甘草酸二铵及吸入制剂在制备治疗冠状病毒感染性疾病药物中的应用的制作方法

1.本发明涉及药物治疗领域，具体涉及甘草酸二铵及吸入制剂在制备治疗冠状病毒感染性疾病药物中的应用。


背景技术：

2.甘草为豆科植物甘草glycyrrhiza uralensis fisch.、胀果甘草glycyrrhiza inflata bat.或光果甘草glycyrrhiza glabra l.的干燥根和根茎。甘草提取物有抑制流感病毒单股负链rna包膜病毒蛋白的作用。在临床上，甘草酸一般通过静脉滴注给药。口服给药由于其极性较大，脂溶性低，使得生物利用度低，影响了口服制剂药效的发挥。为了增加药物制剂的脂溶性，提高甘草酸类药物的生物利用度，目前在国内主要将甘草酸制成为α-甘草酸二铵盐制剂，以充分发挥药物的生物效应。甘草酸二铵是从中药甘草中高效分离，经差向异构筛选出的α体的甘草酸二铵盐，具有较强的抗氧化、免疫调节、抗炎、保肝、调节内源性类固醇激素水平和保护细胞膜结构等多种生物学功能。有研究表明，甘草酸二铵能够明显提高冠状肺炎患者的临床疗效，降低肝损伤等不良反应，抑制血清清crp、il-4、tnf-α水平，提高cd3 、cd4 、cd8 、cd4 /cd8 ，起到抑制炎性反应及增强免疫力的作用。目前，甘草酸二铵上市的制剂为片剂、胶囊剂及注射剂，主要用于伴有谷丙氨基转移酶升高的急、慢性肝炎的治疗。但对于甘草酸二铵用于治疗人冠状病毒hcov-229e感染引起的疾病，目前还没有这方面的报道，且对于无自主吸入能力的婴幼儿童及主动呼吸困难患者的问题，也没有特效的给药方式。


技术实现要素：

3.鉴于现有技术存在的问题，提出了本发明的甘草酸二铵及吸入制剂在制备治疗冠状病毒感染性疾病药物中的应用，本发明的第一目的是提供一种甘草酸二铵及吸入制剂，用于治疗人冠状病毒hcov-229e感染引起的疾病；本发明的第二目的是提供的甘草酸二铵吸入制剂采用雾化方式给药，适用于无自主吸入能力的婴幼儿童及主动呼吸困难患者。
4.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
5.根据本发明的一个方面，提供甘草酸二铵在制备治疗冠状病毒感染性疾病药物中的应用。
6.优选地，所述冠状病毒感染性疾病为人冠状病毒hcov-229e感染引起的疾病。
7.优选地，所述人冠状病毒hcov-229e感染引起的疾病包括肺炎、肾炎和肝炎。
8.优选地，所述治疗冠状病毒感染性疾病药物是指甘草酸二铵吸入制剂。
9.优选地，所述吸入制剂的人日给药剂量为29.5mg/60kg-490.9mg/60kg。
10.优选地，所述吸入制剂为甘草酸二铵吸入溶液制剂。
11.优选地，所述甘草酸二铵吸入溶液中活性成分的含量为1.8-30mg/ml。
12.优选地，所述甘草酸二铵吸入溶液包含：活性成分甘草酸二铵、氯化钠、ph调节剂
和注射用水。
13.优选地，所述甘草酸二铵含量为1.8-30mg/ml，氯化钠的含量为2.5-8.5mg/ml，ph调节剂用量是使甘草酸二铵溶液的ph值为6-8，优选ph调节剂为1mol/l碳酸钠。
14.需要说明的是，甘草酸二铵吸入溶液的制备方法为，
15.量取处方量70％的注射用水，依次加入处方量的甘草酸二铵、氯化钠，搅拌使溶解，用1mol/l的碳酸钠调节溶液的ph值至6-8，补注射用水至全量，搅拌均匀，过滤，灌装，即得甘草酸二铵吸入溶液。
16.本发明技术方案通过在感染人冠状病毒hcov-229e的小鼠试验中验证甘草酸二铵吸入溶液的新用途，该技术方案具有新颖性，并进行了甘草酸二铵吸入溶液在治疗由hcov-229e病毒感染引起的肺炎的疗效试验，试验结果显示，甘草酸二铵吸入溶液在对感染hcov-229e病毒的肺炎小鼠肺指数及抑制率中表现出了良好的药效，能降低小鼠肺指数。
具体实施方式
17.为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。凡依照本发明内容进行的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
18.试验研究
19.采用人冠状病毒hcov-229e感染小鼠肺炎模型，从肺指数及抑制率方面评价甘草酸二铵吸入溶液对人冠状病毒hcov-229e小鼠肺炎模型的治疗作用。
20.一、实验材料
21.1.1、受试药物为实施例1制备的甘草酸二铵吸入溶液，规格分别为2.25mg/5ml、9mg/5ml、38mg/5ml、150mg/5ml。
22.1.2、实验动物为icr小鼠，分别选自雌雄各52只，级别为spf级，体重为11
±
1g，合格证号分别为no.1100112011035073(雄)，no.1100112011035072(雌)，许可证号为scxk(京)2016-0006，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
23.1.3、病毒毒株为人冠状病毒hcov-229e，由中国医学科学院医药生物技术研究所提供，本实验室传代，-80℃冰箱保存备用。
24.细胞株：小鼠单核巨噬细胞raw264.7，购自北京北纳创联生物技术研究院，本实验室传代，液氮保存备用。
25.1.4、试验试剂为乙醚，批号为20150417，国药集团化学试剂有限公司生产，用于小鼠麻醉。
26.1.5、试验仪器
27.表1：
[0028][0029][0030]
二、实验方法
[0031]
2.1、药物剂量设计
[0032]
甘草酸二铵吸入溶液的日给药量为29.5mg/60kg-490.9mg/60kg，按照小鼠系数11和人体重60kg计算为实施例1中的四种剂量，四种剂量的甘草酸二铵吸入溶液均为透明澄清液体，见表2
[0033]
表2：
[0034][0035]
2.2、病毒传代
[0036]
取已长成单层raw264.7细胞的25cm2培养瓶，弃掉培养液，用细胞维持液冲洗细胞面3遍后，加入细胞维持液5ml，再加入hcov-229e病毒液200μl，置37℃5％co2培养箱中培养72～96h，每日倒置显微镜下观察细胞病变情况，直至80％细胞出现明显病变(cpe)后，将细胞培养瓶置于-80℃低温冰箱冻存，病毒液反复冻融3次后，用于病毒滴度测定。
[0037]
2.3、病毒滴度测定
[0038]
取已长成单层raw264.7细胞的96孔板，弃掉培养液，用细胞维持液冲洗细胞3遍后，按10倍倍比(10-1
～10-8
)稀释接种不同滴度的hcov-229e病毒液，共8个稀释度，100μl/孔，每个稀释度做4个复孔，同时设正常细胞对照。96孔板置37℃、5％co2培养箱中培养72～96h，每日倒置显微镜下观察细胞病变情况，并记录各孔的细胞病变情况。按reed-muench法计算50％细胞病变浓度(tcid
50
)。
[0039]
2.4、小鼠模型的构建及给药
[0040]
icr小鼠104只，按体重随机分为正常对照组，模型对照组，甘草酸二铵2.25mg/5ml组、甘草酸二铵9mg/5ml组、甘草酸二铵38mg/5ml组、甘草酸二铵150mg/5ml组，每组8只，雌雄各半；除正常对照组外，其他各组小鼠乙醚轻度麻醉后，用100tcid50 hcov-229e滴鼻感染，50μl/只，感染当天，各给药组雾化吸入，每次20min，每日1次，1次5ml，连续4天。末次给药后一天称量体重后，解剖取肺并称量肺重，计算肺指数和肺指数抑制率。
[0041]
2.5、小鼠肺指数及抑制率计算
[0042]
小鼠称量体重后解剖取肺组织并称量肺重，计算小鼠肺指数及抑制率，具体计算公式如下：
[0043]
肺指数＝肺湿重(g)
×
100/体重(g)
[0044][0045]
2.6、统计分析
[0046]
数据采用(mean
±
sd)表示，组间差异采用t检验，p《0.05为差异具有统计学意义。
[0047]
三、试验结果
[0048]
3.1、甘草酸二铵吸入溶液对感染hcov-229e病毒的肺炎小鼠肺指数及抑制率的影响
[0049]
表3：
[0050][0051]
注：与正常对照组比较
##
p《0.01；与模型对照组比较
*
p《0.05，
**
p《0.01。
[0052]
由表3结果显示：模型对照组小鼠肺指数显著增加，与正常对照组比较有显著性差异(p《0.01)；受试药物甘草酸二铵吸入溶液进行雾化吸入给药，每次20min，每天1次，1次5ml，连续4天后，对小鼠肺指数均有不同程度降低作用，结果如下：
[0053]
甘草酸二铵吸入溶液：9mg/5ml、38mg/5ml和150mg/5ml三个组小鼠肺指数均可显著降低，与模型对照组比较均有显著性差异(p《0.05，p《0.01)，肺指数抑制率分别为66.32％、65.01％和65.43％。2.25mg/5ml组小鼠肺指数有下降趋势，但与模型对照组比较无显著性差异(p》0.05)，肺指数抑制率为37.28％。因此，甘草酸二铵吸入溶液的给药范围为1.8-30mg/ml。
[0054]
实施例1的处方信息见表4。
[0055]
表4：
[0056][0057]
制备方法：
[0058]
分别量取处方量70％(52.5ml)的注射用水，依次加入处方量的氯化钠、甘草酸二铵，搅拌使溶解，用1mol/l的碳酸钠调节溶液的ph值至7.0，补注射用水至全量75ml，搅拌均匀，过滤，灌装至安瓿中，即分别制得浓度为2.25mg/5ml、9mg/5ml、38mg/5ml、150mg/5ml的甘草酸二铵吸入溶液。
[0059]
对本发明的实施例1制备的甘草酸二铵吸入溶液，进行稳定性测定，高温40℃，10天后测定结果见5。
[0060]
表5：
[0061][0062]
由表5可知，实施例1制备的甘草酸二铵吸入溶液高温放置10天后，性状、ph值及有关物质均无明显变化，即实施例1中制备的甘草酸二铵吸入溶液的稳定性较好。
[0063]
实施例2的处方信息见表6。每支含有5ml，制备60支。
[0064]
表6：
[0065][0066]
制备方法：
[0067]
分别量取处方量70％(210ml)的注射用水，依次加入处方量的氯化钠、甘草酸二铵，搅拌使溶解，用1mol/l的碳酸钠调节溶液的ph值至6.0，补注射用水至全量300ml，搅拌均匀，过滤，灌装至安瓿中，即分别制得浓度为5mg/ml、12mg/ml、20mg/ml、25mg/ml的甘草酸二铵吸入溶液。
[0068]
实施例3的处方信息见表7，每支含有5ml，制备60支。
[0069]
表7：
[0070][0071]
分别量取处方量70％(210ml)的注射用水，依次加入处方量的氯化钠、甘草酸二铵，搅拌使溶解，用1mol/l的碳酸钠调节溶液的ph值至8.0，补注射用水至全量300ml，搅拌均匀，过滤，灌装至安瓿中，即分别制得浓度为10mg/ml、15mg/ml、27mg/ml、30mg/ml的甘草酸二铵吸入溶液。