用于治疗肌肉衰退的组合物的制作方法

1.本发明涉及支链氨基酸(branched-chain amino acid，bcaa)和氨基酸l-丙氨酸的组合、相关药物组合物或膳食补充剂，其用于预防和/或治疗与病理病症或年龄相关病症相关的肌肉衰退(muscle wasting)。


背景技术：

2.骨骼肌是由调节细胞和蛋白质更新的多种途径维持的可塑器官。骨骼肌蛋白不断地并且同时地合成和降解。成熟个体中肌肉中蛋白质的量和骨骼肌质量(mass)的维持取决于净肌肉蛋白质平衡(net muscle protein balance，nbal)，其为骨骼肌蛋白合成(muscle protein synthesis，mps)和分解(muscle protein breakdown，mpb)之间的差异。生长因子、激素、细胞因子、营养素和机械负荷可以激活细胞信号传导途径，这些途径有利于蛋白质合成或降解，分别导致骨骼肌质量的增加或减少。
3.肌肉不仅对运动和维持姿势很重要，而且还提供了体内最大的蛋白质储库，并作为可被多种器官(包括心脏、肝和大脑)用于在分解代谢过程中的能量产生和糖异生的氨基酸的来源。
4.在一些病理病症的情况下和在老年人中，可出现蛋白水解系统的激活提高，从而从肌肉中去除收缩蛋白和细胞器，导致肌肉萎缩。肌肉质量过度损失与数种疾病的预后不良有关，这些疾病包括肌病和肌营养不良，以及全身性病症，例如癌症、糖尿病、脓毒症和心力衰竭。肌肉衰退在以下情况下全身性地发生：在老年人中(称为年龄相关肌少症的病症)；作为对禁食、营养不良或不动性(immobility)(例如术后的)的生理应答；以及在病理病症例如神经肌肉退行性病症(例如肌营养不良或萎缩)、慢性阻塞性肺病症、癌症相关恶病质、糖尿病、肾衰竭、心力衰竭、库欣综合征(cushing syndrome)、脓毒症、烧伤、尿毒症、肝硬化和艾滋病(aids)中。
5.强烈感到需要开发有效预防和/或治疗肌肉衰退的组合物。
6.必需氨基酸是人体无法合成并因此需要在膳食中提供的生物分子。支链氨基酸(bcaa)亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸占肌肉中必需氨基酸的35％，并且是体育活动期间消耗量最大的必需氨基酸。
7.许多研究表明，bcaa作为蛋白质合成和能量产生的底物，并执行数种代谢和信号传导功能，特别是通过激活mtor信号传导途径。
8.这些作用是通过bcaa本身，尤其是亮氨酸，以及通过它们的一些代谢物实现的。事实上，亮氨酸刺激通过mtor信号传导途径的蛋白质合成，以及翻译起始因子和核糖体蛋白的磷酸化，而对蛋白水解的抑制作用主要由hmg(β-羟基-β-甲基丁酸)和支链酮酸介导。
9.令人感兴趣地，与大多数氨基酸不同，bcaa分解代谢的初始步骤发生在骨骼肌中而不是肝中，因为支链氨基酸氨基转移酶(bcat)(负责bcaa分解代谢途径的第一酶)在该组织中具有更高的活性。与其他相比，这为基于bcaa的营养配方在提高肌肉和脑功能的作用方面提供了独特的优势，因为在蛋白质摄入之后循环bcaa迅速提高并且变得容易被肝外组
织利用。
10.鉴于以上情况，bcaa的补充作为对肌肉健康和合成代谢的增补剂(ergogenic aid)被运动员广泛使用，其增强身体机能和骨骼肌增生，并支持肌肉健康和合成代谢。
11.l-丙氨酸是糖异生氨基酸，并且是bcaa分解代谢的产物之一，其也用于运动补充剂。例如，sport performance是包含bcca和l-丙氨酸二者的市售的膳食补充剂，并用于提高运动表现和降低疲劳。


技术实现要素：

12.本发明人已在动物模型中发现，施用含有与l-丙氨酸组合的bcaa的经口制剂在预防或治疗其中发生肌肉衰退的那些病理病症或年龄相关病症中特别有效。
13.特别地，本发明人已发现与l-丙氨酸的组合提高了bcaa的血浆和肌肉吸收。
14.因此，本发明的一个目的是包含支链氨基酸(bcca)和l-丙氨酸的组合物，其用于预防和/或治疗与病理病症、年龄相关病症或者营养不良、不动性或禁食相关的肌肉衰退。
15.定义
16.如本文所用，术语“支链氨基酸(bcaa)”是指氨基酸l-异亮氨酸、l-亮氨酸和l-缬氨酸。
附图说明
17.图1示出了如实施例1中所述的对照小鼠(对照)和进行后肢去负荷(hindlimb-unloading)并用载剂(载剂)、重量比l-亮氨酸∶l-异亮氨酸∶l-缬氨酸∶l-丙氨酸为2∶1∶1∶1(bcaa 1ala)、2∶1∶1∶2(bcaa 2ala)或2∶1∶1∶3(bcaa 3ala)的bcaa加l-丙氨酸处理的小鼠的跖屈肌的转矩产生的力-频率曲线(n*mm/kg)(bcaa 2ala*vs bcaa p＜0.05；bcaa 2ala**vs bcaa p＜0.01)。
18.图2示出了：
[0019]-在图a中，如实施例2中所述，对于用单独的bcaa(bcaas)或bcaa加不同量的l-丙氨酸(混合1、2或3)处理的小鼠，在0至24小时的时间间隔内计算的每个经标记的氨基酸的血浆曲线下面积(area under the curve，auc)。数值表示为来自括号中所示小鼠数量的平均值
±
s.e.m.。通过anova随后是bonferroni事后检验发现了与
°
bcaa相比的统计学显著的差异(f＞4.9；p＜0.0001)。通过未配对的student's t检验发现了与
§
bcaa相比的统计学显著的差异(0.0005＜p＜0.05)。
[0020]-在图b中，在每个实验组的gc肌肉中测量的每个经标记的氨基酸的浓度。数值表示为来自括号中所示小鼠数量的平均值
±
s.e.m.。通过anova随后是bonferroni事后检验发现了与bcaa相比的统计学显著的差异(f＞5.1；p＜0.001)。通过未配对的student's t检验发现了与
§
bcaa相比的统计学显著的差异(0.002＜p＜0.04)。
具体实施方式
[0021]
如实验部分所证明的，本发明人已发现在肌肉衰退的动物模型中bcaa与l-丙氨酸的组合在导致肌肉衰退的病理病症中特别有效地维持肌肉质量和功能。
[0022]
此外，发明人已发现bcaa与l-丙氨酸的组合显著提高了bcaa的血浆浓度。
[0023]
因此，本发明涉及组合物，其包含支链氨基酸(bcca)l-亮氨酸、l-缬氨酸和l-异亮氨酸与l-丙氨酸的组合，所述组合物用于预防、缓解和/或治疗与以下相关的肌肉衰退：
[0024]
i)病理病症；
[0025]
ii)年龄相关病症；或者
[0026]
iii)营养不良、不动性或禁食。
[0027]
优选地，所述肌肉衰退与选自以下的病理病症相关：神经肌肉退行性病症，例如肌营养不良或肌肉萎缩；慢性阻塞性肺病症；癌症相关恶病质；糖尿病；肾衰竭；心力衰竭；库欣综合征；脓毒症；烧伤；尿毒症；肝硬化；和艾滋病。
[0028]
优选地，所述肌肉衰退与年龄相关病症肌少症相关。
[0029]
优选地，在上述组合物中，重量比l-亮氨酸∶l-缬氨酸∶l-异亮氨酸为2∶1∶1至8∶1∶1。
[0030]
根据本发明的一个优选实施方案，l-亮氨酸、l-缬氨酸和l-异亮氨酸以2∶1∶1的重量比存在于组合物中。
[0031]
根据本发明的另一优选实施方案，重量比l-亮氨酸∶l-缬氨酸∶l-异亮氨酸为4∶1∶1。
[0032]
根据本发明的另一优选实施方案，重量比l-亮氨酸∶l-缬氨酸∶l-异亮氨酸为8∶1∶1。
[0033]
优选地，在本发明的组合物中，bcaa和l-丙氨酸之间的重量比为5∶1至1∶1，优选地，其为2.5∶1至1.5∶1，更优选地，其为2∶1或1.6∶1。
[0034]
根据一个特别优选的实施方案，重量比l-亮氨酸∶l-缬氨酸∶l-异亮氨酸∶l-丙氨酸为2∶1∶1∶2。
[0035]
事实上，如实验部分所证明的和图1中所示的，令人惊讶的是，在该特定比例下，观察到组合(bcaa 2ala)的氨基酸之间具有特别明显的协同作用，与对照或在不同重量比例下的相同氨基酸的组合相比，神经肌肉功能显著改善(参见图1)。
[0036]
根据一个实施方案，根据本发明所述应用的组合物为药物组合物。
[0037]
所述药物组合物优选包含与至少一种可药用载剂、赋形剂或辅料混合的所述bcaa和l-丙氨酸，优选以上述比例包含所述bcaa和l-丙氨酸。特别有用的可以是制剂辅料，例如增溶剂、分散剂、乳化剂和/或助悬剂。
[0038]
根据一个替代实施方案，根据本发明所述应用的组合物为膳食补充剂。优选地，所述膳食补充剂包含与至少一种可接受的供人使用的载剂或赋形剂混合的所述bcaa和l-丙氨酸，优选以上述比例包含所述bcaa和l-丙氨酸。
[0039]
优选地，本发明的组合物(优选作为药物组合物或膳食补充剂)适于经口施用。
[0040]
本发明的用于经口施用的组合物可以是固体或液体制剂。本发明的一些优选制剂考虑选自颗粒剂、片剂、胶囊剂、泡腾片剂、经口混悬剂、乳剂、散剂、溶液剂、凝胶剂或糖浆剂的药物形式。根据本发明的最优选的药物形式是用于在液体优选水中的经口混悬剂的颗粒剂。
[0041]
优选地，所述组合物，优选作为药物组合物或膳食补充剂，除bcaa和l-丙氨酸之外不包含任何其他活性化合物。
[0042]
优选地，所述组合物，优选作为药物组合物或膳食补充剂，被配制成每单位剂量含
有以下量的bcaa、l-丙氨酸：0.6至1g，优选0.8g的l-亮氨酸；0.3至0.5g，优选0.4g的l-异亮氨酸；0.3至0.5g，优选0.4g的l-缬氨酸；和0.4g至1.2g，优选0.8g的l-丙氨酸。
[0043]
优选地，所述单位剂量每天施用两次。
[0044]
实验部分
[0045]
所有实验均按照意大利实验动物护理和使用指南(italian guidelines for care and use of laboratory animals)(d.l.116/92)和欧洲指令(european directive)(2010/63/ue)进行。就伦理问题和遵守法律而言，本研究属于意大利卫生部研究动物福利的国家伦理委员会(national ethic committee for research animal welfare of the italian ministry of health)批准的研究。本研究中使用的大多数实验程序都得到了研究神经肌肉疾病动物模型的国际科学网络(http：//www.treat-nmd.eu/research/preclinical/sops/)的批准。
[0046]
统计学
[0047]
所有实验数据均表示为平均值
±
平均值的标准误差(standard error of the mean，s.e.m.)。组间多重统计学比较通过单因素anova进行，当零假设被拒绝(p＜0.05)时采用bonferroni t检验事后校正，以允许更好地评价组内和组间的变异性并避免假阳性。如有必要，通过未配对student’s t检验在两种方法之间进行单一比较(经改良的制剂vs载剂或vs标准制剂)。
[0048]
实施例1
[0049]
在肌肉萎缩小鼠模型(hu小鼠)中的临床前评估。
[0050]
a)动物处理
[0051]
成年雄性c57bl/6j小鼠(12至14周龄)购自charles river(calco，italy)。将小鼠细分为4组，每组8只动物，一个对照组和3个后肢去负荷(hindlimb-unloaded，hu)组。hu组的动物使用类似于先前用于hu大鼠的方法(pierno s，et al.j physiol 2007；584：983-95.])，在专用笼中单独悬挂2周。将细绳一端通过橡皮膏连接至尾，另一端连接到笼的顶部。调整绳的长度以允许动物用前肢自由移动，同时身体与水平面呈30
°
至40
°
倾斜。所有小鼠自由饮水，并每天接受8g标准啮齿动物食物。对第二天剩余的食物称重以计算每日食物消耗。
[0052]
将小鼠细分为4组，每组8只动物：
[0053]
1)对照组：将小鼠在对照条件下单独饲养4周；
[0054]
2)载剂组：将小鼠单独饲养4周，并在最后2周进行后肢去负荷。在此期间，它们接受载剂(水)；
[0055]
3)bcaa组：将小鼠单独饲养4周，每天一次接受混合bcaa(l-亮氨酸328mg/kg；l-异亮氨酸164mg/kg；l-缬氨酸164mg/kg)，持续4周，并在最后2周进行后肢去负荷；
[0056]
4)bcaa 1ala组：将小鼠单独饲养4周，每天一次接受混合bcaa 1ala(l-亮氨酸328mg/kg；l-异亮氨酸164mg/kg；l-缬氨酸164mg/kg加l-丙氨酸164mg/kg)，持续4周，并在最后2周进行后肢去负荷；
[0057]
5)bcaa 2ala：将小鼠单独饲养4周，每天一次接受混合bcaa 2ala(l-亮氨酸328mg/kg；l-异亮氨酸164mg/kg；l-缬氨酸164mg/kg加l-丙氨酸328mg/kg)，持续4周，并在最后2周进行后肢去负荷；
[0058]
6)bcaa 3ala：将小鼠单独饲养4周，每天一次接受混合bcaa 3ala(l-亮氨酸328mg/kg；l-异亮氨酸164mg/kg；l-缬氨酸164mg/kg加l-丙氨酸492mg/kg)，持续4周，并在最后2周进行后肢去负荷。
[0059]
每种制剂均通过将粉末溶解在经过滤的自来水中以获得最终浓度来制备。考虑到每只小鼠每周消耗的水量及其体重，这是通过直接制备获得的。处理的持续时间为4周。
[0060]
在整个hu期间，每天检查hu动物的行为、清洁度、毛发和眼睛的外观、食物和水的消耗。每日食物摄入作为属于ctrl组和hu组的小鼠在14天内每天食用的市售食物量(以克为单位)的平均值来测量。经历了处理方案的所有小鼠均未显示出任何应激迹象(缺少食欲、异常的体重减轻、毛发丧失、刻板行为或攻击性行为等)或重要功能的宏观改变。在整个实验窗中均未观察到动物(无论是经处理的还是未经处理的)体重的显著变化。
[0061]
b)体内转矩实验
[0062]
通过测量麻醉的小鼠中跖屈肌群(gc和比目鱼肌)在不同时间点的最大等距(isometric)转矩，评估了所有以上动物组的体内神经肌肉功能。通过吸入(约4％异氟醚和1.5％o2 l/分钟)使小鼠麻醉，并将其置于恒温控制台上；通过鼻锥维持麻醉(约2％异氟醚和1.5％o2 l/分钟)。将右后肢剃毛并进行无菌准备，并将足置于与伺服电机(型号300c-lr；aurora scientific，aurora，on，canada)连接的踏板上。通过与刺激器(型号701b；aurora scientific)连接的针状电极(chalgren enterprises)对胫神经进行经皮电刺激引起收缩以诱导跖屈肌群收缩。将电流从30ma调节至50ma，直到实现最大等距转矩。然后以提高的频率执行一系列刺激：1、10、30、50、80、100和120hz，脉冲串为200ms。使用动态肌肉分析软件(dmav5.201；aurora scientific)分析数据以获得转矩，将其针对小鼠体重归一化。经归一化的值用于构建转矩-频率曲线。
[0063]
获得的结果在图1中示出。
[0064]
肌肉收缩的峰在约80至120hz的频率下达到。在10和60hz之间，各组中记录的力相似，因为在低频率时产生的力小于在高频率刺激时产生的力，因此，健康纤维(对照)和患病纤维(载剂)之间没有显著差异。在高于60hz的频率下，肌肉开始收缩以达到80至120hz下的收缩峰值。正是在这个阶段开始看到健康纤维和患病纤维之间的差异。此外，在相同的脉冲下，因废用(disuse)而受损的纤维的强度低于健康的纤维。
[0065]
从图1可以看出，与静坐组相比，经麻醉的动物中的转矩测量结果公开了后肢去负荷小鼠中的肌肉废用情况(即无力)。此外，数据清楚地表明，施用bcaa和l-丙氨酸提高了跖屈肌(主要是gc和比目鱼肌)的神经肌肉功能。与所有其他组相比，bcaa 2ala组中的这种作用出人意料地更高。与其他经处理的组相比，该组显示出显著更高的转矩-频率值。特别地，在120hz下产生的最大转矩值几乎与静坐小鼠组的转矩值重叠(385
±
7与366
±
5n*mm/kg；n＝8)。
[0066]
实施例2
[0067]
药代动力学研究
[0068]
对来自c57bl/6j野生型(wt)小鼠的血浆和骨骼肌中受试氨基酸分布进行了初步药代动力学评价。
[0069]
共24只(每组n＝6只小鼠)10周龄的雄性c57bl/6jwt小鼠(harlan，italy)用于pk研究。一旦从供应商处接收到小鼠，就对所有小鼠进行健康检查和验收，然后将其饲养在合
适的笼中(每个笼最多5只小鼠)，并使其适应当地的饲养条件约5天。这些动物通常被保持在以下环境中，但实验程序另有规定的短期时间除外。将小鼠饲养在单独的、专用的房间里，控制空气以提供最少15次换气/小时。将环境控制设置为将温度维持在22至24℃范围内，并将相对湿度维持在50至60％范围内，并自动控制约12小时的光照和12小时的黑暗循环。在整个研究过程中，食物(标准glp膳食，mucedola，settimo milanese，mi，italy)和水可自由获得。将所有动物在处理日称重(体重范围为25至30g)，然后随机分配到每个实验组，在实验之前在背部用着色喷雾进行独特标识。在整个研究过程中，以有规律的间隔监测临床体征，以评估对处理的任何反应。在施用经标记的氨基酸的前一天晚上，使动物禁食；在补充氨基酸之后3小时，将食物重新插入笼中。
[0070]
将小鼠分为四个实验组，经口施用单独的或与不同量的l-丙氨酸(混合1、混合2和混合3)组合的经13c6和15n标记的bcaa混合物(bcaa)，目的是评价补充l-丙氨酸对bcaa的药代动力学参数的影响。此外，还评价了gc肌肉中的氨基酸含量。
[0071]
详细地，用以下氨基酸对动物进行处理：
[0072]
第1组(bcaa组)：l-亮氨酸-13c6，15n：328mg/kg；l-异亮氨酸-13c6，15n：164mg/kg；l-缬氨酸-13c5，15n：164mg/kg；
[0073]
第2组(混合1组)：l-亮氨酸-13c6，15n：328mg/kg；l-异亮氨酸-13c6，15n：164mg/kg；l-缬氨酸-13c5，15n：164mg/kg，l-丙氨酸：164mg/kg；
[0074]
第3组(混合2组)：l-亮氨酸-13c6，15n：328mg/kg；l-异亮氨酸-13c6，15n：164mg/kg；l-缬氨酸-13c5，15n：164mg/kg，l-丙氨酸：328mg/kg；
[0075]
第4组(混合3组)：l-亮氨酸-13c6，15n：328mg/kg；l-异亮氨酸-13c6，15n：164mg/kg；l-缬氨酸-13c5，15n：164mg/kg，l-丙氨酸492mg/kg。
[0076]
通过将氨基酸混合物粉末溶解在1.5％w/w柠檬酸水溶液中制备制剂。根据施用体积以15ml/kg通过单次经口强饲法处理动物。在15分钟、30分钟、1小时、3小时、8小时、24小时时收集血液样品(50至60μl)至肝素化离心管(heparin vister 5000u.i./ml)中，将其轻轻混合并立即放在冰上。然后，对管进行离心(15分钟，3500
×
g，4℃)，收集所产生的血浆并将其转移到独特标记的管中，并在-80℃下冷冻，直到进一步的pk分析。在研究结束时，在深度异氟醚麻醉(美国wpi提供的ez-b800系统)下通过放血处死小鼠动物。在处死时收集腓肠肌(gastrocnemius，gc)肌肉，在盐水中洗涤，在吸水纸上干燥，并使用ck14管(0.5ml软组织匀浆裂解试剂盒，cayman chemical，mi，usa)和bertin匀浆器在稀释度为1/5w/v(g/ml)下在盐水中匀浆。匀浆之后对样品进行离心。使用人白蛋白作为替代物以产生25至2000μg/ml的氨基酸分析的校准曲线，而一些样品在缓冲液中以1∶5进一步稀释。使用ezfaast
tm
氨基酸分析试剂盒(phenomenex，castel maggiore，bo，italy)通过净化和衍生对血浆和肌肉样品二者进行分析，并通过uplc-msms(配备有absciex api 4500q质谱仪的uplc shimadzu型号lc-20ad)进行分析。
[0077]
在0至24小时的时间间隔内计算血浆曲线下面积(auc)，并在图2的图a中报道。
[0078]
令人惊讶的是，用l-丙氨酸处理的所有组均显示出bcaa血浆浓度的显著升高。特别地，经l-丙氨酸处理的组中bcaa的血浆暴露是与bcaa组相比的两倍高。
[0079]
该结果表明，l-丙氨酸有助于提高bcaa的吸收。
[0080]
此外，在处死时(24小时)收集gc肌肉，并分析氨基酸含量。在图1b中报道了经标记
的bcaa的浓度。
[0081]
数据显示，与bcaa相比，发现所有经ala处理的组的bcaa肌肉含量在统计学上均显著提高。特别地，与标准制剂相比，混合2组显示出每种bcaa的最高浓度(图2，图b)。
[0082]
这些数据表明bcaa/ala比例强烈影响肌肉组织中的bcaa分布，从而为实施例1中动物模型中观察到的对肌肉功能的特定作用提供了合理的理由。