PANK4作为药物靶点或诊断靶点在制备预防、诊断或治疗白内障药物或试剂中的应用的制作方法

合体指导cas9蛋白在crrna引导序列；
17.靶标的特定位点剪切双链dna；在与crrna引导序列互补的位点，cas9蛋白的hnh 核酸酶结构域剪切互补链而cas9 ruvc-like结构域剪切非互补链在小鼠受精卵；
18.设计sgrna识别序列并构建sgrna，通过cas9和sgrna质粒进行体外转录和纯化； 对雌性小鼠进行卵子超排；将构建的cas9和sgrna质粒进行受精卵的注射和受精卵移植， 通过受孕得到f0代小鼠，该小鼠3号外显子片段gagccaccctatgag移码突变为tcacagctcgcctgcatexon3:-19bp；f0代小鼠繁育，通过pcr鉴定和测序鉴定f1代小鼠。
19.本发明的目的还在于保护如上所述方法构建得到的糖代谢异常型白内障动物模型。
20.本发明的有益效果在于：
21.本发明将泛酸激酶4作为药物靶点或诊断靶点制备预防、诊断或治疗白内障药物或试剂， 通过检测泛酸激酶4的表达水平，从而能够对白内障进行预防或早期干预，降低了白内障的 发生率，对白内障的预防和治疗具有重要临床应用价值。
附图说明
22.图1为实施例1中sirna干扰序列；
23.图2为实施例1中干扰lec细胞内pank4蛋白表达实验检测结果图；其中，a为a 为序列genofftm st-hpank4_001和genofftm st-hpank4_002的干扰效应检测结果，b为序 列genofftm st-hpank4_003的干扰效应检测结果，control为阴性组，nc为空白对照组， pank4-1(30pm)为第一预测序列的30pm浓度组，pank4-1(50)为第一预测序列的50pm 浓度组，pank4-1(100)为第一预测序列的100pm浓度组，pank4-2(30)为第二预测序 列的30pm浓度组，pank4-2(50)为第二预测序列的50pm浓度组，pank4-2(100)为 第二预测序列的100μm浓度组，pank4-3(30)为第三预测序列的30pm浓度组，pank4-3 (50)为第三预测序列的50pm浓度组，pank4-3(100)为第三预测序列的100pm浓度 组，gapdh为内参，下同；
24.图3为实施例1中丙酮酸激酶(pk)活性检测结果图；
25.图4为实施例1中lec细胞增殖情况检测结果图；
26.图5为实施例1中lec细胞细胞的ocr及ecar变化检测结果图，其中，a表示pank4 表达被干扰之后，各组lec糖酵解的相对水平；sirna-pank4与nc组相比，**p《0.01， *p《0.05；
27.b表示pank4表达被干扰之后，lec线粒体压力的相对表达水平；sirna-pank4与nc组相比，**p《0.01，*p《0.05；
28.图6为小鼠晶体表面情况。
具体实施方式
29.所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举 实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述

技术实现要素：
对实施方案进行非本质的改进和调 整，仍属于本发明的保护范围。
30.实施例1
31.干扰lec胞内pank4蛋白表达实验
32.参考ncbi网站进行pank4基因信息的搜索，在“genomic regions,transcripts,
and products”查询录本信息，选择转录较短及同源外显子最多的转录本设计靶点，位于同源区 概率较大。打开invitrogen网站，选择“sirna”，输入gene id:55229，默认编码区；选择 no blast；gc含量默认；默认位设计原则，点击“rnai design”,选择rank星星较多的 靶点为高分值排序。对排序的三条sirna进行ncbi blast比对靶点。对图1三条sirna-pank4 序列交由测序公司进行核酸人工合成；
33.以人眼lecs为基础，利用rna干扰技术，构建pank4的rna干扰片段，western blot 检测rna干扰模型中pank4的表达情况，确定干扰效率最高的rna片段用于后续实验中。 包装pank4过表达慢病毒，转染至晶状体上皮细胞，不同moi值病毒感染细胞确定最佳moi 值用于后续实验。
34.以人眼lecs为基础，分为四组：阴性组，sirna干扰组(1)，sirna干扰组(2)和 sirna干扰组(3)；
35.将lec细胞以1*106个细胞的数量接种于市售dmem 10胎牛血清的12孔细胞培养板 中，待细胞密度达到40-50％之间进行转染；转染之前，试剂配置：sirna稀释，用60μl 1* ribofect
tm cp buffer稀释2.5μl 20μm sirna储存液，轻轻混匀；混合液制备，加入6 μl ribofect
tm cp reagent，轻轻吹打混匀，室温孵育0-15min，制备成转染复合物；将 ribofect
tm cp转染复合物加入到1ml无双抗完全培养基中，轻轻混匀，加至各组细胞培养 孔中，于37℃的co2培养箱中培养24h之后，用于相应实验检测；
36.提取每孔细胞蛋白：每孔加入100ul蛋白裂解液(ripa,1
×
蛋白酶抑制剂，1
×
磷酸酶 抑制剂)，全程冰上操作；细胞被充分裂解之后，4℃，12000rpm，15min，取上清液，经 bca定量之后，分别加入5
×
loadingbuffer，沸水浴10min，利用wb实验方法检测pank4 蛋白的表达；
37.wb实验方法步骤：采用10％sds-page胶(10孔)进行上样电泳，每孔上样量50ng， 电泳条件-80v跑至下层胶，marker条带分开之后，加至120v，溴酚蓝即将跑出下层胶停止 电泳。采用pvdf膜进行电转，条件250ma，90min。电转完之后，利用5％脱脂奶粉进行 封闭1.5h，tbst清洗之后，一抗(pank4,gapdh)4℃孵育过夜，tbst清洗之后，二抗孵育 1.5h，tbst清洗之后，利用ecl化学发光进行显影处理；结果如图2所示。
38.由图2可知，pank4-1 sirna在30-100pm浓度梯度下具有显著抑制pank4蛋白水平 效应，且随sirna浓度的增大而作用增加。pank4-2 sirna在30、50、100pm浓度下都具 有显著的抑制pank4效应。pank4-3 sirna在30-100pm浓度梯度下具有显著抑制pank4 蛋白水平效应，且随sirna浓度的增大而作用增加。由此表明，选择pank4-2作为sirna 干扰工具抑制晶状体上皮细胞具有优势，在较低的浓度下即可对pank4 rna进行干扰。。
39.丙酮酸激酶(pk)活性测定
40.pk活性通过乳酸脱氢酶(ldh)监测丙酮酸依赖性nadh转化为nad 进行测定，具体 为：1μg总蛋白和1
×
丙酮酸激酶反应缓冲液(50毫克tris-hcl，ph值7.5，100mg氯化钾 和5mg mgcl2包含0.5mlpep(sigma-aldrich p0564)，0.6mladp(sigma-aldricha5285),180
ꢀ‑
μmnadh(sigma-aldrich n8129),8单位ldh(sigma-aldrich l1254))，结果如图3所示。
41.由图3可知，干扰pank424小时候可显著抑制晶状体上皮细胞的迁移活动。由此表明， pank4对于维持晶状体上皮细胞emt相关的迁移过程，具有重要作用。
42.通过edu方法对sirna干扰的lec细胞增殖情况进行检测，结果如图4所示。
43.由图4可知，pank表达被干扰后，lec细胞增殖减弱。由此表明，干扰pank4可显著 降低晶状体上皮细胞的增殖。
44.通过seahorse方法对sirna干扰的lec细胞的ocr及ecar变化情况，具体步骤如下：
45.(1)lec细胞接种于seahorse96孔细胞培养板中(其中培养板四角的校准孔勿接种细 胞)，进行sirna干扰之后，细胞长至90％以上进行ocr及ecar检测；
46.细胞胞外酸化率(ecar)，通过依次加入glucose，oligomycin，2-dg反映细胞糖酵解 功能的参数，包括glycolysis，glycolytic capacity，glycolytic reserve和non-glycolytic acidification；
47.氧气消耗速率(ocr)，通过依次加入线粒体电子传递链(etc)的靶向药物(oligomycin， fccp，rotenone/antimycina)检测反映线粒体功能的参数，包括basal respiration，atp-linked respiration，proton leak，maximal respiration，spare respiratory capacity，non-mitochondrial oxygen consumption；
48.检测上机实验前一天，检测仪器需要提前开启预热至少5小时；
49.(2)取出探针板底部的水化板，每孔加入200ul水化液，再重新放入探针板，置于37℃ 无co2的细胞培养箱中孵育过；
50.(3)ocr检测上机当天，按照说明书配制seahorse检测液，97ml seahorse基础培养基 1ml 1.0m葡萄糖 1ml 100mm丙酮酸溶液 1ml 200mm谷氨酰胺溶液，确保ph值＝7.4， 并使其温度处于37℃，使用0.22um滤器过滤培养基，放置于无co2，37℃环境备用；
51.(4)取出细胞培养板，确保细胞无污染，状态良好，分布均匀用于检测，使用配制的 seahorse检测液进行清洗细胞3次之后，加入180ul/孔检测液，并放入无co2，37℃细胞培 养箱中60min等待上机检测；
52.(5)oligomycin，fccp，rotenone/antimycina药物制备按照说明书进行，其中oligomycin 浓度是1.5um，rotenone/antimycina是0.5um，而fccp经过前期优化之后，适合lec的最 佳浓度是2.0um，配制好之后依次按照要求加入探针板加药孔中，然后上机检测；
53.(6)上机检测，先进行校准后取出水化板，再加入细胞培养板，最后检测完成之后通过 bca方法检测每孔蛋白量对每孔细胞数量进行定量；
54.(7)而ecar检测过程中，seahorse检测液为seahorse基础培养基 1mm谷氨酰胺，剩 余步骤同ocr检测步骤；
55.结果如图5所示。
56.由图5可知，pank表达被干扰后，lec的ocr及ecar均升高。由此表明，干扰pank4 的表达，可显著降低晶状体上皮细胞的氧化磷酸化进程，而促进其向糖酵解转化，糖酵解率， 糖酵解保存量，糖酵解容量都显著增加，其非线粒体的氧消耗量、质子渗漏及基线氧化呼吸 水平都不同程度显著增加，提示干预pank4可使晶状体上皮细胞产能方式由氧化磷酸化转 变为糖酵解方向。
57.通过shpank4干扰病毒注射入小鼠眼前房，使晶体上皮细胞降低pank4表达水平，作 为对照组。tgfbeta2为模型组，通过前房注射tgfbeta2，一种晶体上皮细胞emt的诱导剂， 使晶体上皮发生emt间质转化，表现为小鼠晶体表面混浊，结果如图6所示。
58.由图6可知，通过shpank注射前房，能够降低晶状体上皮的pank4水平，可降低由 于tgfbeta2诱发的晶状体上皮emt引起的混浊，是为shpank4对晶状体上皮的保护作用。
59.此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一 个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明 书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解 的其他实施方式。