基-苯基)-甲基聚硅氧烷(agilentdb-1701,30m
×
0.25mm
×
1.0μm)或聚乙二醇(agilentvf-waxms，30m
×
0.25mm
×
0.25μm)。
[0022]
本发明的另一目的在于提供n-亚硝胺类杂质在替格瑞洛质量控制和/或安全用药中的应用。
[0023]
本发明的优选技术方案中，所述n-亚硝胺类杂质选自n-亚硝基二甲胺(ndma)、n-亚硝基二乙胺(ndea)、n-亚硝基哌啶中的一种或其组合。
[0024]
本发明的另一目的在于提供n-亚硝胺类杂质的分离检测方法在替格瑞洛质量控制和/或安全用药中的应用。
[0025]
本发明的优选技术方案中，所述分离检测方法具体为：采用气相色谱-质谱联用(gc-ms)法，对替格瑞洛及其中间体中的n-亚硝胺类杂质进行检测。
[0026]
本发明的优选技术方案中，所述n-亚硝胺类杂质选自n-亚硝基二甲胺(ndma)、n-亚硝基二乙胺(ndea)、n-亚硝基哌啶中的任一种或其组合。
[0027]
本发明的优选技术方案中，所述方法包括以下步骤：1)溶液配制；2)采用气相色谱-质谱联用(gc-ms)法进行检测。
[0028]
本发明的优选技术方案中，所述步骤1)的溶液包含对照品溶液和供试品溶液。
[0029]
本发明的优选技术方案中，所述对照品溶液的配制方法为：精密称取n-亚硝胺类杂质适量，采用适宜溶剂溶解后定量稀释，作为对照品溶液。
[0030]
本发明的优选技术方案中，所述对照品溶液的浓度为500-1000ng/ml。
[0031]
本发明的优选技术方案中，所述溶剂选自n-甲基吡咯烷酮、dmso、dmf中的一种或其组合。
[0032]
本发明的优选技术方案中，所述待测样品溶液的配制方法为：精密称取替格瑞洛或其中间体样品，精密加入一定量溶剂溶解，密封，作为供试品溶液。
[0033]
本发明的优选技术方案中，待测样品溶液的浓度为50-200mg/ml。
[0034]
本发明的优选技术方案中，所述溶剂选自n-甲基吡咯烷酮、dmso、dmf中的一种或其组合。
[0035]
本发明的优选技术方案中，所述步骤2)的具体检测条件为：起始温度为35-50℃，维持0.5-2分钟，以每分钟10-30℃的速率升温至150-200℃，维持0-5分钟，以每分钟5-30℃的速率升温至200-300℃，维持1-5分钟；后进样口温度为200-250℃；氦气为载气，流速为每分钟1.0-5.0ml；分流进样，分流比为3-10:1，传输线温度为100-250℃；顶空进样，20ml顶空瓶装样1ml，顶空平衡温度100-150℃，定量环温度150-200℃，传输线温度150-200℃，平衡时间10-20min；采用单级四级杆质谱检测器，温度为100-200℃；离子源为ei源，温度为200-250℃，溶剂为n-甲基吡咯烷酮(nmp)或dmso；选择离子监测(sim)模式下进行检测，定量、定性离子见表1。
[0036]
表1
[0037]
名称定量离子(m/z)定性离子(m/z)ndma7442、43ndea10244、57n-亚硝基哌啶11442、55
[0038]
本发明的优选技术方案中，色谱柱选自(14％-氰丙基-苯基)-甲基聚硅氧烷(agilentdb-1701,30m
×
0.25mm
×
1.0μm)或聚乙二醇(agilentvf-waxms，30m
×
0.25mm
×
0.25μm)。
[0039]
除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。
[0040]
与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果：
[0041]
1.本发明首次提出对替格瑞洛及其中间体中的n-亚硝基类基因毒杂质进行分离检测，为有效控制药品质量、保障药品的有效性和安全性，实现药品质量可控提供了有力保障。
[0042]
2.本发明所建立的检测方法专属性强、灵敏度和准确度高，可满足替格瑞洛药品检测的要求，测定结果准确可靠。
附图说明
[0043]
图1实施例1空白溶剂色谱图
[0044]
图2实施例1对照品溶液色谱图
[0045]
图3实施例1供试品溶液色谱图
具体实施方式
[0046]
以下将结合实施例具体说明本发明。本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明的实质。
[0047]
实施例1替格瑞洛药品中n-亚硝基哌啶检测方法的建立
[0048]
采用气相色谱-质谱联用(gc-ms)法对替格瑞洛样品中的n-亚硝基哌啶进行检测，包括如下步骤：
[0049]
1)相关溶液的配制
[0050]
①
对照品溶液的配制：精密称取n-亚硝基哌啶适量，加dmso溶解并定量稀释制成700ng/ml的溶液，密封，作为对照品溶液。
[0051]
②
定量限、检测限测试溶液的配制：精密称取n-亚硝基哌啶适量，用溶剂dmso配制浓度0.2μg/ml的溶液，并逐级稀释。
[0052]
③
线性溶液的配制：精密称取n-亚硝基哌啶适量，用溶剂dmso稀释成系列浓度的溶液，作为线性试验溶液。
[0053]
④
供试品溶液的配制：精密称取替格瑞洛100mg，精密加入1mldmso溶解，密封，作为供试品溶液。
[0054]
⑤
加标供试品溶液的配制：精密称取替格瑞洛100mg，置20ml顶空瓶中，精密加入对照品溶液1ml，密封，作为加标供试品溶液。
[0055]
⑥
耐用性测试溶液的配制：精密称取替格瑞洛100mg，精密加入对照品溶液1ml，密封，作为耐用性测试溶液。
[0056]
2)气相色谱-质谱联用(gc-ms)法检测
[0057]
根据实际需求取上述溶液，分别注入agilent 5977agc-ms仪进行检测。色谱条件为：聚乙二醇(agilentvf-waxms，30m
×
0.25mm
×
0.25μm)为色谱柱；起始温度为45℃，维持1分钟，以每分钟15℃的速率升温至180℃，维持0分钟，以每分钟20℃的速率升温至230℃，维持1分钟；后进样口温度为220℃；氦气为载气，流速为每分钟1.0ml；分流进样，分流比为5:1，传输线温度为230℃；顶空进样，20ml顶空瓶装样1ml，顶空平衡温度130℃，定量环温度180℃，传输线温度185℃，平衡时间15min；采用单级四级杆质谱检测器，温度为150℃；离子源为ei源，温度为230℃，溶剂为dmso；选择离子监测(sim)模式下进行检测，定量离子114
(m/z)，定性离子42、55(m/z)。
[0058]
实施例2替格瑞洛中n-亚硝基哌啶检测方法的方法学验证
[0059]
(1)专属性
[0060]
按实施例1的方法配制空白溶剂(dmso)、对照品溶液和供试品溶液，精密量取对照品溶液和供试品溶液1ml于顶空瓶中，密封，平衡后注入气相-质谱联用仪，进行sim扫描。结果见图1-3。结果表明，溶剂及供试品不干扰n-亚硝基哌啶的测定。
[0061]
(2)检测限与定量限
[0062]
按实施例1的方法配制检测限、定量限溶液，并按实施例1的检测方法进行检测，以n-亚硝基哌啶信噪比约为10:1时的溶液为定量限溶液，以n-亚硝基哌啶信噪比约为3:1时的溶液为检测限溶液，计算其定量限及检测限，结果见表2。
[0063]
表2 n-亚硝基哌啶检测限与定量限测定结果
[0064][0065]
结果表明，本发明的方法用于检测n-亚硝基哌啶的灵敏度高。
[0066]
(3)线性与范围
[0067]
按照实施例1的方法配制线性试验溶液并进行测定，以溶液浓度作为横坐标，峰面积作为纵坐标，进行线性回归考察，结果见表3。
[0068]
表3 n-亚硝基哌啶线性试验结果
[0069][0070][0071]
结果表明，n-亚硝基哌啶溶液在限度浓度的15％-200％范围内，浓度与峰面积呈良好的线性关系。
[0072]
(4)精密度
[0073]
按实施例1的方法配制对照品溶液，连续进样6次，考察峰面积的变化，结果见表4。
[0074]
表4 n-亚硝基哌啶精密度试验结果
[0075]
名称n-亚硝基哌啶峰面积精密度-11590.55精密度-21616.71
精密度-31593.22精密度-41578.36精密度-51559.17精密度-61602.35平均值1590.06rsd％1.2
[0076]
结果表明，n-亚硝基哌啶溶液连续进样6次，测得峰面积值的rsd值均小于10％，本发明的方法进样精密度良好。
[0077]
(5)溶液稳定性
[0078]
按实施例1的方法配制对照品溶液及加标供试品溶液，室温条件下分别于第0、2、4、6、8、10、12、16小时注入gc-ms仪，色谱结果见表5。
[0079]
表5 n-亚硝基哌啶检测溶液稳定性结果
[0080][0081][0082]
结果表明，n-亚硝基哌啶对照品溶液及供试品溶液室温条件下放置16小时，各时间点测得峰面积的rsd值不大于5％，稳定性良好。
[0083]
(6)重复性
[0084]
按实施例1的方法配制对照品溶液、供试品溶液及加标供试品溶液各6份，取上述溶液，平衡后，分别注入gc-ms仪，记录色谱图，并按外标法计算n-亚硝基哌啶含量，结果如表6所示。
[0085]
表6 n-亚硝基哌啶检测方法重复性试验结果
[0086]
名称供试品中n-亚硝基哌啶含量(ppm)加标供试品中n-亚硝基哌啶含量(ppm)重复性-1未检出6.65重复性-2未检出6.66重复性-3未检出6.69重复性-4未检出6.58重复性-5未检出6.80重复性-6未检出6.57平均值/6.7
rsd％/1.2
[0087]
结果表明，6份样品中n-亚硝基哌啶均为未检出，且加标的6份样品中，n-亚硝基哌啶检出量的rsd值均不大于5％，重复性良好。
[0088]
(7)准确度
[0089]
在替格瑞洛中加入杂质对照品溶液适量，使其浓度分别为限度浓度水平的50％、150％，每种浓度溶液各配制3份，100％浓度溶液配制6份，按照实施例1的方法进行测定，计算回收率，结果如表7所示。
[0090]
表7 n-亚硝基哌啶检测方法准确度试验结果
[0091][0092]
结果表明，本发明的方法对含n-亚硝基哌啶不同浓度下的样品测定，准确度较高。
[0093]
(8)耐用性
[0094]
按实施例1的方法配制对照品溶液、耐用性测试溶液。取空白溶剂、对照品溶液、耐用性测试溶液分别平衡后注入gc-ms仪，色谱条件如表8所示，结果如表9所示，按外标法计算n-亚硝基哌啶含量。
[0095]
表8 耐用性试验条件
[0096][0097][0098]
表9 耐用性试验结果
[0099]
色谱条件n-亚硝基哌啶检出量(ppm)拟定条件6.47平衡温度125℃6.62平衡温度135℃6.61流量0.9ml/min6.63流量1.1ml/min6.45进样口210℃6.47
进样口230℃-18.33进样口230℃-27.52
[0100]
实施例3替格瑞洛中n-亚硝基哌啶含量检测
[0101]
按实施例1的方法对6个批次的工艺验证样品进行n-亚硝基哌啶杂质的检测。对照品溶液、供试品溶液的配制方法参见实施例1。将空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液分别平衡后注入gc-ms仪，记录色谱图，并按外标法计算n-亚硝基哌啶含量。结果如表10所示。
[0102]
表10 替格瑞洛药品中n-亚硝基哌啶检测结果
[0103]
样品n-亚硝基哌啶(％)工艺验证样品1未检出工艺验证样品2未检出工艺验证样品3未检出工艺验证样品4未检出工艺验证样品5未检出工艺验证样品6未检出工艺验证样品10.06工艺验证样品20.06工艺验证样品30.07
[0104]
以上所述仅是本发明的实施方式的举例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。