一种水体中二甲双胍的测定方法与流程

1.本发明涉及分析化学领域，尤其涉及一种水体中二甲双胍的测定方法。


背景技术：

2.二甲双胍(met)因疗效好，价格低，无毒副作用等优点成为了治疗糖尿病的一线药物。但值得注意的是，二甲双胍被摄入后并不能被人体代谢，几乎100％未经修饰地随着尿液和粪便排出体外，经污水设施处理后，最终进入地表水中，且已在不同的环境介质中检测到。研究证明“神药”二甲双胍可通过内分泌干扰食物链，对水生生物构成潜在威胁。因此，近些年它被认定为一种新产生的环境微污染物。另一方面，基于目前全世界范围内激增的糖尿病人数和不断增加的二甲双胍使用量，以及它在地表水中的广泛分布，自来水厂的消毒处理过程中可能会发生二甲双胍和次氯酸的化学反应从而增加二次污染。
3.二甲双胍是一种极易溶于水的化合物，现有方法对固体或非(弱)极性溶剂作为载体的制品中二甲双胍的测定有稳定的回收率，但对水这种极性溶剂中的二甲双胍的测定比较困难，主要在于其水溶性极好，难以通过萃取、浓缩等手段富集，导致回收率低下，灵敏度不高。
4.现有研究中，文献(julia mart
í
n,etc.high-performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry method for the analysis of antidiabetic drugs in aqueous environmental samples journal of chromatography,b.analytical technologies in the biomedical and life sciences,2012,895/896,94-101)研究了水环境中二甲双胍的分析方法，然而该方法的二甲双胍回收率低(16％～54％)，灵敏度低(定量限为8.2ng/l～32ng/l)。
5.因此，研究一种回收率高，能满足水体中二甲双胍定量分析的测定方法具有重要的意义。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于克服现有技术中水体中二甲双胍的回收率低且灵敏度低的问题，提供一种水体中二甲双胍的测定方法，该方法过程简便、易于操作，回收率高和灵敏度高，适合于批量水体样本中二甲双胍的定量分析。
7.为实现以上发明目的，本发明采用如下技术方案：
8.一种水体中二甲双胍的测定方法，包括如下步骤：
9.s1.含二甲双胍水体样品与碱溶液混合得到碱性水体样品，将碱性水体样品过活化后的hlb固相萃取柱；
10.s2.用甲酸甲醇溶液对hlb固相萃取柱进行洗脱，收集洗脱液，吹干，并溶解成待测溶液；
11.s3.采用外标法，运用lcmsms技术对待测溶液进行分析，通过计算后得出水体中二甲双胍的含量。
12.研究发现，除固相萃取柱的类型及洗脱剂的选取是影响二甲双胍回收率的重要因素，水体样品的ph也起到关键作用。当将含二甲双胍水体样品的ph调节成碱性，并选用hlb固相萃取柱进行固相萃取时，可增强固相萃取柱对二甲双胍较高效率吸附作用，进而提高后续二甲双胍的回收率；然后，以甲酸甲醇溶液为洗脱剂时，洗脱效率高，二甲双胍的回收率进一步提高。而如果选用的固相萃取剂不当，例如选取pax固相萃取柱或pcx固相萃取柱，二甲双胍的回收效率差，回收率为0；如果洗脱剂选用不当，例如选用中性或碱性的甲醇溶液时，洗脱二甲双胍的效率低，回收率低。
13.采用本发明的测定方法，当样品的加标浓度为0.005ng/ml、0.010ng/ml和0.100ng/ml时，二甲双胍平均回收率为85.1％～106.0％，测试结果的相对标准偏差为1.35％～8.61％(n＝6)，表明该方法测定二甲双胍的回收率高、重复性好。此外，该方法的测定二甲双胍的检出限为0.0010ng/ml，定量限为0.0032ng/ml，表明该方法的灵敏度高。该方法的过程简便、易于操作，适合于批量水体样本中二甲双胍的定量分析。
14.优选地，所述含二甲双胍水体样品与碱溶液的用量体积比为(5～10):1。
15.优选地，所述碱溶液的ph为8～14。
16.优选地，所述碱溶液为氨水或氢氧化钠水溶液的一种或两种。
17.优选地，所述碱性水体样品的ph为8～13。
18.更为优选地，所述碱性水体样品的ph为11。
19.优选地，所述hlb固相萃取柱的活化过程为：采用甲醇和水依次活化。
20.优选地，所述hlb固相萃取柱的填料质量为200mg～500mg，填料上方的空间体积为3ml～6ml。
21.更为优选地，hlb固相萃取柱的填料质量为200mg，填料上方的空间体积为6ml。
22.优选地，所述碱性水体样品过hlb固相萃取柱的流速为1～6ml/min。
23.优选地，所述甲酸甲醇溶液的甲酸质量浓度为0.5％～3％。
24.更为优选地，所述甲酸甲醇溶液的甲酸质量浓度为2％。
25.优选地，所述甲酸甲醇溶液的用量为8ml以上。
26.更为优选地，所述甲酸甲醇溶液的用量为10ml。
27.优选地，所述吹干的方式为氮气吹干。
28.优选地，所述lcmsms技术的液相色谱条件为：
29.流动相：流动相a为0.1％甲酸水溶液、流动相b为乙腈；
30.梯度洗脱条件为：0min
→
1.00min
→
4.00min
→
5.50min
→
5.51min
→
8.00min，流动相a：85％
→
85％
→
20％
→
20％
→
85％
→
85％；
31.色谱柱：c18 100mm*2.1mm*1.7μm；柱温：40℃；进样体积：5μl；流速：0.3ml/min。
32.具体地，取24h内水体样品25ml，与氨水混合后得到ph为11的碱性水体样品。采用甲醇、水依次活化hlb固相萃取柱，保持柱体湿润。将制备好的碱性水体样品转移到贮液器中，以约1ml/min的流速过hlb固相萃取柱，待样液完全流出后，用10ml质量浓度为2％甲酸甲醇溶液洗脱于离心管中。洗脱液于50℃水浴中，氮气吹干，用甲醇定容得待测溶液。待测溶液过0.22μm滤膜，采用外标法，运用lcmsms技术对待测溶液进行分析，通过计算后得出水体中二甲双胍的含量。
33.与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
34.采用本发明的测定方法，当样品的加标浓度为0.005ng/ml、0.010ng/ml和0.100ng/ml时，二甲双胍平均回收率为85.1％～106.0％，测试结果的相对标准偏差为1.35％～8.61％(n＝6)，表明该方法测定二甲双胍的回收率高、重复性好。此外，该方法的测定二甲双胍的检出限为0.0010ng/ml，定量限为0.0032ng/ml，表明该方法的灵敏度高。该方法的过程简便、易于操作，适合于批量水体样本中二甲双胍的定量分析。
附图说明
35.图1为盐酸二甲双胍的标准溶液曲线图。
36.图2为二甲双胍典型的质谱图。
具体实施方式
37.下面结合实施例对本发明做进一步的描述。这些实施例仅是对本发明的典型描述，但本发明不限于此。下述实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法，所使用的原料，试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市购等商业途径得到的原料和试剂。
38.实施例1
39.本实施例提供一种水体中二甲双胍的测定方法。
40.1、仪器分析
41.1.1分析仪器：液相色谱串联质谱(waters)；
42.1.2分析参数：
43.1.2.1液相色谱条件：
44.流动相：流动相a为0.1％甲酸水溶液、流动相b为乙腈；
45.梯度洗脱条件为：0min
→
1.00min
→
4.00min
→
5.50min
→
5.51min
→
8.00min，流动相a：85％
→
85％
→
20％
→
20％
→
85％
→
85％；
46.色谱柱：c18 100mm*2.1mm*1.7μm；柱温：40℃；进样体积：5μl；流速：0.3ml/min。
47.1.2.2质谱参考条件：电离方式：正离子模式；扫描模式：多反应监测；分辨率：单位分辨率；母离子：130.4；定性离子：71；定量离子：60。
48.2、标准样品的配制
49.标准样品：盐酸二甲双胍(cas号1115-70-4，纯度98％，固体)，市售有证标准物质，加拿大(上海安谱分装)，批次号：1-mjs-112-1。
50.用甲醇稀释标准样品定容至刻度，配制成10mg/l标准储备溶液，稀释标准储备液，再用甲醇稀释定容，得到浓度分别为0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0ng/ml的系列浓度工作标准溶液，上机测定，得标准曲线，见图1。
51.数据表明，在0.2～20.0ng/ml浓度范围内，二甲双胍有良好的线性，相关系数r2＝0.999652，满足定量分析要求。典型标准谱图(5ng/ml)见图2。
52.3、样品处理
53.取新鲜(24h内)河流地表水25ml，与氨水溶液混合后得到ph为11的碱性水体样品。采用甲醇、水依次活化hlb固相萃取柱，保持柱体湿润。将碱性水体样品转移到贮液器中，以约1ml/min的流速全部过hlb固相萃取小柱，待样液完全流出后，用2％甲酸甲醇溶液洗脱于10ml离心管中。洗脱液于50℃水浴中，氮气吹干，用甲醇定容至0.25ml得待测溶液。待测溶
液过0.22μm滤膜，供液相色谱串联质谱分析。
54.4、测定分析
55.待测溶液上机测定，通过计算后得出水体中二甲双胍的含量为86ng/l。
56.实施例2样品富集净化条件
57.本实施例从固相萃取柱、水样的ph、洗脱剂及洗脱剂用量四个方面考察了水体中二甲双胍的回收率。
58.(1)固相萃取柱的选择
59.固相萃取柱是净化过程中极其重要的实验条件，为了探讨不同类型的固相萃取柱对回收率的影响，选择了5种不同固相萃取柱进行效果对比。取空白水体样品100ml，加入100μl浓度为1μg/ml的二甲双胍标准溶液，选取不同填料和不同型号的固相萃取柱，计算回收率。结果显示，200mg/3ml的pax和60mg/3ml的pcx回收效率最差，回收率为零，hlb固相萃取柱有一定回收效率，故筛选使用hlb固相萃取柱对水样进行净化。不同萃取柱对二甲双胍的萃取效果见表1。
60.表1不同固相萃取柱的萃取效率
61.固相萃取柱名称固相萃取柱规格洗脱剂回收率pax20mg
×
3ml甲醇0％pcx60mg
×
3ml甲醇0％c1860mg
×
3ml甲醇2％hlb200mg
×
6ml甲醇10％hlb500mg
×
6ml甲醇17％
62.(2)水样的ph选择
63.hlb固相萃取柱对水体中的二甲双胍有一定的吸附，但其水溶性极好，未作处理时，效率总体低下，不能满足分析方法灵敏度和准确度要求。为了确保选取良好的前处理条件，考察不同ph情况下的回收率。取加标后的空白水体样品6份，并分别编号1、2、3、4、5和6，再分别将其ph调节成6、7、8、9、11和13，然后经hlb固相萃取柱吸附，用甲醇溶液洗脱，计算二甲双胍的回收率。试验结果如表2所示。
64.表2水样的ph对二甲双胍回收率的影响
[0065][0066]
实验数据表明，与酸性、中性的水体样品相比，碱性水体样品中的二甲双胍的回收率显著提高。适当调高水体样品的ph时，有助于水中二甲双胍回收率的进一步提高，当水体样品的ph为11时，再调高，会导致回收率降低，其原因可能是碱性较强时，抑制了固相萃取柱的吸附作用。
[0067]
(3)洗脱剂的选择
[0068]
根据水样的ph选择的实验结果，将加标后的空白水样的ph调节成11，再经hlb固相萃取柱吸附，然后分别用甲醇、5％氨化甲醇、0.5％甲酸化甲醇、1％甲酸化甲醇、2％甲酸化甲醇、3％甲酸化甲醇洗脱，考察洗脱效率。试验结果见表3。
[0069]
表3不同溶剂的洗脱效果
[0070][0071]
实验数据表明，采用碱性或中性的甲醇溶液进行洗脱，回收率较低，而采用甲酸化甲醇则有较好的洗脱效果，低浓度时，增加甲酸浓度有助于进一步提高洗脱效率。当甲酸浓度达到2％以上时，再增加甲酸浓度对洗脱效率提高不明显。
[0072]
(4)洗脱剂体积的选择
[0073]
将加标后的空白水样的ph调节成11，再经hlb固相萃取柱吸附，然后用2％甲酸化甲醇洗脱，考察不同洗脱剂体积对洗脱效率的影响。实验结果表明，洗脱剂用量的增加有利于提高洗脱效率。当洗脱剂用量达到10ml时，再增加洗脱剂用量，对洗脱效率影响不明显，反而增加了后面氮吹浓缩的时间。试验结果见表4。
[0074]
表4不同洗脱剂体积的洗脱效果
[0075][0076]
综上所述，水样中二甲双胍的富集净化方法确定为：将含二甲双胍水体样品调节成ph为11的碱性水体样品，选取hlb(200mg
×
6ml)作为固相萃取柱，用2％甲酸化甲醇10ml洗脱。
[0077]
实施例3方法学验证
[0078]
(1)空白及空白加标实验
[0079]
取生活饮用水进行空白实验及空白加标实验。按照实施例1的方法进行处理和仪器分析，考察了添加浓度为0.005ng/ml时的回收率。空白实验均未检出二甲双胍，说明实验过程未引入的目标污染物，实验空白符合分析要求。试验结果见表5。
[0080]
表5空白加标实验精密度及回收率
[0081][0082]
数据表明，添加水平为0.005ng/ml时，相对标准偏差rsd为8.61％，回收率在76.4～94.8％之间。
[0083]
(2)样品回收率与重复性实验
[0084]
取地表水空白样品加标，按照实施例1的方法进行处理和仪器分析，考察0.005ng/ml、0.010ng/ml、0.100ng/ml三个浓度水平回收率与重复性，重复6次平行实验。结果见表6。
[0085]
表6二甲双胍回收率与重复性试验结果表
[0086][0087]
实验结果表明，样品加标浓度为0.005ng/ml时，二甲双胍平均回收率为85.1％，6次结果相对标准偏差为8.61％；样品加标浓度为0.010ng/ml时，二甲双胍平均回收率为106.0％，6次结果相对标准偏差为2.27％；样品加标浓度为0.100ng/ml时，二甲双胍平均回收率为99.4％，6次结果相对标准偏差分别1.35％。不同浓度均有有较好的回收率和重复性。
[0088]
(3)方法检出限
[0089]
制作并检测10个低浓度样品，依据试验结果，得出标准偏差(sd)，并以d.l＝3*sd，
mdl＝10d.l*sd，确定二甲双胍的检出限和定量限。结果见表7。
[0090]
表7二甲双胍检出限和定量限试验结果
[0091][0092][0093]
当取水样25ml，加入氨水，hlb固相萃取柱吸附，甲酸化甲醇溶液洗脱，甲醇定容至0.25ml时，二甲双胍的测出检出限为：0.0010ng/ml，定量限为0.0032ng/ml。
[0094]
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改,这并不影响本发明的实质内容。