一种革兰氏阴性细菌的电化学检测方法、传感器及其制备方法与流程

1.本发明涉及电化学免疫传感器技术领域，具体而言，涉及一种革兰氏阴性细菌的电化学检测方法、传感器及其制备方法。


背景技术：

2.由于抗生素的滥用，人类极有可能进入后抗生素时代，超级细菌的出现对人类的威胁逐渐严重，所以细菌的快速灵敏检测尤为重要。临床常用的细菌检测方法如革兰氏染色法、药敏检测、pcr、elisa、飞行时间质谱检测等技术具有较高的特异性，但仍存在耗时、费用昂贵、交叉污染等缺点。
3.生物传感技术，如荧光、化学发光、电化学、电化学发光等，可以利用新的信号放大策略和纳米材料提高检测灵敏度，缩短检测时间。其中，电化学生物传感方法以其操作简便、制备简单、灵敏度高等优点，在细菌检测中得到了广泛的研究。
4.传统的细菌电化学免疫传感器大多通过抗体或适体基于三明治结构组建，电化学免疫传感器大多需要二抗的修饰，这不仅增加了实验过程的复杂化，而且极大增加了实验成本。
5.酶是一种高效的生物体催化剂，具有独特的选择性，能对特定的第五分子显示识别能力而成为许多电化学生物传感器的常用媒介体。虽然酶传感器具有灵敏度高、选择性好、响应快等特点，可是基于酶修饰的电化学传感器存在许多缺陷，酶传感器的制备过程非常复杂，且酶作为具有活性的生物大分子，对外界条件的变化比较敏感，容易失活变性，影响传感器的寿命和测定结果的准确性。
6.因此，需要研究一种无酶、不使用二抗、操作简便且稳定性高的革兰氏阴性菌检测方法。


技术实现要素：

7.本发明的第一个目的在于提供一种革兰氏阴性细菌的电化学分析方法，其能够不使用二抗和酶对革兰氏阴性细菌进行精准高效的检测；
8.本发明的第二个目的在于提供一种用于革兰氏阴性细菌的电化学传感器，能够有效的捕获靶细菌，电导性好，有利于后续的电化学检测；
9.本发明的第三个目的在于提供上述电化学传感器的制备方法，制备得到的传感器具有上述优点。
10.本发明通过以下技术方案实现：
11.一种革兰氏阴性细菌的电化学检测方法，包括以下步骤：
12.(1)将细菌悬液滴加在电化学传感器的工作电极表面并孵育；
13.(2)将pt/ni@go纳米片滴加至(1)处理后的工作电极表面并孵育；
14.(3)将电化学传感器的工作电极、参比电极和对电极连接到电化学工作站上，用磷
酸缓冲液作为反应基底液，进行i-t曲线测定；
15.电化学传感器的工作电极固定有特异性抗体。
16.革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌不同，其外层具有较薄的肽聚糖网络结构且细胞膜较薄。而片层较薄的石墨烯材料其锋利的边缘能够穿透革兰氏阴性菌的致密膜与革兰氏阴性菌结合。
17.将待测细菌悬液滴加到工作电极表面并孵育后，工作电极上的特异性抗体捕获靶细菌，pt/ni@go纳米片通过其锋利的片层边缘穿刺在革兰氏阴性菌细胞膜中，由于革兰氏阳性菌外层具有较厚的肽聚糖网络结构，纳米片较难穿刺进入，因此，pt/ni@go纳米片只会与革兰氏阴性菌的细胞膜结合。
18.pt、ni具有催化过氧化氢的特性，在氧化石墨烯中掺杂pt和ni使得 pt/ni@go纳米片具有过氧化物酶活性，可以产生电化学信号。pt/ni@go 纳米片与工作电极结合后，能够显著改变电化学传感器的性能，i-t曲线会发生显著变化。
19.本发明利用pt/ni@go纳米片与细菌细胞膜的结合作用构建革兰氏阴性菌的电化学免疫传感器，能够有效的区分革兰氏阴性菌和阳性菌，无需使用二抗，利用pt/ni@go纳米片的过氧化物酶活性能够替代酶的使用，实现与电极之间有效直接的电子传输，并且能够提高电化学检测的稳定性，用于革兰氏阴性菌的广谱检测。
20.优选地，将不同浓度的细菌滴加到特异性抗体修饰的电极上，然后在 37℃下温育1.5h，然后将pt/ni@go纳米片滴在制备的电极表面，并在37℃下孵育1h。
21.进一步地，pt/ni@go纳米片的制备方法为：
22.(1)通过hummers法制备并在水中超声得到go分散液；
23.(2)缓慢滴加氯化镍溶液，然后逐滴滴加硼氢化钠溶液，在搅拌下加热回流；
24.(3)将氯铂酸缓慢滴加入混合液中反应获得pt/ni@go纳米片。
25.氯铂酸溶液和氯化镍溶液以及go分散液的浓度相同；
26.优选地，氯铂酸溶液与氯化镍溶液的体积比为1：0.8～1.0；
27.优选地，氯铂酸和氯化镍的溶液总体积与go分散液的体积比为1： 10.0～11.0。
28.优选地，反应时间≥5h；
29.优选地，反应温度为90～100℃。
30.用于上述革兰氏阴性细菌的电化学检测方法的革兰氏阴性细菌的电化学传感器，包括工作电极、参比电极和对电极，工作电极包括玻碳电极以及玻碳电极外封装的电化学活性材料，电化学活性材料包括er-ceo2粒子和金纳米粒子以及特异性抗体。
31.特异性抗体根据需要检测的细菌类型进行选择相应地特异性抗体，比如检测大肠杆菌则选择大肠杆菌的特异性抗体。在工作电极上负载金纳米粒子利于后续与抗体的结合，使得抗体有效的附着在工作电极表面；负载氧化铈能够提高电极的导电性，使用稀土元素铒制备铒掺杂的氧化铈，不仅能够提高导电性，还具有抗菌作用，下层材料能够在检测细菌的同时起到杀菌的作用。
32.一种革兰氏阴性细菌的电化学传感器的制备方法，包括以下步骤：
33.s1：玻碳电极表面处理：将裸电极表面进行抛光处理，使其表面光洁；
34.s2：负载er-ceo2与金纳米粒子：将er-ceo2粒子滴加在电极表面并孵育，然后电沉积上金纳米粒子；
35.s3：固定抗体：将特异性抗体滴加在负载下层材料的电极表面，并孵育；
36.s4：封闭电极：使用封闭试剂封闭非特异性吸附位点。
37.对玻碳电极进行抛光处理，使得er-ceo2粒子与金纳米粒子能够更好地负载，然后负载上er-ceo2粒子与金纳米粒子，特异性抗体与金纳米粒子结合，将抗体固定在电极表面，然后对电极进行封闭，制得特异性捕获革兰氏阴性菌体系。
38.具体的，采用氧化铝粉对玻碳电极进行抛光处理。
39.优选地，s2中的孵育时间≥30min；
40.优选地，s3中的孵育时间≥8h；
41.优选地，s3中的孵育温度为4℃。
42.进一步地，封闭试剂为牛血清白蛋白(bsa)。
43.优选地，冲洗电极三次后，滴加10μl 0.01g/ml bsa封闭0.5h。
44.进一步地，s2中er-ceo2粒子的制备方法为：
45.先将ceo2粉末与乙二醇混合，然后将ercl2粉末溶解于混合液中，再加入3-氨丙基三乙氧基硅烷(aptes)混合；
46.优选地，s2中，er-ceo2的浓度为0.85～0.90mg/ml；
47.优选地，孵育时间≥1h；
48.优选地，所述s3中抗体浓度为10.0～11.0μg/ml。
49.s2中金纳米粒子的制备方法为：
50.将经过er-ceo2修饰的电极浸入1％的haucl4溶液中，通过-0.2v的沉积电位经过30s电沉积后修饰上aunps。
51.进一步地，ercl2粉末与ceo2粉末的重量比为0.3:(0.8～1.2)；
52.进一步地，ceo2粉末与乙二醇的重量体积比为1：(0.8～1.0)g/ml；
53.进一步地，3-氨丙基三乙氧基硅烷与乙二醇的体积比为1：(5～6)。
54.进一步地，参比电极为饱和甘汞电极或银/氯化银电极，对电极为玻碳电极；
55.优选地，参比电极为甘汞电极。
56.优选地，电化学传感器还包括1x磷酸缓冲液。
57.将上述电化学传感器应用到上述的电化学检测方法中，通过水热法合成er-ceo2和pt/ni@go纳米片。在电极表面首先自然沉积er-ceo2，增加有效反应面积以及增强电子转移。在er-ceo2修饰电极表面电沉积aunps 可进一步提高其导电性，并具有与巯基末端的抗体高效结合的功能。因此，靶细菌存在的情况下，被特异性抗体捕获。然后，pt/ni@go插入革兰氏阴性菌表面的细胞膜并牢牢结合。由于细菌细胞膜的广泛表面覆盖，每个细菌可以结合多个pt/ni@go。pt/ni@go能够实现与电极之间有效直接的电子传输，改变传感器的电化学性能，最终构建了一种超灵敏、操作简单、成本低廉的信号增强式的电化学生物传感器。
58.本发明的技术方案至少具有如下优点和有益效果：
59.(1)本发明提供了一种革兰氏阴性细菌的电化学检测方法，铂镍掺杂的氧化石墨烯具有过氧化物酶活性，再利用氧化石墨烯与革兰氏阴性细菌细胞膜的反应，能够检测出细菌悬液中是否含有革兰氏阴性细菌；电化学传感器未使用二抗和酶且操作简便，显著提高了革兰氏阴性细菌的检测效率并且灵敏度高、稳定性强、重现性好、反应速度快；
60.(2)本发明提供了一种用于上述检测方法的革兰氏阴性细菌的电化学传感器，能
够捕获靶细菌，使用铒掺杂的氧化铈对玻碳电极表面进行修饰，然后再使用金纳米粒子进行修饰，增强了工作电极的导电性，提高传感器的灵敏度，利于抗体的附着，同时下层材料还具有抑菌作用，可以在检测细菌的同时进行灭菌；
61.(3)本发明提供了一种革兰氏阴性细菌的电化学传感器的制备方法，能够有效的将er-ceo2粒子与金纳米粒子负载到玻碳电极上，制备得到的电化学传感器能够用于革兰氏阴性细菌的电化学检测。
附图说明
62.图1显示为本发明的电化学检测方法的检测原理图；
63.图2显示为本方案er-ceo2的sem和tem表征图；
64.图3显示为本方案er-ceo2的eds-mapping表征图；
65.图4显示为本方案pt/ni@go的sem表征图；
66.图5显示为本方案大肠杆菌与pt/ni@go的结合表征图；
67.图6显示为本方案金黄色葡萄球菌与pt/ni@go的结合表征图；
68.图7显示为本方案不同浓度目标物的电化学生物传感器i-t表征图。
具体实施方式
69.(1)材料和试剂
70.石墨粉、氯化铂酸钾(ptcl4)、六水氯化镍(nicl2·
6h2o)、浓硝酸 (hno3)、硫酸(h2so4)、过氧化氢(h2o2)、高锰酸钾(k2mno4)和牛血清白蛋白(bsa)均购买自sigma公司(美国)。e.coli和s.aureus由重庆医科大学附属永川医院提供。luria bertani培养基(lb)，哥伦比亚血平板，聚乙烯吡咯烷酮(pvp，mw30000)，磷酸盐缓冲液(pbs，2.7mm kcl， 137mm nacl，1.8mm kh2po4，8mm na2hpo4)，甘油和todd hewitt肉汤(thb)购自生工公司(上海，中国)。抗e.coli抗体购自生物合成公司(北京，中国)。所有溶液均使用去离子水(大于等于18mω，milli-q， millipore)制备。
71.(2)仪器设备
72.电化学检测由上海辰华公司的chi660d电化学工作站(上海，中国) 完成。以玻碳电极(glassy carbon electrode,ge，3mm)为工作电极，铂丝为对电极，ag/agcl电极为参比电极，组成三电极系统。采用美国thermofisher公司的thermo scientific nicolet is50红外吸收光谱仪和 usemerfer/thermo二氧化碳细胞培养箱(美国)以及智诚仪器公司的 zwdy-240型全温多振幅振动筛(上海，中国)。采用日本日立公司的h-7500 透射电子显微镜和su8000扫描电子显微镜对纳米材料的形貌进行了表征 (东京，日本)。
73.实施例
74.(1)er-ceo2的制备
75.将ceo2粉末与乙二醇按照重量体积比为1：(0.8～1.0)g/ml混合，然后将ercl2粉末溶解于混合液中置于磁力搅拌器上搅拌0.5h充分混合均匀，再加入3-氨丙基三乙氧基硅烷混合后，于反应釜中180℃反应2h，制得浓度为0.85～0.90mg/ml的er-ceo2。
76.(2)玻碳电极表面处理：
77.用0.05μm铝粉对玻碳电极进行抛光处理至“镜面状”，去离子水超声清洗3次，每次
3min；然后，用去离子水冲洗干净后用洗耳球吹干电极表面；
78.(3)负载er-ceo2粒子：将浓度为0.90mgml的er-ceo2粒子滴加在电极表面并孵育1h；
79.(4)电沉积aunps：将er-ceo2修饰的电极浸入1％的haucl4溶液中，通过-0.2v的沉积电位经过30s电沉积后修饰上aunps；
80.(5)负载特异性抗体：将10l 10mg/ml细菌特异性抗体添加到aunps 修饰的电极上，在4℃下孵育8h；
81.(6)采用bsa封闭电极：特异性抗体组装好的电极表面用1
×
pbs缓冲液冲洗电极三次后，滴加10l 0.01g/ml bsa封闭0.5h。重复冲洗电极得到探针修饰的工作电极备用；
82.(7)制备pt/ni@go纳米片：通过hummers法制备并在水中超声得到浓度约为1mg/ml的go分散液，缓慢滴加氯化镍溶液，然后逐滴滴加硼氢化钠溶液，在搅拌下加热回流，将氯铂酸缓慢滴加入混合液中反应获得pt/ni@go纳米片。其中氯铂酸与氯化镍溶液浓度相同，体积比为1：0.8～ 1.0；
83.(8)将制备的电极用tris-hcl缓冲液清洗后用氮气吹干。将不同浓度的细菌滴加到特异性抗体修饰的电极上，然后在37℃下温育1.5h，然后将pt/ni@go滴在制备的电极表面，并在37℃下孵育1h；
84.(9)以pbs缓冲液作为电化学测量的基底溶液，将经步骤(7)处理后的待测电极置于其中，ag/agcl电极为参比电极，铂丝电极为对电极，在室温下，用安培i-t曲线(i-t)进行测定。
85.实验例
86.(1)er-ceo2的表征
87.sem和tem图像表征er-ceo2成功合成。
88.如图2a所示，通过sem图像可以看出er-ceo2在视野中均匀分布，其形状为均匀球形大小约为60-80nm左右。通过图2b的tem图像表征其具有均匀尺寸和球形形态。通过以上两种表征从微观上证明了er-ceo2被成功合成。
89.(2)er-ceo2的元素分析
90.如图3所示，进一步验证er-ceo2的元素组成，证明了该粒子含有er 元素，ce元素和o元素，从微观上证明了纳米材料的成功合成。
91.(3)pt/ni@go的表征
92.sem图像表征pt/ni@go成功合成。
93.如图4a所示，通过sem图像可以看出pt/ni纳米粒子均匀的分散在 go表面，其片层大小约为3-4μm左右。如图4b所示tem图像表征其具有较薄的片层结构且形态均一。通过以上两种表征从微观上证明了 pt/ni@go被成功合成。
94.(4)革兰氏阴性菌和pt/ni@go的结合验证
95.为了验证pt/ni@go和革兰氏阴性菌的结合效果，将两者混合培养后用sem表征两者之间的结合，如图5a和5b所示，pt/ni@go插入细菌细胞膜并与其紧密结合。片层周围插入和吸附了大量革兰氏阴性菌。
96.(5)革兰氏阳性菌和pt/ni@go的作用
97.如图6所示，金黄色葡萄球菌与pt/ni@go共培养后并没有显示出结合的作用，而是
其周围零散的分布着金黄色葡萄球菌，由于革兰氏阳性菌具有较厚的肽聚糖，pt/ni@go无法穿透细胞膜插入细菌因此其无法与革兰氏阳性菌牢牢结合。
98.(6)i-t曲线测试
99.pt/ni@go作为一种性能优越的过氧化物酶，通过对双氧水的高效催化产生电化学催化信号。为了证明所开发的细菌电化学生物传感器具有一定的可行性，采用较为灵敏的电化学检测方法(i-t)表征。
100.使用不同浓度的目标物进行测试，得到测试结果如图7所示，其中，各样品的目标物浓度为(a)0，(b)1.5
×
105cfu/ml，(c)1.5
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107cfu/ml。得到在pt/ni@go的催化作用下，连续测定了氧还原峰(-0.4v)的电流值。当目标菌不存在时，pt/ni@go不能与修饰电极结合，只有较低的背景信号。当目标菌存在时，pt/ni@go插入细菌细胞膜并紧密结合。因此，随着靶细菌浓度的增加，i-t信号逐渐增强。因此，i-t的检测结果证实了电化学生物传感器的可行性。
101.以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。