光活化的血液制品和用于制造和使用其的方法和设备与流程

1.本发明的主题涉及血浆制品和用于制造和使用其的方法和设备。


背景技术：

2.自体富含血小板的血浆(aprp)用于多种治疗目的。已知prp的某些治疗组分(诸如生长因子)的浓度影响许多治疗用途(例如组织再生长)的结果。prp是非手术治疗，通过注射给予。它与干细胞的不同之处在于它使用在血浆中发现的愈合因子来愈合关节中的退行性损伤或急性损伤。
3.对于给定的患者，在它们的自体血液制品内的生长因子的增强可以导致增强的组织生长。因此，需要增加血液和血液制品诸如富含血小板的血浆的组合物中生长因子(例如血小板衍生的生长因子)的浓度的方法。
4.干细胞疗法还典型地是通过注射给予的非手术治疗，其使用患者自身的干细胞来加速愈合。干细胞是未分化的细胞，当它们分化时变成其他类型的细胞。存在四种主要类型的干细胞，即，脐带血/羊水干细胞、胚胎干细胞、非胚胎(成体)干细胞和诱导的多能干细胞(ipsc)。
5.出生前或出生时获得脐带血/羊水干细胞，并且冷冻供随后使用。这种类型的干细胞仅可用于父母预先储存了这些细胞的个体，因此对于寻找干细胞治疗的老年患者，不能获得这些细胞。
6.胚胎干细胞是“创造者”细胞，其可以被诱导以发展成几乎所有类型的组织。在一些情况下，这可以是有益的，但是在其他情况下，这是有害的，因为细胞可能发展成肿瘤而不是所希望的组织类型。此外，由于这些不是自体干细胞，它们可能被排斥。相比之下，成体干细胞是具有有限转化范围的“修复”细胞。而且，由于这些细胞通常来源于患者自己的身体，即，是自体干细胞，不存在排斥的风险。
7.成体干细胞可以获得自多种来源，虽然主要来源是骨髓源性干细胞和脂肪源性干细胞，但是于患者的外周血中也发现了干细胞。
8.诱导的多能干细胞(ipsc)是成体细胞，其通过被迫表达对维持胚胎干细胞的限定特性重要的基因和因子而被遗传地重新编程为胚胎干细胞样状态。
9.ipsc技术由日本京都的shinya yamanaka实验室开创，该实验室在2006年示出引入四种编码转录因子的特定基因(命名为myc、0ct3/4、sox2和klf4)可以将体细胞转化成多能干细胞。yamanaka的组使用逆转录病毒系统用相同的四个关键基因oct4、sox2、klf4和cmyc成功地将人成纤维细胞转化至ipsc中(takahashi et al.,cell.131(5):861-72(2007))。除了成纤维细胞外，ipsc也可以由人角质化细胞和外周血细胞产生。
10.由于ipsc可以直接衍生自成人组织，它们不仅绕过对胚胎的需要，而且可以以患者匹配方式制备，这意味着每个个体可以具有其自身的多能干细胞系，而没有免疫排斥的风险。
11.据信一旦给予干细胞，在损伤位点的细胞因子将干细胞吸引到它们需要的地方。
一旦存在，各种生长因子可以影响干细胞分化。
12.注射到区域中的干细胞本身可以保持相对静止。在没有prp或其一些组分也存在的情况下，干细胞往往不能很好地发挥作用。prp贡献生长因子和刺激蛋白质，其直接影响干细胞。信号因子指示身体将干细胞送至损伤区域并且同时引起干细胞再生并开始修复。
13.在美国之外，治疗医师可能通常从骨盆或髋部提取骨髓，和/或提取脂肪组织(脂肪)，以及从所提取的样品中分离干细胞。然后可以使用一种或多种生长因子激活和增殖干细胞。在这种激活过程中，可以定制干细胞用于治疗中的应用目的。例如，可以激活它们以建立心脏的肌肉组织、重建四肢或肺中的血管或进入中枢神经系统的神经细胞。
14.在美国，目前的法律不允许治疗医师将干细胞与外源生长因子混合。因此，治疗依赖于内源性生长因子以引起干细胞分化成期望的组织类型。
15.由于内源性生长因子(与外源生长因子相反)存在于患者自身的富血浆蛋白质(prp)中，因此开发了各种不同的治疗，其中将干细胞(包括脂肪干细胞和/或骨髓衍生的干细胞)与富血浆蛋白质(prp)一起给予。prp中的生长因子可以引起干细胞分化。干细胞(外周血干细胞)也存在于prp中，可以将这些干细胞与源自脂肪组织和/或骨髓的干细胞组合。在一些情况下，人类生长激素(hgh)连同prp和干细胞一起给予。
16.使用prp的一个限制是生长因子的量是有限的。生长因子可以单独帮助伤口愈合，可以帮助干细胞分化为其他类型的细胞，这些细胞帮助伤口愈合。提供增加prp中内源性生长因子的量的方法将是有利的，特别是当与干细胞疗法组合时。


技术实现要素：

17.根据一些实施方式，方法包括通过控制施加于一定量的血液的光的光谱含量处理一定量的血液，使得在一定量的血液中的生长因子的浓度增加。从处理一定量的血液中提取包含生长因子的血浆制品。
18.在一些实施方式中，控制所施加的光的光谱含量可以包括提供在从约600nm至约1500nm的波长范围内具有增强的功率的光。在进一步的实施方式中，控制所施加的光的光谱含量可以包括提供在从约600nm至约900nm的波长范围内具有增强的功率的光，并且其中生长因子包括血小板衍生的生长因子(pdgf)。提供在从约600nm至约900nm的波长范围内具有增强的功率的光可以包括使用发光二极管(led)光源照射所述一定量的血液。
19.根据进一步的方面，方法可以还包括控制所施加的光的辐射能。控制所施加的光的辐射能可以包括控制所施加的光的暴露时间。
20.在一些实施方式中，控制所施加的光的光谱含量可以包括用固态光源照射所述一定量的血液。固态光源可以包括led光源。led光源可以具有在从约600nm至约1500nm的波长范围内的最大光谱功率。
21.根据进一步的实施方式，控制所施加的光可以包括用光谱选择性选择性光源照射含有所述一定量的血液的透明容器，同时将该透明容器容纳在封闭体中，该封闭体阻挡容器暴露于环境光。
22.在一些实施方式中，方法可以还包括将治疗有效量的包含血浆制品的组合物给予受试者的组织以促进组织再生。组合物中生长因子的浓度可以比从一定量的血液来源中分离的富含血小板的血浆的未照射样品高至少约50％。所述一定量的血液可以来源于受试
者。
23.仍进一步的实施方式提供包括封闭体的设备，该封闭体配置为用于将载血容器(blood-carrying vessel)安装在其中，使得所安装的容器中的血液被屏蔽免受环境光的影响。设备还包括光源，该光源在封闭体中并且配置为将安装的容器中的血液暴露于具有在从约600nm至约1500nm的波长范围内的最大光谱功率的光。光源可以配置为将安装的容器中的血液暴露于具有在约600nm至约900nm的范围内的最大光谱功率的光。光源可以包括led光源。
24.在一个实施方式中，公开了用于增加生物样品中的一种或多种生长因子(例如血小板衍生的生长因子)的浓度的方法，包括用光照射样品，该生物样品可以是自体样品。
25.在另一个实施方式中，公开了通过用光照射血液和/或血液制品用于增加血液和/或血液制品(包括但不限于自体组合物)的组合物中的生长因子的浓度的方法。
26.在这些实施方式的一些方面中，组合物包括来源于受试者的血液样品(即自体样品)。在该实施方式的其他方面，组合物包含全血或全血的部分(例如富含血小板的血浆，包括自体富含血小板的血浆)。
27.在另一个实施方式中，公开了用于增加富含血小板的血浆的样品中的生长因子的浓度的方法。方法涉及用光照射全血样品，以及从照射的全血样品中分离富含血小板的血浆的样品。
28.在又一个实施方式中，还公开了包含照射血液、血液制品或prp的组合物，该组合物包含增强浓度的一种或多种生长因子。在该实施方式的一个方面中，该组合物包含照射的自体富含血小板的血浆(prp)，其中自体生长因子在组合物中的浓度比从相同自体来源分离的富含血小板的血浆的未照射样品高至少约30％、优选地至少40％、以及还更优选地至少50％。
29.在一些实施方式中，自体生长因子的浓度比从同一自体来源分离的富含血小板的血浆的未照射样品高至少约100％、至少150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％、至少约350％、至少约400％、至少约450％或至少约500％。
30.在一些实施方式中，组合物不包含外源生长因子。在一些实施方式中，生长因子是血小板衍生的生长因子。在其他实施方式中，组合物进一步包含一种或多种外源生长因子。在仍其他实施方式中，组合物进一步包含人生长激素(hgh)、hgh的类似物和/或促进hgh释放的化合物。
31.在一些实施方式中，将组合物与干细胞组合。在实施方式中，干细胞是自体干细胞，以及在其他实施方式中，干细胞是胚胎干细胞。代表性的自体干细胞包括脂肪组织来源的干细胞、外周血来源的干细胞和骨髓来源的干细胞。间充质干细胞(msc)是多能基质细胞，其可以分化成多种细胞类型，包括成骨细胞(骨细胞)、软骨细胞(chondrocyte，cartilage cells)、肌细胞(肌肉细胞)和脂肪细胞(产生骨髓脂肪组织的脂肪细胞)。在这些实施方式的一些方面，还存在人生长激素、其类似物和/或促进人生长激素的产生和/或释放的化合物。
32.这些组合物可以用于治疗另外可用干细胞治疗的受试者，其中一种或多种生长因子的浓度增加有助于干细胞分化成期望的组织类型和/或提供其他的健康益处。
33.还公开了用这些组合物治疗患者的方法。可以给予组合物以促进组织生长、修复
关节等。在一些实施方式中，组合物是prp，在一些方面，prp从全血的自体样品中分离。
34.治疗方法包括在有需要的受试者中促进组织再生，包括伤口愈合。这些方法涉及将治疗有效量的组合物给予该受试者的组织，该组合物包含经照射的自体富含血小板的血浆。一种或多种自体生长因子(在一个实施方式中是或包含血小板衍生的生长因子(pdgf))在组合物中的浓度比从同一自体来源分离的富含血小板的血浆的未照射样品高至少约50％。
35.在这些实施方式的一个方面中，组合物中的自体生长因子(诸如pdgf)的浓度比分离自相同自体来源的富含血小板的血浆的未照射样品高至少约50％。在这些实施方式的一个方面，组合物是或包含富含血小板的血浆，其可以但不必须分离自全血的自体样品。
36.在一些实施方式中，将包含富含血小板的血浆的组合物注射到受试者的组织中或直接注射到一个或多个关节中。在其他实施方式中，将组合物局部施用至组织。
37.在一些实施方式中，组织再生包括增加毛发生长、减少皮肤皱纹、减少皮肤中的细纹、增加皮肤弹性或治疗烧伤。
38.可以例如通过向受试者的皮肤(诸如受试者的头皮)给予治疗有效量的包含经照射的自体富含血小板的血浆的组合物来促进头发生长。在一些实施方式中，受试者的皮肤包括多个毛囊。该组合物可以局部施用或注射到皮肤(诸如头皮)中。
39.可以减少皮肤中的皮肤皱纹和细纹，并且可以增加皮肤弹性，例如，通过将组合物局部应用至皮肤或将组合物注射至皮肤。
40.可以通过将组合物局部施用到烧伤的皮肤上来处理烧伤。
41.在其他实施方式中，对其有需要的受试者患有腱损伤、肌腱病、肱骨外上髁炎、膝盖骨肌腱病、足底筋膜炎、旋转套肌腱病、阿基里斯肌腱病(achilles tendinopathy)，经历了旋转套修复，经历了阿基里斯肌腱修复、来自关节炎的关节损伤、骨关节炎、踝关节扭伤、骨折、具有骨折不愈合的骨折、肌肉损伤和/或肌肉拉伤。在这些实施方式的一些方面中，骨关节炎是膝、肩、肘、髋、背、手和/或脚的骨关节炎。用于治疗这些受试者的方法涉及矫形组织再生，包括使用本文描述的组合物再生腱、肌肉、软骨、韧带和/或骨。可以将组合物注射到受损的关节中，或在骨已经骨折的地方或附近，或肌肉、韧带或肌腱已经受伤的地方或附近。
42.在一个实施方式中，用于增加样品(诸如血液或血液制品，包括富含血小板的血浆)中的生长因子的浓度的方法(无论样品是否是自体的)涉及用具有至少约600纳米(例如约600纳米至约1500纳米)的波长的光照射样品。在一些实施方式中，光具有至少约650纳米、至少约700纳米、至少约750纳米、至少约800纳米、至少约850纳米、至少约900纳米、至少约950纳米、至少约1000纳米或在约1000至约1500纳米之间的波长。在一些实施方式中，光不包括紫外光。
43.在一些实施方式中，使用波长的组合。在这些实施方式的一些方面，每个波长促进不同生长因子的产生。在一些实施方式中，生长因子是血小板衍生的生长因子。
44.在一些实施方式中，全血对光的辐射暴露为至少约1j/cm2、至少约2j/cm2、至少约3j/cm2、至少约4j/cm2、至少约5j/cm2、至少约6j/cm2、至少约7j/cm2、至少约8j/cm2、至少约9j/cm2、至少约10j/cm2、至少约11j/cm2、至少约12j/cm2、至少约13j/cm2、至少约14j/cm2、至少约15j/cm2、至少约20j/cm2、至少约25j/cm2、至少约30j/cm2、至少约35j/cm2、至少约40j/
cm2、至少约45j/cm2或至少约50j/cm2。
45.在一些实施方式中，用光照射全血至少约1秒、至少约2秒、至少约3秒、至少约4秒、至少约5秒、至少约6秒、至少约7秒、至少约8秒、至少约9秒、至少约10秒、至少约20秒、至少约30秒、至少约40秒、至少约50秒、至少约60秒、至少约2分钟、至少约3分钟、至少约4分钟、至少约5分钟、至少约6分钟、至少约7分钟、至少约8分钟、至少约9分钟、至少约10分钟、至少约20分钟、至少约30分钟、至少约40分钟、至少约50分钟或至少约60分钟。
46.在一些实施方式中，光具有至少约600纳米的波长，并且全血对光的辐射暴露为至少约5j/cm2。在一些实施方式中，照射全血至少约1分钟。
47.在一些实施方式中，光具有至少约700纳米的波长，以及全血对光的辐射暴露为至少约7j/cm2。在一些实施方式中，照射全血至少约5分钟。
48.在一些实施方式中，光具有至少约800纳米的波长，以及全血对光的辐射暴露为至少约9j/cm2。在一些实施方式中，照射全血至少约7分钟。
49.在一些实施方式中，光具有至少约850纳米的波长，以及全血对光的辐射暴露为至少约10j/cm2。在一些实施方式中，照射全血至少约10分钟。
50.在一些实施方式中，光是非相干光，包括led和oled光。在其他实施方式中，光是激光。在仍其他实施方式中，使用光源的组合。
51.在一些实施方式中，在暴露期间搅拌全血样品。在一些实施方式中，搅拌包括机械搅拌。在一些实施方式中，搅拌包括使全血流过照射室。在一些实施方式中，搅拌包括将全血泵送穿过照射室。在一些实施方式中，搅拌包括移动含有全血的容器(例如光学透明容器)。在一些实施方式中，搅拌包括倒置含有全血的容器。在一些实施方式中，搅拌包括滚动包含全血的容器。
52.在一些实施方式中，从照射的全血样品中分离富含血小板的血浆样品包括：离心照射的全血样品以分离全血的组分；去除贫血小板血浆的一部分；将血小板再悬浮于剩余量的贫血小板血浆中以给出富含血小板的血浆的样品；和从全血的剩余组分中分离富含血小板的血浆。在一些实施方式中，富含血小板的血浆是在照射的约10分钟内从被照射的全血样品中分离的。
53.在以下具体实施方式中阐述了本公开的附加特征和优点。
附图说明
54.图1是示出了根据一些实施方式的用于制造血浆制品的操作的示图。
55.图2是示出了根据进一步的实施方式的用于制造经照射的富含血小板的血液制品(prp)以及用光照射的prp治疗受试者的操作的示图。
56.图3是根据一些实施方式的用于用光谱选择性光照射血液的设备的侧视图。
57.图4是图3的设备的顶视图，其中顶盖被移除。
58.图5是示出根据一些实施方式制造的富含血小板的血液制品(prp)中的血小板衍生的生长因子(pdgf)的浓度变化的图。
59.图6是示出根据进一步的实施方式制造的prp中pdgf的变化的图。
60.图7是示出响应于用850nm光照射全血prp中vegf水平的图。
61.图8是示出基于用于照射全血的光的波长，在由光照射的全血制造的prp中pdgf的
百分比变化的图。
62.图9是示出了当在分离prp之前在各种波长和辐射暴露水平下照射全血时，prp中pdgf相对于未处理对照的百分比变化的图。
63.图10是示出当以各种波长和剂量照射全血时，相对于未处理对照，prp中vegf百分比变化的图。
64.图11是示出在不同波长和剂量下照射prp时，相对于未处理对照，prp中的pdgf百分比变化的图。
65.图12是示出了当在不同波长和剂量下照射prp时，相对于未处理的对照，prp中vegf百分比变化的图。
66.图13是根据一些实施方式的血液处理设备的透视图。
具体实施方式
67.一些实施方式提供了制备血液和/或血液制品(诸如富含血小板的血浆(prp))的样品的方法，该血液和/或血液制品包含升高浓度的某些生长因子，诸如血小板衍生的生长因子。在一些实施方式中，血液或血液制品是分离自受试者的自体组合物，并且相对于分离自同一受试者的其他样品，生长因子(例如血小板衍生的生长因子)的浓度升高。血液或血液制品可以用于促进组织生长，例如毛发生长。
68.一些实施方式涉及照射全血以增加全血以及所得血液制品(例如富含血小板的血浆)中的某些生长因子(诸如血小板衍生的生长因子)的浓度的方法。如本文所阐述的，全血对光的波长和辐射暴露可以影响全血和所得血液制品中生长因子的相对增加。可以将经照射的血液和所得血液制品给予回最初采集全血的受试者(例如全血和/或血液制品可以是自体的)。
69.全血和/或血液制品可以用于治疗疾病和/或用于美容目的。例如，富含如本文教导的血小板衍生的生长因子的自体血小板衍生血浆可以用于促进组织生长，例如促进毛发生长或再生长。
70.本公开教导了增加在从受试者分离的血液或血液制品的组合物中的生长因子诸如血小板衍生的生长因子的浓度的方法。如本文所阐述的，与分离自未经照射的相同受试者的全血相比，可以用光照射分离自受试者的全血以增加生长因子(例如血小板衍生的生长因子)的浓度。因此，本公开允许制备可以富集自体生长因子(诸如血小板衍生的生长因子)的血液或血液制品的自体样品。
71.本文描述的组合物和方法的优点是它们用患者自身的生长因子富集患者自身(即自体)血液样品。这可以减少或消除在将那些血液制品给予受试者(例如用于治疗目的)之前向血液或血液制品中添加外源生长因子(诸如血小板衍生的生长因子)的需要。本文公开的方法减少了向自体血液或血液制品添加其他外源化学品以增加血液或血液制品中生长因子的浓度的需要。
72.另一个优点是可以基于光应用参数的选择可预测地调节血液或血液制品中生长因子(例如血小板衍生的生长因子)的富集量。例如，可以基于光的波长、持续时间和/或强度(例如辐射暴露)制备可以或多或少富集某些生长因子(例如血小板衍生的生长因子)的自体血液制品。
73.另一个优点是非相干光可以用于增加血液或血液制品中生长因子的浓度。因此，一些实施方式包括不需要昂贵的设备来增加血液或血液制品中生长因子的浓度的方法。
74.冠词“一(a)”和“一个(an)”在本公开中用于指代该冠词的一个或多于一个(即指代至少一个)的语法对象。举例来说，“一个元件”意指一个元件或多于一个元件。
75.除非另外指明，否则术语“和/或”在本公开中用以意指“和”或“或”。
76.如本文所使用的，术语“受试者”涵盖哺乳动物和非哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于哺乳纲的任何成员：人、非人灵长类动物诸如黑猩猩和其他猿类和猴类；农场动物，诸如牛、马、绵羊、山羊、猪；家畜诸如兔、狗和猫；实验室动物，包括啮齿动物，诸如大鼠、小鼠和豚鼠等。非哺乳动物的实例包括但不限于鸟、鱼等。在一个实施方式中，哺乳动物是人。
77.如本文所使用的，术语“自体的(autologous)”应理解为意指给定样品或组合物(例如全血或血液制品诸如富含血小板的血浆的样品或组合物)获得自特定个体(例如诸如人的个体)并且给予至同一个体(即返回至同一个体)。例如，从个体中分离全血样品并随后将相同的全血样品给予该个体是将自体全血样品给予个体的实例。类似地，从个体中分离血浆样品(例如富含血小板的血浆)并且随后将相同的血浆样品(例如富含血小板的血浆)给予回到该个体是将自体血浆(例如富含血小板的血浆)样品给予该个体的实例。
78.如本文所使用的，“矫形组织再生”是指与骨骼和相关组织和结构(诸如腱、韧带和肌肉)的畸形、疾病和损伤的矫正、预防、治疗或改善相关联的再生。
79.如本文所使用的，“伤口”是指任何受损的组织，例如在创伤或手术之后。哺乳动物中的伤口包括但不限于褥疮、溃疡、撕裂和烧伤、移植部位(移植供体和受体部位)、瘘管、牙周组织损伤、糖尿病性非愈合伤口、创伤的结果或任何手术行为。在一些实施方式中，该伤口是一种褥疮、溃疡、撕裂、烧伤、移植部位、瘘管、牙周组织损伤、糖尿病性非愈合伤口、外伤的结果或由手术引起。在一些实施方式中，该糖尿病性非愈合伤口是糖尿病性溃疡。
80.如本文所使用的，“血液制品”应理解为是指源自全血(例如自体照射的全血)的组合物。例如，血液制品可以包括富含血小板的血浆。血液制品可以是全血。在一些情况下，该富含血小板的血浆富含特定的生长因子，诸如血小板衍生的生长因子(例如如本文公开的用光照射的结果)。
81.如本文所使用的，“prp”应理解为是指富含血小板的血浆。可以如在例如cavallo et al.,biomed research international,volume 2016,article id6591717中阐述的；和/或如在dhurat and sukesh,j.cutan.aesthet.surg.2014oct-dec；7(4):189
–
197中阐述的分离和表征富含血小板的血浆，其内容以其全文通过引用结合本文。如本文所使用的，富含血小板的血浆可以包含浓度为约1.0x105至约1.0x106–
血小板/mm3的血小板。
82.如本文所使用的，“pdgf”应理解为是指血小板衍生的生长因子。写作[pdgf]，它指pdgf的浓度。pdgf是一种调节细胞生长和分裂的生长因子。pdgf配体通过两种酪氨酸激酶受体(血小板衍生的生长因子受体α(pdgfrα)和血小板衍生的生长因子受体β(pdgfrβ))充当二聚体以激活对pdgf信号的细胞反应。pdgf配体单体亚基由血小板衍生的生长因子亚基a(pdgfa)、血小板衍生的生长因子亚基b(pdgfb)、血小板衍生的生长因子c(pdgfc)和血小板衍生的生长因子d(pdgfd)编码。已知的pdgf配体包括pdgf-aa、pdgf-bb、pdgf-cc。pdgf-dd和pdgf-ab。所有pdgf信号传导都被设想为在本公开的范围内。
[0083]
pdgf通过受体酪氨酸激酶pdgfrα和pdgfrβ发信号。已经示出，pdgf诱导的迁移涉及信号通路，其涉及mek/erk、egfr、src和pi3k/akt(kim等人)。pdgf-aa通常用于将人多能干细胞(hpsc)衍生的神经祖细胞分化成少突胶质细胞前体细胞。
[0084]
血小板衍生的生长因子-bb(pdgf-bb)是血小板衍生制品中最丰富的生长因子之一并且已经显示在组织损伤后刺激再生。
[0085]
毛囊再生取决于上皮细胞与真皮乳头内的下层间充质细胞之间的相互信号传导。毛囊真皮干细胞存在于毛囊间质内，在体内自我更新，并且用来随着每个毛周期重新填充真皮乳头并且再生结缔组织鞘。血小板衍生的生长因子信号传导对于毛囊真皮干细胞功能至关重要(gonzalez et al.,npj regenerative medicine volume 2,article number:11(2017))。
[0086]
来自cns干细胞的未成熟神经元响应于pdgf而增殖。pdgf在干细胞分化的早期阶段充当分裂素以扩增未成熟神经元的库(erlandsson et al.,j.neuroscience 15may 2001,21(10)3483-3491)。pdgf对于真皮和腱成纤维细胞、血管平滑肌细胞、神经胶质细胞和软骨细胞也是促有丝分裂的。pdgf还在加速伤口愈合中与转化生长因子-1相互作用。
[0087]
如本文所使用的，“vegf”应理解为是指血管内皮生长因子。写作[vegf]，它是指vegf的浓度。vegf是参与血管生成的生长因子家族以及其他功能。vegf配体包括血管内皮生长因子a(vegfa)、血管内皮生长因子b(vegfb)、血管内皮生长因子c(vegfc)和血管内皮生长因子d(vegfd)。vegf受体包括fms相关酪氨酸激酶1(vegfr1)、激酶插入结构域受体(vegfr2)和fms相关酪氨酸激酶4(vegfr3)。设想所有vegf信号传导在本公开的范围内。
[0088]
如本文所使用的，“辐射暴露”或“通量”应理解为是指每单位面积的表面所接收的光的辐射能。辐射暴露可以以焦耳每平方厘米(j/cm2)为单位测量。
[0089]
如本文所使用的，如本文使用的术语富含血小板的血浆或prp是广义的术语，该术语以其普通意义使用并且是大于悬浮于血浆、或适合于给予人类或非人类动物的其他赋形剂的溶液中的外周血浓度的血小板浓度，溶液包括但不限于等渗氯化钠溶液、生理盐水、等渗盐水、在水中的5％右旋糖、在水中的10％右旋糖、林格溶液、乳酸盐林格溶液、乳酸林格溶液和类似物。prp组合物可以是自体制剂，该自体制剂来自取自待治疗的受试者的全血，或可替代地，可以由取自单一供体来源的全血样品或取自多个供体来源的全血样品制备prp组合物。通常，prp组合物包含血小板浓度高于全血中血小板的基线浓度的血小板。
[0090]
在一些实施方式中，prp组合物可以进一步包含wbc浓度高于全血中wbc的基线浓度的wbc。如在本文中使用的，基线浓度是指在没有通过实验室技术诸如细胞分选、离心或过滤操作样品的情况下，在患者的血液中发现的指定细胞类型的浓度，其将与在来自该患者的血液样品中发现的该细胞类型的浓度相同。当从一种以上的来源获得血液样品时，基线浓度是指在混合血液样品中发现的浓度，从该混合血液样品获得prp，而无需通过实验室技术诸如细胞分选、离心或过滤来操作该混合样品。
[0091]
在一些实施方式中，prp组合物包含相对于其基线浓度升高的血小板和wbc浓度和较低水平的rbc和血红蛋白。在一些实施方式中，仅血小板的浓度相对于基线浓度升高。prp组合物的一些实施方式包括与基线浓度相比升高水平的血小板和wbc。在一些实施方式中，prp组合物包含相对于其基线浓度升高的血小板浓度和较低水平的中性粒细胞。prp组合物的一些实施方式包括与它们的基线浓度相比升高水平的血小板和嗜中性粒细胞耗尽的
wbc。在一些实施方式中，淋巴细胞和单核细胞与中性粒细胞的比值显著高于它们的基线浓度的比值。
[0092]
prp制剂可以包含以下水平的血小板：在约1.01倍与约2倍基线之间、约2倍与约3倍基线之间、约3倍与约4倍基线之间、约4倍与约5倍基线之间、约5倍与约6倍基线之间、约6倍与约7倍基线之间、约7倍与约8倍基线之间、约8倍与约9倍基线之间、约9倍与约10倍基线之间、约11倍与约12倍基线之间、约12倍与约13倍基线之间、约13倍与约14倍基线之间或更高。在一些实施方式中，血小板浓度可以是在基线的约4倍与约6倍之间。典型地，一微升全血包含至少140,000至150,000个血小板以及高达400,000至500,000个血小板。prp组合物可以包含每微升约500,000至约7,000,000个血小板。在一些实例中，prp组合物可以包含每微升约500,000至约700,000、约700,000至约900,000、约900,000至约1,000,000、约1,000,000至约1,250,000、约1,250,000至约1,500,000、约1,500,000至约2,500,000、约2,500,000至约5,000,000、或约5,000,000至约7,000,000个血小板。
[0093]
prp组合物可以作为液体、固体、半固体(例如凝胶)、可吸入粉末或它们的一些组合递送。当prp作为液体递送时，它可以包括溶液、乳液、悬浮液等。可以通过将凝血剂(例如凝血酶、肾上腺素、钙盐)加入到prp中来制备prp半固体或凝胶。凝胶可以比溶液更粘稠，因此一旦将其递送至目标组织可以更好地保持其位置。在一些实施方式中，递送至目标组织可以包括递送至体内的治疗区域以及掺入如本文描述的细胞培养物或悬浮液中。在一些实施方式中，prp组合物是在没有凝血剂的情况下递送的。
[0094]
在一些情况下，可能期望递送作为液体的prp组合物并使其原位胶凝化或硬化。例如，prp组合物可以包括例如胶原、氰基丙烯酸酯、注射入组织后固化的粘合剂、注射入组织后固化或凝胶化的液体、缝合材料、琼脂、明胶、光活化牙科复合材料、其他牙科复合材料、丝-弹性蛋白聚合物、凝胶状蛋白混合物(bd biosciences)、水凝胶和/或其他合适的生物聚合物。可替代地，上述试剂不需要形成prp混合物的一部分。例如，上述试剂可以在prp已经被递送至目标组织之前或之后递送至目标组织以引起prp凝胶化。在一些实施方式中，prp组合物可以响应于一种或多种环境或化学因素诸如温度、ph、蛋白质等而硬化或凝胶化。
[0095]
可以使用碱性缓冲剂将prp缓冲至生理ph。该缓冲剂可以是生物相容缓冲剂，诸如hepes、tris、磷酸二氢盐、碳酸氢钠或其任何合适的组合，该组合可能能够将prp调节到生理ph在约6.5与约8.0之间。在某些实施方式中，生理ph可以是从约7.3至约7.5并且可以是约7.4。例如，缓冲剂可以是8.4％的碳酸氢钠溶液。在这些实施方式中，对于从全血中分离的每cc的prp，可以添加0.05cc的8.4％碳酸氢钠。在一些实施方式中，可以轻轻摇动注射器以混合prp和碳酸氢盐。
[0096]
如上所述，prp组合物可以包含一种或多种其他试剂、稀释剂、溶剂或其他成分。其他试剂的实例包括但不限于凝血酶、肾上腺素、胶原、钙盐、ph调节剂、促进脱粒或保存血小板的材料、其他生长因子或生长因子抑制剂、nsaids、类固醇、抗感染剂以及上述物质的混合物和组合。
[0097]
在一些实施方式中，prp组合物可以包含用于通过成像技术(诸如x射线、磁共振成像(mri)或超声)检测的造影剂。此类造影剂的实例包括但不限于x射线对比度(例如isovue)、mri对比度(例如钆)和超声对比度。
[0098]
本文描述的实施方式利用光谱控制的光来照射血液以产生具有所希望的特征(诸如某一生长因子的增强的浓度)的血液制品。如本文所使用的，控制施加于一定量血液的光的光谱含量是指在各种波长下控制施加于血液的能量的相对量。这可以例如通过提供光源来实现，该光源除了由不受控制的环境(例如宽光谱)源提供的光能之外，选择性地增加以单一波长或相对窄的波长带施加到血液的光能的量，使得施加到血液的聚集光的光谱含量是受控的。在一些实施方式中，控制施加至血液的光的光谱含量可以包括阻断环境源并限制血液暴露于由光谱选择性源产生的光，该光谱选择性源产生光谱功率集中在单个波长或相对窄带波长的光的固态光源(例如led或激光光源)。
[0099]
如本文所使用的，“固态光源”是指采用当电激活时发射光的一个或多个半导体器件的光源。这样的器件包括例如发光二极管(led)，其是将电流转换为光的半导体器件。其他固态器件(诸如激光二极管)可以类似地用于提供光。市售的固态照明设备可以包括半导体芯片，该半导体芯片包括一个或多个固态发射器(例如led)以及诸如涂层、透镜、引线和环境封装的附属结构。
[0100]
应当理解，诸如led或激光二极管的固态照明设备可以发射限于单个波长或集中在相对窄的波长范围内的光。例如，虽然激光二极管可以发射单个波长的光，但是led可以发射具有光谱分布的光，其中功率集中在峰值波长附近并且远离峰值波长下降。因此，即使led可以具有显著的峰值波长，它也可以在远离峰值波长的波长处产生衰减水平的光。一类led可以由标称峰值波长(例如650nm)表征，但是应理解的是，在给定组(例如生产批次)内的led可以具有在一定容差内与该标称峰值波长不同的峰值波长，通常，光谱功率分布可以在组内略微变化。具有不同单独光谱功率分布的led也可以组合在灯具或其他设备中，以产生具有特定光谱含量的组合光输出，该特定光谱含量是组合的组成构件的光谱贡献的总和。由固态光源产生的光可以是相干的或非相干的。
[0101]
在各种实施方式中，led和/或其他固态光源可以用于控制施加于一定量的血液的光的光谱含量，以刺激生长因子或其他血液组分的产生。例如，血小板衍生的生长因子(pdgf)在血液中的浓度可以通过使用固态光源控制施加波长范围从约600nm至约900nm的光来增加。这种光源可以是补充现有的环境(例如通常为白色)光，或者可以将待照射的所述一定量的血液放置在基本上阻挡环境光的封闭体中，使得施加于所述一定量的血液的光通常限于由固态光源提供的光。
[0102]
在一些实施方式中，从受试者分离血液样品并进行处理(例如通过用光照射样品)。在一些实施方式中，用光进行的处理可以引起血液或所得血液制品中生长因子的浓度的增加，并且可以将这种处理(即照射)的血液或血液制品给予回受试者。
[0103]
本公开教导了将包含血液或血液制品(例如富含血小板的血浆)的组合物给予受试者。在一些实施方式中，血液或血液制品可以促进受试者中的组织生长。例如，组合物可以促进受试者中毛发的生长(例如再生长)。
[0104]
本文考虑的血液或血液制品可以是非自体血液或血液制品。也就是说，在一些实施方式中，可以向受试者给予已经用光照射以增加某些生长因子的浓度并且衍生自不同受试者(例如不同个体)的血液或血液制品。例如，血液或血液制品可以是同源血液或血液制品。
[0105]
在一些实施方式中，本文公开的血液制品(例如血浆，诸如富含血小板的血浆或全
血)可以是自体样品。即，可以向受试者给予最初来源于该受试者的血液或血液制品。在一些实施方式中，自体血液或血液制品可以包含增加浓度的自体生长因子，诸如血小板衍生的生长因子。因此，在一些实施方式中，本公开可以减少或消除向衍生自受试者的样品中添加外源生长因子诸如血小板衍生的生长因子的需要。这可以帮助降低或消除由给予本文所描述的非自体血液制品引起的免疫应答(例如不利的免疫反应)的概率。
[0106]
在一些实施方式中，血液制品诸如prp包括相对于这些组分在全血中的基线浓度升高的血小板和白细胞(wbc)浓度以及更低的红细胞(rbc)和血红蛋白水平。在一些实施方式中，仅血小板的浓度相对于其在全血中的基线浓度升高。
[0107]
在一些实施方式中，血小板和wbc的浓度相对于其在全血中的基线浓度是升高的。在一些实施方式中，血液制品组合物(例如prp)包括相对于它们在全血中的基线浓度升高的血小板浓度和较低水平的中性粒细胞。在一些实施方式中，血液制品(例如prp)包括与其在全血中的基线浓度相比升高水平的血小板和嗜中性粒细胞耗尽的wbc。在一些实施方式中，血液制品(例如prp)中的淋巴细胞和单核细胞与中性粒细胞的比值显著高于其在全血中的基线浓度的比值。
[0108]
在一些实施方式中，本文所描述的血液制品(例如富含血小板的血浆)可以包含全血中处于约1.01倍和约2倍基线之间、约2倍和约3倍基线之间、约3倍和约4倍基线之间、约4倍和约5倍基线之间；约5倍和约6倍基线、约6倍和约7倍基线、约7倍和约8倍基线、约8倍和约9倍基线、约9倍和约10倍基线、约11倍和约12倍基线、约12倍和约13倍基线、约13倍和约14倍基线或更高的水平的血小板。在一些实施方式中，血小板浓度可以是在约4倍和约6倍基线之间。在一些实施方式中，一微升全血(例如未照射的全血)包含至少140,000至150,000个血小板以及高达400,000至500,000个血小板。在一些实施方式中，本文所描述的血液制品(例如，富含血小板的血浆)可以包含每微升约500,000至约7,000,000个血小板。在一些实施方式中，本文所描述的血液制品(例如，富含血小板的血浆)可以包含每微升约500,000至约700,000、约700,000至约900,000、约900,000至约1,000,000、约1,000,000至约1,250,000、约1,250,000至约1,500,000、约1,500,000至约2,500,000、约2,500,000至约5,000,000、或约5,000,000至约7,000,000个血小板。
[0109]
白细胞(wbc)浓度可以在本文所描述的血液制品中(例如在prp中)升高。例如，wbc浓度可以是全血中基线的约1.01倍和约2倍之间、基线的约2倍和约3倍之间、基线的约3倍和约4倍之间、基线的约4倍和约5倍之间、基线的约5倍和约6倍之间、基线的约6倍和约7倍之间、基线的约7倍和约8倍之间、基线的约8倍和约9倍之间、基线的约9倍和约10倍之间或更高。在一些实施方式中，一微升全血(例如未照射的全血)中的wbc计数是约4,100至4,500并且高达10,900至11,000。以微升计的本公开的组合物的wbc计数可以在约8,000和约10,000之间；约10,000和约15,000之间；约15,000和约20,000之间；约20,000和约30,000之间；约30,000和约50,000之间；约50,000和约75,000之间；以及约75,000和约100,000之间。
[0110]
在全血(例如未照射的全血)中，淋巴细胞计数可以在约1,300和4,000个细胞/微升之间，单核细胞计数可以在约200和800个细胞/微升之间，并且嗜酸性粒细胞浓度可以是约40至400个细胞/微升。在本文所公开的血液制品(例如富含血小板的血浆)中，单核细胞浓度可以小于约1,000/微升，在约1,000至约5,000/微升之间，或大于约5,000/微升。嗜酸性粒细胞浓度可以是在约200和约1,000/微升之间。在一些变体中，嗜酸性粒细胞浓度可以
小于约200每微升或大于约1,000每微升。
[0111]
在某些实施方式中，本文公开的血液制品(例如富含血小板的血浆组合物)可以包含特定浓度的中性粒细胞。嗜中性粒细胞浓度可以在小于嗜中性粒细胞的基线浓度(例如在未照射的全血中)至嗜中性粒细胞的基线浓度(例如在未照射的全血中)的八倍之间变化。在一些实施方式中，本文公开的血液制品(例如富含血小板的血浆组合物)可以包含嗜中性粒细胞，其浓度为在全血中发现的嗜中性粒细胞的水平的50％-70％、30％-50％、10％-30％、5％-10％、1％-5％、0.5％-1％、0.1％-0.5％或更少。在一些实施方式中，嗜中性粒细胞水平被耗减至全血中发现的水平的1％或更少。在一些变体中，嗜中性粒细胞浓度在全血中可以是在约0.01倍和约0.1倍基线之间、约0.1倍和约0.5倍基线之间、约0.5倍和1.0倍基线之间、约1.0倍和约2倍基线之间、约2倍和约4倍基线之间、约4倍和约6倍基线之间、约6倍和约8倍基线之间或更高。可以另外地或可替代地相对于淋巴细胞和/或单核细胞的浓度指定嗜中性粒细胞浓度。一微升全血(例如未照射的全血)可包含约2,000至7,500个嗜中性粒细胞。在一些变体中，本文公开的血液制品(例如富含血小板的血浆组合物)可以包含小于约1,000/微升、约1,000至约5,000/微升、约5,000至约20,000/微升、约20,000至约40,000/微升、或约40,000至约60,000/微升的浓度的中性粒细胞。在一些实施方式中，中性粒细胞被消除或基本上消除。耗尽嗜中性粒细胞的血液制品(诸如prp)的手段是已知的并且在美国专利号7,462,268中进行了讨论，其内容通过引用并入本文。
[0112]
在一些实施方式中，本文公开的血液制品(例如富含血小板的血浆组合物)可以包含与全血相比升高的血小板和白细胞水平，并且其中单核细胞和/或淋巴细胞与中性粒细胞的比值高于全血。在一些实施方式中，单核细胞和/或淋巴细胞与中性粒细胞的比值可以用作确定血液制品(例如prp)制剂是否可以有效地用于特定疾病或病症的治疗的指数。可以通过降低嗜中性粒细胞水平或通过在增加单核细胞和/或淋巴细胞的水平的同时维持嗜中性粒细胞水平来生成其中单核细胞和/或淋巴细胞与嗜中性粒细胞的比值增加的血液制品(例如prp)组合物。在一些实施方式中，本文公开的血液制品(例如富含血小板的血浆组合物)可以包含至少约1.01倍基线浓度的血小板以及至少约1.01倍基线浓度的白细胞，其中中性粒细胞组分从基线消耗至少1％。
[0113]
在一些实施方式中，本文公开的血液制品(例如富含血小板的血浆组合物)可以包含比全血(例如未照射的全血)中的浓度更低浓度的红细胞(rbc)和/或血红蛋白。rbc浓度可以是全血中基线的约0.01至约0.1倍、约0.1至约0.25倍、约0.25至约0.5倍、或约0.5至约0.9倍。血红蛋白浓度可以降低，并且在一些变体可以是约1g/dl或更小、在约1g/dl和约5g/dl之间、在约5g/dl和约10g/dl之间、在约10g/dl和约15g/dl之间、或在约15g/dl和约20g/dl之间。在一些实施方式中，从雄性患者抽取的全血(例如未照射的全血)可具有每微升至少4,300,000至4,500,000且高达5,900,000至6,200,000的rbc计数，而来自雌性患者的全血(例如未照射的全血)可具有每微升至少3,500,000至3,800,000且高达5,500,000至5,800,000的rbc计数。这些rbc计数可以对应于对于男性至少132g/l至135g/l并且高达162g/l至175g/l的血红蛋白水平，并且对于女性至少115g/l至120g/l并且高达152g/l至160g/l的血红蛋白水平。
[0114]
可以通过本领域已知的标准方法从受试者分离血液样品。例如，可以通过将针插入受试者的静脉中从患者抽取血液，并将血液收集在采血管(blood tube)中。
[0115]
本公开提供了通过用光照射全血来增加血液样品或血液制品中的生长因子诸如pdgf的浓度的方法。一旦照射了全血，可以将全血分离成其组分以产生血液制品(例如全血的部分，诸如富含血小板的血浆)。
[0116]
如以下实施例中所阐明的，本公开教导了与在相同波长和相同通量下用光照射血液部分(例如富含血小板的血浆)相比，用光照射全血可以增加血液中生长因子的浓度。换言之，与照射全血的部分相比，在分离全血之前照射全血在所得血液制品(例如富含血小板的血浆)中产生不同浓度的生长因子。
[0117]
例如，如实施例1所述，用850nm波长和10j/cm2通量的光照射全血和富含血小板的血浆。如图3所示，与未经光照射的全血样品相比，经照射的全血样品中血小板衍生的生长因子的浓度增加超过250％。相反，与未经光照射的富含血小板的血浆样品相比，经照射的富含血小板的血浆样品在血小板衍生的生长因子的量方面经历可忽略的变化。因此，在一些实施方式中，本公开提供了在将全血分离成其组分(例如通过离心)之前用光照射全血。
[0118]
在一些实施方式中，用于照射全血的光源可以是非相干光(例如从led或oled源产生的光)。在一些实施方式中，用于照射全血的光源可以是相干光(例如由激光器产生的光)。
[0119]
本公开提供了在照射期间控制通过全血样品的光(例如led光)的光学透射率。在一些实施方式中，至少一部分光被全血散射或吸收。在一些实施方式中，光通过全血的透射率是至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。
[0120]
在一些实施方式中，可以用一定范围或多个波长的光照射全血以增加血液中生长因子的浓度。例如，在一些实施方式中，可以用包括可见光谱(例如基本上所有可见光谱或可见光谱的一部分)的光照射全血。在一些实施方式中，可以用包括电磁光谱的紫外部分(例如基本上所有的紫外光谱或紫外光谱的一部分)的光照射全血。在一些实施方式中，可以用包括电磁谱的红外部分(例如基本上所有的红外光谱或红外光谱的一部分)的光照射全血。在一些实施方式中，可以用紫外、可见和/或红外光谱的一部分照射全血。因此，在一些实施方式中，可以同时用多个波长的光照射全血，例如通过用特定范围内的每个波长照射全血。例如，全血可用可见光谱中的所有波长和/或红外光谱中的所有波长照射。
[0121]
在一些实施方式中，本公开教导用特定波长的光照射全血。例如，在一些实施方式中，通过用特定波长的光照射全血可以调节(例如增加)特定生长因子的浓度。
[0122]
例如，如实施例2中所阐明的，所得到的富含血小板的血浆样品中的血小板衍生的生长因子的浓度随着衍生该富含血小板的血浆的全血被较长波长(即较低能量)的光照射而增加。特别地，实施例2表明，与未用光照射的全血相比，在420nm和530nm的波长下照射全血导致在所得的富含血小板的血浆样品中血小板衍生的生长因子的浓度轻微(即小于50％)增加。然而，随着全血被波长越来越长的光照射，所得富含血小板的血浆中的血小板衍生的生长因子的浓度增加。例如，与源自未照射的全血的富含血小板的血浆相比，用597nm的光照射全血导致所得富含血小板的血浆中的血小板衍生的生长因子增加约75％。类似地，与源自未用光照射的全血的富含血小板的血浆相比，在约660nm的波长下照射全血导致在富含血小板的血浆中的血小板衍生的生长因子增加约250％。与源自未用光照射的全血的富含血小板的血浆相比，在约850nm的波长下照射全血导致富含血小板的血浆中血
小板衍生的生长因子增加约275％。因此，用特定波长的光照射全血可以产生富含特定生长因子(例如血小板衍生的生长因子)的富含血小板的血浆。
[0123]
在一些实施方式中，本公开教导了用多种波长的光照射全血以同时调节(例如增加或减少)多种生长因子的浓度。例如，如实施例2中阐明的并且不希望受理论束缚，富含血小板的血浆中的血小板衍生的生长因子的浓度可以通过用至少约850nm波长的光照射衍生出该富含血小板的血浆的全血来增加。然而，如实施例2中阐明的并且不希望受理论束缚，用850nm光照射全血对其他生长因子(例如vegf)的浓度没有实质性影响。因此，在一些实施方式中，在从照射的全血中分离富含血小板的血浆之前，通过用其他波长的光照射全血可以调节(例如增加或减少)富含血小板的血浆中其他生长因子的浓度。
[0124]
在一些实施方式中，不希望受理论束缚，本公开设想两种或更多种生长因子(例如血小板衍生的生长因子和其他生长因子)可以通过一次用多种特定波长的光照射全血来同时调节。prp中的其他生长因子包括但不限于转化生长因子β(tgf-β)、wingless/int-1(wnt)家族蛋白、rna结合蛋白(fbf)、表皮生长因子(egf)、成纤维细胞生长因子2(fgf-2)、角质细胞生长因子(kgf或fgf-7)、胰岛素样生长因子(igf)、vegf、转化生长因子-β(tgf-b)以及β连环蛋白。在一些实施方式中，其他生长因子包括细胞因子。在一些实施方式中，wnt家族蛋白是wnt4。
[0125]
用于照射全血的光的光谱含量可以通过本领域已知的多种技术来控制，诸如滤光片和棱镜。在一些实施方式中，发光二极管(led)可以用于主要以特定波长发射光来照射全血。在一些实施方式中，激光可用于发射特定波长的光以照射全血。
[0126]
因此，在一些实施方式中，可以以至少约400nm；至少约450nm；至少约500nm；至少约550nm；至少约600nm；至少约650nm；至少约700nm；至少约750nm；至少约800nm；至少约850nm；至少约900nm；至少约950nm；至少约1000nm；或至少约1500nm的波长(例如特定波长)照射全血。
[0127]
图1示出了根据一些实施方式的操作。控制施加至一定量血液的光的光谱含量以增强生长因子诸如pdgf(框110)。从处理的所述一定量的血液中提取血浆制品(框120)。将源自血浆制品的组合物给予受试者(框130)。
[0128]
图2示出了根据进一步的实施方式的操作。从患者抽取血液样品(框210)。用非uv光照射自体样品(框220)。然后将经照射的样品离心，并且从经离心的样品中提取一种或多种组分(框230、框240)。由所提取的一种或多种组分形成形成prp(框250)。患者输注prp(框260)。
[0129]
图3和图4示出了用于照射血液以产生prp的设备，以下实施例解释该设备。该设备包括封闭体300，该封闭体配置为容纳至少一个容器，本文示出该容器是配置为容纳全血样品的透明板的测试孔310。测试孔310覆盖用于照射测试孔310中包含的血液的两个led光源320。封闭体300由盖(本文示出为箔330)覆盖，以阻挡环境光施加至测试孔310中的血液，而led 310将具有非环境光谱功率分布的光施加至测试孔310中的血液。
[0130]
图5-图12示出通过用光谱控制的光照射全血样品而产生的血液制品的结果。图5是示出了在富含血小板的血液制品(prp)中血小板衍生的生长因子(pdgf)的浓度变化是过程依赖性的图。在分离prp之前或之后，用850纳米(nm)光以10j/cm2照射全血(左侧柱)或分离的prp(右侧柱)，并测定pdgf相对于未处理对照的百分比增加。当将cacl2作为对照加入
到prp中时，pdgf浓度的变化是142％。当将cacl2加入到全血中，然后分离prp时，pdgf浓度的变化是41.4％。
[0131]
图6是示出了响应于全血的光照射的prp中[pdgf]的变化是剂量依赖性的图。用低剂量的1j/cm2(左侧柱)或高剂量的10j/cm2(右侧柱)的850nm光照射全血，分离prp，并测定pdgf相对于未处理对照的百分比增加。当将cacl2作为对照加入到全血中，然后分离prp时，pdgf浓度的变化是41.4％。
[0132]
图7是示出了prp中vegf的水平不响应850nm光照射而增加的曲线。用低剂量的1j/cm2(左侧柱)或高剂量的10j/cm2(右侧柱)的850nm光照射全血，分离prp，并测定[vegf]相对于未处理对照的变化。当将cacl2作为对照加入到prp中时，vegf浓度的变化是46.7％。当将cacl2加入到全血中，然后分离prp时，vegf浓度的变化是28.8％。
[0133]
图8是示出了来自光照射的全血的prp中[pdgf]的百分比变化取决于用于照射全血的光的波长的曲线图。在固定通量水平下降低能量导致pdgf增加。以10j/cm2的高剂量在420nm、530nm、597nm、660nm和850nm的波长下照射全血，分离prp，并测定pdgf相对于未处理对照的百分比增加。当将cacl2作为对照加入到全血中，然后分离prp时，pdgf浓度的变化是41.4％。(*)指示增加为p＜0.05。
[0134]
图9是示出了在分离prp之前，当以1j/cm2的低剂量(左侧柱)或10j/cm2的高剂量(右侧柱)用420nm、530nm、597nm、660nm或850nm光照射全血时，prp中[pdgf]相对于未处理对照的百分比变化的图。虚线表示当将cacl2加入到全血中并且分离prp时，在对照中显示的pdgf的增加。(*)指示统计学上显著的增加，p＜0.05。
[0135]
图10是示出了当在分离prp之前用1j/cm2的低剂量(左侧柱)或10j/cm2的高剂量(右侧柱)用420nm、530nm、597nm、660nm或850nm光照射全血时，prp中[vegf]相对于未处理对照的百分比变化的图。虚线表示当将cacl2加入到分离的全血prp中时对照中显示的vegf的增加。
[0136]
图11是示出了当以1j/cm2的低剂量(左侧柱)或10j/cm2的高剂量(右侧柱)用420nm、530nm、597nm、660nm或850nm光照射prp时，prp中[pdgf]相对于未处理对照的百分比变化的图。虚线表示当将cacl2加入到prp中时对照中显示的pdgf的增加。
[0137]
图12示出在prp用1j/cm2的低剂量(左侧柱)或10j/cm2的高剂量(右侧柱)的420nm、530nm、597nm、660nm或850nm光照射时，prp中[vegf]相对于未处理对照的百分比变化。虚线表示当将cacl2加入到prp中时对照中显示的vegf的增加。在660nm处的大的百分比增加是由于在三个重复中的一个中的单个离群值，并且在统计学上是不显著的。
[0138]
应当理解，图3和图4示出了用于用光谱控制的光处理血液以调节各种生长因子的设备。图13示出了根据进一步的实施方式的采用类似原理的处理设备的示例性实现方式。该设备包括封闭体1310，其具有配置为接收一个或多个容器的隔室1312，容器是例如包含用于治疗的血液的管状小瓶20。可拆卸的支架1320配置为支撑小瓶20并且具有多个led光源1330的阵列，该阵列配置为用于当将支架1320插入隔室1312中时向这些小瓶20中的血液施加光谱选择性光。当支架1320完全插入封闭体1310中时，设备阻止向小瓶20中的血液施加环境光，使得血液的照射将限于由led光源1330产生的光谱控制光。小瓶20中的处理过的血液可以被进一步处理(例如离心)，并且从中提取血浆制品以用于可以给予受试者的组合物中。
[0139]
在一些实施方式中，可以通过在光的不同辐射暴露下照射全血来调节(例如增加或减少)血液或血液制品(诸如富含血小板的血浆)中的生长因子(例如血小板衍生的生长因子)的浓度。例如，如实施例2和图5所示，当以10j/cm2的通量照射全血时，以约850nm的波长照射全血导致所得富含血小板的血浆中血小板衍生的生长因子增加约275％。然而，当以lj/cm2的通量照射全血时，在约850nm的相同波长下照射全血不会导致所得富含血小板的血浆中的血小板衍生的生长因子显著增加(即小于约10％)。
[0140]
因此，在一些实施方式中，本公开教导了用光的不同辐射暴露来照射全血以调节所得血液和血液制品(例如富含血小板的血浆)中的不同生长因子的浓度。
[0141]
因此，在一些实施方式中，可以在至少约1j/cm2；至少约2j/cm2；至少约3j/cm2；至少约4j/cm2；至少约5j/cm2；至少约6j/cm2；至少约7j/cm2；至少约8j/cm2；至少约9j/cm2；至少约10j/cm2；至少约15j/cm2；至少约20j/cm2；或至少约25j/cm2的辐射暴露下照射全血。
[0142]
在一些实施方式中，可以调节用于照射全血的光的辐射能和波长两者以调节血液或所得血液制品(例如富含血小板的血浆)中的生长因子(例如富含血小板的血浆)的浓度。
[0143]
因此，在一些实施方式中，在约600nm的波长和约1j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约600nm的波长和约2j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约600nm的波长和约3j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约600nm的波长和约4j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约600nm的波长和约5j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约600nm的波长和约6j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约600nm的波长和约7j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约600nm的波长和约8j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约600nm的波长和约9j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约600nm的波长和约10j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约600nm的波长和约15j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约600nm的波长和约20j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约600nm的波长和约25j/cm2的辐射暴露下照射全血。在任何上述实施方式中，可以照射全血至少约1分钟、至少约2分钟、至少约3分钟、至少约4分钟、至少约5分钟、至少约6分钟、至少约7分钟、至少约8分钟、至少约9分钟、至少约10分钟、至少约11分钟、至少约12分钟、至少约13分钟、至少约14分钟或至少约15分钟，
[0144]
在一些实施方式中，在约650nm的波长和约1j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约650nm的波长和约2j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约650nm的波长和约3j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约650nm的波长和约4j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约650nm的波长和约5j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约650nm的波长和约6j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约650nm的波长和约7j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约650nm的波长和约8j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约650nm的波长和约9j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约650nm的波长和约10j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约650nm的波长和约15j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约650nm的波长和约20j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约650nm的波长和约25j/cm2的辐射暴露下照射全血。在任何上述实施方式中，可以照射全血至少约1分钟、至少约2分钟、至少约3分钟、至少约4分钟、至少
约5分钟、至少约6分钟、至少约7分钟、至少约8分钟、至少约9分钟、至少约10分钟、至少约11分钟、至少约12分钟、至少约13分钟、至少约14分钟或至少约15分钟。
[0145]
在一些实施方式中，在约700nm的波长和约1j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约700nm的波长和约2j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约700nm的波长和约3j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约700nm的波长和约4j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约700nm的波长和约5j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约700nm的波长和约6j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约700nm的波长和约7j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约700nm的波长和约8j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约700nm的波长和约9j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约700nm的波长和约10j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约700nm的波长和约15j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约700nm的波长和约20j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约700nm的波长和约25j/cm2的辐射暴露下照射全血。在任何上述实施方式中，可以照射全血至少约1分钟、至少约2分钟、至少约3分钟、至少约4分钟、至少约5分钟、至少约6分钟、至少约7分钟、至少约8分钟、至少约9分钟、至少约10分钟、至少约11分钟、至少约12分钟、至少约13分钟、至少约14分钟或至少约15分钟，
[0146]
在一些实施方式中，在约750nm的波长和约1j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约750nm的波长和约2j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约750nm的波长和约3j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约750nm的波长和约4j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约750nm的波长和约5j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约750nm的波长和约6j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约750nm的波长和约7j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约750nm的波长和约8j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约750nm的波长和约9j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约750nm的波长和约10j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约750nm的波长和约15j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约750nm的波长和约20j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约750nm的波长和约25j/cm2的辐射暴露下照射全血。在任何上述实施方式中，可以照射全血至少约1分钟、至少约2分钟、至少约3分钟、至少约4分钟、至少约5分钟、至少约6分钟、至少约7分钟、至少约8分钟、至少约9分钟、至少约10分钟、至少约11分钟、至少约12分钟、至少约13分钟、至少约14分钟或至少约15分钟。
[0147]
在一些实施方式中，在约800nm的波长和约1j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约800nm的波长和约2j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约800nm的波长和约3j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约800nm的波长和约4j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约800nm的波长和约5j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约800nm的波长和约6j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约800nm的波长和约7j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约800nm的波长和约8j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约800nm的波长和约9j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约800nm的波长和约10j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约800nm的波长和约15j/cm2的辐
射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约800nm的波长和约20j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约800nm的波长和约25j/cm2的辐射暴露下照射全血。在任何上述实施方式中，可以照射全血至少约1分钟、至少约2分钟、至少约3分钟、至少约4分钟、至少约5分钟、至少约6分钟、至少约7分钟、至少约8分钟、至少约9分钟、至少约10分钟、至少约11分钟、至少约12分钟、至少约13分钟、至少约14分钟或至少约15分钟。
[0148]
在一些实施方式中，在约850nm的波长和约1j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约850nm的波长和约2j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约850nm的波长和约3j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约850nm的波长和约4j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约850nm的波长和约5j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约850nm的波长和约6j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约850nm的波长和约7j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约850nm的波长和约8j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约850nm的波长和约9j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约850nm的波长和约10j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约850nm的波长和约15j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约850nm的波长和约20j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约850nm的波长和约25j/cm2的辐射暴露下照射全血。在任何上述实施方式中，可以照射全血至少约1分钟、至少约2分钟、至少约3分钟、至少约4分钟、至少约5分钟、至少约6分钟、至少约7分钟、至少约8分钟、至少约9分钟、至少约10分钟、至少约11分钟、至少约12分钟、至少约13分钟、至少约14分钟或至少约15分钟。
[0149]
在一些实施方式中，在约900nm的波长和约1j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约900nm的波长和约2j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约900nm的波长和约3j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约900nm的波长和约4j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约900nm的波长和约5j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约900nm的波长和约6j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约900nm的波长和约7j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约900nm的波长和约8j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约900nm的波长和约9j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约900nm的波长和约10j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约900nm的波长和约15j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约900nm的波长和约20j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约900nm的波长和约25j/cm2的辐射暴露下照射全血。在任何上述实施方式中，可以照射全血至少约1分钟、至少约2分钟、至少约3分钟、至少约4分钟、至少约5分钟、至少约6分钟、至少约7分钟、至少约8分钟、至少约9分钟、至少约10分钟、至少约11分钟、至少约12分钟、至少约13分钟、至少约14分钟或至少约15分钟。
[0150]
在一些实施方式中，在约950nm的波长和约1j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约950nm的波长和约2j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约950nm的波长和约3j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约950nm的波长和约4j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约950nm的波长和约5j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约950nm的波长和约6j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约950nm的波长和约7j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施
方式中，在约950nm的波长和约8j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约950nm的波长和约9j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约950nm的波长和约10j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约950nm的波长和约15j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约950nm的波长和约20j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约950nm的波长和约25j/cm2的辐射暴露下照射全血。在任何上述实施方式中，可以照射全血至少约1分钟、至少约2分钟、至少约3分钟、至少约4分钟、至少约5分钟、至少约6分钟、至少约7分钟、至少约8分钟、至少约9分钟、至少约10分钟、至少约11分钟、至少约12分钟、至少约13分钟、至少约14分钟或至少约15分钟。
[0151]
在一些实施方式中，在约1000nm的波长和约1j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约1000nm的波长和约2j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约1000nm的波长和约3j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约1000nm的波长和约4j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约1000nm的波长和约5j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约1000nm的波长和约6j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约1000nm的波长和约7j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约1000nm的波长和约8j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约1000nm的波长和约9j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约1000nm的波长和约10j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约1000nm的波长和约15j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约1000nm的波长和约20j/cm2的辐射暴露下照射全血。在一些实施方式中，在约1000nm的波长和约25j/cm2的辐射暴露下照射全血。在任何上述实施方式中，可以照射全血至少约1分钟、至少约2分钟、至少约3分钟、至少约4分钟、至少约5分钟、至少约6分钟、至少约7分钟、至少约8分钟、至少约9分钟、至少约10分钟、至少约11分钟、至少约12分钟、至少约13分钟、至少约14分钟或至少约15分钟。
[0152]
尽管fda可能不允许干细胞与外源生长因子组合，但是用优化prp的化合物对患者进行预治疗可能是有利的，在一些实施方式中，prp将与干细胞组合。
[0153]
粒细胞集落刺激因子(gcsf)可以调动来自骨髓的细胞(包括血小板)。用gcsf预治疗患者将通过增加血小板和其他修复细胞的数量来增强prp的值。这在血小板计数低的患者或细胞计数较低的老年患者中可能尤其如此。在从如上所述的任何来源抽取全血之前，给予gcsf或调动细胞的其他分子一次、两次或多次。优选的方案将是在prp分离之前几天给予gcsf。
[0154]
一种具体的方法是在prp的制备之前将粒细胞集落刺激因子(g-csf，也称为乙二醇非格司亭)或刺激身体产生干细胞的任何其他分子给予患者。将5-50微克/千克/天给予患者，持续1-10天。然后由患者的全血中制备prp。全血可以来自任何来源，包括骨髓和脾脏。在优选的实施方式中，向患者皮下给予10微克/千克/天的g-csf，持续1-10天。然后由来自任何来源(包括骨髓或脾脏)的患者的全血制备prp。可以添加或替代刺激血液或干细胞产生的另外的药物或更新的分子。在一些实施方式中，给予分子以在制备prp或骨髓浓缩物之前刺激所希望的细胞的内源产生，以治疗用或用于细胞的再编程、增殖或分化。其他潜在分子的实例包括但不限于普乐沙福、沙格司亭、γ-生育三烯酚、维生素e以及安西司亭。随着科学的发展，将开发帮助调动所希望的细胞的较新的分子。通过这个申请所预期的是，这些较新的分子将被包括在可以在生产prp或其他生物活性血液部分之前给予的列表中。
[0155]
在制备prp之前给予患者这样的调动药物时，应当注意的是，与没有这样的细胞调动药物相比，组合物将改变。
[0156]
在替代实施方式中，在给予prp的同时给予分子诸如g-csf，或在给予prp之后给予分子诸如g-csf，持续取决于治疗而确定的一段时间。例如，对于结缔组织损伤的治疗，具有或不具有prp的g-csf可以在规律的基础上经数周的时间段给予，例如一周一次、一周两次、一周三次或更多次，由执业医师所确定的。在一些实施方式中，在从患者采血用于分离prp持续1-10天的时间段之前以及在向患者给予prp的同时和/或在给予如上所述的prp之后给予分子诸如g-csf。prp含有细胞因子诸如sdf-1，它们对干细胞具有化学吸引力。在一些实施方式中，使用gcsf将通过调动更多的细胞来增强prp治疗的价值。
[0157]
在一些实施方式中，在600和1500nm之间的波长下给予的光是抗微生物的。已知一氧化氮是抗微生物的。一氧化氮(no)杀死或抑制多种胞内病原体复制的精确机制尚未完全了解。然而，似乎靶向半胱氨酸蛋白酶(saura et al.,immunity,volume 10,issue 1,1january 1999,pages 21-28)。no s-使某些病毒蛋白酶的活性位点中的半胱氨酸残基亚硝基化，抑制蛋白酶活性并且中断病毒生命周期。由于半胱氨酸蛋白酶对于许多病毒、细菌和寄生虫的毒力或复制是关键的，no产生和释放可以用于治疗微生物感染。因此，在一些实施方式中，以有效增强内源no产生和/或释放的波长给予光。下文更详细地讨论这些波长。一氧化氮(“no”)的内源储存的光引发的释放有效地再生“气态的”(或未结合的)一氧化氮，该一氧化氮被自动氧化成硝基饱和中间体并且以“结合的”状态在体内共价结合。通过刺激一氧化氮从内源储存器的释放，可以将一氧化氮维持在气态持续延长的持续时间和/或可以扩展一氧化氮释放的空间区。
[0158]
一氧化氮内源性地储存在多种亚硝基化的生物化学结构上。在接收所要求的激发能量时，亚硝基化合物和亚硝基化合物都经历s-n、n-n或m-n键的溶血裂解，以产生自由基一氧化氮。亚硝基硫醇和亚硝胺是光活性的并且可以是光触发的以通过波长特异性激发释放一氧化氮。某些波长的光在一氧化氮的产生和/或释放中的影响描述于美国专利号10,525,275中，其内容通过引用结合本文。
[0159]
还已知特定波长的可见光也破坏细菌、霉菌和真菌细胞。强蓝光，通常在400和500nm之间，以及优选在约400-430nm，诸如415nm，据称对于杀死细菌优于红光(lubart,r et al.“a possible mechanism for the bactericidal effect of visible light.”laser therapy vol.20,1(2011):17-22.doi:10.5978/islsm.20.17)。在一些实施方式中，除了在600-1500nm的波长下给予光以增加一种或多种生长因子的浓度之外，还在抗微生物的波长下给予光，以在血液制品诸如prp被重新注入患者体内之前对其进行灭菌和/或消毒。
[0160]
如本文所阐述的，可以用光照射全血以增加全血和源自全血的所得血液制品(例如富含血小板的血浆)中的各种生长因子的浓度。如本文所阐述的，可以在将全血分离成其组成组分之前照射全血。
[0161]
可以根据标准技术分离经照射的全血。例如，可以将经照射的全血离心(例如在约3500rpm下持续约10分钟)以将全血分离成各种组分，诸如血浆、红细胞(rbc)、白细胞和血小板。
[0162]
在一些实施方式中，可以用抗凝剂处理从受试者分离的全血。在一些实施方式中，
可以用氯化钙(即cacl2)处理从受试者分离的全血。不希望受理论束缚，向全血中添加氯化钙可以增加全血中某些生长因子(例如血小板衍生的生长因子)的浓度。因此，相对于用氯化钙处理的未照射的血液，本文所描述的方法(即用光照射全血)可用于增加在全血或所得血液制品(例如富含血小板的血浆)中发现的生长因子的浓度。
[0163]
在一个实施方式中，用氯化钙和照射的组合来处理全血和/或血液制品，以便组合增强一种或多种生长因子的浓度。
[0164]
在一些实施方式中，从照射的全血样品中分离富含血小板的血浆样品的步骤包括：离心照射的全血样品以分离全血的组分；去除贫血小板血浆的一部分；将血小板再悬浮于剩余量的贫血小板血浆中以给出富含血小板的血浆的样品；以及从全血的剩余组分中分离富含血小板的血浆。
[0165]
在一些实施方式中，以约3500rpm离心进行照射的全血的步骤约10分钟。
[0166]
在一些实施方式中，离心全血样品可以基于密度分离全血的组分。不希望受理论束缚，在一些实施方式中，经离心(即分离)的血液的顶层可以主要包含贫血小板血浆；下一层可以主要包含血小板和白细胞(即血沉棕黄层)；底层可以主要包含红细胞。
[0167]
因此，去除贫血小板血浆的一部分的步骤可以包括简单地倾析贫血小板血浆的一部分或通过针抽取贫血小板血浆。
[0168]
在去除贫血小板血浆的一部分的情况下，血沉棕黄层中的血小板(当去除贫血小板血浆的一部分时它们未被去除)可以重新悬浮于剩余的贫血小板血浆中。以此方式，不希望受理论束缚，血浆可以变成富含血小板的血浆，因为全血初始样品中存在的总量的血小板的可以再悬浮于比全血初始样品中存在的血浆体积更小的血浆中。
[0169]
在一些实施方式中，可以通过倾析富含血小板的血浆或通过针抽取富含血小板的血浆，将所得的富含血小板的血浆样品与分离的全血的剩余组分(例如从红血细胞)分离。
[0170]
在一些实施方式中，可以在照射全血的约24小时内从照射的全血中分离富含血小板的血浆样品。在一些实施方式中，可以在照射全血的约12小时内从照射的全血中分离富含血小板的血浆样品。在一些实施方式中，可以在照射全血的约6小时内从照射的全血中分离富含血小板的血浆样品。在一些实施方式中，可以在照射全血约1小时内从照射的全血中分离富含血小板的血浆样品。在一些实施方式中，可以在照射全血约30分钟内从照射的全血中分离富含血小板的血浆样品。在一些实施方式中，可以在照射全血的约20分钟内从照射的全血中分离富含血小板的血浆样品。在一些实施方式中，可以在照射全血的约10分钟内从照射的全血中分离富含血小板的血浆样品。在一些实施方式中，可以在照射全血的约5分钟内从照射的全血中分离富含血小板的血浆样品。在一些实施方式中，可以在照射全血的约1分钟内从照射的全血中分离富含血小板的血浆样品。
[0171]
在一些实施方式中，组合物可以包含经照射的全血或血液制品，诸如prp。
[0172]
prp可以作为液体、固体、半固体(例如凝胶)、可吸入粉末或它们的一些组合递送。当prp作为液体递送时，它可以包括溶液、乳液、悬浮液等。可以通过将凝血剂(例如凝血酶、肾上腺素、钙盐)加入到prp中来制备prp半固体或凝胶。凝胶可以比溶液更粘稠，并且因此一旦其被递送至目标组织可以更好地保持其位置。在一些实施方式中，递送至目标组织可以包括递送至体内的治疗区域以及掺入如本文描述的细胞培养物或悬浮液中。在一些实施方式中，prp组合物是在没有凝血剂的情况下递送的。
[0173]
在一些情况下，可能期望递送作为液体的prp组合物并使其原位凝胶化或硬化。例如，prp组合物可以包含例如胶原、氰基丙烯酸酯、注射入组织后固化的粘合剂、注射入组织后固化或凝胶化的液体、缝合材料、琼脂、明胶、光活化牙科复合材料、其他牙科复合材料、丝-弹性蛋白聚合物、凝胶状蛋白混合物(bd biosciences)、水凝胶和/或其他合适的生物聚合物。可替代地，上述试剂不需要形成prp混合物的一部分。例如，上述试剂可以在prp已经被递送至目标组织之前或之后被递送至目标组织以引起prp凝胶化。在一些实施方式中，prp组合物可以响应于一种或多种环境或化学因素例诸如温度、ph、蛋白质等而硬化或凝胶化。
[0174]
可以使用碱性缓冲剂将prp缓冲至生理ph。该缓冲剂可以是生物相容缓冲剂，诸如hepes、tris、磷酸二氢盐、碳酸氢钠或其任何合适的组合，其可能能够将prp调节到生理ph在约6.5与约8.0之间。在某些实施方式中，生理ph可以是从约7.3至约7.5并且可以是约7.4。例如，缓冲剂可以是8.4％的碳酸氢钠溶液。在这些实施方式中，对于从全血中分离的每cc的prp，可以添加0.05cc的8.4％碳酸氢钠。在一些实施方式中，可以轻轻摇动该注射器以混合prp和碳酸氢盐。
[0175]
如上所述，prp组合物可以包含一种或多种其他试剂、稀释剂、溶剂或其他成分。其他试剂的实例包括但不限于凝血酶、肾上腺素、胶原、钙盐、ph调节剂、促进脱粒或保存血小板的材料、其他生长因子或生长因子抑制剂、nsaids、类固醇、抗感染剂和上述物质的混合物和组合。
[0176]
在一些实施方式中，prp组合物可以包含用于通过成像技术(诸如x射线、磁共振成像(mri)或超声)检测的造影剂。此类造影剂的实例包括但不限于x射线对比剂(例如isovue)、mri对比剂(例如钆)以及超声对比剂。
[0177]
在一些实施方式中，组合物进一步包含干细胞，其可以是胚胎干细胞、非胚胎(成人)干细胞和诱导多能干细胞(ipsc)。干细胞可以源自例如脂肪组织、骨髓、外周血和它们的组合。
[0178]
除了干细胞之外，组合物可以进一步包含人生长激素、其类似物或增加人生长激素的产生和/或释放的化合物。
[0179]
还可以添加外源生长因子。
[0180]
本公开教导了自体血液或血液制品(例如富含血小板的血浆)的制备，该血液或血液制品富含某些生长因子，诸如血小板衍生的生长因子。自体血液或血液制品(例如富含血小板的血浆)可以用于多种治疗应用。例如，在一些实施方式中，可以将自体富含血小板的血浆给予受试者以促进组织再生。例如，可以将自体富含血小板的血浆给予受试者以治疗病症诸如肌腱炎和骨关节炎。
[0181]
在进一步的实施例中，自体血液或血液制品(prp)可以用于治疗伤口或组织愈合，例如外伤或外科伤口，诸如在天然或假体移植物(例如皮肤、骨移植物和/或牙科假体或植入物等，也包括移植物供体部位)的配合和/或保持和/或密封中、血管炎、溃疡诸如糖尿病性神经性溃疡或褥疮、放射性皮炎(例如照射表皮样皮肤癌之后)或太阳损伤，或用于闭合瘘管。
[0182]
在仍进一步的实施例中，自体血液或血液制品(prp)可以用于治疗心脏病症、心脏再生，诸如在心力衰竭、慢性心力衰竭、缺血性和非缺血性心力衰竭以及心肌病的治疗中。
[0183]
在仍进一步的实施例中，自体血液或血液制品(prp)可以用于治疗尿失禁和/或肛门失禁、反流性食管炎和/或胃食管反流障碍。
[0184]
在仍进一步的实施例中，自体血液或血液制品(prp)可以用于治疗皮肤损伤，诸如在由照射受损的皮肤(放射性皮炎或太阳损伤皮肤)、衰老皮肤或烧伤皮肤中和/或在改善面部皱纹、皱缩、痤疮(尤其是在磨皮治疗之后)、烧伤、风疹或小痘瘢痕、白癜风、脂肪萎缩或脂肪营养不良、卡波西肉瘤、皮肤瘢痕样或杜普伊特伦(dupuytren)手掌纤维瘤中和/或在皮肤复原治疗中。
[0185]
在仍进一步的实施例中，自体血液或血液制品(prp)可以用于治疗脂肪萎缩，诸如在hiv/aids患者中和在面部的其他先天性单侧萎缩中，诸如先天性软骨鼻萎缩。
[0186]
在仍进一步的实施例中，自体血液或血液制品(prp)可以用于治疗骨、软骨和关节病症诸如软骨损伤、关节炎、软骨和/或骨损伤诸如深软骨损伤和/或糜烂和/或关节镜、撕裂腱和肩中的旋转套。
[0187]
在仍进一步的实施例中，自体血液或血液制品(prp)可以用于治疗血液性疾病，诸如地中海贫血。
[0188]
在仍进一步的实施例中，自体血液或血液制品(prp)可以用于治疗角膜疾病，诸如干眼综合征；角膜不透明，诸如由化学烧伤、由史蒂文约翰逊综合征引起的痛苦引起的那些；角膜和角膜溃疡的瘢痕形成。
[0189]
在仍进一步的实施例中，自体血液或血液制品(prp)可以用于治疗外周神经损伤、神经缝合以及脊髓损伤。
[0190]
在一些实施方式中，本文公开的自体血液制品(例如富血小板衍生的生长因子的富含血小板的血浆)可以用于化妆用途。例如，本文公开的自体血液制品可以用于促进受试者的毛发生长。例如，本文公开的自体血液制品可以增加毛发生长至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。治疗可以与光疗组合，例如使用促进内源性一氧化氮的产生和/或释放的红色和/或蓝色波长的光，特别是如本文描述的波长。
[0191]
在一些实施方式中，本文公开的自体血液制品可以用于减少受试者中的瘢痕组织。本文公开的自体血液制品可以将瘢痕组织减少至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。
[0192]
在一些实施方式中，本文公开的自体血液制品可以用于减少受试者中的皮肤皱纹。本文公开的自体血液制品可以将皮肤皱纹减少至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。
[0193]
在一些实施方式中，本文公开的自体血液制品可以用于减少受试者中的皮肤细线。本文公开的自体血液制品可以将皮肤细线减少至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。
[0194]
在一些实施方式中，本文公开的自体血液制品可以用于增加受试者的皮肤弹性。本文公开的自体血液制品可以使皮肤弹性增加至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少
约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约100％。
[0195]
在一些实施方式中，可以将本文公开的自体血液制品给予(例如注射)到受试者的面部、头皮、真皮、表皮、皱纹、前额、鼻子、阴茎或阴道中。在一些实施方式中，可以将本文公开的自体血液制品直接给予(例如注射)至受试者的瘢痕或损伤。
[0196]
在一些实施方式中，可以将血液制品局部地、经皮地、颊地、舌下、腹腔内地、皮下地、指甲下、经颅地、肌内地、关节内、静脉内地、胸腔内地、鞘内和/或肠胃外地给予至对其有需要的受试者。在一些实施方式中，局部给予包括给予至眼睛(例如作为滴眼剂)。
[0197]
在一些实施方式中，可以用局部麻醉剂进行给予(例如注射)。例如，局部麻醉剂可以是利多卡因、丙胺卡因、丁卡因、tac、苯佐卡因、氯普鲁卡因、可卡因、环美卡因、二甲卡因(拉罗卡因)、哌罗卡因、丙氧卡因、普鲁卡因(奴佛卡因)、丙美卡因、丁卡因(地卡因)、普萘洛尔、阿替卡因、布比卡因、辛可卡因(地布卡因)、依替卡因、左布比卡因、利多卡因(利诺卡因)、甲哌卡因、丙胺卡因、罗哌卡因或三甲卡因。
[0198]
参考以下非限制性实施例将更好地理解本发明。
[0199]
实施例
[0200]
通过以下实施例和合成实施例进一步说明本公开，这些实施例和合成实施例不应被解释为将本公开在范围或精神上限制于本文描述的具体程序。应当理解，提供这些实施例来说明某些实施方式，并且由此并不旨在对本公开的范围进行限制。应当进一步理解的是，在不背离本公开的精神和/或所附权利要求的范围的情况下，本领域技术人员可以想到的各种其他实施方式、修改及其等同物。
[0201]
实施例1：用选择的波长和剂量的光照射全血和富含血小板的血浆(prp)
[0202]
研究设计
[0203]
抽取人血液，并且将prp或全血暴露于不同波长的led下持续约2分钟暴露。将暴露的全血样品旋转沉降到prp中，并且将两组样品温育约21小时。通过添加2.28m cacl2溶液产生阳性对照。每个样品进行三次，并且用所选择的elisa(vegf-a和pdgf-aa，参见实施例2)测量pdgf和vegf的水平。
[0204]
方法
[0205]
一个受试者同意，完成了一些基本的人口统计学和医疗历史数据，并且经由22号针抽取100ml全血到8.5ml管(包括抗凝血剂)。分配prp或全血，指定将30ml立即旋转到prp中。将剩余的全血(80ml)以4.5ml等分部分置于6孔培养皿的单个孔中用于暴露(参见图2b)。在产生prp时，将这些孔储存在37℃细胞培养箱中。
[0206]
总共有12个板：(a)420nm/总计9ml(4.5ml低功率板/4.5ml高功率板)；(b)530nm/总计9ml(4.5ml低功率板/4.5ml高功率板)；(c)660nm/总计9ml(4.5ml低功率板/4.5ml高功率板)；(d)597nm/总计9ml(4.5ml低功率板/4.5ml高功率板)；(e)850nm/总计9ml(4.5ml低功率板/4.5ml高功率板)；(f)未处理(untx)/暗对照4.5ml(仅需要一个板)和(g)阳性对照4.5ml(仅需要一个板)。
[0207]
将30ml全血留在收集管中并旋转沉降以制备血浆。初始旋转是在1,500相对离心力(rcf)下进行10分钟。在完成此旋转后，血浆没有完全分离并且看起来是混浊的。进行第二次旋转10分钟。在完成该第二次旋转时，血液仍未清晰地分离，因此完成了在2100rcf下15分钟的最终旋转。这引起了清楚的分离，将1.5ml(两倍预期的量)的prp等分到6孔细胞培
养皿的单个孔中用于发光二极管(led)暴露。
[0208]
与全血一样，总共有12个板：(a)420nm/总计1.5ml(750ul低功率板/750ul高功率板)；(b)530nm/总计1.5ml(750ul低功率板/750ul高功率板)；(c)660nm/总计1.5ml(750ul低功率板/750ul高功率板)；(d)597nm/总计1.5ml(750ul低功率板/750ul高功率板)；(e)850nm/总计1.5ml(750ul低功率板/750ul高功率板)；(f)未处理的(untx)/暗对照750ul(仅需要一个板)；(g)阳性对照750ul(仅需要一个板)。
[0209]
实验性能
[0210]
如图3和图4所示，设置两个led暴露系统。简言之，将led 320面朝上的led棒放置在桌子上。将biobox罩300放置在led条320的顶部上并且居中。将6孔板310置于led 320上并用箔330覆盖以防止光污染。将风扇放置成约1.5英寸远，其中空气在led棒的金属风扇上方流动。将led附接至电源，将电压设定为30v并且将电流设定为140ma。将led设备中的板的相同定向用于所有测试。为了实现1j/cm2和10j/cm2暴露两者，使用相同的电流和因此相同的照射度。如以下表2中可见，暴露时间变化10倍以实现两种剂量。
[0211]
在根据表1的波长下，一个prp样品和一个全血样品在高功率下(21分钟，51秒，在表2上列出的电压下)同时暴露。这花费约2.5小时的暴露时间，因为未处理对照在以上5次暴露中的任一次期间的黑暗中置于环境条件下持续相等的持续时间。在每次暴露后，将全血样品重新组合到单个离心管中，并且如前所述进行prp分离方案。将得到的prp置于6孔培养皿中，并在elisa性能前返回至培养箱中18-24小时。
[0212]
表1.波长暴露表
[0213]
暴露#prp样品全血样品1420nm660nm2660nm420nm3530nm597nm4597nm850nm5850nm530nm
[0214]
表2.实验条件
[0215][0216]
将一个prp样品和一个全血样品在低功率下暴露(在先前描述的电压下2分钟，11秒)，同时，在先前列出的暴露表1上从行5工作回到行1。这花费约0.5小时的暴露时间，因为未处理对照在以上5次暴露中的任一次期间的黑暗中置于环境条件下持续相等的持续时
间。
[0217]
在暴露完成之后，将全血样品重新组合到单个离心管中，并且使用15分钟@2100rcf方法进行prp分离方案。这再次产生层的清晰区分。
[0218]
在elisa性能之前，将从全血暴露中产生的prp置于6孔培养皿中并返回至培养箱中18-24小时。
[0219]
最后，通过将15.0μl(调节以确保它保持总孔容积的10％)的2.28m cacl2溶液直接施加到每个阳性对照指定的孔中产生阳性对照。
[0220]
在暴露之后约21小时(对于最后暴露的孔)，将prp收集到1.5ml离心管中用于存储。将样品置于4℃的实验室冰箱中直到用于elisa。cacl2溶液导致阳性对照样品跨过孔顶部形成薄凝胶层。破坏该层并且从凝胶残余物中提取所有可能的流体。
[0221]
实施例2：确定在光照射的prp和从光照射的全血中分离的prp中的生长因子的浓度
[0222]
使用elisa(酶联免疫吸附测定)测试如在样品1中所述产生的prp的pdgf和vegf的浓度。
[0223]
为了确定最终elisa的适当浓度，使用未处理的对照血浆对pdgf-aa和vegf-a两者的样品孔进行系列稀释。实施例(vegf-a；pdgf-aa是相似的)方案在下文针对vegf描述，pdgf-aa方案是相似的，但使用不同的主抗体。
[0224]
vegf-a elisa方案
[0225]
在使用之前，使所有试剂和样品达到室温(18-25℃)。测定稀释剂b(项目e)在使用前用去离子水或蒸馏水稀释5倍。测定稀释剂a(项目d)用于稀释prp样品。如下所述稀释prp样品。通过简单地旋转项目c的小瓶来制备标准品。将640μl测定稀释剂a(用于血清/血浆样品)添加到项目c小瓶中以制备50ng/ml标准品。通过温和混合彻底溶解粉末。将来自项目c的小瓶的60μl的50ng/ml vegf标准品添加至具有440μl测定稀释剂a的管中，以制备6,000pg/ml标准溶液。
[0226]
将400μl测定稀释剂a移液至每个管中。使用储备标准溶液来产生稀释系列，其中浓度为30,000皮克(pg)/毫升(ml)、10,000pg/ml、3,333pg/ml、1,111pg/ml、370.4pg/ml、123.5pg/ml、41.15pg/ml和0pg/ml。标准品一式三份运行。
[0227]
如果洗涤浓缩物(20x)(项目b)包含可见晶体，将其加热至室温并轻轻混合直到溶解。将20ml洗涤缓冲液浓缩物稀释到去离子水或蒸馏水中，以产生400ml的1x洗涤缓冲液。
[0228]
使用前简单旋转检测抗体小瓶(项目f)。将100μl的1x测定稀释剂b(项目e)添加至小瓶中以制备检测抗体浓缩物，并且上下吸移以轻轻混合。将浓缩物在4℃下储存小于5天。
[0229]
用1x测定稀释剂b(项目e)稀释检测抗体浓缩物100倍并用于测定程序。将hrp-链霉抗生物素蛋白浓缩小瓶(项目g)短暂旋转并上下吸移以在使用前轻轻混合。用1x测定稀释剂b(项目e)将hrp-链霉抗生物素蛋白浓缩物稀释300倍。将40μl hrp-链霉抗生物素蛋白浓缩物添加至具有12ml 1x测定稀释剂b的管中，以制备300倍稀释的hrp-链霉抗生物素蛋白溶液。将该溶液充分混合，不储存。
[0230]
将100μl的每种标准品和样品加入适当的孔中。将孔覆盖并且在室温下伴随轻轻振荡温育2.5小时。丢弃溶液，并且使用多通道移液管或自动洗涤器，通过用洗涤缓冲液(300μl)填充每个孔，用1x洗涤溶液洗涤孔4次。在最后一次洗涤之后，通过抽吸或倾析去除
剩余的洗涤缓冲液，将板倒置并用干净的纸巾吸干。
[0231]
将100μl的1x制备的生物素酰化抗体添加至每个孔。将样品和标准品在室温下伴随轻轻振荡温育1小时。然后弃去溶液，并且如前所述重复洗涤步骤。向每个孔中添加100μl制备的链霉抗生物素蛋白溶液。将样品和标准品在室温下伴随轻轻振荡温育45分钟。68.然后弃去溶液，并且如前所述重复洗涤步骤。将100μl tmb一步底物试剂(项目h)添加至每个孔。将样品和标准品在室温下在黑暗中在温和振摇下温育30分钟。向每个孔中添加50μl终止溶液(项目i)，并且立即在450nm下读取这些板。
[0232]
测试结果确定所有样品都在范围内，尽管vegf-a elisa显示低水平并且pdgf-aa elisa显示以1：10稀释样品以确保pdgf-aa的任何刺激将保持在范围内将是最安全的。不经稀释使用vegf-a elisa样品。
[0233]
最终elisa上的所有样品一式三份运行，包括阴性/未处理的对照以及cacl2阳性对照。所使用的vegf-a elisa是raybiotech elh-vegf-a，批号：1016170196，到期10/16/18，并且所使用的pdgf-aa elisa是raybiotech elh-pdgfaa，批号：1019170248，到期10/19/18。
[0234]
使用μquant通用微板分光光度计和相关软件读取所有光密度(od)。生成数据并且将其放入microsoft excel中，然后使用www.eliaanalysis.com/app网站进行分析。
[0235]
在表3和表4中，wb＝在prp纯化之前作为全血光照射的样品，prp＝作为prp光照射的样品，低剂量＝1j/cm2，高剂量＝10j/cm2。如本文所述，将(-)阴性对照与实验样品平行处理，但不暴露于光。如本文所述用cacl2处理( )对照。
[0236]
表3.pdgf-aa相对于适当的未处理的对照的统计显著性。
[0237][0238]
将来自表3的pdgf-aa elisa结果绘制在图3、图4、图6、图7a、图7c中。在所有情况下，y轴显示相对于未处理对照(即未暴露于光的对照)的百分比变化。
[0239]
图4比较了分离自用10j/cm2下850nm光照射的全血的prp中的pdgf的百分比变化，与用相同波长和光通量照射的prp的pdgf的百分比变化。从图3可以看出，全血的照射导致prp中pdgf的量的显著增加，而prp的照射直接没有。
[0240]
图5比较了分离自用两个剂量1j/cm2和10j/cm2的850nm光处理的全血的prp中的pdgf水平。从图4中可以看出，prp中pdgf的量随光剂量增加。
[0241]
图6显示在从照射的全血分离的prp中pdgf的光依赖性增加取决于光的波长。用较长波长的光(诸如660nm和850nm)照射全血导致prp中pdgf的增加，而用较短波长的光照射的全血不会导致pdgf水平的增加。
[0242]
表4.vegf-aelisa结果相对于合适的未处理对照的统计学显著性。
[0243]
样品来自(未配对t-检验)的p值未处理对照的vegf-a％变化prp高剂量420nm0.0252.70％prp高剂量530nm0.0620.40％prp高剂量597nm0.2714.50％prp高剂量660nm0.46-5.00％prp高剂量850nm0.01-21.50％prp低剂量420nm0.0617.40％prp低剂量530nm0.0617.40％
prp低剂量597nm0.180.07％prp低剂量660nm0.1814.50％prp低剂量850nm0.0620.40％wb高剂量420nm0.0914.30％wb高剂量530nm0.04-26.60％wb高剂量597nm0.05-19.50％wb高剂量660nm0.0710.70％wb高剂量850nm0.0710.70％wb低剂量420nm0.42-5.30％wb低剂量530nm0.485.30％wb低剂量597nm0.625.30％wb低剂量660nm0.23-5.30％wb低剂量850nm0.1-23.10％ 对照prp0.00446.70％ 对照全血0.00628.80％
[0244]
来自表4的vegf-aelisa结果绘制在图7、图11和图12中。在所有情况下，y轴显示相对于未处理对照(即未暴露于光的对照)的百分比变化。除了在660nm和10j/cm2通量下的单个离群结果(其仅存在于3个重复中的1个中)，来自光照射的全血或光照射的prp中的vegf水平没有显示出与pdgf相同的增加。虽然在光照prp中vegf的水平略有增加，但这些水平没有超过对cacl2对照观察到的vegf的增加。
[0245]
elisa对vegf-a和pdgf-aa均产生良好分组的数据和良好标准曲线。在回顾这些值时，在暴露之后，led处理导致血浆中蛋白质水平的变化。这些变化在高和低剂量以及波长之间是可变的。阳性氯化钙对照证明了所测试的两种蛋白质的刺激。
[0246]
pdgf-aa elisa阳性对照展示出暴露的血浆增加142.1％以及暴露的全血仅增加41.4％。相比之下，相对于高剂量led暴露的prp，高剂量led暴露的全血在pdgf-aa中产生大得多的阳性变化。相反，全血的低剂量led暴露相对于低剂量暴露血浆产生较低的正变化。在暴露于高剂量850nm(277.0％)、660nm(274.4％)和597nm(86.3％)led的全血中观察到所见的最大变化。直接暴露的prp中的最大变化是低剂量850nm(56.2％)和530nm(23.9％)。
[0247]
vegf-aelisa阳性对照在暴露的prp中产生46.7％的变化，在暴露的全血中产生28.8％的变化。总的来说，产生的vegf-a的总量是小皮克量，除了标准品。在这种情况下，在所有情况下，高led剂量似乎比低led剂量产生更大的正变化。
[0248]
t检验对某些led产生vegf-a和pdgf-aa水平的统计显著性。这将允许较低体积的抽血并且消除不产生任何统计变化的参数。通常，vegf-a水平不是非常高。现在可以将选择的波长和暴露持续时间修改为可变脉冲模式。
[0249]
虽然已经结合以上阐述的具体实施方式描述了本发明，但是对于本领域的普通技术人员来说，其许多替代方案、修改和其他变化将是显而易见的。所有这些替换、修改和变化都旨在落入本发明的精神和范围内。