含有阴离子聚合物和阳离子聚合物或肽的复合粒子及其制造方法与流程

含有阴离子聚合物和阳离子聚合物或肽的复合粒子及其制造方法
1.本技术是申请号为201780063620.1的发明专利申请的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及一种可用作皮肤外用剂原料的纳米粒子以及该纳米粒子的制造方法。


背景技术：

3.一直以来，为了将皮肤外用剂的有效成分送到角质细胞层内，存在着以下问题。
4.皮肤的角质细胞层具有防止异物从外界入侵的屏障功能，有效成分难以到达角质细胞层内。尤其是在有效成分是高分子化合物时，由于高分子化合物的渗透性低，因此难以渗透到角质细胞层内，有效成分会残留在皮肤表面。
5.在这种情况下，推进纳米粒子的开发作为将有效成分送到角质细胞层内的载体。
6.在专利文1中，记载了一种冷冻干燥体，其是一种复合物，含有：核酸、寡核酸、或其衍生物；阳离子聚合物或阳离子脂质或者含有阳离子聚合物或阳离子脂质的聚集体；以及阴离子聚合物。
7.在专利文献2中，记载了一种得到施用活性成分用的直径低于1μm的纳米粒子的方法，其包括：a)调制透明质酸盐的水溶液；b)调制阳离子聚合物的水溶液；c)向所述透明质酸盐溶液中加入聚阴离子盐；d)混合搅拌在由所述b)和c)中得到的溶液，得到自然产生的纳米粒子；在所述方法中，使所述活性成分溶解在由所述a)、b)或c)中得到的溶液里的一个内，或溶解在由所述d)中得到的纳米粒子的悬浊液内，附着到纳米粒子上。
8.在专利文献3中，记载了一种含有释放生物活性分子用的纳米粒子的系统，其特征在于，所述纳米粒子包括：a)至少50重量％的壳聚糖或壳聚糖衍生物；以及b)含有低于50重量％的聚乙二醇(peg)或由peg衍生物而成的偶联物；在所述系统中，所述配料成分a)和b)经壳聚糖氨基而共价连接，所述纳米粒子通过交联剂而交联。
9.在专利文献4中，记载了一种用于释放生物活性分子的系统，其特征在于：含有平均大小低于1微米的纳米粒子，纳米粒子含有：a)透明质酸或透明质酸盐；以及b)壳聚糖或其衍生物；在所述系统中，壳聚糖或其衍生物的分子量低于90kda。并且，记载了含有作为生物活性分子的核酸等的系统，含有作为成网剂的三聚磷酸盐的系统。
10.在专利文献5中，记载了含有透明质酸和壳聚糖的二元复合物，并进一步记载了含有阴离子聚合物的三元复合物。
11.【现有技术文献】
12.【专利文献】
13.【专利文献1】国际公开第2007/132873号小册子
14.【专利文献2】特表2007－520424号公报
15.【专利文献3】特表2008－533108号公报
16.【专利文献4】特表2009－537604号公报
17.【专利文献5】特开2014－114272号公报


技术实现要素：

18.发明要解决的技术问题
19.正如专利文献5中所记载的，透明质酸易于与壳聚糖形成复合粒子。但是，不清楚：在壳聚糖之外，具有什么特性的聚合物、在怎样的条件下可与透明质酸形成复合粒子。
20.因此，本发明要解决的第一个问题在于提供一种粒子化透明质酸的新技术。
21.再有，正如专利文献5中所记载的，透明质酸和壳聚糖在接近中性(ph6.5)的条件下易于形成复合粒子。
22.本发明人在对可与阴离子聚合物形成复合粒子的聚合物进行各种探究的过程中，发现了在这种中性条件下，透明质酸和肽难以形成小粒径的复合粒子。
23.因此，本发明要解决的第二个问题在于提供一种适于制造含有阴离子聚合物和肽的复合粒子的新技术。
24.解决技术问题的手段
25.＜第一发明＞
26.本发明人经锐意研究和不懈努力，发现作为可与透明质酸形成复合粒子的阳离子聚合物的特性，阳离子化程度很重要，从而完成了本发明。
27.即解决上述问题的第一发明是一种复合粒子，其含有：阴离子聚合物；以及阳离子化程度大于等于0.2的阳离子聚合物(除壳聚糖外)。
28.本发明的复合粒子作为将有效成分送到皮肤内的载体是有益的。
29.在本发明的优选实施方式中，阴离子聚合物是透明质酸和/或聚谷氨酸。
30.这种方式的本发明的复合粒子可将作为保湿成分的透明质酸和聚谷氨酸送到皮肤内部。
31.在本发明的优选实施方式中，阳离子聚合物是烯丙基胺聚合物和/或阳离子多糖。
32.通过使用这些阳离子聚合物，可提高复合粒子的稳定性。
33.在本发明的优选实施方式中，阳离子聚合物是伯胺～叔胺。
34.含有作为阳离子聚合物的伯胺～叔胺的本发明的复合粒子，在渗透到皮肤内部后，具有发生崩解的性质。因此，这种方式的本发明的复合粒子可将原本无法渗透到皮肤内部的非凝聚态的阴离子聚合物导入到皮肤内部。
35.在本发明的优选实施方式中，阳离子聚合物是肽。
36.通过使用肽，可提高复合粒子的稳定性。
37.本发明还涉及含有上述复合粒子的皮肤外用组合物。
38.本发明的皮肤外用组合物可使阴离子聚合物渗透到皮肤内部。
39.本发明还涉及上述复合粒子的制造方法。即本发明的制造方法，其特征在于：在水系溶剂中，混合阴离子聚合物以及阳离子化程度大于等于0.2的阳离子聚合物(除壳聚糖外)。
40.采用本发明，可容易地制造上述复合粒子。
41.在本发明的优选实施方式中，其特征在于：另行调制
42.(a)所述阴离子聚合物的水溶液；以及
43.(b)所述阳离子聚合物的水溶液；
44.将这些水溶液混合。
45.这样看来，通过另行调制(a)水溶液和(b)水溶液的方式，可防止复合粒子凝聚。
46.进一步优选所述(a)水溶液中的所述阴离子聚合物的浓度小于等于1.7mm。
47.再有，优选所述(b)水溶液中的所述阳离子聚合物的合计浓度小于等于1.7mm。
48.通过将(a)和(b)的水溶液中的聚合物的浓度设置在所述范围内，可制造难以凝聚的复合粒子。
49.本发明还涉及采用上述制造方法制造的复合粒子。
50.本发明的复合粒子具有出色的稳定性。
51.＜第二发明＞
52.再有，本发明人经锐意研究和不懈努力，发现通过使透明质酸和肽在ph小于等于5的酸性区域中的水系溶剂中混合，可制造微小的复合粒子。
53.即解决上述问题的第二发明是含有阴离子聚合物和肽的复合粒子的制造方法，其特征在于：在ph小于等于5的水系溶剂中混合阴离子聚合物和肽。
54.采用本发明的制造方法，可制造含有阴离子聚合物和肽的粒径较小的复合粒子。
55.在本发明的优选实施方式中，阴离子聚合物是透明质酸。
56.本发明优选用于制造含有透明质酸的复合粒子。
57.阴离子聚合物与含有酸性和/或中性氨基酸残基的肽在接近中性的条件下难以形成复合粒子。
58.因此，本发明优选适用于含有酸性和/或中性氨基酸残基的肽。
59.在本发明的优选实施方式中，所述肽是从由水溶性胶原蛋白、寡肽-20和聚赖氨酸构成的群组中选出的一种或大于等于两种。
60.本发明优选用于制造含有这些对人体有益的肽的复合粒子。
61.在本发明的优选实施方式中，当所述肽是水溶性胶原蛋白时，设置水系溶剂的ph小于等于3。
62.通过这种方式，可制造小粒径的复合粒子。
63.在本发明的优选实施方式中，当所述肽是寡肽-20时，设置水系溶剂的ph小于等于3.5。
64.通过这种方式，可制造小粒径的复合粒子。
65.在本发明的优选实施方式中，当所述肽是聚赖氨酸时，设置水系溶剂的ph小于等于4.4。
66.通过这种方式，可制造小粒径的复合粒子。
67.在本发明的优选实施方式中，另行调制所述阴离子聚合物的水溶液和所述肽的水溶液，将这些水溶液混合。
68.通过如此另行调制阴离子聚合物的水溶液和肽的水溶液的方式，可防止复合粒子的凝聚。
69.本发明还涉及含有采用上述制造方法制造的复合粒子的含复合粒子组合物的制造方法。
70.即本发明的含复合粒子组合物的制造方法，其特征在于：也可在采用上述制造方
法制造复合粒子后，包括将水系溶剂与其他成分混合的工序，混合后的组合物与所述水系溶剂的ph不同。
71.采用上述制造方法制造的复合粒子即使之后ph改变也不会消失。因此，只要采用本发明，就可容易地制造含复合粒子组合物。
72.再有，本发明还涉及一种复合粒子，其是含有阴离子聚合物和肽的复合粒子，其特征在于：所述肽是从由水溶性胶原蛋白、寡肽-20和聚赖氨酸构成的群组中选出的一种或大于等于两种，粒径小于等于500nm。
73.本发明的复合粒子可用于使阴离子聚合物和肽渗透到皮肤内部的目的。
74.在本发明的优选实施方式中，所述阴离子聚合物是透明质酸。
75.采用本发明的复合粒子，可将透明质酸导入到皮肤内部。
76.发明效果
77.第一本发明的复合粒子可使阴离子聚合物渗透到皮肤内。再有，采用本发明的复合粒子的制造方法，可容易地制造上述复合粒子。
78.采用第二本发明的制造方法，可提供含有阴离子聚合物和肽的、粒径较小的复合粒子。
79.再有，采用本发明的复合粒子，可使阴离子聚合物和肽渗透到皮肤内部。
附图说明
80.图1是显示pbs的添加量和复合粒子的粒径的关系的图表。
81.图2是显示使用了复合粒子组合制剂和无组合制剂的皮肤提取液的hplc定量分析结果的图表。
82.图3是显示对使用了复合粒子组合制剂的皮肤提取液、含有已知浓度的荧光素胺标记透明质酸钠的复合粒子的标准水溶液、只有荧光素胺标记透明质酸钠的标准水溶液进行fff分析的结果的图。
具体实施方式
83.＜第一发明＞
84.＜1＞复合粒子
85.(1)阴离子聚合物
86.本发明的复合粒子含有阴离子聚合物，是其必要成分。作为阴离子聚合物，只要对人体无害就没有限制，但优选例如可以是聚谷氨酸、聚天冬氨酸等阴离子聚氨基酸，琼脂、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸葡聚糖、硫酸乙酰肝素、硫酸皮肤素、褐藻糖胶、硫酸角质素、肝素、角叉菜胶、琥珀葡聚糖、阿拉伯树胶、黄原胶、海藻酸、果胶、羧甲基纤维素等阴离子多糖，聚丙烯酸，以及它们的盐。特别优选可以是透明质酸、聚谷氨酸以及它们的盐。
87.阴离子聚合物可使用市售的产品。
88.作为形成透明质酸盐和聚谷氨酸盐的盐，例如是钠、钾、钙、铵、镁、碱性氨基酸盐等。
89.本发明使用的阴离子聚合物的分子量没有限制，但优选是100～100000kda，更为优选是200～50000kda。
90.更具体而言，在使用透明质酸或其盐作为阴离子聚合物时，可使用分子量优选是100～2000kda，更为优选是200～1500kda的透明质酸或其盐。
91.再有，在使用聚谷氨酸或其盐作为阴离子聚合物时，可使用分子量优选是500～30000kda，更为优选是1000～20000kda，进一步优选是1500～15000kda的聚谷氨酸或其盐。
92.对阴离子聚合物的阴离子化程度没有特殊限制，但从促进与阳离子聚合物形成复合粒子的观点出发，下限优选大于等于0.1，更为优选大于等于0.2。
93.另一方面，从与阳离子聚合物形成复合粒子的观点出发，阴离子聚合物的阴离子化程度没有特定上限。作为标准可使用阴离子化程度小于等于2的阴离子聚合物。
94.此处，“阴离子化程度”是指可通过下述公式计算出的值：
95.{(聚合物中含有的阴离子官能基的个数)－(聚合物中含有的阳离子官能基的个数)}/构成聚合物的单体的总量
96.(2)阳离子聚合物
97.在本发明中，所谓阳离子聚合物，是指至少在水中显示阳离子性的聚合物，也包括整体呈阳离子性的两性聚合物。
98.在本发明中，使用阳离子化程度大于等于0.2的聚合物。通过使用这种阳离子聚合物，可容易地与阴离子聚合物形成复合粒子。
99.另一方面，从与阴离子聚合物形成复合粒子的观点出发，阳离子聚合物的阳离子化程度没有特定上限。作为标准，可使用阳离子化程度小于等于2的阳离子聚合物。
100.此处，所谓“阳离子化程度”是指可通过下述公式计算出的值：
101.{(聚合物中含有的阳离子官能基的个数)－(聚合物中含有的阴离子官能基的个数)}/构成聚合物的单体的总量
102.本发明中使用的阳离子聚合物，无论是天然物质还是合成物质，只要是具有阳离子性的官能基的物质即可。
103.作为阳离子聚合物中含有的阳离子官能基，例如是氨基、胍基和亚氨基等。本发明的阳离子聚合物是在聚合物的侧链或主链中含有这些基的物质。
104.作为阴离子聚合物，例如可以是阳离子多糖、烯丙基胺聚合物、含氨基(甲基)丙烯酸聚合物等，特别优选例如可以是阳离子多糖、烯丙基胺聚合物。
105.作为阳离子多糖，例如可以是阳离子纤维素、阳离子瓜尔胶、阳离子淀粉等。
106.所谓烯丙基胺聚合物，是具有烯丙基和氨基的单体通过烯丙基聚合而聚合的物质。单体具有的烯丙基的个数没有特殊限制，但优选是一个或两个。
107.作为烯丙基胺聚合物，例如可以是烯丙胺盐酸盐聚合物，烯丙胺酰胺硫酸盐聚合物，烯丙胺盐酸盐/二烯丙胺盐酸盐共聚物，烯丙胺乙酸盐/二烯丙基胺乙酸盐共聚物，烯丙胺盐酸盐/二烷基烯丙胺盐酸盐共聚物，部分烷氧基羰基化烯丙胺聚合物，部分烷基羰基化烯丙胺乙酸盐聚合物，部分尿素化聚烯丙胺聚合物，二烯丙基胺盐酸盐聚合物，烷基二烯丙基胺盐酸盐聚合物，烷基二烯丙基胺酰胺硫酸盐聚合物，烷基二烯丙基胺乙酸盐聚合物，二烯丙基二甲基氯化铵聚合物，二烯丙基甲基乙基铵乙基硫酸盐聚合物，二烯丙基胺盐酸盐/二氧化硫共聚物，二烯丙基胺乙酸盐/二氧化硫共聚物，二烯丙基甲基乙基铵乙基硫酸盐/二氧化硫共聚物，烷基二烯丙基胺盐酸盐/二氧化硫共聚物，二烯丙基二烷基氯化铵/二氧化硫共聚物，二烯丙基二烷基氯化铵/丙烯酰胺共聚物等。
108.作为含氨基(甲基)丙烯酸聚合物，没有特殊限定，只要是含氨基的侧链结构通过酯键或酰胺键结合在(甲基)丙烯酸聚合物的羧基部分上即可。该侧链结构既可以是直链形的，也可以是支链形的。侧链上含有的氨基即可以是伯胺～叔胺中的任意一种形式的，也可以是季铵形式的。
109.在本发明的优选实施方式中，使用是伯胺～叔胺的阳离子聚合物。在更为优选的实施方式中，使用是伯胺～叔胺的烯丙基胺聚合物。
110.作为伯胺～叔胺的烯丙基胺聚合物，具体而言，例如可以是烯丙胺盐酸盐聚合物，烯丙胺酰胺硫酸盐聚合物，烯丙胺盐酸盐/二烯丙胺盐酸盐共聚物，烯丙胺乙酸盐/二烯丙基胺乙酸酯共聚物，烯丙胺盐酸盐/二烷基烯丙胺盐酸盐共聚物，部分烷氧基羰基化烯丙胺聚合物，部分烷基羰基化烯丙胺乙酸盐聚合物，部分尿素化聚烯丙胺聚合物，二烯丙基胺盐酸盐聚合物，烷基二烯丙基胺盐酸盐聚合物，烷基二烯丙基胺酰胺硫酸盐聚合物，烷基二烯丙基胺乙酸盐聚合物，二烯丙基胺盐酸盐/二氧化硫共聚物，二烯丙基胺乙酸盐/二氧化硫共聚物，烷基二烯丙基胺盐酸盐/二氧化硫共聚物等。
111.作为因整体呈阳离子性而可归类为阳离子聚合物的两性聚合物，例如优选可以是二烷基氨基乙基甲基丙烯酸酯聚合物的乙酸两性化合物，甲基丙烯酰基乙基甜菜碱/甲基丙烯酸酯共聚物，丙烯酸辛基丙烯酰胺/丙烯酸羟丙酯/甲基丙烯酸丁基氨基乙酯共聚物，二甲基二烯丙基氯化铵/丙烯酸共聚物，二甲基二烯丙基氯化铵/丙烯酸/丙烯酰胺共聚物，甲基丙烯酰胺丙基三甲基氯化铵/丙烯酸/丙烯酸甲酯共聚物。
112.再有，优选使用整体显示阳离子性的肽作为阳离子聚合物。
113.肽的种类没有特殊限定，但优选使用碱性肽，其中碱性氨基酸残基相对于整个氨基酸残基的比例优选大于等于70％，更为优选大于等于80％，进一步优选大于等于90％，更进一步优选大于等于99％。
114.尤其是可优选例如只由碱性氨基酸残基构成的碱性肽。
115.作为碱性肽，尤其适用例如由精氨酸和赖氨酸构成的肽。
116.具体而言优选使用聚赖氨酸或聚精氨酸。
117.再有，作为肽，可使用由单一氨基酸残基构成的肽，也可使用由大于等于两种的氨基酸残基构成的肽。
118.(3)复合粒子
119.本发明的复合粒子含有上述阴离子聚合物和阳离子聚合物，是其必要成分。
120.复合粒子中的阴离子聚合物和阳离子聚合物的质量比，根据制备量，优选是10:1～1:10，更为优选是5:1～5:1，进一步优选是2:1～1:2，再进一步优选是1.5:1～1:1.5。
121.复合粒子中也可含有上述必要成分之外的任意成分，但上述必要成分占复合粒子整体的总含量优选大于等于50质量％，更为优选大于等于70质量％，进一步优选大于等于90质量％，再进一步优选大于等于99质量％。
122.复合粒子的平均粒径优选小于等于1000nm，更为优选小于等于500nm，进一步优选小于等于300nm，再进一步优选小于等于100nm。
123.(4)复合粒子的制造方法
124.上述复合粒子的制造方法没有特殊限定，但优选适用本发明的制造方法制造。下面对本发明的复合粒子的制造方法的具体实施方式进行说明。
125.本发明的制造方法，其特征在于：在水系溶剂中，混合阴离子聚合物以及阳离子化程度大于等于0.2的阳离子聚合物(除壳聚糖外)。
126.采用本发明的制造方法，可通过将作为必要成分的聚合物在水系溶剂中混合的简单操作制造复合粒子。
127.所谓水系溶剂，是指水(例如净化水，离子交换水，自来水等)或水溶性成分的水溶液。作为水溶性成分，没有特殊限制，只要是不损害本发明效果的物质均可使用，例如是通常混合到化妆品或准药品(医薬部外品)等中的粉末、保湿剂、增稠剂、防腐剂等添加剂。此外，当混合高融点的水溶性成分时，可预先加热使其均匀溶解在水中备用，但在水溶性成分溶解后，优选使水溶液恢复到室温后再用于制造复合粒子。
128.优选的实施方式是：分别另行预先调制阴离子聚合物水溶液和阳离子聚合物水溶液，将它们混合。
129.通过混合像这样另行调制的各聚合物水溶液的方式，可防止复合粒子凝聚。
130.当预先调制阴离子聚合物水溶液时，该水溶液中阴离子聚合物的浓度优选小于等于1.7mm，更为优选小于等于1mm，进一步优选小于等于0.9mm。
131.通过预先调节到这样的浓度，当在之后的工序中与阳离子聚合物混合时，可避免粒子发生不必要的凝聚。
132.当预先调制阳离子聚合物水溶液时，该水溶液中各聚合物的浓度优选小于等于1.7mm，更为优选小于等于1mm，进一步优选小于等于0.9mm。
133.通过预先调节到这样的浓度，当在之后的工序中与阴离子聚合物水溶液混合时，可避免粒子发生不必要的凝聚。
134.阴离子聚合物相对于混合后的溶液的浓度优选小于等于0.9mm，更为优选小于等于0.5mm。
135.阳离子聚合物相对于混合后的溶液的浓度优选小于等于0.9mm，更为优选小于等于0.5mm。
136.作为混合的方法，例如有一次混合各种溶液的方法，向一种溶液中滴入其他溶液的方法等。从避免凝聚的观点出发，均优选一边搅拌溶液一边进行混合。
137.如此制造的复合粒子优选通过与任意成分结合而形成皮肤外用组合物的形式。作为皮肤外用组合物，可以是药品、准药品、化妆品中的任意一种形式。
138.作为任意成分，可例如是脂肪酸皂(月桂酸钠，棕榈酸钠等)、月桂基硫酸钾、烷基硫酸盐三乙醇胺醚等阴离子型表面活性剂，硬脂基三甲基氯化铵、苯扎氯铵、月桂基胺氧化物等阳离子型表面活性剂，咪唑啉两性表面活性剂(2-椰油基-2-咪唑啉氢氧化物-1-羧乙氧基二钠盐)，甜菜碱型表面活性剂(烷基甜菜碱，氨基甜菜碱，磺基甜菜碱等)、酰基甲基牛磺酸等两性表面活性剂，脱水山梨醇脂肪酸酯(脱水山梨醇单硬脂酸酯，脱水山梨醇倍半油酸酯等)、甘油脂肪酸(甘油单硬脂酸酯等)、丙二醇脂肪酸酯类(丙二醇单硬脂酸酯等)、氢化蓖麻油衍生物、甘油烷基醚、poe脱水山梨糖醇脂肪酸酯(poe脱水山梨聚糖单油酸酯，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单硬脂酸酯)、poe山梨糖醇脂肪酸酯(poe-山梨糖醇单月桂酸酯)、poe甘油脂肪酸酯(poe-甘油单异硬脂酸酯等)、poe脂肪酸酯(聚乙二醇单油酸酯，二硬脂酸poe等)、poe烷基醚(poe2-辛基十二烷基醚等)、poe烷基苯基醚(poe壬基苯基醚等)、聚醚(
プルロニック
)类、poe
·
pop烷基醚(poe
·
pop 2-癸基十四烷基醚等)、特窗类、poe蓖麻油/氢化
蓖麻油衍生物(poe蓖麻油，poe硬化蓖麻油等)、蔗糖脂肪酸酯、烷基糖苷等非离子表面活性剂，吡咯烷酮羧酸钠、乳酸、乳酸钠等保湿成分，可接受表面处理的、云母、滑石、高岭土、合成云母、碳酸钙、碳酸镁、无水硅酸(二氧化硅)、氧化铝粉末、硫酸钡等粉末类，可接受表面处理的、氧化钴、群青、沥青、氧化锌的无机颜料，可接受表面处理的氧化铁二氧化钛烧结结体的复合颜料，可接受表面处理的、云母钛、鱼磷箔、氯氧化铋等珠光剂类，可被色淀化的、红色202号、红色228号、红色226号、黄色第4号、蓝色404号、黄色5号、红色505号、红色230号、红色223号、橙色201号、红色213号、黄色204号、黄色203号、蓝色1号、绿色201号、紫色201号、红色204号等有机色素类，聚乙烯粉末、聚甲基丙烯酸甲酯、尼龙粉末、有机聚硅氧烷弹性体等有机粉末类，乙醇和异丙醇等低级醇类，维生素a或其衍生物、维生素b6盐酸盐、维生素b6三棕榈酸酯、维生素b6二辛酸、维生素b2或其衍生物、维生素b12、维生素b15或其衍生物等维生素b类、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚、维生素e乙酸酯等维生素e类、维生素d类、维生素h、泛酸，泛硫乙胺、吡咯喹啉醌等维生素类。
139.＜第二发明＞
140.本发明的制造方法，其技术特征在于：在ph小于等于5的水系溶剂中混合阴离子聚合物和肽。下面分别对发明的要件进行详细说明。
141.本发明中可使用的阴离子聚合物的实施方式可直接使用上述＜第一发明＞中的说明。
142.作为本发明中可使用的肽，只要是对人体无害就没有限制，既可以是由相同氨基酸残基构成的肽，也可以是由多种氨基酸残基构成的肽。
143.肽既可以是天然物质也可以是合成物质，再有，也可以使用天然物质或合成物质的蛋白质分解得到的肽。再有，也可使用经过化学修饰的肽。
144.具体而言，可例如是水溶性胶原蛋白、寡肽-24(egf合成肽，13个氨基酸序列，分子量1271)，乙酰基十肽-3(fgf合成肽)，寡肽-34(tgfβ合成肽，13个氨基酸序列，分子量1468)，寡肽-20(igf合成肽，12个氨基酸序列，分子量1476)，聚赖氨酸，聚精氨酸等，尤其适用例如水溶性胶原蛋白、寡肽-20和聚精氨酸。
145.在本发明的制造方法中，将上述阴离子聚合物和肽在水系溶剂中混合。
146.此处，所谓水系溶剂，是指水(例如净化水，离子交换水，自来水等)或水溶性成分的水溶液。作为水溶性成分，没有特殊限制，只要是不损害本发明效果的物质均可使用，例如是通常混合到化妆品或准药品(医薬部外品)等中的粉末、保湿剂、增稠剂、防腐剂等添加剂。此外，当混合高融点的水溶性成分时，可预先加热使其均匀溶解在水中备用，但在水溶性成分溶解后，优选使水溶液恢复到室温后再用于制造复合粒子。
147.水系溶剂的ph上限小于等于5，优选小于等于4.5，更为优选小于等于4.2。
148.再有，水系溶剂的ph下限没有特殊限定，优选大于等于1，更为优选大于等于2，进一步优选大于等于2.5。
149.当使用水溶性胶原蛋白作为与阴离子聚合物相结合的肽时，设置为水系溶剂的ph优选小于等于4，更为优选小于等于3.5，进一步优选小于等于3。
150.此时ph的下限没有特殊限定，但可设置为优选大于等于2，更为优选大于等于2.5，进一步优选大于等于2.7。
151.再有，当使用寡肽-20作为与阴离子聚合物相结合的肽时，设置为水系溶剂的ph优
选小于等于4.5，更为优选小于等于4，进一步优选小于等于3.5。
152.此时ph的下限没有特殊限定，但可设置为优选大于等于2，更为优选大于等于2.5，进一步优选大于等于2.7，更进一步优选大于等于2.75。
153.进而，当使用聚赖氨酸作为与阴离子聚合物相结合的肽时，设置为水系溶剂的ph优选小于等于4.7，更为优选小于等于4.4，进一步优选小于等于4.2。
154.此时ph的下限没有特殊限定，但可设置为优选大于等于2，更为优选大于等于2.5，进一步优选大于等于3，更进一步优选大于等于3.5。
155.在水系溶剂中混合阴离子聚合物和肽时的方式没有特殊限定。
156.在本发明中，优选的方式是：分别预先另行调制阴离子聚合物水溶液和肽水溶液，将它们混合。
157.通过像这样混合另行调制的各聚合物水溶液的方式，可防止复合粒子凝聚。
158.预先调制的阴离子聚合物水溶液和肽水溶液各自的ph没有特殊限定，只要混合后水系溶剂的ph在上述范围内即可。
159.也可不特别设置用于调制混合后水系溶剂的ph的工序，而是混合预先调制到需要的ph的阴离子聚合物水溶液和肽水溶液的方式。
160.再有，从简化制造工序的观点出发，优选在混合阴离子聚合物水溶液和肽水溶液后，通过加入酸性的水溶液来调整水系溶剂的ph的实施方式。
161.用于调制水系溶剂的ph的酸性水溶液没有特殊限定，可优选例如是柠檬酸、磷酸、苹果酸、乳酸等有机酸的水溶液。
162.当预先调制阴离子聚合物水溶液时，该水溶液中阴离子聚合物的浓度优选小于等于1.7mm，更为优选小于等于1mm，进一步优选小于等于0.9mm。
163.通过预先调节到这样的浓度，当在之后的工序中与肽混合时，可避免粒子发生不必要的凝聚。
164.当预先调制肽水溶液时，该水溶液中各聚合物的浓度优选小于等于5.1mm，更为优选小于等于3mm，进一步优选小于等于2.7mm。
165.通过预先调节到这样的浓度，当在之后的工序中与阴离子聚合物水溶液混合时，可避免粒子发生不必要的凝聚。
166.此处所说的肽的摩尔浓度，是用组成比乘以组成的氨基酸各自的分子量所得乘积为1摩尔而计算出的值。
167.阴离子聚合物相对于混合后的溶液的浓度优选小于等于0.9mm，更为优选小于等于0.5mm。
168.肽相对于混合后的溶液的浓度优选小于等于2.7mm，更为优选小于等于1.5mm。
169.作为混合的方法，例如有一次混合各种溶液的方法，向一种溶液中滴入其他溶液的方法等。从避免凝聚的观点出发，均优选一边搅拌溶液一边进行混合。
170.如果采用本发明的制造方法的话，则可制造与在接近中性的水系溶剂中混合阴离子聚合物和肽得到的复合粒子相比粒径大致相同或根据肽的种类而粒径更小的复合粒子。
171.并且，本发明还涉及含有阴离子聚合物和肽的复合粒子。
172.从使复合粒子渗透到皮肤内部的观点出发，设置为粒径小于等于500nm，更为优选小于等于400nm，进一步优选小于等于300nm。
173.此外，可使用粒径分布测量装置以光散射法测量粒径。
174.关于本发明的复合粒子可使用的阴离子聚合物和肽，可适用上述制造方法涉及的内容。
175.本发明的复合粒子通过与任意成分结合，可形成含复合粒子组合物。本发明还涉及在通过上述制造方法制造复合粒子后包括混合水系溶剂和其他成分的含复合粒子组合物的制造方法。
176.此外，一旦形成，复合粒子不会因ph的变化而消失。因此，水系溶剂和其他成分混合后的混合物的ph也可相较水系溶剂的ph有所变化。
177.含复合粒子组合物优选是皮肤外用组合物的形式。作为皮肤外用组合物，可以是药品、准药品、化妆品中的任意一种形式。
178.复合粒子也可与任意成分结合。任意成分可例如是上述＜第一发明＞中例举的成分。
179.【实施例】
180.＜第一发明＞
181.＜试验例1＞
182.分别调制表1所示的阴离子聚合物、阳离子聚合物的水溶液。调制浓度为阴离子聚合物水溶液0.2mm、阳离子聚合物水溶液0.2～2mm(其中肽水溶液是0.1～0.2mm)。
183.接着一边搅拌一边向各阴离子聚合物水溶液中滴入各阳离子聚合物的水溶液，以此来调制混合溶液。设置阴离子聚合物水溶液和阳离子聚合物水溶液的混合比是1：1。
184.【表1】
[0185][0186]
※
在聚合物的构建过程中，当与阳离子基同样地含有阴离子基时，将对此进行扣减的比例设为阳离子化程度。
[0187]
使用els-z2(大冢电子股份公司)测量(动态光散射法)调制好的各混合溶液，当观测到布朗运动时，判断形成了复合粒子。结果如表2所示。
[0188]
【表2】
[0189][0190]
※
在聚合物的构建过程中，当与阳离子基同样地含有阴离子基时，将对此进行扣减的比例设为阳离子化程度。
[0191]
○
···
形成了复合粒子
[0192]
×
···
未形成复合粒子
[0193]
如表2所示，阳离子化程度小于0.2的阳离子聚合物均未与透明质酸钠和聚谷氨酸钠形成复合粒子。另一方面，阳离子化程度是大于等于0.2的阳离子聚合物，均与透明质酸钠和聚谷氨酸钠形成了复合粒子。
[0194]
结果显示，对与阴离子聚合物形成复合粒子来说，阳离子聚合物的阳离子化程度大于等于0.2是很重要的。
[0195]
＜试验例2＞
[0196]
以表3所示的浓度分别另行调制透明质酸钠水溶液和二烯丙基二甲基胺盐酸盐聚合物水溶液，将它们混合，以此调制实施例1～6的复合粒子的水溶液。
[0197]
使用els-z2(大冢电子股份公司)测量(动态光散射法)在实施例1～6的水溶液中形成的复合粒子的粒径。结果如表3所示。
[0198]
【表3】
[0199][0200]
如表3所示，可确认在实施例1和2的水溶液中粒子的粒径明显很大，因此认识到所形成的复合粒子凝聚了。
[0201]
对于实施例3的水溶液，可确认调制后马上形成了粒径较小的复合粒子。但是，放置30分钟后，可见粒径增大，因此认识到水溶液的静置会导致复合粒子凝集。
[0202]
另一方面，可确认在实施例4～6的水溶液中形成了小于200nm的小粒径的复合粒子。并且，即使将其放置大于等于30分钟也未见粒径增大。
[0203]
以上结果显示，当预先调制阴离子聚合物水溶液和阳离子聚合物水溶液，通过将其混合制造复合粒子时，从避免复合粒子凝聚的观点出发，优选调制的浓度为阴离子聚合物水溶液小于等于1.7mm，而阳离子聚合物水溶液或肽水溶液小于等于1.7mm。
[0204]
＜试验例3＞
[0205]
采用与试验例1相同的方法，调制含有复合粒子的水溶液，所述复合粒子是透明质酸钠和表4所示的伯胺或季铵的阳离子聚合物的复合粒子。
[0206]
【表4】
[0207][0208]
通过向调制的复合粒子水溶液中加入由活体内常见的离子构成的pbs缓冲液，检查在模拟活体内环境中放置的复合粒子会表现出何种行为。
[0209]
具体而言，向调制的复合粒子水溶液中添加pbs，采用与试验例2相同的方法测量水溶液中复合粒子的粒径。结果如图1所示。
[0210]
如图1所示，由透明质酸钠与季铵的二烯丙基二甲基胺盐酸盐聚合物或者阳离子淀粉形成的复合粒子，通过添加pbs而粒径增大。
[0211]
另一方面，透明质酸钠和伯胺的鱼精蛋白或聚赖氨酸形成的复合粒子，在pbs添加量是100％时(与皮肤内相同的环境)呈几乎无法测量粒径的状态。
[0212]
该结果显示，阴离子聚合物和季铵以外的伯～叔胺的阳离子聚合物形成的复合粒子，在皮肤内等活体环境下发生崩解。
[0213]
即该结果启示，该复合粒子既具有皮肤渗透性，且具有到达皮肤内部后崩解，使作为构成要件的聚合物扩散的性质。
[0214]
＜试验例4＞
[0215]
制作表5所示配方的乳化制剂，即在用均质混合器搅拌水相的状态下，加入油相，得到乳化制剂。
[0216]
荧光素胺标记透明质酸钠使用平均分子量120万的岩井化学药品公司生产的产品。此外，荧光素胺标记透明质酸钠也可按照文献j gene med 2008；10:70-80中记载的方法进行合成。
[0217]
再有，水相成分的调制方式是：先搅拌混合荧光素胺标记透明质酸钠水溶液和聚赖氨酸水溶液，向其中加入柠檬酸溶液后再加入其它水性成分。
[0218]
【表5】
[0219][0220]
将人体皮肤碎片(碧欧普瑞迪克公司(
バイオプレディック
社))装设在有效透过面积1.77cm2的垂直型扩散池上，在接收室侧(真皮侧)使用4ml的pbs。之后，在供给室侧使用1ml的实施例7和比较例1的制剂，进行24小时处理。
[0221]
将处理的皮肤回收，在用纯水多次冲洗皮肤表层的剩余制剂后，在50％甲醇水溶液中均质化，然后通过离心分离(15400
×
g、25℃、5分钟)得到皮肤提取液。
[0222]
用以下条件，对该皮肤提取液和只有荧光素胺标记透明质酸钠的标准水溶液进行hplc分析。图2示出使用了实施例7和比较例1的各制剂的皮肤提取液中的荧光强度测量结果。此外，该荧光是只与分析上述标准水溶液后得到的来自荧光素胺标记透明质酸钠的峰值相一致地计算出的。
[0223]
·
分析装置：agilent 1260
[0224]
·
色谱柱：ymc-pack diol-300、300
×
8.0mml.d.,s-5μm,30nm
[0225]
·
流动相：10mm乙酸铵/甲醇＝80/20
[0226]
·
流速：1.0ml/分
[0227]
·
温度：40℃
[0228]
·
波长：λ
ex
＝494nm，λ
em
＝521nm
[0229]
进而，以下述条件对使用了实施例7制剂的皮肤提取液、含有荧光素胺标记透明质酸钠和聚赖氨酸的复合粒子的标准水溶液、以及只有荧光素胺标记透明质酸钠的标准水溶液进行fff分析。
[0230]
·
分析装置：af2000mf流fff系统(af2000mfflowfffsystem)(af4)
[0231]
·
分离通道：af2000分析通道(af4)350μm
[0232]
·
流动相：10mm乙酸铵/甲醇＝80/20
[0233]
·
检测流速：0.5ml/分
[0234]
·
交叉流流速：1.0ml/分
[0235]
·
波长：λ
ex
＝494nm，λ
em
＝521nm
[0236]
如图3所示，使用了实施例7制剂的皮肤提取液与只有荧光素胺标记透明质酸钠的标准水溶液的洗脱时间-强度曲线几乎一致。
[0237]
该结果显示，由荧光素胺标记透明质酸钠和聚赖氨酸构成的复合粒子在渗透到皮肤后崩解，在皮肤内释放非凝聚态的透明质酸。
[0238]
试验例3和4的结果显示，阴离子聚合物和是伯胺～叔胺的阳离子聚合物形成的复
合粒子可将与内源性的阴离子聚合物(透明质酸等)相同状态的阴离子聚合物导入皮肤内部，可提高皮肤的屏障功能。
[0239]
＜第二发明＞
[0240]
另行调制透明质酸水溶液、聚赖氨酸、寡肽-20以及水溶性胶原蛋白的各肽水溶液。并且，将各水溶液调制为透明质酸水溶液是80.2μg/ml，聚赖氨酸水溶液是24.0μg/ml，寡肽-20水溶液是88.2μg/ml，水溶性胶原蛋白水溶液是21.87μg/ml。
[0241]
接着，通过一边搅拌一边向透明质酸水溶液中滴入各肽水溶液来调制混合溶液。此时，各肽水溶液相对于透明质酸水溶液以容积比是0.8～1的比例滴入。之后，逐次少量添加1～3％的柠檬酸水溶液，调整到表6～8所示的ph。
[0242]
【表6】
[0243]
透明质酸/聚赖氨酸微粒子系统
[0244][0245]
【表7】
[0246]
透明质酸/寡肽-20微粒子系统
[0247][0248]
【表8】
[0249]
透明质酸/水溶性胶原蛋白微粒子系统
[0250]
ph5.552.912.7粒径(nm)-197.2297.6微粒子形成
×○○
[0251]
使用els-z2(大冢电子股份公司)测量如此调制的混合溶液，测量出该溶液中形成的透明质酸和肽的复合粒子的粒径。其结果如表6～8所示。
[0252]
再有，基于该测量结果，将混合溶液中形成的复合粒子按以下的标准分为三个阶段进行评估的结果也如表6～8所示。
[0253]
(有无形成微小的复合粒子的评估标准)
[0254]
○
：形成小于300nm的粒子
[0255]
△
：形成大于等于300nm、小于500nm的粒子
[0256]
×
：未见形成粒子
[0257]
如表6所示，对于透明质酸和聚赖氨酸的结合，可确认即使在混合溶液的ph是接近中性时也有微小粒径的复合粒子形成。但是在混合溶液处于5.15～5.64的ph区域时，没有形成微小的复合粒子。
[0258]
再有，如表7和8所示，对于透明质酸和寡肽-20的复合粒子，以及对于透明质酸和水溶性胶原蛋白的复合粒子，在混合溶液ph大于5的区域没有形成微小的复合粒子。
[0259]
另一方面，如表6～8所示，无论是哪种肽，当与透明质酸混合时混合溶液的ph小于等于5时，形成粒径小于等于500nm的微小的复合粒子。
[0260]
结果显示，在制造含有阴离子聚合物和肽的复合粒子时，要制造微小的复合粒子，在ph小于等于5的水系溶剂中混合这些聚合物是很重要的。
[0261]
【工业实用性】
[0262]
本发明可用于化妆品。