紫草素作为碳青霉烯类抗生素的增效剂在抗碳青霉烯类耐药菌中的应用的制作方法

1.本发明涉及一种中药单体及其新用途，特别涉及中药单体紫草素作为碳青霉烯类抗生素的增效剂在抗碳青霉烯耐药菌中的应用。本发明属于医药技术领域。


背景技术：

2.碳青霉烯类抗生素是治疗多重耐药革兰氏阴性菌“最后一道防线”的药物，然而，随着此类药物在临床上的大量使用，使得对碳青霉烯类药物耐药的大肠杆菌逐年增多，给临床抗感染治疗带来了严重挑战。自2009年首次在印度新德里发现了一种新型碳青霉烯酶-新德里金属β-内酰胺酶ndm后，并伴随着该金属酶在全球范围内的快速传播，将碳青霉烯耐药大肠杆菌引发的感染防控难度提高到了一个前所未有的高度。在新药研发速度迟缓的背景下，急需寻找能与现有抗生素联用的中药单体作为增效剂以恢复碳青霉烯类抗生素对碳青霉烯耐药大肠杆菌原有的杀菌效果，以缓解针对该类菌引起的感染无药可用的局面。
3.天然药物是一个资源丰富、数量庞大的化合物库，一直以来都是发现活性成分以及先导化合物的一条重要途径。我国拥有丰富的药用植物资源，这为我们从天然植物中挖掘有抗菌活性的有效单体增效剂奠定了物质基础。中药单体是从中药中提取出来的有效化合物，去除了中药中的无效成分，保留了有药理活性的化合物。目前的研究显示中药单体增效剂主要有三大类：皂苷类、黄酮类和生物碱类，这三种成分不仅具有良好的生物活性，而且相对于化学药物来说还具有低毒、无副作用等优势。彭勤等的研究显示亚胺培南、美罗培南分别与槲皮素二水物、盐酸小檗碱、黄芩苷联用后能明显降低抗菌药物对泛耐药鲍曼不动杆菌的最小抑菌浓度“mic”，两者表现为不同程度的协同作用。张迎冰的研究显示穿心莲内酯与氨基糖苷类药物联用对鸡耐药大肠杆菌的杀菌效果表现为协同效果。这些研究都提示不同的中药单体与不同的抗菌药联用后能够逆转耐药菌对抗菌药的敏感性。
4.ndm-1酶是流行最广的碳青霉烯酶，产ndm-1病原菌的广泛流行给公共卫生和人类健康带来了前所未有的挑战和威胁，大肠杆菌是编码ndm-1酶基因bla
ndm-1
的主要宿主。因此，寻找碳青霉烯类抗生素的增效剂以逆转次类耐药菌引发的感染是当前有效的策略之一。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种碳青霉烯类抗生素的增效剂，该增效剂与碳青霉烯类抗生素联合应用时能对碳青霉烯类耐药菌起到良好的杀菌效果。
6.为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：本发明在前期研究的基础上，采用药敏实验和联合药敏实验从20种中药单体中筛选出了美罗培南的增效剂-紫草素，它与美罗培南联合应用时能对碳青霉烯类耐药菌起到良好的杀菌效果。
7.在上述研究的基础上，本发明提出了紫草素作为碳青霉烯类抗生素的增效剂在制备抗碳青霉烯类耐药菌药物中的应用。
8.其中，优选的，所述的碳青霉烯类抗生素为美罗培南（meropenem）。
9.其中，优选的，紫草素与美罗培南的用量比为1-3:30。
10.其中，优选的，所述的碳青霉烯类耐药菌为携带碳青霉烯类耐药基因bla
imp-4
、bla
ndm-1
、bla
vim-1
及/或bla
oxa-23
基因的肠杆菌科细菌。
11.进一步的，本发明还提出了一种抗碳青霉烯类耐药菌的药物组合物，所述的药物中含有紫草素以及美罗培南。
12.其中，优选的，紫草素与美罗培南的用量比为1-3:30。
13.更进一步的，本发明还提出了所述的药物组合物在制备抗碳青霉烯类耐药菌杀菌剂中的应用。
14.其中，优选的，所述的碳青霉烯类耐药菌为携带碳青霉烯类耐药基因bla
imp-4
、bla
ndm-1
、bla
vim-1
及/或bla
oxa-23
基因的肠杆菌科细菌。
15.相较于现有技术，本发明的有益效果是：本发明采用药敏实验和联合药敏实验从20种中药单体中筛选出了与碳青霉烯类抗生素联合应用时能对碳青霉烯类耐药菌起到良好的杀菌效果的增效剂——紫草素。美罗培南与紫草素联合应用后对产5种不同碳青霉烯酶病原菌的杀菌效果，结果发现美罗培南和紫草素联合应用后，除abm44-1外，紫草素和美罗培南联用对于其余4种产不同碳青霉烯酶的菌ec62、pam75、ech10和abm25的fic值均小于0.5，表现为不同程度的协同作用。紫草素和美罗培南联用对产imp-4酶的ec62菌株的协同效果最为明显，其联用后的fic值为0.1875，联用后美罗培南的mic值从单独应用时的16 μg/ml下降到联合应用时的1 μg/ml（浓度降低16倍），紫草素的mic值从单独应用时的512 μg/ml下降到联合应用时的128 μg/ml（浓度降低8倍）。紫草素和美罗培南联用除对ec62的协同效果最好外，对ech10、pam75和abm25的fic值都在0.25-0.375之间，联用前后美罗培南的浓度都下降了4-8倍不等，紫草素的浓度在联合应用前后均下降了8倍，由此说明紫草素与美罗培南联合应用时能对碳青霉烯类耐药菌起到良好的杀菌效果。本发明的提出为碳青霉烯耐药菌的防控提供了新的技术手段。
附图说明
16.图1a与图1b为美罗培南和20种中药单体联合应用的fic值；图2为紫草素和美罗培南联用对大肠杆菌ech10的体内杀菌效果；其中：mem：美罗培南；shk：紫草素其中：（a）大蜡螟感染模型中不同组治疗后的生存曲线；（b）小鼠腹膜炎败血症感染模型不同组治疗后的生存曲线；图3为小鼠腹膜炎－败血症模型中美罗培南和紫草素联合使用后各脏器的载菌量；其中：mem：美罗培南；shk：紫草素。
具体实施方式
17.下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随具体实施例的描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
18.实施例11 材料与方法1.1 主要实验材料和实验动物：lb培养基购自每个bd公司；bhi购自美国oxoid公司；mh购自美国oxoid公司；美罗培南购自上海源叶生物科技公司；21种中药单体购自上海融合医药科技有限公司；本实验所用的产ndm-1酶大肠杆菌ech10为本实验室分离保存；dmso购自德国merck-millipore公司；dmem细胞培养液购自gibco公司；脱纤维羊血购自哈尔滨邦力生物科技有限公司；balb/c小鼠，雌性，6-8周龄，体重18-20g，购自北京维通利华科技有限公司；大蜡螟购自哈尔滨泰康生物公司。
19.1.2 中药单体储备液的配置：21种中药单体全部用dmso溶剂进行溶解配置，配置的最终储存浓度都是10240 μg/ml（表1）。
20.1.3 最小抑菌浓度（mic）的测定：选取了分别产5种不同碳青霉烯酶类的耐药菌作为测试对象，分别是e. coli ec62（携带bla
imp-4
基因）、ech10（携带bla
ndm-1
基因）、pseudomonas aeruginosa pam75（携带bla
vim
基因）、acinetobacter baumannii abm25（携带bla
oxa-23
基因）、acinetobacter baumannii abm44-1（携带bla
kpc-2
基因），开展联合药敏试验，测定了选取的20种中药单体和碳青霉烯类药物美罗培南联合应用的fic值。参照美国临床和标准实验室协会（clsi）及欧盟药敏试验eucast version 5.0推荐的微量肉汤稀释法对受试菌株进行mic测定，全程无菌操作。用mh-f培养基稀释新鲜培养的测试菌菌液，使其浓度在10
5-106cfu/ml的范围内。mics的测定具体按以下步骤进行：（1）在无菌96孔板中第1列加入180 μg/ml mh-f培养基，第2列至第10列加入100 μg/ml mh-f培养基，第11列加入200 μl mh-f培养基作为阴性对
照，第12列加入200 μl按照上述浓度稀释好的菌液作为阳性对照。（2）第1列加入20 μl配置好的中药单体或者抗菌药，做2个平行重复。然后用排枪进行2倍比例稀释，弃去第10列稀释的100μl。（3）第1列至第10列，加入100 μl稀释好的菌液。（4）将加完测试中药单体/抗菌药和菌液的96孔板放置37℃恒温培养箱中，静置培养18小时。
21.1.4 肉汤微量稀释棋盘法测定fic指数通过肉汤微量稀释棋盘法试验来筛选抗碳青霉烯类耐药菌中药单体增效剂。根据分级抑菌浓度（fic）指数值来判定选取的中药单体与美罗培南是否具有协同作用，fic指数计算公式：fic=（mic
联合用药中药单体
/mic
中药单体
） （mic
联合用药美罗培南
/mic
美罗培南
）。判定标准：fic≤0.5为协同作用；0.5《fic≤2.0为相加作用；fic》2.0为无效果。
22.1.5大蜡螟感染模型30只大蜡螟置于37 ℃培养箱中过夜使其复苏后，随机平均分成3组，每组10只，置于9 cm平板中，右腹足给予大蜡螟10 μl的大肠杆菌ech10菌悬液（3.0
×
10
4 cfu)，感染2 h后，于左腹足分别给予pbs、美罗培南（1 mg/kg）、紫草素（30 mg/kg）或紫草素 美罗培南（1 mg/kg 30 mg/kg）进行治疗。将所有大蜡螟置于37 ℃培养中，观察5天内的存活率情况。
23.1.6 小鼠腹腔炎-败血症感染模型20只balb/c雌性小鼠随机分成4组，每组5只，所有小鼠腹腔内注射200 μl的e. coli ech10菌悬液（3.0
×
10
8 cfu)。前期实验表明，该剂量的的菌悬液下小鼠48 h的死亡率大于90 %。四组小鼠感染2 h后，分别给予pbs、美罗培南（2 mg/kg）、紫草素（30 mg/kg）或紫草素 美罗培南（2 mg/kg 30 mg/kg）进行治疗。48 h后，观察每组成活率，并取小鼠内脏进行菌落计数和he染色。
24.2 结果2.1 抗生素和中药单体联合使用的fic值联合药敏试验结果显示，除abm44-1外，紫草素和美罗培南联用对于其余4种产不同碳青霉烯酶的菌ec62、pam75、ech10和abm25的fic值均小于0.5，表现为不同程度的协同作用，其他19种中药单体与美罗培南联用后对测试的5种产碳青霉烯酶菌株均无协同效果（图1a和图1b）。紫草素和美罗培南联用对产imp-4酶的ec62菌株的协同效果最为明显，其联用后的fic值为0.1875，联用后美罗培南的mic值从单独应用时的16 μg/ml下降到联合应用时的1 μg/ml（浓度降低16倍），紫草素的mic值从单独应用时的512 μg/ml下降到联合应用时的128 μg/ml（浓度降低8倍）。紫草素和美罗培南联用除对ec62的协同效果最好外，对ech10、pam75和abm25的fic值都在0.25-0.375之间，联用前后美罗培南的浓度都下降了4-8倍不等，紫草素的浓度在联合应用前后均下降了8倍，具体结果见表2所示。
25.2.2 紫草素和美罗培南联合应用体内效果评价紫草素和美罗培南联用在体外对碳青霉烯类耐药肠杆菌科细菌已经展现出了良好的杀菌活性，在此基础上本研究进一步评价了两者联用在体内对碳青霉烯类耐药大肠杆菌引发的感染治疗的效果。本研究选用大肠杆菌ech10为研究对象，构建了大蜡螟感染模型和小鼠腹腔炎败血症模型，如图2结果所示，紫草素和美罗培南联合给药48小时内可显著提高大蜡螟和小鼠的存活率，显著高于美罗培南单独给药的成活率和紫草素单独给药的成活率；此外，还测定了48 h后小鼠内脏器官（心、肝、脾、肺、肾）的载菌量，如图3所示所示，紫草素和美罗培南联合给药组各个器官的载菌量相对于单独给药组显著降低，降低量为2
‑ꢀ
4个 log值。同时，利用he染色对各个内脏器官的病理情况进行了评价，结果发现pbs组、紫草素和美罗培南单独给药组出现肝脏窦状隙内可见多量杆状细菌样颗粒增殖、轻度瘀血；脾脏脾-白髓可见散在红细胞，红髓可见菌体增殖；肺脏淤血，间质可见菌体增殖；肾脏淤血，部分肾小管上皮细胞核固缩，变性坏死；而在紫草素和美罗培南联合给药组中这些病理特征得到了显著的缓解。