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ARL16蛋白激动剂在低氧下精子鞭毛多发形态异常中的应用的制作方法

2022-02-23 00:14:06 来源:中国专利 TAG:

arl16蛋白激动剂在低氧下精子鞭毛多发形态异常中的应用
技术领域
1.本发明涉及dna重组技术领域,尤其涉及arl16蛋白激动剂在低氧下精子鞭毛多发形态异常中的应用。


背景技术:

2.我国拥有世界上面积最大、海拔最高、居住人口最多的高原,高原地区不仅自然资源丰富,也是我国社会经济发展的重要地区和戍守边疆的前沿阵地。高原低氧(低张性缺氧)环境对男性生殖功能有显著负面影响,大量关于人类、羊驼、大鼠与小鼠精子(elongating spermatid/spermatozoa,也称为长形精子)鞭毛多形态异常现象已有报道(liu x.etc.biochem biophys res commun,2020)。由高原低氧引起的精子鞭毛多形态异常继而造成精子前向运动能力降低严重威胁着高原男性人群生殖健康,其直接后果是畸形精子症、弱畸形精子症,严重者可导致男性不育;畸形精子症的不育患者大多存在精子的表观遗传失稳,比如h3k9me3组蛋白甲基化丰度下降及富含组蛋白甲基化的基因启动子减少等(wang,s.y.etc.nat commun,2016)。因此深入研究高原低氧下精子鞭毛多发形态异常(hypoxic multiple morphological abnormalities of the sperm flagella,hmmaf)中的表观遗传机制,探索有效控制低氧下精子鞭毛多形态异常发生的策略,对于设计高原男性生殖防治措施具有十分重要的意义,对于我国高原地区的经济和国防建设也有重大意义。
3.hmmaf是男性不育的常见表现之一,药物治疗效果不佳,部分患者需要实施辅助生殖技术达到生育目的,其特征是精子鞭毛表型异常(如无鞭毛、短鞭毛、卷曲鞭毛、弯曲鞭毛和/或不规则鞭毛口径等),从而导致精子活动能力严重受损。研究提示精子鞭毛多发形态异常(mmaf)多为鞭毛超微结构异常,其病因多数与基因变异密切相关。由于人类精子结构复杂,精子鞭毛中存在1000种以上的蛋白,研究认为mmaf可能包含多种不同的超微结构病变,存在不同的病因和致病基因,mmaf精子形态学差异可能源于不同的遗传学缺陷。目前已鉴定出20余种导致mmaf和不育的突变基因,主要包括:激酶a锚固蛋白(akap)家族基因、动力蛋白轴丝重链基因(dnah)家族基因、cfap家族基因、ttc家族基因、fsip2基因、cep135基因、spef2基因、qrich2基因、ak7基因、armc2基因等。但对于低氧下导致的精子鞭毛多形态异常患者的遗传病因尚不明确。因此,对于hmmaf的遗传学病因和致病机理并不明确,仍需进一步探索。
4.arl16蛋白(adp-ribosylation factor-like 16)属于ras gtpase超家族成员,目前研究认为arl16蛋白以gtp依赖性的方式来抑制rig-i介导的抗病毒固有免疫信号通路。但关于arl16蛋白的其他功能和作用机制尚未见报道。


技术实现要素:

5.针对现有技术中所存在的不足,本发明提供了一种arl16蛋白激动剂在低氧下精子鞭毛多发形态异常中的应用,其解决了现有技术中hmmaf药物治疗效果不佳,hmmaf的遗
传学病因和致病机理不明确的问题。
6.本发明一方面,提供arl16蛋白激动剂在制备药物中的应用,所述药物的功能为如下中的至少一种:
7.1)预防低氧下精子鞭毛多发形态异常;2)治疗低氧下精子鞭毛多发形态异常;3)提高精子运动能力。
8.进一步地,所述arl16蛋白激动剂包括增强arl16蛋白的活性或表达的制剂,其中,所述arl16蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示。
9.进一步地,所述制剂包括小分子化合物、核酸分子、包含所述核酸分子的表达载体中的任一种。
10.优选地,所述核酸分子所述核酸分子为以arl16蛋白的编码基因为靶序列、通过pcr扩增得到的产物;
11.所述pcr扩增用到的引物如seq id no.2-3所示。
12.优选地,所述表达载体为重组腺病毒载体。
13.进一步地,所述arl16蛋白激动剂通过促进arl16蛋白与dynactin2竞争结合dynein2,来促进精子鞭毛内逆向转运。
14.本发明另一方面,提供一种arl16蛋白激动剂,所述arl16蛋白激动剂为能增强arl16蛋白的活性或表达的重组腺病毒颗粒。
15.进一步地,所述重组腺病毒颗粒的制备方法为:构建arl16过表达的重组腺病毒载体,经包装得到重组腺病毒颗粒。
16.优选地,所述重组腺病毒载体为adeasy016-padeasy-cmv-marl16-6xhis-cmv-egfp。
17.本发明再一方面,提供一种试剂在制备试剂盒中的应用,所述试剂用于定量检测arl16蛋白的表达水平,所述试剂盒用于诊断低氧下精子鞭毛多发形态异常。
18.相比于现有技术,本发明具有如下有益效果:
19.本发明首次发现并鉴定了arl16蛋白在低氧下精子鞭毛多发形态异常中的作用,并对其机制进行了研究,发现该蛋白通过与dynactin2竞争结合dynein2,以促进精子鞭毛内逆向转运,避免了dynactin2运载的货物在鞭毛尾段聚集,从而保持了精子鞭毛的正常形态。本发明通过对低氧下精子鞭毛多发形态异常小鼠精子的arl16基因的过表达,发现其精子的形态异常和运动能力得到改善,由此推测,arl16基因在低氧下精子鞭毛多发形态异常中起着重要作用,从而为低氧下精子鞭毛多发形态异常提供了新的治疗途径。
附图说明
20.图1为本发明实施例1中western blot检测附睾尾精子中arl16表达效果图;
21.图2为本发明实施例2中adeasy016-padeasy-cmv-marl16-6xhis-cmv-egfp的载体图谱;
22.图3为本发明实施例4中小鼠精子细胞中gfp荧光效果图;其中,488nm通道表示arl16表达质粒,555nm通道表示arl16染色;
23.图4为本发明实施例4中小鼠精子细胞中arl16表达的western blot效果图;
24.图5为本发明实施例5中巴氏染色观察的精子畸形图;
25.图6为本发明实施例5中透射电镜观察精子中鞭毛中心体结构图;
26.图7为本发明实施例6中if检测精子中dynein2和dynactin2定位,其中,7a为dynein2定位,7b为dynactin2定位;
27.图8为本发明实施例6中co-ip检测精子中dynactin2分别与dynein2与arl16关联效果图;
28.图9为本发明实施例6中if检测转染adv-arl16的小鼠精子中dynein2和dynactin2定位。
具体实施方式
29.下面结合附图及实施例对本发明中的技术方案进一步说明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料,如无特殊说明,均可购买得到的。以下实施例中的定量试验,均设置三次重复实验,结果取平均值。
30.主要实验试剂:
[0031][0032][0033]
实施例1低氧下小鼠精子中arl16的变化
[0034]
1、制备小鼠低氧hmmaf模型:将小鼠置于模拟海拔5800m高原低压氧舱内(压力:约360mmhg,氧含量10%),连续低压低氧处理10w来复制小鼠低氧hmmaf模型。经鉴定低氧hmmaf模型复制成功。并设置21%氧浓度暴露10周组小鼠为对照组。
[0035]
2、精子采集:打开腹腔,取出附睾组织,摘取双侧附睾尾进行液化与裂解后,得到精子。western blot检测附睾尾精子中arl16的表达。具体方法如下:
[0036]
(1)蛋白准备
[0037]
1)用37℃温浴的pbs漂洗待处理的细胞,加入预冷的裂解液(现加pmsf,使终浓度为1mm),在冰上用细胞刮刮下贴壁细胞,转入冰上静置裂解20min;
[0038]
2)4℃低温10000g离心5min;
[0039]
3)吸取上清进行蛋白定量。
[0040]
(2)制胶
[0041]
1)配制10%分离胶,上层用ddh2o密封,静置约60min;
[0042]
2)弃掉上层水并用滤纸吸干,配制5%的积层胶,装配好梳子,静置凝固约40min;sds-page分离胶与积层胶配置体系如表1所示:
[0043]
表1 sds-page分离胶与积层胶配置体系
[0044][0045]
3)每孔加入约5μl蛋白样品,每板胶的两侧的泳道各加蛋白分子量marker 3μl,其余泳道加入相同体积的1
×
上样缓冲液,补足电泳缓冲液,60v恒压预电泳,等样品进入分离胶后换成90v恒压电泳,待溴酚蓝染料电泳至底部时结束电泳。
[0046]
(3)转模
[0047]
取出凝胶,根据凝胶大小剪切大小一致的pvdf膜,将pvdf膜、滤纸放置电泳缓冲液中平衡20min,按照负极-海绵垫-滤纸-凝胶-pvdf膜-滤纸-海绵垫顺序制备三明治夹心,100v稳压转印1h。
[0048]
(4)封闭
[0049]
取出pvdf膜,将膜浸入5%bsa中孵育1h。
[0050]
(5)一抗孵育
[0051]
用一抗稀释液分别配制一抗工作液(arl16为1:1000,21kda,#39855,sab;gapdh为1:1000,38kda,ab77109,abcam),将pvdf膜浸入装有一抗工作液的抗体孵育盒中,4℃过夜。取出pvdf膜,用1
×
tbst洗膜3次,10min/次。
[0052]
(6)二抗孵育
[0053]
加入辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,hrp)标记的二抗工作液(1:1000),室温孵育1h,1
×
tbst洗膜3次,10min/次。
[0054]
(7)beyoecl plus显色
[0055]
等体积混合适量beyoecl plusa液和b液(碧云天),均匀滴加到pvdf膜上,室温避光作用1min后放置凝胶成像分析仪显色观察,拍照保存。结果如图1所示。
[0056]
由结果可知,与21%氧浓度暴露10周组小鼠精子相较,10%氧浓度暴露10周组小鼠精子arl16蛋白表达降低。
[0057]
实施例2过表达arl16载体构建
[0058]
1、引物设计
[0059]
小鼠arl16基因所在基因组序列是genbank accession no.nm_197995.2(update date 2020-03-25),根据该基因组序列设计引物,所用引物序列如下:
[0060]
正向引物(seq id no.2):5'-ctgatgcgcggaagaac-3'
[0061]
反向引物(seq id no.3):5'-ttgccccacatccca-3'
[0062]
2、pcr扩增目的片段
[0063]
提取小鼠基因组dna,配制表2所示的pcr扩增体系,轻轻混匀,置于pcr仪中,按表3
所示的pcr程序进行反应;
[0064]
表2 pcr扩增体系
[0065][0066]
表3 pcr程序
[0067][0068]
3、arl16基因片段与载体连接
[0069]
(1)padeasy腺病毒表达载体(购自吉凯基因)酶切
[0070]
根据表4中顺序依次加入试剂,混匀,置于37℃水浴锅中反应1-2h;酶切结束之后进行琼脂糖凝胶电泳,回收酶切片段;
[0071]
表4酶切反应体系
[0072]
[0073]
(2)配制表5中的反应体系,采用hb infusiontm一步克隆连接体系在50℃反应30min。
[0074]
表5连接反应体系
[0075][0076]
本步骤最终得到arl16的过表达载体。
[0077]
4、转化
[0078]
(1)将dh5α感受态细胞从-80℃冰箱取出,置于冰上融化;
[0079]
(2)待感受态融化后,以每管50μl的体积分装,加5μl过表达载体,冰上放置20-30min;
[0080]
(3)42℃热激90s,热激完之后冰育2-3min;
[0081]
(4)加入500μllb培养基(无抗);
[0082]
(5)37℃、230rpm震荡培养45-60min;
[0083]
(6)将菌液涂到ampicillin抗性的lb平板上,涂布均匀,倒置,37℃恒温箱培养12-16h。
[0084]
挑取若干单克隆菌落,接种于ampicillin抗性的培养液中,37℃恒温摇床培养过夜。然后用小量质粒提取试剂盒(invitrogen)提取质粒进行测序,测序结果与目的序列一致,目的质粒构建成功。
[0085]
5、腺病毒载体重组
[0086]
(1)将构建好的过表达载体,选择酶切位点blpi与ecorv,进行线性化,并进行琼脂糖胶回收;
[0087]
(2)使用制备好的含有腺病毒骨架质粒padeasy-1的e.coli bj5183感受态细胞(beyotime),将回收好的线性化穿梭质粒进行转化,进行细胞内重组;
[0088]
(3)转化之后,涂板,37℃,培养12-16h;
[0089]
(4)选取单克隆进行培养,抽提质粒进行paci酶切验证;
[0090]
(5)验证正确的重组质粒转化e.coli stbl3感受态(百奥莱博),得到高纯度的重组腺病毒载体,命名为adeasy016-padeasy-cmv-marl16-6xhis-cmv-egfp,载体图谱如图2所示;
[0091]
(6)重组质粒paci线性化,待转染细胞。
[0092]
实施例3腺病毒包装
[0093]
1、细胞培养
[0094]
转染前一天,将293细胞接种于60mm培养皿,培养基为dmem 10%hyclon胎牛血清,置37℃含5%co2的培养箱中培养过夜。
[0095]
2、转染
[0096]
待细胞生长至底面积的长满到70~80%时,取重组腺病毒载体线性化质粒,用lipofiter
tm
转染试剂进行转染。具体步骤为:
[0097]
1)转染前2小时更换完全培养基,取4μg重组腺病毒载体线性化质粒,用300μl的dmem培养液进行稀释,室温放置5min。
[0098]
2)取15μl的lipofiter
tm
,用300μl的dmem培养液进行稀释,室温放置5min。
[0099]
3)将两者混和,室温避光放置20min。然后将混合物加入到60mm培养皿中,置于37℃含5%co2的培养箱中培养。转染6小时后,更换新鲜的细胞培养液。反复收毒和冻融3次,得到含重组腺病毒颗粒adv-arl16的裂解上清。经纯化得到adv-arl16。
[0100]
同时以空质粒按同样方法转染293细胞得到空病毒,作为阴性对照adv-ctl。对病毒进行热源检测、微生物检测,同时用pcr法检测是否有野生病毒复制(rcl),确保无热源,无细菌、真菌、病毒等微生物污染,无野生病毒复制。对病毒进行滴度检测,得到滴度为2
×
10
11
pfu/ml。
[0101]
实施例4adv-arl16对小鼠精子细胞中adl16基因的表达效果检测
[0102]
1、小鼠精子细胞培养
[0103]
分别将小鼠精子细胞系(63423,atcc,manassas,virginia,usa)与小鼠睾丸支持细胞系(crl-1715,atcc)共培养于改良dmem培养基(补加1μm睾酮、500miu/ml重组fsh、5μg/ml肾上腺素、10%胎牛血清)中,在32℃、5%co2培养箱中6h得到成熟精子。在培养基中加入实施例3制备的重组腺病毒颗粒adv-arl16,培养12小时后,去除原有培养基,并加入新鲜的egm-2完全培养基继续培养72小时。
[0104]
2、arl16基因的表达效果检测
[0105]
(1)激光共聚焦显微镜下观察adv-arl16病毒感染精子细胞
[0106]
激光共聚焦显微镜(ix81,olympus)下观察精子细胞中gfp荧光、照相。结果如图3所示。
[0107]
(2)western blot检测附睾尾精子中arl16表达
[0108]
方法和步骤同实施例1中western blot检测arl16,结果如图4所示。
[0109]
结果表明,转入adv-arl16的精子细胞的arl16表达量明显高于转入adv-ctl的精子细胞的arl16表达量。本发明成功构建了过表达arl16的表达载体。
[0110]
实施例5重组腺病毒adv-arl16对低氧处理小鼠精子鞭毛形态的影响
[0111]
将实施例3制备的重组腺病毒颗粒adv-arl16以5.5
×
107tu/只剂量感染小鼠,并设立空病毒对照组,10%氧浓度暴露小鼠10周,液化并收集附睾尾精子。
[0112]
1、巴氏染色法观察精子形态
[0113]
(1)长形精子分离:附睾尾投入37℃预热的0.5%bsa的f12,剪碎,液化10min。40μm细胞筛过滤,冲洗数次确保足够细胞滤过,转移细胞悬液至15ml离心管。1500rpm离心10min。弃上清,沉淀用红细胞裂解液裂解,裂解液加入量为4ml/只,重悬2min。1500rpm离心10min。用pbs稀释后均匀涂抹于载玻片上,自然干燥。
[0114]
(2)巴氏染色:将玻片置于等量的95%乙醇和乙醚混合成的溶液中,固定5min,将玻片依次浸入80%、70%、50%乙醇溶液各1min,最后放入蒸馏水中1min;把玻片放入苏木精染液中染色3min,蒸馏水冲洗1min;放入0.5%盐酸乙醇中分色,约2min,蒸馏水冲洗
1min;将玻片依次浸入50%、70%、80%乙醇溶液各1min;在橘黄g6染液中染色2min,然后将玻片浸入95%乙醇溶液中两次,每次2min;将玻片放入ea36中染色5min,然后浸入95%乙醇中3次,每次1min,再入无水乙醇中浸2min;将玻片放入二甲苯溶液中透明3次,每次1min;干燥后立即显微镜观察。结果如图5所示。
[0115]
2、透射电镜(transmission electron microscopy,tem)观察精子鞭毛轴丝中心体超微结构
[0116]
睾丸切除后,立即将组织切片成小样本(1mm3),并在4℃下在3%缓冲戊二醛中固定4h;然后将组织样本在1%四氧化锇(oso4)中后固定90min;固定的组织用乙醇脱水,然后组织通过环氧丙烷转移到树脂中。在用纯树脂组织浸渍后,将样品嵌入相同的树脂混合物中。使用配备金刚石刀的超显微切片机(leica,uct)切割样品为60

70nm的超薄切片;将切片放置在铜网格上,用醋酸铀酰染色20min,以及采用柠檬酸铅染色5min。用透射电子显微镜(jem-1011,jeol,tokyo,japan)在80kv下观察染色切片。结果如图6所示。
[0117]
结果表明:与对照组相比,转染重组腺病毒adv-arl16的小鼠精子形态明显改善,精子畸形数量明显减少,精子中鞭毛中心体结构明显改善,正常中心体结构明显增多。
[0118]
实施例6arl16的作用机制研究
[0119]
1、将小鼠置于模拟海拔5800m高原低压氧舱内(压力:约360mmhg,氧含量10%),连续低压低氧处理10w来复制小鼠低氧hmmaf模型。经鉴定低氧hmmaf模型复制成功。并设置21%氧浓度暴露10周组小鼠为对照组。打开腹腔,取出附睾组织,摘取双侧附睾尾进行液化与裂解后,得到精子。免疫荧光检测精子中dynein2和dynactin2定位。结果如图7a和7b所示。co-ip检测精子中dynactin2分别与dynein2与arl16关联。结果如图8所示。
[0120]
2、将adv-arl16以8
×
107tu/只剂量感染小鼠,并设立空病毒对照组,将小鼠放海拔5800米(约11.7%氧含量)低压氧舱饲养10w,并设立20%氧浓度暴露小鼠10周为对照组,液化并收集附睾尾精子。if观察精子中dynein2和dynactin2定位。结果如图9所示。
[0121]
由结果可知:与21%氧浓度暴露10周组小鼠精子相比,10%氧浓度暴露10周组小鼠精子dynein2与dynactin2定位于鞭毛尾段;21%氧浓度暴露10周组小鼠精子中dynactin2与arl16关联,10%氧浓度暴露10周组小鼠精子中dynactin2与dynein2关联。过表达arl16,小鼠精子鞭毛尾段dynein2与dynactin2的聚集减少。
[0122]
由此推测,常氧条件下,精子细胞内arl16通过与dynactin2竞争性结合dynein2,促进精子鞭毛内的货物逆向转运。在低氧条件下,arl16表达抑制,导致arl16不能与dynactin2竞争性结合dynein2,导致dynein2-dynactin2聚集在过渡区,使得鞭毛尾部膨胀,从而导致低氧下鞭毛形态异常。
[0123]
最后说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
再多了解一些

本文用于企业家、创业者技术爱好者查询,结果仅供参考。

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