用于细胞疗法的环状RNA的制作方法

用于细胞疗法的环状rna相关申请的交叉引用1.本技术要求于2019年6月14日提交的美国临时申请号62/861,805和2020年1月29日提交的62/967,537的优先权和权益，其各自的全部内容通过援引并入本文。背景2.某些环状多核糖核苷酸普遍存在于人的组织和细胞中，包括健康个体的组织和细胞。概述3.本披露总体上涉及包含分离的细胞和细胞制剂的组合物，以及使用此类细胞和细胞制剂在哺乳动物(例如人)中进行细胞疗法的方法。这些组合物包括并且这些方法使用包含环状多核糖核苷酸的分离的细胞(例如，包含外源、合成环状rna的分离的哺乳动物细胞)，其中这些环状多核糖核苷酸(a)包含至少一个结合位点，(b)编码蛋白质，或(a)和(b)两者。这些细胞(例如，分离的哺乳动物细胞)尤其可以选自免疫细胞(诸如t细胞、b细胞或nk细胞)、巨噬细胞、树突细胞、红细胞、网织红细胞、髓系祖细胞和巨核细胞。所述蛋白质可以是分泌蛋白、膜蛋白或细胞内蛋白。细胞疗法的方法可以包括将分离的细胞或制剂施用至有需要的受试者(例如人)。4.在一方面，本发明的特征在于一种药物组合物，其包含药学上可接受的载体或赋形剂和包含至少一个结合位点的环状多核糖核苷酸、编码的蛋白质或其组合。在此方面的一个实施例中，环状多核糖核苷酸(1)包含至少一个结合位点，(2)编码分泌蛋白或细胞内蛋白，或(3)(1)和(2)的组合。在此方面的另一个实施例中，环状多核糖核苷酸(1)包含至少一个结合位点，(2)编码膜蛋白，或(3)(1)和(2)的组合，其中膜蛋白不是嵌合抗原受体、t细胞受体或t细胞受体融合蛋白。在此方面的另一个实施例中，环状多核糖核苷酸包含至少一个结合位点并编码蛋白质，其中所述蛋白质是分泌蛋白、膜蛋白或细胞内蛋白。5.在另一个方面，本发明的特征在于分离的细胞或此类细胞的制剂，其包含含有至少一个结合位点的环状多核糖核苷酸、编码的蛋白质或其组合，其中将分离的细胞施用至受试者。在此方面的一个实施例中，环状多核糖核苷酸(1)包含至少一个结合位点，(2)编码分泌蛋白或细胞内蛋白，或(3)(1)和(2)的组合。在此方面的另一个实施例中，环状多核糖核苷酸(1)包含至少一个结合位点，(2)编码膜蛋白，或(3)(1)和(2)的组合，其中膜蛋白不是嵌合抗原受体、t细胞受体或t细胞受体融合蛋白。在此方面的另一个实施例中，环状多核糖核苷酸包含至少一个结合位点并编码蛋白质，其中所述蛋白质是分泌蛋白、膜蛋白或细胞内蛋白。6.在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少聚a尾、复制元件或两者。7.在一些实施例中，细胞内蛋白、膜蛋白或分泌蛋白是治疗性蛋白。在一些实施例中，细胞内蛋白、膜蛋白或分泌蛋白促进细胞扩增、细胞分化和/或细胞对靶的定位。在一些实施例中，细胞内蛋白、膜蛋白和/或分泌蛋白具有结合活性或转录调节物活性。8.在一些实施例中，蛋白质是膜蛋白并且细胞是非免疫细胞。9.在一些实施例中，膜蛋白是跨膜蛋白或细胞外基质蛋白。在一些实施例中，膜蛋白是嵌合抗原受体。10.在一些实施例中，所述至少一个结合位点赋予细胞至少一种治疗特征。在一些实施例中，所述至少一个结合位点赋予细胞或分离的细胞核酸定位。在一些实施例中，所述至少一个结合位点赋予细胞或分离的细胞中的核酸活性。在一些实施例中，所述至少一个结合位点是适配体。在一些实施例中，所述至少一个结合位点是蛋白结合位点、dna结合位点或rna结合位点。在一些实施例中，所述至少一个结合位点是mirna结合位点。在一些实施例中，所述至少一个结合位点与细胞表面上的细胞受体结合。在一些实施例中，在所述至少一个结合位点与细胞表面上的细胞受体结合后，环状多核糖核苷酸被内化到细胞中。11.在一些实施例中，细胞是真核细胞、动物细胞、哺乳动物细胞或人细胞。在一些实施例中，细胞是免疫细胞。在一些实施例中，细胞是外周血单核细胞、外周血淋巴细胞或淋巴细胞。在一些实施例中，细胞选自由以下组成的组：t细胞(例如，调节性t细胞、γδt细胞、αβt细胞、cd8 t细胞或cd4 t细胞)、b细胞或自然杀伤细胞。在一些实施例中，细胞是非复制型的。12.在本文所述任何方面的一些实施例中，药物组合物包含多个细胞或细胞制剂，其中所述制剂包含或所述多个是至少105个细胞，例如，至少106或至少107或至少108或至少109或至少1010或至少1011个细胞，例如5x105个细胞至1x107个细胞。在一些实施例中，所述多个是12.5x105个细胞至4.4x1011个细胞。在一些实施例中，药物组合物包含作为目标受试者的单位剂量的多个细胞或细胞制剂，例如，药物组合物包含105-109个细胞/kg目标受试者，例如，106-108个细胞/kg目标受试者。例如，体重为50kg的目标受试者的单位剂量可以是包含5x107至2.5x1010个细胞，例如5x107至2.5x109个细胞，例如5x108至5x109个细胞的药物组合物。13.在一些实施例中，药物组合物用于施用至受试者。在一些实施例中，受试者是人或非人动物。人可以是青少年、青年(18-25岁)、成人或新生儿。在一些实施例中，受试者患有疾病或病症。在一些实施例中，受试者患有过度增殖性疾病或癌症。在一些实施例中，细胞或分离的细胞对治疗的受试者是同种异体的。在一些实施例中，细胞或分离的细胞对治疗的受试者是自体的。14.在一些实施例中，分离的细胞用药学上可接受的赋形剂(例如稀释剂)配制。15.在第三方面，本发明提供了一种包含细胞的药物组合物，其中所述细胞包含编码抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域并包含至少一个结合位点的环状多核糖核苷酸。16.在第四方面，本发明提供了一种分离的细胞，其包含编码嵌合抗原受体并包含至少一个结合位点的环状多核糖核苷酸，其中分离的细胞用于施用(例如，静脉内施用至受试者)。17.在第五方面，本发明提供了一种细胞，其包含：(a)环状多核糖核苷酸，其包含i)至少一个编码与抗原结合的抗原结合蛋白的靶结合序列，或ii)编码抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域的序列，并且任选地包含至少一个结合位点；和(b)编码蛋白质的第二核苷酸序列，其中蛋白质的表达在抗原与抗原结合蛋白结合时被激活。18.在第六方面，本发明提供了一种细胞，其包含编码对抗原具有亲和力的t细胞受体(tcr)的环状多核糖核苷酸和编码双特异性抗体的环状多核糖核苷酸，其中所述细胞在所述细胞表面上表达tcr和双特异性抗体。19.在本文所述任何方面的一些实施例中，嵌合抗原受体包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。在一些实施例中，抗原结合蛋白包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，抗原结合结构域连接至跨膜结构域，所述跨膜结构域连接至细胞内信号传导结构域以产生嵌合抗原受体。在一些实施例中，抗原结合结构域与肿瘤抗原、耐受原或病原体抗原结合，或者所述抗原是肿瘤抗原或病原体抗原。在一些实施例中，抗原结合结构域是抗体或其抗体片段(例如，scfv、fv、fab)。在一些实施例中，抗原结合结构域是双特异性抗体。在一些实施例中，双特异性抗体具有结合第一表位的第一免疫球蛋白可变结构域和结合第二表位的第二免疫球蛋白可变结构域。在一些实施例中，第一表位和第二表位是相同的。在一些实施例中，第一表位和第二表位是不同的。20.在一些实施例中，跨膜结构域连接结合结构域和细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，跨膜结构域是铰链蛋白(例如，免疫球蛋白铰链)、多肽接头(例如，gs接头)、kir2ds2铰链、cd8a铰链或间隔子。21.在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含t细胞信号传导分子的至少一部分。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含cd3ζ、普通fcrγ(fcer1g)、fcγriia、fcrβ(fcεrib)、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd79a、cd79b、dap10、dap12、或其任何组合的至少一部分。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域进一步包含共刺激细胞内信号传导结构域。22.在一些实施例中，共刺激细胞内信号传导结构域包含tnf受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞活化分子或活化nk细胞受体蛋白中的至少一种或多种。在一些实施例中，共刺激细胞内信号传导结构域包含cd27、cd28、4-1bb、ox40、gitr、cd30、cd40、pd-1、icos、baffr、hvem、icam-1、lfa-1、cd2、cds、cd7、cd287、light、nkg2c、nkg2d、slamf7、nkp80、nkp30、nkp44、nkp46、cd160、cd19、cd4、cd8α、cd8β、il2rβ、il2rγ、il7rα、itga4、vla1、cd49a、ia4、cd49d、itga6、vla6、cd49f、itgad、cd103、itgal、itgam、itgax、itgb1、cd29、itgb2、cd18、itgb7、tnfr2、trance/trankl、cd226、slamf4、cd84、cd96、ceacam1、crtam、cd229、cd160、psgl1、cd100、cd69、slamf6、slamf1、slamf8、cd162、ltbr、lat、gads、slp-76、pag/cbp、cd19a、b7-h3或与cd83结合的配体thab中的至少一种或多种。23.在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少聚a尾、复制元件或其组合。24.在一些实施例中，细胞是免疫效应细胞。在一些实施例中，所述细胞是t细胞(例如，αβt细胞或γδt细胞)或nk细胞。在一些实施例中，所述细胞是同种异体细胞或自体细胞。在一些实施例中，抗原表达自肿瘤或癌症。在一些实施例中，蛋白质是细胞因子(例如，il-12)或共刺激配体(例如，cd40l或4-1bbl)。在一些实施例中，蛋白质是分泌蛋白。25.在第七方面，本发明提供了一种具有1x105至9x1011个细胞，例如，1x105-9x105个细胞、1x106-9x106个细胞、1x107-9x107个细胞、1x108-9x108个细胞、1x109-9x109个细胞、1x1010-9x1010个细胞、1x1011-9x1011个细胞，例如，5x105个细胞至4.4x1011个细胞的制剂，所述制剂被配置用于肠胃外递送至受试者，其中所述制剂包含如本文所述的多个(例如，制剂中至少1％的细胞)细胞或分离的细胞。例如，制剂中至少50％的细胞、至少60％的细胞，例如50％-70％的细胞是包含如本文所述的合成的外源环状rna的细胞。在此方面的一些实施例中，制剂呈本文所述的单位剂量形式。在此方面的一些实施例中，递送是注射或输注(例如，iv注射或输注)。26.在第八方面，本发明提供了一种包含分离的细胞的悬浮液的静脉注射袋或其他输注产品，其中悬浮液中的多个细胞(例如，制剂中至少1％的细胞)是本文所述的任何细胞或分离的细胞。在一些实施例中，悬浮液包含1x105-9x105个细胞、1x106-9x106个细胞、1x107-9x107个细胞、1x108-9x108个细胞、1x109-9x109个细胞、1x1010-9x1010个细胞、1x1011-9x1011个细胞，例如，5x105个细胞至4.4x1011个细胞，iv袋被配置用于肠胃外递送至受试者。在一些实施例中，悬浮液中至少50％的细胞、至少60％的细胞，例如50％-70％的细胞是包含如本文所述的合成的外源环状rna的细胞。在此方面的一些实施例中，iv袋包含本文所述的单位剂量的细胞。27.在第九方面，本发明提供了一种医疗装置，其包含多个细胞，例如1x105-9x105个细胞、1x106-9x106个细胞、1x107-9x107个细胞、1x108-9x108个细胞、1x109-9x109个细胞、1x1010-9x1010个细胞、1x1011-9x1011个细胞，例如，5x105个细胞至4.4x1011个细胞，所述医疗装置被配置用于植入受试者，其中所述医疗装置中至少40％的细胞是如本文所述的细胞或分离的细胞。例如，医疗装置中至少50％的细胞、至少60％的细胞，例如50％-70％的细胞是包含如本文所述的合成的外源环状rna的细胞。28.在第十方面，本发明提供了一种包含多个细胞的生物相容性基质，其中所述生物相容性基质被配置用于植入受试者。生物相容性基质可以包含1x105-9x105个细胞、1x106-9x106个细胞、1x107-9x107个细胞、1x108-9x108个细胞、1x109-9x109个细胞、1x1010-9x1010个细胞、1x1011-9x1011个细胞，例如，5x105个细胞至4.4x1011个细胞，其中生物相容性基质中至少50％的细胞、至少60％的细胞，例如，50％-70％的细胞是包含如本文所述的合成的外源环状rna的细胞。例如，生物相容性基质是afibromertm基质。例如，生物相容性基质可以是描述于bose等人2020.natbiomedeng[自然生物医学工程].2020.doi:10.1038/s41551-020-0538-5中的基质，将其通过援引并入本文。[0029]在第十一方面，本发明提供了一种生物反应器，其包含多个细胞，例如，1x105-9x105个细胞、1x106-9x106个细胞、1x107-9x107个细胞、1x108-9x108个细胞、1x109-9x109个细胞、1x1010-9x1010个细胞、1x1011-9x1011个细胞，例如，5x105个细胞至4.4x1011个细胞，其中生物反应器中至少50％的细胞、至少60％的细胞，例如，50％-70％的细胞是包含如本文所述的合成的外源环状rna的细胞。在此方面的一些实施例中，生物反应器包括2d细胞培养物。在此方面的一些实施例中，生物反应器包括3d细胞培养物。[0030]在一些实施例中，本文披露的医疗装置或生物相容性基质被配置为在植入受试者时产生并释放所述多个细胞。[0031]在以上方面的一些实施例中，受试者是人或非人动物。[0032]在一些实施例中，所述多个细胞用药学上可接受的载体或赋形剂配制。[0033]在第十二方面，本发明提供了一种生产细胞或多个细胞的方法，其包括提供分离的细胞或多个分离的细胞；提供如本文所述的环状多核糖核苷酸的制剂，并使环状多核糖核苷酸与分离的细胞或多个分离的细胞接触，其中分离的细胞或多个分离的细胞能够表达环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，与细胞接触的环状多核糖核苷酸的制剂包含不超过1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、600ng/ml、1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200g/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml、900μg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、或2mg/ml的线性多核糖核苷酸分子。在一些实施例中，相对于药物制剂中的总核糖核苷酸分子，与细胞接触的环状多核糖核苷酸的制剂包含至少30％(w/w)、40％(w/w)、50％(w/w)、60％(w/w)、70％(w/w)、80％(w/w)、85％(w/w)、90％(w/w)、91％(w/w)、92％(w/w)、93％(w/w)、94％(w/w)、95％(w/w)、96％(w/w)、97％(w/w)、98％(w/w)、或99％(w/w)的环状多核糖核苷酸分子。在实施例中，制剂中总核糖核苷酸分子的至少30％(w/w)、40％(w/w)、50％(w/w)、60％(w/w)、70％(w/w)、80％(w/w)、85％(w/w)、90％(w/w)、91％(w/w)、92％(w/w)、93％(w/w)、94％(w/w)、95％(w/w)、96％(w/w)、97％(w/w)、98％(w/w)、或99％(w/w)是环状多核糖核苷酸分子。在此方面的一些实施例中，与标准化的未接触分离的细胞或多个标准化的未接触分离的细胞相比，接触后分离的细胞或多个分离的细胞的生存力为至少40％。在此方面的一些实施例中，所述方法进一步包括在与受试者接触后施用细胞或多个细胞。[0034]在第十三方面，本发明提供了一种生产用于施用至受试者的细胞的方法，其包括a)提供分离的细胞，和b)使分离的细胞与本文所述的环状多核糖核苷酸接触；从而产生用于施用至所述受试者的细胞。在此方面的一个实施例中，细胞中的环状多核糖核苷酸在施用至受试者之前被降解。[0035]在第十四方面，本发明提供了一种细胞疗法的方法，其包括将药物组合物、细胞、多个细胞、制剂、静脉注射袋中的多个细胞、医疗装置中的多个细胞、生物相容性基质中的多个细胞、或来自如本文所述生物反应器的多个细胞施用至有需要的受试者。在一些实施例中，施用的药物组合物、多个细胞、细胞制剂、静脉注射袋中的多个细胞、医疗装置中的多个细胞、或生物相容性基质中的多个细胞包含受试者的单位剂量，例如包含105-109个细胞/kg受试者，例如106-108个细胞/kg受试者。例如，体重为50kg的目标受试者的单位剂量可以是包含5x107至2.5x1010个细胞，例如5x107至2.5x109个细胞，例如5x108至5x109个细胞的药物组合物。[0036]在此方面的一些实施例中，药物组合物、多个细胞、制剂、静脉注射袋、医疗装置或生物相容性基质包含一定剂量的例如1x105至9x1011个细胞，例如，1x105-9x105个细胞、1x106-9x106个细胞、1x107-9x107个细胞、1x108-9x108个细胞、1x109-9x109个细胞、1x1010-9x1010个细胞、1x1011-9x1011个细胞、例如5x105个细胞至4.4x1011个细胞，其中至少1％的细胞是如本文所述的细胞或分离的细胞。例如，所述多个、细胞制剂、静脉注射袋、医疗装置或生物相容性基质中至少50％的细胞、至少60％的细胞，例如50-70％的细胞是包含如本文所述的合成的外源环状rna的细胞。在此方面的一些实施例中，所述方法包括以1x105至9x1011个细胞，例如，1x105-9x105个细胞、1x106-9x106个细胞、1x107-9x107个细胞、1x108-9x108个细胞、1x109-9x109个细胞、1x1010-9x1010个细胞、1x1011-9x1011个细胞，例如，5x105个细胞/kg至6x108个细胞/kg的剂量施用药物组合物、多个细胞或制剂。在此方面的一些实施例中，所述方法包括以多次施用或剂量施用药物组合物、多个细胞或制剂。在此方面的一些实施例中，所述多个(例如两个)后续剂量间隔至少约1周、2周、28天、35天、42天或60天或更长时间施用。[0037]在另一方面，本发明提供了一种编辑分离的细胞或多个分离的细胞的核酸的方法，其包括a)提供分离的细胞或多个分离的细胞；b)使分离的细胞或多个分离的细胞与编码核酸酶和/或包含指导核酸的环状多核糖核苷酸接触；从而产生经编辑的细胞或多个经编辑的细胞，用于施用至受试者。在此方面的一些实施例中，所述方法进一步包括用药学上可接受的赋形剂配制经编辑的细胞或多个经编辑的细胞。在此方面的一些实施例中，核酸酶是锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶或cas蛋白。在此方面的一些实施例中，核酸酶是cas9蛋白、cas12蛋白、cas14蛋白或cas13蛋白。[0038]在另一方面，本发明提供了一种用于细胞疗法的分离的细胞，其包含编码蛋白质或其组合的环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含至少一个结合位点。在此方面的一个实施例中，环状多核糖核苷酸(1)包含至少一个结合位点，(2)编码分泌蛋白或细胞内蛋白，或(3)(1)和(2)的组合。在此方面的一个实施例中，环状多核糖核苷酸(1)包含至少一个结合位点，(2)编码膜蛋白，或(3)(1)或(2)的组合，其中膜蛋白不是嵌合抗原受体、t细胞受体或t细胞受体融合蛋白。在此方面的一个实施例中，环状多核糖核苷酸包含至少一个结合位点并编码蛋白质，其中所述蛋白质是分泌蛋白、膜蛋白或细胞内蛋白。[0039]本发明还提供了一种1x106-1x1011个人细胞(例如，t细胞)，例如，1x107至5x1010个人细胞，例如，1x108-1x109个人细胞的制剂，其用适于肠胃外施用的赋形剂配制，其中制剂中至少50％(例如，50％-70％)的细胞包含表达本文所述的嵌合抗原受体的外源环状rna，并且其中所述制剂在被配制用于肠胃外递送至人的医疗装置(诸如输液袋)中。本发明还提供了一种治疗被诊断患有癌症，例如白血病或淋巴瘤(例如，急性淋巴细胞白血病或者复发或难治性弥漫性大b细胞淋巴瘤)的人受试者的方法，其包括向受试者施用用适于肠胃外施用的赋形剂配制的自体t细胞的制剂，其中制剂中至少50％(例如，50％-70％)的细胞包含表达本文所述的嵌合抗原受体的外源环状rna，其中所述制剂以1x105至1x109个细胞/kg受试者的剂量，经由被配制用于肠胃外递送至人的医疗装置(诸如输液袋)来施用。[0040]本发明还提供了一种1x106-1x1011个人细胞(例如，cd34 造血干细胞或hsc，例如，nk细胞)，例如，1x107至5x1010个人细胞，例如，1x108-1x109个人细胞的制剂，其用适于肠胃外施用的赋形剂配制，其中制剂中至少50％(例如，50％-70％)的细胞包含表达血红蛋白亚基β(β球蛋白或血红蛋白β链或hbb)以用于治疗地中海贫血或镰状细胞疾病，或者表达abc转运蛋白以用于治疗脑肾上腺脑白质营养不良的外源环状rna，并且其中所述制剂在被配制用于肠胃外递送至人的医疗装置(诸如输液袋)中，并且其中所述制剂以1x105至1x109个细胞/kg受试者的剂量，经由被配制用于肠胃外递送至人的医疗装置(诸如输液袋)来施用。[0041]本发明还提供了一种1x106-1x1011个人细胞(例如，cd34 造血干细胞或hsc，例如，nk细胞)，例如，1x107至5x1010个人细胞，例如，1x108-1x109个人细胞的制剂，其用适于肠胃外施用的赋形剂配制，其中制剂中至少50％(例如，50％-70％)的细胞包含表达(a)血红蛋白亚基β(β球蛋白或血红蛋白β链或hbb)以用于治疗地中海贫血或镰状细胞疾病，或(b)abc转运蛋白以用于治疗脑肾上腺脑白质营养不良，或(c)腺苷脱氨酶(ada)以用于治疗ada-scid，或(d)was蛋白以用于治疗wiskott-aldrich，或(e)cybb蛋白以用于治疗x连锁慢性肉芽肿病或(f)arsa以用于治疗异染性脑白质营养不良，或(g)α-l-艾杜糖苷酶以用于治疗mps-i，或(h)n-磺基葡萄糖胺磺基水解酶以用于治疗mps-iiia或(i)n-乙酰-α-氨基葡萄糖苷酶以用于治疗mps-iiib的外源环状rna，并且其中所述制剂在被配制用于肠胃外递送至人的医疗装置(诸如输液袋)中，并且其中所述制剂以1x105至1x109个细胞/kg受试者的剂量，经由被配制用于肠胃外递送至人的医疗装置(诸如输液袋)来施用。在一些实施例中，所述剂量是iv剂量，例如，例如100-500万个细胞的单次iv剂量。定义[0042]本发明将针对特定实施例并参考某些附图进行描述，但是本发明不限于此，而是仅由权利要求来限定。除非另有说明，否则下文陈述的术语通常应以其常见意义来理解。[0043]如本文使用的，术语“circrna”或“环状多核糖核苷酸”或“环状rna”可互换使用，并且意指具有没有游离端(即，没有游离3’和/或5’端)的结构的多核糖核苷酸分子，例如通过共价或非共价键形成环状或环形结构的多核糖核苷酸。[0044]如本文使用的，术语“适配体序列”是特异性结合至靶分子的非天然存在、或合成的寡核苷酸。典型地，适配体是从20至500个核苷酸。典型地，适配体通过二级结构而非序列同源性结合至其靶。[0045]如本文所用，术语“治疗特征”是有益地影响病状或疾病进程的任何特征，包括促进治疗分子(诸如环状rna)向细胞的递送或治疗分子对细胞的作用。[0046]如本文所用，“分离的细胞”意指从受试者的组织或流体中获得和分离的细胞。分离的细胞是从受试者的组织或流体中获得和分离的细胞，或者是从受试者的组织或流体中获得和分离的细胞的子代细胞，例如，分离的细胞可以是来自置于体外或离体培养的受试者的原代细胞、这种细胞的子代、或来自细胞系的细胞。在一些实施例中，分离的细胞来源于受试者自身的细胞(用于自体转移)或来源于不同于经治疗受试者的受试者(用于同种异体转移)。[0047]如本文使用的，术语“加密原”是环状多核糖核苷酸的核酸序列或结构，所述核酸序列或结构有助于降低、逃避和/或避免免疫细胞的检测和/或降低针对环状多核糖核苷酸的免疫应答的诱导。[0048]如本文使用的，术语“表达序列”是编码产物(例如，肽或多肽)的核酸序列、或调控核酸。编码肽或多肽的示例性表达序列包含多个核苷酸三联体，其中每一个都编码氨基酸，并且被称为“密码子”。[0049]如本文所用，术语“外源的”，当相对于生物分子(诸如环状rna)使用时，意指通过人工将生物分子引入宿主基因组、细胞或生物中。例如，使用重组dna技术和/或用于将生物分子内化到细胞中的方法添加至现有基因组、细胞、组织或受试者中的环状rna对于现有核酸序列、细胞、组织或受试者以及保留生物分子的核酸序列、细胞、组织或受试者的任何子代来说是外源的。[0050]如本文使用的，术语“免疫蛋白结合位点”是与免疫蛋白结合的核苷酸序列。在一些实施例中，免疫蛋白结合位点有助于掩蔽为外源性的环状多核糖核苷酸，例如，免疫蛋白结合位点被蛋白质(例如，竞争性抑制剂)结合，从而阻止环状多核糖核苷酸被免疫蛋白识别和结合，从而降低或避免针对环状多核糖核苷酸的免疫应答。[0051]如本文使用的，术语“免疫蛋白”是与免疫应答(例如像针对免疫原，例如环状多核糖核苷酸)相关的任何蛋白质或肽。免疫蛋白的非限制性实例包括t细胞受体(tcr)、抗体(免疫球蛋白)、主要组织相容性复合体(mhc)蛋白、补体蛋白、和rna结合蛋白。[0052]如本文所用，术语“经修饰的核糖核苷酸”意指具有对未修饰的天然核糖核苷酸的化学组成(诸如天然未修饰的核苷酸腺苷(a)、尿苷(u)、鸟嘌呤(g)、胞苷(c))的一个或多个化学修饰的任何核糖核苷酸类似物或衍生物。在一些实施例中，经修饰的核糖核苷酸的化学修饰是对核糖核苷酸的任何一个或多个官能团，诸如糖、核碱基或核苷间键(例如对连接的磷酸酯/对磷酸二酯键/对磷酸二酯主链)的修饰。[0053]如本文使用的，短语“准螺旋结构”是环状多核糖核苷酸的高阶结构，其中环状多核糖核苷酸的至少一部分折叠成螺旋结构。[0054]如本文使用的，短语“准双链二级结构”是环状多核糖核苷酸的高阶结构，其中环状多核糖核苷酸的至少一部分产生内部双链。[0055]如本文使用的，术语“调控元件”是修饰环状多核糖核苷酸内表达序列的表达的部分，诸如核酸序列。[0056]如本文使用的，术语“重复核苷酸序列”是一段dna或rna内或整个基因组内的重复核酸序列。在一些实施例中，重复核苷酸序列包括聚ca序列或聚tg(ug)序列。在一些实施例中，重复核苷酸序列包括内含子alu家族中的重复序列。[0057]如本文所用，术语“复制元件”是复制或起始环状多核糖核苷酸转录所必需或可用的序列和/或一个或多个基序。[0058]如本文使用的，术语“交错元件”是在翻译期间诱导核糖体暂停的部分，诸如核苷酸序列。在一些实施例中，交错元件是具有强α-螺旋倾向的氨基酸的非保守序列，其后接共有序列-d(v/i)exnpgp，其中x＝任何氨基酸。在一些实施例中，交错元件可以包括化学部分，诸如甘油、非核酸连接部分、化学修饰、经修饰的核酸、或其任何组合。[0059]如本文所用，术语“实质性抗性”意指相较于参考物具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％抗性的物质。[0060]如本文所用，术语“化学计量翻译”意指从环状多核糖核苷酸翻译的表达产物的基本当量的产生。例如，对于具有两个表达序列的环状多核糖核苷酸，环状多核糖核苷酸的化学计量翻译可以表示两个表达序列的表达产物可具有基本相等的量，例如两个表达序列之间的量差(例如摩尔差)可以为约0，或小于1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％或20％。[0061]如本文使用的，术语“翻译起始序列”是起始环状多核糖核苷酸中表达序列的翻译的核酸序列。[0062]如本文使用的，术语“终止元件”是终止环状多核糖核苷酸中表达序列的翻译的部分，诸如核酸序列。[0063]如本文使用的，术语“翻译效率”意指从核糖核苷酸转录物产生蛋白质或肽的速率或量。在一些实施例中，翻译效率可以表示为给定量的编码蛋白质或肽的转录物产生的蛋白质或肽的量，例如在给定的时间段内，例如在给定的翻译系统，例如体外翻译系统(像兔网织红细胞裂解物)或体内翻译系统(像真核细胞或原核细胞)中。[0064]如本文所用，术语“环化效率”是所得环状多核糖核苷酸相对于其起始材料的测量。[0065]如本文使用的，术语“免疫原性”是针对物质诱导免疫应答的潜力。在一些实施例中，当生物体的免疫系统或某种类型的免疫细胞暴露于免疫原性物质时，可以诱导免疫应答。术语“非免疫原性”是对于物质缺少或不存在高于可检测阈值的免疫应答。在一些实施例中，当生物体的免疫系统或某种类型的免疫细胞暴露于非免疫原性物质时，未检测到免疫应答。在一些实施例中，当通过免疫原性测定测量时，如本文提供的非免疫原性环状多核糖核苷酸不会诱导超过预定阈值的免疫应答。例如，当使用免疫原性测定来测量针对环状多核糖核苷酸的先天性免疫应答(诸如测量炎性标记物)时，如本文提供的非免疫原性多核糖核苷酸可以导致水平低于预定阈值的先天性免疫应答的产生。预定阈值可以是例如由针对对照参考物的先天性免疫应答产生的一种或多种标记物水平的至多1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。[0066]如本文使用的，术语“线性对应物”是与环状多核糖核苷酸具有相同或相似的核苷酸序列(例如，100％、95％、90％、85％、80％、75％、或其间的任何百分比的序列相似性)并且具有两个游离端的多核糖核苷酸分子(及其片段)(即，环状多核糖核苷酸的未环化形式(及其片段))。在一些实施例中，线性对应物(例如，环化前形式)是与环状多核糖核苷酸具有相同或相似的核苷酸序列(例如，100％、95％、90％、85％、80％、75％、或其间的任何百分比序列相似性)并且具有相同或相似的核酸修饰，并且具有两个游离端的多核糖核苷酸分子(及其片段)(即，环状多核糖核苷酸的未环化形式(及其片段))。在一些实施例中，线性对应物是与环状多核糖核苷酸具有相同或相似的核苷酸序列(例如，100％、95％、90％、85％、80％、75％、或其间的任何百分比的序列相似性)并且具有不同的核酸修饰或不具有核酸修饰，并且具有两个游离端的多核糖核苷酸分子(及其片段)(即，环状多核糖核苷酸的未环化形式(及其片段))。在一些实施例中，作为线性对应物的多核糖核苷酸分子的片段是线性对应物多核糖核苷酸分子的任何部分，所述任何部分短于线性对应物多核糖核苷酸分子。在一些实施例中，线性对应物进一步包含5’帽。在一些实施例中，线性对应物进一步包含聚腺苷尾。在一些实施例中，线性对应物进一步包含3’utr。在一些实施例中，线性对应物进一步包含5’utr。[0067]如本文使用的，术语“载体”意指通过经由部分或完全包封剂或其组合共价修饰环状多核糖核苷酸来促进将组合物(例如，环状多核糖核苷酸)转运或递送至细胞中的化合物、组合物、试剂、或分子。载体的非限制性实例包括碳水化合物载体(例如，酸酐修饰的植物糖原或糖原型材料)、纳米颗粒(例如，包封或共价连接结合至环状多核糖核苷酸的纳米颗粒)、脂质体、融合体、离体分化的网织红细胞、外来体、蛋白载体(例如，共价连接至环状多核糖核苷酸的蛋白)或阳离子载体(例如，阳离子脂聚合物或转染试剂)。[0068]如本文使用的，术语“裸递送”意指用于在不借助载体并且不对部分进行有助于递送至细胞的共价修饰的情况下递送至细胞的配制品。裸递送配制品不含任何转染试剂、阳离子载体、碳水化合物载体、纳米颗粒载体、或蛋白质载体。例如，环状多核糖核苷酸的裸递送配制品是包含无共价修饰的环状多核糖核苷酸并且不含载体的配制品。[0069]术语“稀释剂”意指包含本文所述的组合物(例如，包含环状多核糖核苷酸的组合物)可以稀释或溶解于其中的非活性溶剂的媒介物。稀释剂可以是rna增溶剂、缓冲液、等渗剂、或其混合物。稀释剂可以是液体稀释剂或固体稀释剂。液体稀释剂的非限制性实例包括水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油(特别是棉籽油、落花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯、和1,3-丁二醇。固体稀释剂的非限制性实例包括碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠、乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、山梨糖醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉、或糖粉。通过援引并入[0070]本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请通过援引并入本文，其程度如同明确地和单独地指示将每篇单独的公开、专利或专利申请通过援引并入本文。附图说明[0071]当结合附图阅读时，将更好地理解本发明的实施例的以下详细描述。出于说明本发明的目的，在附图中示出了本发明示例的实施例。然而，应理解，本发明不限于附图中所示实施例的精确安排和手段。[0072]图1示出了如下的实验数据，所述数据展示了电穿孔后由环状多核糖核苷酸(“环形rna”)编码的gfp蛋白的表达在细胞中持续的时间比由线性多核糖核苷酸对应物(“线性rna”)编码的gfp蛋白的表达更长。[0073]图2示出了如下的实验数据，所述数据展示了在将编码car蛋白的环状(“c”)或线性(“l”)多核糖核苷酸引入细胞后的car蛋白的表面表达。[0074]图3示出了如下的实验数据，所述数据展示了由不同环状多核糖核苷酸构建体或线性多核糖核苷酸构建体编码的高斯萤光素酶在hela细胞中的表达是核苷酸量的函数。[0075]图4显示cd19car在用编码cd19car序列的环状rna构建体或用编码cd19car序列的线性rna构建体电穿孔的原代人t细胞上表达。仅用媒介物电穿孔的原代人t细胞未观察到表达(阴性对照)。[0076]图5是示出在肿瘤杀伤测定中从编码cd19car序列的环状rna构建体表达cd19car的t细胞的示意图。[0077]图6示出了从编码杀死肿瘤细胞的cd19car序列的环状rna构建体表达cd19car的t细胞。[0078]图7示出了在来自环状多核糖核苷酸的细胞中表达的pah蛋白的蛋白质印迹。[0079]图8示出了由两种测试的环状rna在细胞中表达的pah蛋白是有功能的，并且能够将苯丙氨酸转化为酪氨酸[0080]图9示出了如下的实验数据，所述数据展示了与线性多核糖核苷酸(“gluc-线性”和“gluc-线性-修饰-球蛋白”)相比，环状多核糖核苷酸(“gluc-环状”)随时间的稳定性[0081]图10示出了如下的实验数据，所述数据示出了与线性多核糖核苷酸(“gluc-线性”)或转染试剂阴性对照(“lipofectamine(-)rna”)相比，环状多核糖核苷酸(“gluc-环状”)的毒性随时间降低。[0082]图11示出了环状rna的示意图。左下方的示意图示出了包含结合转铁蛋白受体的c2min适配体序列的环状rna。底部中间的示意图示出了包含结合转铁蛋白受体的36a适配体序列的环状rna。右下方的示意图示出了包含不结合转铁蛋白受体的非结合序列的环状rna。所有三种环状rna还包含与af488标记的dna寡核苷酸结合的序列(退火序列)。[0083]图12示出了包含结合转铁蛋白受体的适配体序列(c2.min或36a)的环状多核糖核苷酸被内化到基于荧光表达转铁蛋白受体的细胞中。包含非结合适配体的环状多核糖核苷酸没有被内化到基于荧光表达转铁蛋白受体的细胞中。[0084]图13示出了单链rna寡核苷酸和环状rna的示意图。单链rna寡核苷酸包含适配体序列和与环状多核糖核苷酸结合的序列(结合基序)。环状rna包含与单链rna寡核苷酸中的结合序列结合的序列。左下方的示意图示出了结合至环状多核糖核苷酸的单链rna寡核苷酸，其包含结合转铁蛋白受体的c2min适配体序列和结合至环状多核糖核苷酸的序列。底部中间的示意图示出了结合至环状多核糖核苷酸的单链rna寡核苷酸，其包含结合转铁蛋白受体的36a适配体序列和结合至环状多核糖核苷酸的序列。右下方的示意图示出了结合至环状多核糖核苷酸的单链rna寡核苷酸，其包含不结合转铁蛋白受体的适配体序列和结合至环状多核糖核苷酸的序列。[0085]图14是展示了在示例性纯化过程之后的示例性环状rna的变性page凝胶图像。[0086]图15a是示出了使用捕获线性和环状rna两者的引物进行的对递送至细胞后24小时的线性和环状rna水平的qrt-pcr分析的图。[0087]图15b是示出了使用对环状rna具有特异性的引物进行的对线性和环状rna水平的qrt-pcr分析的图。[0088]图16是示出了对来自用环状rna或线性rna转染的293t细胞的免疫相关基因的qrt-pcr分析的图。[0089]图17是示出了由环状rna经由滚环翻译表达的蛋白质的萤光素酶活性的图。[0090]图18是示出了环状rna或线性rna的表达产物的蛋白质印迹的图像。[0091]图19示出了如下的实验数据，所述数据展示了与线性对照相比，环状rna在正进行分裂的细胞中有更高的稳定性。[0092]图20示出了如下的实验数据，所述数据展示了与线性对照相比，示例性环状rna对转染细胞的毒性降低。[0093]图21示出了环状rna的示例性体外产生过程示意图，所述环状rna含有起始密码子、编码gfp的orf(开放阅读框)、交错元件(2a)、加密原、和ires(内部核糖体进入位点)。[0094]图22示出了环状rna的示例性体内产生过程的示意图。[0095]图23示出了示例性环状rna的设计，所述环状rna包含起始密码子、编码gfp的orf、交错元件(2a)、和加密原。[0096]图24a和图24b是展示了两种不同环状rna的体内化学计量蛋白质表达的示意图。具体实施方式[0097]本披露总体上涉及用于细胞疗法的组合物以及在细胞疗法中使用这些组合物的方法。这些组合物包括并且这些方法使用包含外源环状多核糖核苷酸的细胞(例如，分离的细胞)，这些外源环状多核糖核苷酸包含至少一个结合位点、编码蛋白质或其组合。所述蛋白质可以是分泌蛋白、膜蛋白或细胞内蛋白。在一些实施例中，蛋白是治疗性蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少聚a尾、复制元件或其组合。细胞疗法的方法可以包括将分离的细胞施用至有需要的受试者。[0098]本披露涉及包含外源环状多核糖核苷酸的分离的细胞。在一些实施例中，药物组合物、制剂、悬浮液、医疗装置或生物相容性基质包含用于细胞疗法的分离的细胞。在一些实施例中，生物反应器包含用于细胞疗法的分离的细胞。在一些实施例中，所述至少一个结合位点赋予环状多核糖核苷酸细胞定位。在一些方面，分离的细胞是经编辑的细胞。[0099]本披露进一步涉及产生用于细胞疗法的分离的细胞。在一个实施例中，产生细胞或多个细胞的方法包括提供如本文所述的分离的细胞或多个分离的细胞；提供如本文所述的环状多核糖核苷酸，并使环状多核糖核苷酸与分离的细胞或多个分离的细胞接触。在一些实施例中，所述方法进一步包括在与受试者接触后施用细胞或多个细胞。[0100]本披露进一步涉及施用包含如本文所披露的环状多核糖核苷酸的分离的细胞。在一个实施例中，细胞疗法的方法包括向有需要的受试者施用包含分离的细胞、多个分离的细胞的药物组合物、包含分离的细胞的制剂、静脉注射袋中的多个分离的细胞、来自生物反应器的多个分离的细胞，或者将包含多个分离的细胞的医疗装置或生物相容性基质植入受试者。[0101]本披露进一步涉及一种编辑分离的细胞或多个分离的细胞的核酸的方法，其包括a)提供分离的细胞或多个分离的细胞；b)使分离的细胞或多个分离的细胞与编码核酸酶和/或包含指导核酸的环状多核糖核苷酸接触；从而产生经编辑的细胞或多个经编辑的细胞，用于施用至受试者。在一些实施例中，核酸酶是锌指核酸酶、talen或cas蛋白。[0102]在一些方面，本发明涉及一种包含细胞的细胞疗法，其中所述细胞包含含有至少一个编码蛋白质(例如，治疗性蛋白质)的表达序列的外源环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，所述细胞包含蛋白质(例如，治疗性蛋白质)和环状多核糖核苷酸，其中环状多核糖核苷酸包含至少一个编码蛋白质的表达序列。在一些实施例中，所述细胞是治疗性细胞，其中治疗性细胞包含蛋白质和环状多核糖核苷酸，并且其中环状多核糖核苷酸包含至少一种编码赋予所述细胞至少一种治疗特征的蛋白质的表达序列。所述细胞可以是离体细胞(例如，分离的细胞)。所述细胞可以是分离的细胞。在一些实施例中，细胞疗法是药物组合物，并且进一步包含药学上可接受的载体或赋形剂。[0103]本文所述的细胞可用于细胞疗法的方法。细胞疗法的方法可以包括提供环状多核糖核苷酸，例如任何本文披露的环状多核糖核苷酸或其组合物，并使环状多核糖核苷酸与细胞(例如分离的细胞)离体接触。环状多核糖核苷酸可以包含一个或多个表达序列。一个或多个表达序列的表达产物可以是蛋白质，例如治疗性蛋白质。在一些实施例中，细胞疗法的方法进一步包括将细胞施用至有需要的受试者，例如人受试者。在一些方面，细胞疗法的方法包括提供包含一个或多个表达序列的环状多核糖核苷酸，并使环状多核糖核苷酸与细胞(例如，分离的细胞)离体接触。在一些实施例中，所述一个或多个表达序列的表达产物包含用于治疗有需要的受试者的蛋白质。在进一步的方面，本发明涉及一种细胞疗法的方法，其包括将如本文所披露的细胞或治疗性细胞或其药物组合物施用至有需要的受试者。用于细胞疗法的细胞[0104]在一些方面，细胞疗法包括细胞(例如，分离的细胞)，其中所述细胞包含环状多核糖核苷酸，其中环状多核糖核苷酸(a)包含至少一个结合位点，(b)编码蛋白质，或(a)和(b)两者。环状多核糖核苷酸可包含至少一个编码蛋白质(例如，治疗性蛋白质)的表达序列、至少一个结合位点、或其组合。在一些实施例中，所述细胞是治疗性细胞，其中治疗性细胞包含蛋白质和环状多核糖核苷酸，并且其中环状多核糖核苷酸包含至少一种编码赋予所述细胞至少一种治疗特征的蛋白质的表达序列。在一些实施例中，所述细胞是治疗性细胞，其中治疗性细胞包含环状多核糖核苷酸，并且其中环状多核糖核苷酸包含至少一个赋予所述细胞至少一种治疗特征的结合位点。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸与细胞接触。所述细胞可以是分离的细胞。在一些实施例中，所述细胞(例如，分离的细胞)是分离的哺乳动物细胞，其包含外源、合成环状多核糖核苷酸。[0105]在一些实施例中，所述细胞(例如，分离的细胞)包含外源、合成环状多核糖核苷酸，其包含至少一个结合位点、编码的蛋白质或其组合，其中将细胞施用至受试者。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸(1)包含至少一个结合位点，(2)编码分泌蛋白或细胞内蛋白，或(3)(1)和(2)的组合。在实施例中，环状多核糖核苷酸(1)包含至少一个结合位点，(2)编码膜蛋白，或(3)(1)和(2)的组合，其中膜蛋白不是嵌合抗原受体、t细胞受体或t细胞受体融合蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含至少一个结合位点并编码蛋白质，其中所述蛋白质是分泌蛋白、膜蛋白或细胞内蛋白。[0106]在一些实施例中，用于细胞疗法的细胞包含由如本文所述的外源环状多核糖核苷酸编码的嵌合抗原受体(car)。例如，细胞包含编码抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域的环状多核糖核苷酸，并包含至少一个结合位点。在一些实施例中，分离的细胞包含编码嵌合抗原受体并包含至少一个结合位点的环状多核糖核苷酸，其中分离的细胞用于施用(例如，静脉内施用至受试者)。[0107]在一些实施例中，细胞包含：(a)环状多核糖核苷酸，其包含i)至少一个编码与抗原结合的抗原结合蛋白的靶结合序列，或ii)编码抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域的序列；和(b)编码蛋白质的第二核苷酸序列，其中蛋白质的表达在抗原与抗原结合蛋白结合时被激活。在一些实施例中，ii)的序列进一步包含至少一个结合位点。在一些实施例中，蛋白质是分泌蛋白。在一些实施例中，蛋白质是细胞因子(例如，il-12)或共刺激配体(例如，cd40或4-1bbl)。[0108]在特定实施例中，用于细胞疗法的细胞是修饰的t细胞。例如，细胞包含编码对抗原具有亲和力的t细胞受体(tcr)的环状多核糖核苷酸和编码双特异性抗体的环状多核糖核苷酸，其中所述细胞在所述细胞表面上表达tcr和双特异性抗体。细胞类型[0109]在一些实施例中，细胞(例如，分离的细胞)是真核细胞。在一些实施例中，细胞是动物细胞。在一些实施例中，细胞来自水产养殖动物(鱼、蟹、虾、牡蛎等)、哺乳动物(例如，来自宠物或动物园动物(猫、狗、蜥蜴、鸟、狮子、老虎和熊等)的细胞，来自农场或役用动物(马、牛、猪、鸡等)的细胞)，或者是人细胞、培养的细胞、原代细胞或细胞系、干细胞、祖细胞、分化细胞、生殖细胞、癌细胞(例如，致瘤的、转移的)、非致瘤细胞(正常细胞)、胎儿细胞、胚胎细胞、成年细胞、有丝分裂细胞或非有丝分裂细胞。[0110]在一些实施例中，细胞(例如，分离的细胞)是免疫细胞。在一些实施例中，细胞是非免疫细胞。在一些实施例中，细胞是外周血单核细胞。在一些实施例中，细胞是淋巴细胞。在一些实施例中，细胞是神经细胞。在一些实施例中，细胞是心脏病学细胞。在一些实施例中，细胞是脂肪细胞。在一些实施例中，细胞是肝细胞。在一些实施例中，细胞是β细胞。细胞可以是选自由以下组成的组的细胞：t细胞(例如，调节性t细胞、γδt细胞、αβt细胞、cd8 t细胞或cd4 t细胞)、b细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤t细胞、巨噬细胞、树突细胞、红细胞、网织红细胞、髓系祖细胞和巨核细胞。[0111]在一些实施例中，细胞(例如，分离的细胞)选自由以下组成的组：间充质干细胞、胚胎干细胞、胎儿干细胞、胎盘来源的干细胞、诱导多能干细胞、脂肪干细胞、造血干细胞(例如cd34 细胞)、皮肤干细胞、成体干细胞、骨髓干细胞、脐带血干细胞、脐带干细胞、角膜缘干细胞、祖干细胞和神经干细胞。[0112]在一些实施例中，细胞(例如，分离的细胞)是外周血淋巴细胞。在一些实施例中，细胞是成纤维细胞。细胞可以是软骨细胞。细胞可以是心肌细胞。细胞可以是多巴胺能神经元。细胞可以是小胶质细胞。细胞可以是少突胶质细胞。细胞可以是肠神经元。细胞可以是肝细胞。[0113]在一些实施例中，细胞(例如，分离的细胞)是非复制型的，例如，所述细胞是有丝分裂后的，或者用有丝分裂原或辐射处理。[0114]可使用本领域已知的任何方法从受试者(例如，动物)中取出细胞(例如，分离的细胞)。在一些实施例中，从受试者的器官、组织、血液或淋巴中取出细胞。在一些实施例中，细胞是在体外扩增或培养的取出的或分离的细胞。在一些实施例中，细胞来自细胞系，例如永生化实验室细胞系。细胞可以对受试者是自体的。细胞可以对受试者是同种异体的。细胞在受试者中可以是免疫原性的。在一些实施例中，所述细胞在受试者中没有免疫原性。在一些实施例中，多个细胞(例如，多个分离的细胞)是同质细胞群。在一些实施例中，多个细胞(例如，多个分离的细胞)是异质群体。例如，异质群体是免疫细胞的异质群体。[0115]在一些实施例中，细胞在从受试者中取出待用于器官移植的组织或器官中。例如，细胞在肝脏、心脏、肾脏、皮肤、角膜、脂肪、胰腺、肺、肠、中耳、骨、骨髓、心脏瓣膜、结缔组织或血管化复合同种异体移植物(例如，几种组织(诸如皮肤、骨、肌肉、血管、神经和结缔组织)的复合物)中。环状多核糖核苷酸[0116]在一些方面，如本文所述的细胞包含环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸是外源、合成环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，细胞疗法包括细胞，其中所述细胞包含环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸(1)包含至少一个结合位点，(2)编码分泌蛋白或细胞内蛋白，或(3)(1)和(2)的组合。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸(1)包含至少一个结合位点，(2)编码膜蛋白，或(3)(1)和(2)的组合，其中膜蛋白不是嵌合抗原受体、t细胞受体或t细胞受体融合蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含至少一个结合位点并编码蛋白质，其中所述蛋白质是分泌蛋白、膜蛋白或细胞内蛋白。[0117]环状多核糖核苷酸可包含至少一个编码蛋白质(例如，治疗性蛋白质)的表达序列或至少一个结合位点。在一些实施例中，所述细胞是治疗性细胞，其中治疗性细胞包含蛋白质和环状多核糖核苷酸，并且其中环状多核糖核苷酸包含至少一种编码赋予所述细胞至少一种治疗特征的蛋白质的表达序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸与如本文所述的细胞接触。蛋白质[0118]在一些实施例中，如本文所述的环状多核糖核苷酸编码蛋白质。所述蛋白质可以是分泌蛋白、膜蛋白或细胞内蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸编码在细胞中翻译时产生表达产物的表达序列。表达序列可编码蛋白质，诸如治疗性蛋白质。表达序列可编码赋予细胞至少一种治疗特征的蛋白质。环状多核糖核苷酸可包含一个或多个编码蛋白质或治疗性蛋白质的表达序列。[0119]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含编码表达序列的肽或多肽(例如用作细胞疗法的治疗性蛋白质)的表达序列。所述蛋白质可以治疗有需要的受试者的疾病。在一些实施例中，表达序列的肽或多肽是赋予细胞治疗特征(例如，促进细胞扩增、细胞永生化、细胞分化和/或细胞对靶的定位)的任何肽或多肽。治疗性蛋白质可补偿有需要的受试者中突变的、表达不足的或缺失的蛋白质。治疗性蛋白质可靶向、相互作用或结合有需要的受试者中的细胞、组织或病毒。[0120]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个rna表达序列，其中每一个都可以可编码多肽。多肽可以大量产生。这样，多肽可以是可产生的任何蛋白质分子。[0121]多肽可以是可从细胞分泌或定位于细胞的细胞质、细胞核或膜区室的多肽。一些多肽包括但不限于以下中的至少一部分：病毒包膜蛋白、代谢调控酶(例如，调控脂质或类固醇的产生)、抗原、耐受原、细胞因子、毒素、其不存在与疾病相关的酶、和在动物体内没有活性直至被裂解(例如，在动物的肠道中)的多肽、以及激素。在一些实施例中，多肽是补偿细胞中缺陷(例如，突变蛋白质、缺陷蛋白质、表达不良蛋白质或缺失蛋白质)的蛋白质或治疗性蛋白质。[0122]在一些实施例中，可以由本文披露的环状多核糖核苷酸表达的蛋白质或治疗性蛋白质具有抗氧化活性、结合活性、运货受体活性、催化活性、分子载体活性、分子换能器(moleculartransducer)活性、营养储库活性、结构分子活性、毒素活性、转录调节物活性、翻译调节物活性、耐受性活性、或转运蛋白活性。在一些实施例中，蛋白质是分子功能调节物。在一些实施例中，蛋白质起蛋白质标签的作用。蛋白质或治疗性蛋白质的一些实例包括但不限于酶替代蛋白质、用于补充的蛋白质、蛋白疫苗、抗原(例如肿瘤抗原、病毒、细菌)、激素、细胞因子、抗体、免疫疗法(例如癌症)、细胞重编程/转分化因子、转录因子、嵌合抗原受体、转座酶或核酸酶、免疫效应子(例如，影响对免疫应答/信号的易感性)、经调控的死亡效应子蛋白(例如，细胞凋亡或坏死的诱导物)、肿瘤的非溶解性抑制剂(例如癌蛋白抑制剂)、表观遗传修饰剂、表观遗传酶、转录因子、dna或蛋白质修饰酶、dna嵌入剂、外排泵抑制剂、核受体活化剂或抑制剂、蛋白酶体抑制剂、酶竞争性抑制剂、蛋白质合成效应剂或抑制剂、核酸酶、蛋白质片段或结构域、配体或受体、cas蛋白、以及crispr系统或其组分。在一些实施例中，蛋白质是耐受性因子，诸如hla-g、pd-l1、cd47或cd24。[0123]在一些实施例中，由环状多核糖核苷酸编码并任选地在细胞中表达的蛋白质或治疗性蛋白质是细胞内蛋白或细胞溶质蛋白。蛋白质或治疗性蛋白质可以是例如，苯丙氨酸羟化酶、g蛋白、激酶、磷酸酶、核酸酶、嵌合抗原受体、锌指核酸酶蛋白、转录激活因子样蛋白质核酸酶或cas蛋白。在一些实施例中，cas蛋白是cas9、cas12、cas14或cas13。[0124]在一些实施例中，由环状多核糖核苷酸编码并任选地在细胞中表达的蛋白质或治疗性蛋白质是膜蛋白。在一些实施例中，膜蛋白是跨膜蛋白。在一些实施例中，膜蛋白是细胞外基质蛋白。蛋白质或治疗性蛋白质可以是例如，嵌合抗原受体(car)、跨膜受体、g蛋白偶联受体(gpcr)、受体酪氨酸激酶(rtk)、抗原受体、离子通道或膜转运蛋白。[0125]在一些实施例中，蛋白质或治疗性蛋白质是膜蛋白。在一些实施例中，膜蛋白是细胞外基质蛋白。在一些实施例中，膜蛋白是嵌合抗原受体(car)。在一些实施例中，蛋白质或治疗性蛋白质包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，抗原结合结构域连接至跨膜结构域，所述跨膜结构域连接至细胞内信号传导结构域以产生car。[0126]在一些实施例中，抗原结合结构域结合肿瘤抗原、耐受原或病原体，或者所述抗原是肿瘤抗原或病原体抗原。在一些实施例中，抗原结合结构域是抗体或其抗体片段。例如，抗原结合结构域是单链可变片段(scfv)、可变片段或fab。在一些实施例中，抗原结合结构域是双特异性抗体。在一些实施例中，双特异性抗体具有结合第一表位的第一免疫球蛋白可变结构域和结合第二表位的第二免疫球蛋白可变结构域。在一些实施例中，第一表位和第二表位是相同的。在一些实施例中，第一表位和第二表位是不同的。在一些实施例中，跨膜结构域连接抗原结合结构域和细胞内信号传导结构域。[0127]在一些实施例中，跨膜结构域是铰链蛋白(例如，免疫球蛋白铰链)、多肽接头(例如，gs接头)、kir2ds2铰链、cd8a铰链或间隔子。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含t细胞信号传导分子的至少一部分。[0128]在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含cd3ζ、普通fcrγ(fcer1g)、fcγriia、fcrβ(fcεrib)、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd79a、cd79b、dap10、dap12、或其任何组合的至少一部分。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域进一步包含共刺激细胞内信号传导结构域。在一些实施例中，共刺激细胞内信号传导结构域包含tnf受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞活化分子或活化nk细胞受体蛋白中的至少一种或多种。在一些实施例中，共刺激细胞内信号传导结构域包含cd27、cd28、4-1bb、ox40、gitr、cd30、cd40、pd-1、icos、baffr、hvem、icam-1、lfa-1、cd2、cds、cd7、cd287、light、nkg2c、nkg2d、slamf7、nkp80、nkp30、nkp44、nkp46、cd160、cd19、cd4、cd8α、cd8β、il2rβ、il2rγ、il7rα、itga4、vla1、cd49a、ia4、cd49d、itga6、vla6、cd49f、itgad、cd103、itgal、itgam、itgax、itgb1、cd29、itgb2、cd18、itgb7、tnfr2、trance/trankl、cd226、slamf4、cd84、cd96、ceacam1、crtam、cd229、cd160、psgl1、cd100、cd69、slamf6、slamf1、slamf8、cd162、ltbr、lat、gads、slp-76、pag/cbp、cd19a、b7-h3或与cd83结合的配体thab中的至少一种或多种。[0129]在一些实施例中，嵌合抗原受体是cd19特异性嵌合抗原受体、taa特异性嵌合抗原受体、bcma特异性嵌合抗原受体、her2特异性嵌合抗原受体、cd2特异性嵌合抗原受体、ny-eso-1特异性嵌合抗原受体、cd20特异性嵌合抗原受体、间皮细胞特异性嵌合抗原受体、ebv特异性嵌合抗原受体、或cd33特异性嵌合抗原受体。[0130]在一些实施例中，由环状多核糖核苷酸编码并任选地在细胞中表达的蛋白质或治疗性蛋白质是分泌蛋白。分泌蛋白可以是例如，促红细胞生成素、细胞因子、胰岛素、催产素、分泌酶、激素或神经递质。[0131]在一些实施例中，蛋白质或治疗性蛋白质可以具有活性。例如，活性可以是抗氧化活性、结合活性、运货受体活性、催化活性、分子载体活性、分子换能器活性、营养储库活性、结构分子活性、毒素活性、转录调节物活性、翻译调节物活性、或转运蛋白活性。在一些实施例中，活性可以赋予细胞特征(例如，永生化、细胞分化、定位于靶位点、扩增和/或增加复制)。在一些实施例中，用于细胞分化的蛋白质或治疗性蛋白质是oct4、klf4、sox2、cmyc、或其组合。在一些实施例中，这些蛋白质用于对细胞进行重编程，例如，以产生诱导多能干细胞。[0132]在一些实施例中，可以由本文披露的环状多核糖核苷酸表达的示例性蛋白质包括人蛋白，例如受体结合蛋白、激素、生长因子、生长因子受体调节子和再生蛋白质(例如，增殖和分化涉及的蛋白质，例如用于伤口愈合的治疗性蛋白质)。在一些实施例中，可以由本文披露的环状多核糖核苷酸表达的示例性蛋白质包括egf(表皮生长因子)。在一些实施例中，可以由本文披露的环状多核糖核苷酸表达的示例性蛋白质包括酶，例如，氧化还原酶、代谢酶、线粒体酶、加氧酶、脱氢酶、非atp依赖型蛋白酶和去饱和酶。在一些实施例中，可以由本文披露的环状多核糖核苷酸表达的示例性蛋白质包括细胞内蛋白或胞质蛋白质。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸表达苯丙氨酸羟化酶。在一些实施例中，可以由本文披露的环状多核糖核苷酸表达的示例性蛋白质包括分泌蛋白，例如分泌酶。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸表达促红细胞生成素。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸表达表皮生长因子(egf)。在一些情况下，环状多核糖核苷酸表达如下的分泌蛋白，所述分泌蛋白可以在血液中具有较短半衰期，或者可以是具有亚细胞定位信号的蛋白，或者是具有分泌信号肽的蛋白。[0133]在一些实施例中，蛋白质或治疗性蛋白质特异性结合抗原。例如，本文所述的可用于本发明的肽包括抗原结合肽，例如抗原结合抗体或抗体样片段，诸如单链抗体、纳米抗体(参见，例如，steeland等人2016.nanobodiesastherapeutics:bigopportunitiesforsmallantibodies.[纳米抗体作为治疗剂：小抗体的巨大机会]drugdiscovtoday[今日药物发现]:21(7):1076-113)。此类抗原结合肽可以结合细胞质抗原、核抗原、细胞内抗原。在一些实施例中，抗原是肿瘤抗原、耐受原或病原体抗原在一些实施例中，抗原表达自肿瘤或癌症。[0134]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸表达抗体，例如，全长抗体、抗体片段或其一部分。在一些实施例中，由环状多核糖核苷酸表达的抗体可以是任何同种型，诸如iga、igd、ige、igg、igm。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸表达抗体的一部分，诸如轻链、重链、fc片段、cdr(互补决定区)、fv片段、或fab片段、其另一部分。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸表达抗体的一个或多个部分。例如，环状多核糖核苷酸可以包含多于一个表达序列，其中每一个表达抗体的一部分，并且其总和可以构成抗体。在一些情况下，环状多核糖核苷酸包含一个编码抗体重链的表达序列和另一个编码抗体轻链的表达序列。当环状多核糖核苷酸在细胞中表达时，轻链和重链可以经受适当的修饰、折叠或其他翻译后修饰以形成功能性抗体。[0135]肽可以包括但不限于神经递质、激素、药物、毒素、病毒或微生物颗粒、合成分子及其激动剂或拮抗剂。[0136]多肽可以是直链或支链的。多肽的长度可以是从约5个至约40,000个氨基酸、约15个至约35,000个氨基酸、约20个至约30,000个氨基酸、约25个至约25,000个氨基酸、约50个至约20,000个氨基酸、约100个至约15,000个氨基酸、约200个至约10,000个氨基酸、约500个至约5,000个氨基酸、约1,000至约2,500个氨基酸、或其间的任何范围。在一些实施例中，长度少于约40,000个氨基酸、少于约35,000个氨基酸、少于约30,000个氨基酸、少于约25,000个氨基酸、少于约20,000个氨基酸、少于约15,000个氨基酸、少于约10,000个氨基酸、少于约9,000个氨基酸、少于约8,000个氨基酸、少于约7,000个氨基酸、少于约6,000个氨基酸、少于约5,000个氨基酸、少于约4,000个氨基酸、少于约3,000个氨基酸、少于约2,500个氨基酸、少于约2,000个氨基酸、少于约1,500个氨基酸、少于约1,000个氨基酸、少于约900个氨基酸、少于约800个氨基酸、少于约700个氨基酸、少于约600个氨基酸、少于约500个氨基酸、少于约400个氨基酸、少于约300个氨基酸、或更少的多肽可能是有用的。[0137]在一些实施例中，来自环状多核糖核苷酸的蛋白质(例如，治疗性蛋白质或赋予治疗特征的蛋白质)的表达是短暂的或长期的。所述表达可对细胞、在细胞内或细胞外产生治疗效果。在某些实施例中，治疗效果持续至少约1小时至约30天，或至少约2小时、6小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天或更长时间或介于之间的任何时间。在某些实施例中，治疗效果持续不超过约30分钟至约7天、或不超过约1小时、2小时，3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、4天、5天、6天、7天或其间的任何时间。[0138]在一些实施例中，在细胞中至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14或16天的时间段内，一个或多个表达序列在细胞中产生的表达产物比线性对应物大至少1.5倍。在一些实施例中，在至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14或16天的时间段内，一个或多个表达序列在细胞中的表达维持在变化不超过约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的水平。在一些实施例中，在至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14或16天的时间段内，一个或多个表达序列在细胞中的表达减少不大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。[0139]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个表达序列，并且被配置用于在受试者体内细胞中的持续表达。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸被配置为使得一个或多个表达序列在细胞中在较晚时间点的蛋白质表达等于或高于较早时间点的蛋白质表达。在此类实施例中，所述一个或多个表达序列的蛋白质表达可以维持在相对稳定的水平或可以随时间增加。表达序列的蛋白质表达可以在延长的时间段内相对稳定。例如，在一些情况下，在至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、23或更多天的时间段内，一个或多个表达序列在细胞中的蛋白质表达不会减少50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％。在一些情况下，所述一个或多个表达序列在细胞中在至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、18、20、22、23或更多天的蛋白质表达维持在变化不超过50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％或5％的水平。[0140]本发明包括肽或多肽的表达、蛋白质表达，其包括翻译本文提供的环状多核糖核苷酸的至少一个区域。蛋白质表达可由如本文所披露的编码蛋白质(例如，治疗性蛋白质或赋予治疗性细胞治疗特征的蛋白质)的环状多核糖核苷酸发生。蛋白质表达可以在细胞与环状多核糖核苷酸接触后发生。蛋白质表达可以在细胞(例如离体细胞(例如分离的细胞)中发生。将细胞施用至有需要的受试者后，蛋白质表达可以细胞中发生。[0141]在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸的总长度的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％翻译成多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成具有至少5个氨基酸、至少10个氨基酸、至少15个氨基酸、至少20个氨基酸、至少50个氨基酸、至少100个氨基酸、至少150个氨基酸、至少200个氨基酸、至少250个氨基酸、至少300个氨基酸、至少400个氨基酸、至少500个氨基酸、至少600个氨基酸、至少700个氨基酸、至少800个氨基酸、至少900个氨基酸、或至少1000个氨基酸的多肽。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成具有约5个氨基酸、约10个氨基酸、约15个氨基酸、约20个氨基酸、约50个氨基酸、约100个氨基酸、约150个氨基酸、约200个氨基酸、约250个氨基酸、约300个氨基酸、约400个氨基酸、约500个氨基酸、约600个氨基酸、约700个氨基酸、约800个氨基酸、约900个氨基酸、或约1000个氨基酸的多肽。在一些实施例中，这些方法包括将环状多核糖核苷酸翻译成如本文提供的连续多肽、如本文提供的离散多肽、或两者。[0142]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的至少一个区域的翻译在体内发生，例如，在真核细胞的转染或原核细胞(诸如细菌)的转化之后，或者在使细胞(诸如离体细胞(例如，分离的细胞))与环状多核糖核苷酸之后。[0143]在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括翻译产物的修饰、折叠或其他翻译后修饰。在一些实施例中，用于蛋白质表达的方法包括体内或离体细胞中的翻译后修饰，例如经由细胞机器。[0144]在一些实施例中，蛋白质表达导致细胞内蛋白、膜蛋白或分泌蛋白的产生。[0145]在一些实施例中，与总多肽相比，一个或多个表达序列产生一定量的离散多肽，其中所述量是多肽摩尔数占多肽总量的百分比。多肽可以在环状多核糖核苷酸的滚环翻译过程中产生。每个离散的多肽均可以由单一表达序列产生。在一些实施例中，离散多肽的量是总多肽的至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、或至少98％(摩尔/摩尔)。在一些实施例中，离散多肽的量是总多肽的10％至15％、15％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至35％、35％至40％、40％至45％、45％至50％、50％至55％、55％至60％、60％至65％、65％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至92％、92％至94％、94％至95％、95％至96％、96％至97％、97％至98％、98％至99％、10％至30％、10％至40％、10％至50％、10％至60％、10％至70％、10％至80％、10％至90％、10％至95％、40％至50％、40％至60％、40％至70％、40％至80％、40％至90％、40％至95％、60％至80％、60％至90％、60％至95％、或60％至98％(摩尔/摩尔)。[0146]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含比线性多核糖核苷酸对应物产生更大量表达产物的表达序列。在一些实施例中，表达产物的更大量比线性多核糖核苷酸对应物的量大至少1倍、至少1.2倍、至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍或至少25倍。在一些实施例中，表达产物的更大量比线性多核糖核苷酸对应物的量大1.5倍至1.6倍、1.6倍至1.7倍、1.7倍至1.8倍、1.8倍至1.9倍、1.9倍至2倍、2倍至2.5倍、2.5倍至3倍、3倍至3.5倍、3.5倍至4倍、4倍至4.5倍、4.5倍至5倍、5倍至6倍、6倍至7倍、7倍至8倍、8倍至9倍、9倍至10倍、10倍至15倍、15倍至20倍、20倍至25倍、2倍至5倍、2倍至6倍、2倍至7倍、2倍至10倍、2倍至20倍、4倍至5倍、4倍至6倍、4倍至7倍、4倍至10倍、4倍至20倍、5倍至6倍、5倍至7倍、5倍至10倍、5倍至20倍、或10倍至20倍。在一些实施例中，更大量的表达产物在细胞中产生至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约12天、至少约14天、至少约16天、至少约18天、至少约20天、至少约25天、至少约30天、至少约40天、或至少约50天。在一些实施例中，更大量的表达产物在细胞中产生1天至2天、2天至3天、3天至4天、4天至5天、5天至6天、6天至7天、7天至8天、8天至9天、9天至10天、10天至12天、12天至14天、14天至16天、16天至18天、18天至20天、20天至25天、25天至30天、30天至40天、40天至50天、1天至14天、1天至30天、7天至14天、7天至30天、或14天至30天。[0147]在一些实施例中，在细胞中至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14或16天的时间段内，一个或多个表达序列在细胞中产生的表达产物比线性对应物大至少1.5倍。在一些实施例中，所述时间段在细胞与环状多核糖核苷酸接触后一天开始。在一些实施例中，在至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14或16天的时间段内，一个或多个表达序列在细胞中的表达维持在变化不超过约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的水平。在一些实施例中，所述时间段在细胞与环状多核糖核苷酸接触后一天开始。在一些实施例中，所维持的表达水平是所述时间段开始时的表达水平，例如使细胞与环状多核糖核苷酸接触后一天的表达水平。在一些实施例中，所维持的表达水平是使细胞与环状多核糖核苷酸接触后一天的最高表达水平。在一些实施例中，在至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14或16天的时间段内，一个或多个表达序列在细胞中的表达减少不大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。。在一些实施例中，所述时间段在细胞与环状多核糖核苷酸接触后一天开始。在一些实施例中，减少不大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的表达水平是所述时间段开始时的表达水平。在一些实施例中，减少不大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的表达水平是时间段开始时的最高表达水平，例如使细胞与环状多核糖核苷酸接触后一天的表达水平。在一些实施例中，与使细胞与环状多核糖核苷酸接触后一天的最高表达水平相比，表达水平减少不大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。[0148]翻译后，蛋白质可以在细胞中检测到或作为分泌蛋白检测到。在一些实施例中，在至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、20、30、40、50、60或更多天的时间段内，在细胞中检测蛋白质。在一些实施例中，在至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、20、30、40、50、60或更多天的时间段内，在细胞表面上检测蛋白质。在一些实施例中，在至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、20、30、40、50、60或更多天的时间段内，检测分泌蛋白。在一些实施例中，所述时间段在细胞与编码蛋白质的环状多核糖核苷酸接触后一天开始。可使用本领域已知的用于蛋白质检测的任何技术来检测蛋白质，诸如通过流式细胞术。[0149]肽可以包括但不限于小肽、拟肽(例如，类肽)、氨基酸、和氨基酸类似物。肽可以是直链或支链的。这种肽可以具有小于约5,000克/摩尔的分子量、小于约2,000克/摩尔的分子量、小于约1,000克/摩尔的分子量、小于约500克/摩尔的分子量和此类化合物的盐、酯和其他药学上可接受的形式。肽可以是治疗性肽。结合位点[0150]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸编码至少一个结合位点。所述至少一个结合位点可结合靶，诸如蛋白质、rna或dna。所述至少一个结合位点是蛋白结合位点、rna结合位点或dna结合位点。所述至少一个结合位点赋予细胞至少一种治疗特征。在一些实施例中，所述至少一个结合位点赋予细胞核酸(例如，如本文所述的环状多核糖核苷酸)定位。在一些实施例中，所述至少一个结合位点赋予包含环状多核糖核苷酸的细胞核酸活性(例如，是导致包含mirna的细胞中核酸降解的mirna结合位点)。在一些实施例中，所述至少一个结合位点结合至细胞表面上的细胞受体。在一些实施例中，当所述至少一个结合位点结合至细胞表面上的细胞受体时，环状多核糖核苷酸被内化到如本文所述的细胞中。在一些实施例中，该至少结合位点与线性多核苷酸杂交，所述线性多核苷酸有助于环状多核糖核苷酸内化到细胞中。例如，线性多核苷酸包含与环状多核糖核苷酸的至少一个结合位点杂交的区域和与细胞表面上的细胞受体结合的区域。在一些实施例中，线性多核糖核苷酸的与细胞受体结合的区域导致结合后与环状多核糖核苷酸杂交的线性多核糖核苷酸内化。[0151]在一些实施例中，circrna包含一个结合位点。结合位点可包含适配体。在一些情况下，circrna包含至少两个结合位点。例如，circrna可以包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个结合位点。在一些实施例中，本文描述的circrna是结合一个或多个靶或者一个或多个靶的一个或多个结合部分的分子支架。每个靶可以是但不限于不同或相同的核酸(例如，rna、dna、rna-dna杂交体)、小分子(例如、药物)、适配体、多肽、蛋白、脂质、碳水化合物、抗体、病毒、病毒颗粒、膜、多组分复合物、细胞、细胞部分、其任何片段及其任何组合。在一些实施例中，一个或多个结合位点结合至相同靶。在一些实施例中，所述一个或多个结合位点结合至相同靶的一个或多个结合部分。在一些实施例中，一个或多个结合位点结合至一个或多个不同靶。在一些实施例中，所述一个或多个结合位点结合至不同靶的一个或多个结合部分。在一些实施例中，circrna充当一种或多种结合一个或多个靶的支架。在一些实施例中，circrna充当一个或多个靶的一个或多个结合部分的支架。在一些实施例中，circrna通过与一个或多个一个或多个靶特异性结合来调节细胞过程。在一些实施例中，circrna通过与一个或多个靶的一个或多个结合部分特异性结合来调节细胞过程。在一些实施例中，circrna通过与一个或多个靶特异性结合来调节细胞过程。在一些实施例中，本文描述的circrna包括针对一个或多个特定目的靶的结合位点。在一些实施例中，circrna包括针对每个目的靶的多个结合位点或结合位点的组合。在一些实施例中，circrna包括针对每个目的结合部分的多个结合位点或结合位点的组合。例如，circrna可以包括针对多肽靶的一个或多个结合位点。在一些实施例中，circrna包括针对多核苷酸靶例如dna或rna、mrna靶、rrna靶、trna靶或基因组dna靶的一个或多个结合位点。[0152]在一些实施例中，circrna包含针对单链dna的结合位点。在一些情况下，circrna包含针对双链dna的结合位点。在一些情况下，circrna包含针对抗体的结合位点。在一些情况下，circrna包含针对病毒颗粒的结合位点。在一些情况下，circrna包含针对小分子的结合位点。在一些情况下，circrna包含在细胞内或细胞上结合的结合位点。在一些情况下，circrna包含针对rna-dna杂交体的结合位点。在一些情况下，circrna包含针对甲基化的多核苷酸的结合位点。在一些情况下，circrna包含针对未甲基化的多核苷酸的结合位点。在一些情况下，circrna包含针对适配体的结合位点。在一些情况下，circrna包含针对多肽的结合位点。在一些情况下，circrna包含针对多肽、蛋白、蛋白片段、经标记的蛋白、抗体、抗体片段、小分子、病毒颗粒(例如，包含跨膜蛋白的病毒颗粒)或细胞的结合位点。在一些情况下，circrna包含针对单链dna上的结合部分的结合位点。在一些情况下，circrna包含针对双链dna上的结合部分的结合位点。在一些情况下，circrna包含针对抗体上的结合部分的结合位点。在一些情况下，circrna包含针对病毒颗粒上的结合部分的结合位点。在一些情况下，circrna包含针对小分子上的结合部分的结合位点。在一些情况下，circrna包含针对细胞内或细胞上的结合部分的结合位点。在一些情况下，circrna包含针对rna-dna杂交体上的结合部分的结合位点。在一些情况下，circrna包含针对甲基化的多核苷酸上的结合部分的结合位点。在一些情况下，circrna包含针对未甲基化的多核苷酸上的结合部分的结合位点。在一些情况下，circrna包含针对适配体上的结合部分的结合位点。在一些情况下，circrna包含针对多肽上结合部分的结合位点。在一些情况下，circrna包含针对多肽、蛋白、蛋白片段、经标记的蛋白、抗体、抗体片段、小分子、病毒颗粒(例如，包含跨膜蛋白的病毒颗粒)或细胞上的结合部分的结合位点。[0153]在一些实施例中，结合位点与靶的包含至少两个酰胺键的部分结合。在一些情况下，结合位点不结合靶的包含磷酸二酯键的部分。在一些情况下，靶的一部分不是dna或rna。在一些情况下，结合部分包含至少两个酰胺键。在一些情况下，结合部分不包含磷酸二酯键。在一些情况下，结合部分不是dna或rna。[0154]本文提供的circrna可以包括针对复合物上的结合部分的一个或多个结合位点。本文提供的circrna可以包含一个或多个靶结合位点以形成复合物。例如，本文提供的circrna可充当支架，以在circrna和靶之间形成复合物。在一些实施例中，circrna与单个靶形成复合物。在一些实施例中，circrna与两个靶形成复合物。在一些实施例中，circrna与三个靶形成复合物。在一些实施例中，circrna与四个靶形成复合物。在一些实施例中，circrna与五个或更多个靶形成复合物。在一些实施例中，circrna与两个或更多个靶的复合物形成复合物。在一些实施例中，circrna与三个或更多靶的复合物形成复合物。在一些实施例中，两个或更多个circrna与单个靶形成复合物。在一些实施例中，两个或更多个circrna与两个或更多个靶形成复合物。在一些实施例中，第一circrna与第一靶标的第一结合部分和第二靶的第二不同结合部分形成复合物。在一些实施例中，第一circrna与第一靶的第一结合部分形成复合物，并且第二circrna与第二靶的第二结合部分形成复合物。[0155]在一些实施例中，circrna可以包括针对以下的结合位点：一种或多种抗体-多肽复合物、多肽-多肽复合物、多肽-dna复合物、多肽-rna复合物、多肽-适配体复合物、病毒颗粒-抗体复合物、病毒颗粒-多肽复合物、病毒颗粒-dna复合物、病毒颗粒-rna复合物、病毒颗粒-适配体复合物、细胞-抗体复合物、细胞-多肽复合物、细胞-dna复合物、细胞-rna复合物、细胞-适配体复合物、小分子-多肽复合物、小分子-dna复合物、小分子-适配体复合物、小分子-细胞复合物、小分子-病毒颗粒复合物及其组合。[0156]在一些实施例中，circrna可以包括针对以下的结合位点：一种或多种抗体-多肽复合物、多肽-多肽复合物、多肽-dna复合物、多肽-rna复合物、多肽-适配体复合物、病毒颗粒-抗体复合物、病毒颗粒-多肽复合物、病毒颗粒-dna复合物、病毒颗粒-rna复合物、病毒颗粒-适配体复合物、细胞-抗体复合物、细胞-多肽复合物、细胞-dna复合物、细胞-rna复合物、细胞-适配体复合物、小分子-多肽复合物、小分子-dna复合物、小分子-适配体复合物、小分子-细胞复合物、小分子-病毒颗粒复合物及其组合上的一个或多个结合部分。[0157]在一些实施例中，结合位点与多肽、蛋白或其片段结合。在一些实施例中，结合位点与靶的多肽、蛋白或其片段的结构域、片段、表位、区域或一部分结合。例如，结合位点与分离的多肽、细胞的多肽、纯化的多肽或重组多肽的结构域、片段、表位、区域或部分结合。例如，结合位点与抗体或其片段的结构域、片段、表位、区域或一部分结合。例如，结合位点与转录因子的结构域、片段、表位、区域或一部分结合。例如，结合位点与受体的结构域、片段、表位、区域或一部分结合。例如，结合位点与跨膜受体的结构域、片段、表位、区域或一部分结合。结合位点可以与分离的、纯化的和/或重组的多肽的结构域、片段、表位、区域或一部分结合。结合位点可以与分析物混合物(例如裂解物)的结构域、片段、表位、区域或的一部分结合。例如，结合位点与来自多个细胞或来自单个细胞的裂解物中的结构域、片段、表位、区域或一部分结合。结合位点可以结合靶的结合部分。在一些实例中，结合部分在多肽、蛋白质、或其片段上。在一些实施例中，结合部分包含多肽、蛋白质或其片段的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，结合部分包含分离的多肽、细胞的多肽、经纯化的多肽或重组多肽的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，结合部分包含抗体或其片段的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，结合部分包含转录因子的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，结合部分包含受体的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，结合部分包含跨膜受体的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合部分可以在分离的、纯化的和/或重组的多肽的结构域、片段、表位、区域或一部分上或者包含分离的、纯化的和/或重组的多肽的结构域、片段、表位、区域或一部分上。结合部分包括分析物(例如，裂解物)的混合物上的结合部分或分析物(例如，裂解物)的混合物的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，结合部分在来自多个细胞或来自单个细胞的裂解物的结构域、片段、表位、区域或一部分上或者包含来自多个细胞或来自单个细胞的裂解物的结构域、片段、表位、区域或一部分。[0158]在一些实例中，结合位点与化合物(例如小分子)的结构域、片段、表位、区域或一部分结合。例如，结合结合至药物的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，结合位点结合至化合物的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，结合部分结合至有机化合物的结构域、片段、表位、区域或一部分。在一些情况下，结合位点结合至分子量为900道尔顿或更小的小分子的结构域、片段、表位、区域或一部分。在一些情况下，结合位点结合至分子量为500道尔顿或更大的小分子的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合位点所结合的小分子部分可以例如从天然存在或合成分子的文库获得，包括通过组合方式产生的化合物的文库，即化合物多样性组合文库。组合文库及其产生和筛选的方法是本领域已知的，并且在以下专利中进行了描述：us5,741,713；5,734,018；5,731,423；5,721,099；5,708,153；5,698,673；5,688,997；5,688,696；5,684,711；5,641,862；5,639,603；5,593,853；5,574,656；5,571,698；5,565,324；5,549,974；5,545,568；5,541,061；5,525,735；5,463,564；5,440,016；5,438,119；5,223,409，其披露内容通过援引并入本文。结合位点可以结合小分子的结合部分。在一些情况下，结合部分在小分子的结构域、片段、表位、区域或一部分上或者包含小分子的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，结合部分在药物的结构域、片段、表位、区域或一部分上或者包含药物的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，结合部分在化合物的结构域、片段、表位、区域或一部分上或者包含化合物的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，结合部分在有机化合物的结构域、片段、表位、区域或一部分上或者包含有机化合物的结构域、片段、表位、区域或一部分。在一些情况下，结合部分在分子量为900道尔顿或更小的小分子的结构域、片段、表位、区域或一部分上或者包含分子量为900道尔顿或更小的小分子的结构域、片段、表位、区域或一部分。在一些情况下，结合部分在分子量为500道尔顿或更大的小分子的结构域、片段、表位、区域或一部分上或者包含分子量为500道尔顿或更大的小分子的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合部分可以例如从天然存在或合成分子的文库获得，所述文库包括通过组合手段产生的化合物的文库，即化合物多样性组合文库。组合文库及其产生和筛选的方法是本领域已知的，并且在以下专利中进行了描述：us5,741,713；5,734,018；5,731,423；5,721,099；5,708,153；5,698,673；5,688,997；5,688,696；5,684,711；5,641,862；5,639,603；5,593,853；5,574,656；5,571,698；5,565,324；5,549,974；5,545,568；5,541,061；5,525,735；5,463,564；5,440,016；5,438,119；5,223,409，其披露内容通过援引并入本文。[0159]结合位点可以结合特异性结合对的成员(例如配体)的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合位点可以结合单价(单表位)或多价(多表位)的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合位点可以结合靶的抗原部分或半抗原部分。结合位点可结合共享至少一个共同表位或决定簇位点的单个分子或多个分子的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合位点可以结合细胞(例如细菌细胞、植物细胞或动物细胞)的一部分的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合位点可以结合天然环境(例如组织)，培养的细胞或微生物(例如细菌、真菌、原生动物或病毒)或裂解的细胞中的靶。结合位点可以结合至靶的一部分，所述部分被修饰(例如，化学地修饰)以提供一个或多个另外的结合位点，例如但不限于染料(例如，荧光染料)、多肽修饰性部分(例如磷酸基团、碳水化合物基团等)、或多核苷酸修饰性部分(例如甲基)。结合位点可以结合特异性结合对的成员的结合部分。结合部分可以在特异性结合对的成员(例如，配体)的结构域、片段、表位、区域或一部分上或者包含特异性结合对的成员(例如，配体)的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合部分可以在单价(单表位)或多价(多表位)的结构域、片段、表位、区域或一部分上或者包含单价(单表位)或多价(多表位)的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合部分可以是抗原的或半抗原的。结合部分可以在共享至少一个共同表位或决定簇位点的单个分子或多个分子的结构域、片段、表位、区域或一部分上或者包含共享至少一个共同表位或决定簇位点的单个分子或多个分子的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合部分可以在细胞(例如，细菌细胞、植物细胞或动物细胞)的一部分的结构域、片段、表位、区域或一部分上或者包含细胞(例如，细菌细胞、植物细胞或动物细胞)的一部分的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合部分可以在天然环境(例如，组织)、培养的细胞、或微生物(例如，细菌、真菌、原生动物或病毒)、或裂解的细胞中。可以修饰(例如，化学地)结合部分，以提供一个或多个另外的结合位点，诸如但不限于染料(例如，荧光染料)、多肽修饰性部分(诸如磷酸酯基团、碳水化合物基团等)、或多核苷酸修饰性部分(诸如甲基基团)。[0160]在一些情况下，结合位点结合来自宿主的样品中发现的分子的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合位点可以结合来自宿主的样品中发现的分子的结合部分。在一些情况下，结合部分在来自宿主的样品中发现的分子的结构域、片段、表位、区域或部分上或者包含来自宿主的样品中发现的分子的结构域、片段、表位、区域或部分。来自宿主的样品包括体液(例如，尿液、血液、血浆、血清、唾液、精液、粪便、痰、脑脊髓液、眼泪、粘液等)。样品可以直接检查或者可以进行预处理以使结合部分更易于检测。样品包括一定数量的来自有生命物或先前有生命物的物质。样品可以是天然的、重组的、合成的或非天然存在的。结合位点可以结合上述任何，其从细胞天然或重组表达，在细胞裂解物中或细胞培养基中，是体外翻译的样品，或从样品(例如细胞裂解物)免疫沉淀。结合部分可以是以上中的任一种，其从细胞天然或重组表达、在细胞裂解物或细胞培养基中、是体外翻译的样品、或是来自样品(例如，细胞裂解物)的免疫沉淀。[0161]在一些情况下，结合位点与在无细胞系统中或在体外表达的靶结合。例如，结合位点与细胞提取物中的靶结合。在一些情况下，结合位点与细胞提取物中的靶结合，所述细胞提取物具有dna模板以及用于转录和翻译的试剂。结合位点可以与在无细胞系统中或在体外表达的靶的结合部分结合。在一些情况下，靶的结合部分在无细胞系统中或在体外表达。例如，靶的结合部分在细胞提取物中。在一些情况下，靶的结合部分在细胞提取物中，所述细胞提取物具有dna模板以及用于转录和翻译的试剂。可以使用的细胞提取物的示例性来源包括小麦胚芽、大肠杆菌、兔网织红细胞、极端嗜热菌、杂交瘤、爪蟾属(xenopus)卵母细胞、昆虫细胞、和哺乳动物细胞(例如，人细胞)。可用于表达靶多肽(例如，在阵列上产生靶多肽)的示例性无细胞方法包括蛋白质原位阵列(pisa)、多重斑点技术(mist)、自组装mrna翻译、核酸可编程蛋白阵列(nappa)、纳米孔nappa、dna阵列至蛋白质阵列(dapa)、无膜dapa、纳米孔复制和μip-微凹版印刷、以及pmac-蛋白质微阵列复制(参见kilb等人,eng.lifesci.[生命科学工程]2014,14,352-364)。[0162]在一些情况下，结合位点与从dna模板原位(例如，在阵列的固体基底上)合成的靶结合。结合位点可以与原位合成的靶的结合部分结合。在一些情况下，靶的结合部分是从dna模板原位(例如，在阵列的固体基底上)合成的。在一些情况下，平行或在单一反应中从多个相应的dna模板原位合成多个结合部分。用于原位靶多肽表达的示例性方法包括以下文献中描述的那些：stevens,structure[结构]8(9):r177-r185(2000)；katzen等人,trendsbiotechnol.[生物技术趋势]23(3):150-6.(2005)；he等人,curr.opin.biotechnol.[生物技术新见]19(1):4-9.(2008)；ramachandran等人,science[科学]305(5680):86-90.(2004)；he等人,nucleicacidsres.[核酸研究]29(15):e73-3(2001)；angenendt等人,mol.cellproteomics[分子与细胞蛋白组学]5(9):1658-66(2006)；tao等人,natbiotechnol[自然生物技术]24(10):1253-4(2006)；angenendt等人,anal.chem.[分析化学]76(7):1844-9(2004)；kinpara等人,j.biochem.[生物化学杂志]136(2):149-54(2004)；takulapalli等人,j.proteomeres.[蛋白组学研究杂志]11(8):4382-91(2012)；he等人,nat.methods[自然方法]5(2):175-7(2008)；chatterjee和j.labaer,curropinbiotech[生物技术新见]17(4):334-336(2006)；he和wang,biomoleng[生物分子工程]24(4):375-80(2007)；以及he和taussig,j.immunol.methods[免疫学方法杂志]274(1-2):265-70(2003)。[0163]在一些情况下，结合位点与包含至少6个核苷酸跨度(例如，至少8、9、10、12、15、20、25、30、40、50或100个核苷酸)的核酸靶结合。在一些情况下，结合位点与包含连续核苷酸段的蛋白靶结合。在一些情况下，结合位点与包含非连续核苷酸段的蛋白靶结合。在一些情况下，结合位点与包含突变或功能性突变的位点的核酸靶结合，所述突变或功能性突变包括核酸序列中核苷酸的缺失、添加、交换或截短。结合位点可以结合核酸靶的结合部分。在一些情况下，核酸靶的结合部分包含至少6个核苷酸，例如，至少8、9、10、12、15、20、25、30、40、50、或100个核苷酸的跨度。在一些情况下，蛋白质靶的结合部分包含连续核苷酸段。在一些情况下，蛋白质靶的结合部分包含不连续核苷酸段。在一些情况下，核酸靶的结合部分包含突变或功能性突变的位点，所述突变或功能性突变包括核酸序列中核苷酸的缺失、添加、交换、或截短。[0164]在一些情况下，结合位点与包含至少6个氨基酸(例如，至少8、9、10、12、15、20、25、30、40、50或100个氨基酸)跨度的蛋白靶结合。在一些情况下，结合位点与包含连续氨基酸段的蛋白靶结合。在一些情况下，结合位点与包含非连续氨基酸段的蛋白靶结合。在一些情况下，结合位点与包含突变或功能性突变的位点的蛋白靶结合，所述突变或功能性突变包括多肽序列中氨基酸的缺失、添加、交换或截短。结合位点可以结合蛋白靶的结合部分。在一些情况下，蛋白质靶的结合部分包含至少6个氨基酸，例如至少8、9、10、12、15、20、25、30、40、50、或100个氨基酸的跨度。在一些情况下，蛋白质靶的结合部分包含连续氨基酸段。在一些情况下，蛋白质靶的结合部分包含不连续氨基酸段。在一些情况下，蛋白质靶的结合部分包含突变或功能性突变的位点，所述突变或功能性突变包括多肽序列中氨基酸的缺失、添加、交换、或截短。[0165]在一些实施例中，结合位点与膜结合蛋白的结构域、片段、表位、区域或一部分结合。结合位点可以结合膜结合蛋白的结合部分。在一些实施例中，结合部分在膜结合蛋白的结构域、片段、表位、区域或一部分上或者包含膜结合蛋白的结构域、片段、表位、区域或一部分。示例性的膜结合蛋白包括但不限于gpcr(例如肾上腺素能受体、血管紧张素受体、胆囊收缩素受体、毒蕈碱乙酰胆碱受体、神经降压素受体、甘丙肽受体、多巴胺受体、阿片受体、血清素受体、生长抑素受体等)、离子通道(例如、烟碱乙酰胆碱受体、钠通道、钾通道等)、非兴奋性和兴奋性通道、受体酪氨酸激酶、受体丝氨酸/苏氨酸激酶、受体鸟苷酸环化酶、生长因子和激素受体(例如表皮生长因子(egf)受体)，等。结合位点可以结合膜结合蛋白的突体变或修饰变体的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合位点可以结合膜结合蛋白的突变体或修饰变体的结合部分。结合部分也可以在膜结合蛋白的突变体或修饰变体的结构域、片段、表位、区域或一部分上或者包含膜结合蛋白的突变体或修饰变体的结构域、片段、表位、区域或一部分。例如，gpcr的一些单点或多点突变保留功能并在疾病中涉及(参见，例如，stadel等人,(1997)trendsinpharmacologicalreview[药理学趋势综述]18:430-37)。[0166]结合位点结合至例如泛素连接酶的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合位点结合至例如泛素衔接子、蛋白酶体衔接子或蛋白酶体蛋白的结构域、片段、表位、区域或一部分。结合位点结合至例如内吞、吞噬、溶酶体途径、自噬途径、巨自噬、微自噬、分子伴侣介导的自噬、多囊体途径、或其组合中涉及的蛋白的结构域、片段、表位、区域或一部分。rna结合位点[0167]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个rna结合位点。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括rna结合位点，所述rna结合位点修饰内源基因和/或外源基因的表达。在一些实施例中，rna结合位点调节宿主基因的表达。rna结合位点可以包括与内源基因(例如，如本文所述的mirna、sirna、mrna、lncrna、rna、dna、反义rna、grna的序列)杂交的序列、与外源核酸(例如病毒dna或rna)杂交的序列、与rna杂交的序列、干扰基因转录的序列、干扰rna翻译的序列、稳定rna或使rna不稳定(例如通过靶向降解)的序列、或调节dna-或rna-结合因子的序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含与rna结合的适配体序列。适配体序列可以结合至内源基因(例如，如本文所述的mirna、sirna、mrna、lncrna、rna、dna、反义rna、grna的序列)、外源核酸(例如病毒dna或rna)、rna、干扰基因转录的序列、干扰rna翻译的序列、稳定rna或使rna不稳定(例如通过靶向降解)的序列、或调节dna-或rna-结合因子的序列。适配体序列的二级结构可以结合至rna。通过将适配体序列与rna结合，环状rna可以与rna形成复合物。[0168]在一些实施例中，rna结合位点可以是trna、lncrna、lincrna、mirna、rrna、snrna、微rna、sirna、pirna、snorna、snrna、exrna、scarna、yrna、和hnrna结合位点之一。rna结合位点是本领域普通技术人员熟知的。[0169]某些rna结合位点可以通过rna干扰(rnai)的生物学过程抑制基因表达。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含rnai分子，所述rnai分子具有rna或rna样结构，典型地具有15-50个碱基对(诸如约18-25个碱基对)并且具有与细胞内表达的靶基因中的编码序列相同(互补)或几乎相同(基本上互补)的核碱基序列。rnai分子包括但不限于：短干扰rna(sirna)、双链rna(dsrna)、微rna(mirna)、短发夹rna(shrna)、部分双链体(meroduplex)、和切丁酶(dicer)底物。[0170]在一些实施例中，rna结合位点包含sirna或shrna。sirna和shrna类似于内源性mirna基因加工途径中的中间体。在一些实施例中，sirna可以充当mirna，并且反之亦然。像sirna一样，微rna可以使用risc来下调靶基因，但是与sirna不同，大多数动物mirna都不裂解mrna。相反，mirna通过翻译抑制或聚a去除和mrna降解来降低蛋白质输出。已知的mirna结合位点位于mrna3’‑utr内；mirna似乎靶向与从mirna5’端的第2-8个核苷酸几乎完全互补的位点。此区域称为种子区域。因为sirna和mirna是可互换的，所以外源性sirna可以下调具有与sirna的种子互补性的mrna。3’‑utr内的多个靶位点可以提供更强的下调。[0171]微rna(mirna)是短非编码rna，与核酸分子的3’‑utr结合并且通过降低核酸分子的稳定性或通过抑制翻译来下调基因表达。环状多核糖核苷酸可包含一种或多种mirna靶序列、mirna序列或mirna种子。此类序列可以对应于任何mirna。[0172]mirna序列包含“种子”区域，即成熟mirna的第2-8位区域中的序列，所述序列与mirna靶序列具有沃森-克里克互补性。mirna种子可以包含成熟mirna的第2-8位或第2-7位。在一些实施例中，mirna种子可以包含7个核苷酸(例如，成熟mirna的第2-8个核苷酸)，其中相应mirna靶中的种子互补位点侧接与mirna第1位相对的腺嘌呤(a)。在一些实施例中，mirna种子可以包含6个核苷酸(例如，成熟mirna的第2-7个核苷酸)，其中相应mirna靶中的种子互补位点侧接与mirna第1位相对的腺嘌呤(a)。[0173]mirna种子的碱基可以与靶序列基本上互补。通过将mirna靶序列工程化至环状多核糖核苷酸中，环状多核糖核苷酸可以逃避或被宿主免疫系统检测到，可以调节降解或调节翻译。所述过程将减少环状多核糖核苷酸递送时脱靶效应的危险。[0174]环状多核糖核苷酸可包括与靶基因约5至约25个连续核苷酸相同的mirna序列。在一些实施例中，mirna序列靶向mrna并且从二核苷酸aa开始，包含约30％-70％、约30％-60％、约40％-60％、或约45％-55％的gc含量，并且例如通过标准blast搜索测定，与要引入其中的哺乳动物基因组中的靶以外的任何核苷酸序列不具有高百分比同一性。[0175]相反，可以将微小rna结合位点工程化出(即从其去除)环状多核糖核苷酸，以调节特定组织中的蛋白表达。多个组织中表达的调控可通过引入或去除一个或几个mirna结合位点(例如，mirna结合位点在细胞中赋予核酸活性)来完成。[0176]已知mirna调控mrna并且从而调控蛋白质表达的组织的实例包括但不限于肝脏(mir-122)、肌肉(mir-133、mir-206、mir-208)、内皮细胞(mir-17-92、mir-126)、骨髓细胞(mir-142-3p、mir-142-5p、mir-16、mir-21、mir-223、mir-24、mir-27)、脂肪组织(let-7、mir-30c)、心脏(mir-ld、mir-149)、肾脏(mir-192、mir-194、mir-204)、和肺上皮细胞(let-7、mir-133、mir-126)。mirna还可以调控复杂的生物学过程，诸如血管生成(mir-132)。在本734、linc01608、cc-499b15.5、casc15、linc00937、和rp11-191。[0185]已知lincrna和lncrna序列的列表可以在研究组织(例如，基因组和整合生物学研究所(instituteofgenomicsandintegrativebiology)、昆士兰大学迪亚曼蒂纳研究所(diamantinainstituteattheuniversityofqueensland)、根特大学(ghentuniversity)和中山大学(sunyat-senuniversity))维护的数据库中找到。lincrna和lncrna分子可以是通过本领域已知的技术易于设计和产生的。另外，计算工具可用于确定有效和特定的序列基序。[0186]rna结合位点可以包含与内源性基因或基因产物(例如，mrna)的全部或片段基本上互补、或完全互补的序列。互补序列可以与内含子和外显子之间的边界处的序列互补，从而防止特异性基因的新产生的核rna转录物成熟为用于转录的mrna。互补序列可以通过与基因的mrna杂交并且防止其翻译而对所述基因具有特异性。rna结合位点可包含与内源基因或基因产物(例如dna、rna或其衍生物或杂交物)的全部或片段反义或基本上反义的序列。[0187]rna结合位点可以包含与内源性基因或基因产物(例如，mrna)的全部或片段基本上互补、或完全互补的序列。互补序列可以与内含子和外显子之间的边界处的序列互补，从而防止特异性基因的新产生的核rna转录物成熟为用于转录的mrna。互补序列可以通过与基因的mrna杂交并且防止其翻译而对所述基因具有特异性。rna结合位点可包含与内源基因或基因产物(例如dna、rna或其衍生物或杂交物)的全部或片段反义或基本上反义的序列。[0188]rna结合位点可以包含与线性多核糖核苷酸的区域基本上互补或完全互补的序列。互补序列可以对用于环状多核糖核苷酸与线性多核糖核苷酸杂交的线性多核糖核苷酸区域具有特异性。在一些实施例中，线性多核糖核苷酸还包含与细胞上的蛋白质(诸如受体)结合的区域。在一些实施例中，线性多核糖核苷酸的与细胞受体结合的区域导致结合后与环状多核糖核苷酸杂交的线性多核糖核苷酸内化到细胞中。[0189]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含rna结合位点，所述rna结合位点具有rna或rna样结构，典型地在约5-5000个碱基对之间(取决于特定的rna结构，例如mirna5-30bp，lncrna200-500bp)并且具有与细胞内表达的靶基因中的编码序列相同(互补)或几乎相同(基本上互补)的核碱基序列。dna结合位点[0190]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含dna结合位点，诸如指导rna(grna)的序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含指导rna或grna序列的互补序列。grna短合成rna由与不完整的效应子部分结合所必需的“支架”序列和用于基因组靶的用户定义的约20个核苷酸靶向序列构成。指导rna序列可以具有17-24个核苷酸(例如19、20或21个核苷酸)的长度，并且与靶核酸序列互补。定制的grna生成器和算法可用于设计有效的指导rna。可以使用嵌合的“单指导rna”(“sgrna”)(一种模拟天然存在的crrna-tracrrna复合物并包含tracrrna(用于结合核酸酶)和至少一个crrna(以将核酸酶指导至被靶向进行编辑的序列)的工程化(合成)单rna分子)实现基因编辑。经化学修饰的sgrna可以在基因组编辑中有效。[0191]grna可以识别特定的dna序列(例如，与基因的启动子、增强子、沉默子或阻遏子相邻或在其内的序列)。[0192]在一些实施例中，grna是用于基因编辑的crispr系统的一部分。对于基因编辑，可以将环状多核糖核苷酸设计为包含一个或多个与所需的靶dna序列相对应的指导rna序列。grna序列可包括至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个核苷酸与cas9或其他外切核酸酶相互作用以切割dna，例如，cpf1与grna序列的至少约16个核苷酸相互作用以进行可检测的dna切割。[0193]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含可与dna结合的适配体序列。适配体序列的二级结构可以结合至dna。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸通过将适配体序列与dna结合而与dna形成复合物。[0194]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括结合双链体dna中的大沟的序列。在一个这样的情况下，由环状多核糖核苷酸和双链体dna产生的三链体结构的特异性和稳定性是通过hoogsteen氢键提供，其不同于双链dna中经典沃森-克里克碱基配对中形成的那些氢键。在一种情况下，环状多核糖核苷酸通过大沟与靶双链体的富嘌呤链结合。[0195]在一些实施例中，三链体形成发生在两个基序中，以环状多核糖核苷酸相对于靶双链体的富嘌呤链的取向辨别。在一些情况下，环状多核糖核苷酸中的多嘧啶序列段通过hoogsteen氢键以平行方式(即，与双链体的富嘌呤链相同的5’至3’方向)结合至双链体dna的多嘌呤序列段，而多嘌呤段(r)通过反向hoogsteen氢键以反平行方式结合至双链体的嘌呤链。在反平行中，嘌呤基序包含g:g-c、a:a-t或t:a-t的三联体；而在平行中，嘧啶基序包含c :g-c或t:a-t三联体的典型三联体(其中c 代表n3位置上的质子化胞嘧啶)。环状多核糖核苷酸中的反平行ga和gt序列在中性ph下可形成稳定的三链体，而环状多核糖核苷酸中的平行ct序列可在酸性ph下结合。环状多核糖核苷酸中胞嘧啶上的n3可以被质子化。用5-甲基-c取代c可能允许在生理ph下结合环状多核糖核苷酸中的ct序列，因为5-甲基-c具有比胞嘧啶更高的pk。对于嘌呤和嘧啶基序，连续的至少10个碱基对的同型嘌呤-同型嘧啶序列段有助于环状多核糖核苷酸结合至双链体dna，因为较短的三链体在生理条件下可能不稳定，并且序列中断会使三链体结构不稳定。在一些实施例中，针对三链体形成的dna双链体靶在一条链中包括连续的嘌呤碱基。在一些实施例中，针对三链体形成的靶包括在dna双链体的一条链中的同型嘌呤序列和在互补链中的同型嘧啶序列。[0196]在一些实施例中，包含环状多核糖核苷酸的三链体是稳定的结构。在一些实施例中，包含环状多核糖核苷酸的三链体表现出增加的半衰期，例如增加约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％或更大，例如，持续至少约1小时至约30天，或至少约2小时、6小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天或更长时间或其间的任何时间。蛋白结合位点[0197]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个蛋白结合位点。在一些实施例中，蛋白结合位点包含适配体序列。在一个实施例中，与由参考化合物(例如缺少蛋白结合位点的环状多核糖核苷酸，例如线性rna)所触发的应答相比，环状多核糖核苷酸包括蛋白结合位点以减少来自宿主的免疫应答。[0198]在一些实施例中，本文披露的环状多核糖核苷酸包括一个或多个蛋白结合位点，以结合蛋白，例如核糖体。通过将蛋白结合位点(例如核糖体结合位点)工程化至环状多核糖核苷酸中，环状多核糖核苷酸可以逃避或更少地被宿主的免疫系统检测到，具有经调节的降解或经调节的翻译。[0199]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含至少一个免疫蛋白结合位点，例如，以掩蔽环状多核糖核苷酸免于宿主免疫系统组分的作用，例如逃避ctl应答。在一些实施例中，免疫蛋白结合位点是结合至免疫蛋白并有助于将环状多核糖核苷酸掩蔽为非内源性的核苷酸序列。[0200]核糖体与线性rna接合的传统机制包括核糖体与rna的加帽5’端的结合。从5’端，核糖体迁移到起始密码子，于是形成第一肽键。根据本发明，环状多核糖核苷酸的内部起始(即，不依赖帽)或翻译不需要游离端或加帽端。而是，核糖体结合至未加帽的内部位点，由此核糖体在起始密码子处开始多肽延长。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个rna序列，所述一个或多个rna序列包含核糖体结合位点，例如起始密码子。[0201]在一些实施例中，本文披露的环状多核糖核苷酸包含与蛋白结合的蛋白结合序列。在一些实施例中，蛋白结合序列靶向环状多核糖核苷酸或将其定位至特定靶。在一些实施例中，蛋白质结合序列特异性结合蛋白质的精氨酸富集区。[0202]在一些实施例中，本文披露的环状多核糖核苷酸包括一个或多个蛋白结合位点，其各自结合靶蛋白，例如，充当使两个或更多个蛋白紧密接近的支架。在一些实施例中，本文披露的环状多核苷酸包含两个蛋白结合位点，其各自结合靶蛋白，从而使靶蛋白紧密接近。在一些实施例中，本文披露的环状多核苷酸包含三个蛋白结合位点，其各自结合靶蛋白，从而使三个靶蛋白紧密接近。在一些实施例中，本文披露的环状多核苷酸包含四个蛋白结合位点，其各自结合靶蛋白，从而使四个靶蛋白紧密接近。在一些实施例中，本文披露的环状多核苷酸包含五个或更多个蛋白结合位点，其各自结合靶蛋白，从而使五个或更多个靶蛋白紧密接近。在一些实施例中，靶蛋白是相同的。在一些实施例中，靶蛋白是不同的。在一些实施例中，使靶蛋白紧密接近促进了蛋白复合物的形成。例如，本披露的环状多核糖核苷酸可以充当支架以促进包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个靶蛋白或更多的复合物的形成。在一些实施例中，使两个或更多个靶蛋白紧密接近促进两个或更多个靶蛋白的相互作用。在一些实施例中，使两个或更多个靶蛋白紧密接近调节、促进或抑制酶促反应。在一些实施例中，使两个或更多个靶蛋白紧密接近调节、促进或抑制信号转导途径。[0203]在一些实施例中，蛋白结合位点包括但不限于与针对以下蛋白的结合位点，诸如acin1、ago、apobec3f、apobec3g、atxn2、auh、bccip、caprin1、celf2、cpsf1、cpsf2、cpsf6、cpsf7、cstf2、cstf2t、ctcf、ddx21、ddx3、ddx3x、ddx42、dgcr8、eif3a、eif4a3、eif4g2、elavl1、elavl3、fam120a、fbl、fip1l1、fkbp4、fmr1、fus、fxr1、fxr2、gnl3、gtf2f1、hnrnpa1、hnrnpa2b1、hnrnpc、hnrnpk、hnrnpl、hnrnpm、hnrnpu、hnrnpul1、igf2bp1、igf2bp2、igf2bp3、ilf3、khdrbs1、larp7、lin28a、lin28b、m6a、mbnl2、mettl3、mov10、msi1、msi2、nono、nono-、nop58、npm1、nudt21、p53、pcbp2、polr2a、prpf8、ptbp1、rbfox1、rbfox2、rbfox3、rbm10、rbm22、rbm27、rbm47、rnps1、safb2、sbds、sf3a3、sf3b4、sirt7、slbp、sltm、smndc1、snd1、srrm4、srsf1、srsf3、srsf7、srsf9、taf15、tardbp、tia1、tnrc6a、top3b、tra2a、tra2b、u2af1、u2af2、unk、upf1、wdr33、xrn2、ybx1、ythdc1、ythdf1、ythdf2、ywhag、zc3h7b、pdk1、akt1、以及任何其他结合rna的蛋白。[0204]在一些实施例中，蛋白结合位点是与蛋白结合的核酸序列，例如，可以与转录因子、增强子、阻遏物、聚合酶、核酸酶、组蛋白或结合dna的任何其他蛋白结合的序列。在一些实施例中，蛋白结合位点是与蛋白结合的适配体序列。在一些实施例中，适配体序列的二级结构结合蛋白。在一些实施例中，环状rna通过适配体序列与蛋白的结合而与蛋白形成复合物。[0205]在一些实施例中，环状rna缀合至小分子或其部分，其中所述小分子或其部分结合至靶，诸如蛋白。可以通过经修饰的核苷酸，例如通过点击化学，将小分子与环状rna缀合。可以结合蛋白的小分子的实例包括但不限于4-羟基他莫昔芬(4-oht)、ac220、阿法替尼、氨基吡唑类似物、ar拮抗剂、bi-7273、博舒替尼、色瑞替尼、氯烷烃、达沙替尼、弗瑞替尼、吉非替尼、hif-1α-衍生的(r)-羟基脯氨酸、hjb97、基于羟基脯氨酸的配体、iacs-7e、依鲁替尼、依鲁替尼衍生物、jq1、拉帕替尼、lcl161衍生物、来那度胺、nutlin小分子、otx015、pde4抑制剂、泊马度胺、ripk2抑制剂、rn486、sirt2抑制剂3b、sns-032、青灰因子、tbk1抑制剂、酞胺哌啶酮、酞胺哌啶酮衍生物、基于噻唑烷二酮的配体、vh032衍生物、vhl配体2、vhl-1、vl-269及其衍生物。[0206]在一些实施例中，环状rna缀合至一个以上的小分子，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个小分子。在一些实施例中，环状rna缀合至一个以上不同的小分子，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个不同的小分子。在一些实施例中，与环状rna缀合的多于一个的小分子被配置为募集其各自的靶蛋白接近，这可以导致靶蛋白之间的相互作用和/或其他分子和细胞变化。例如，环状rna可以缀合至jq1和酞胺哌啶酮两者或其衍生物，因此可以募集jq1的靶蛋白(例如bet家族蛋白)和酞胺哌啶酮的靶蛋白(例如e3连接酶)。在一些情况下，与jq1和酞胺哌啶酮缀合的环状rna通过jq1或其衍生物募集bet家族蛋白，通过由酞胺哌啶酮或其衍生物募集的e3连接酶用泛素标记bet家族蛋白，并且因此导致经标记的bet家族蛋白的降解。其他结合位点[0207]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含针对非rna或非dna靶的一个或多个结合位点。在一些实施例中，结合位点可以是小分子、适配体、脂质、碳水化合物、病毒颗粒、膜、多组分复合物、细胞、细胞部分、或其任何片段的结合位点中之一。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含针对脂质的一个或多个结合位点。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含针对碳水化合物的一个或多个结合位点。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含针对碳水化合物的一个或多个结合位点。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含针对膜的一个或多个结合位点。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含针对多组分复合物例如核糖体、核小体、转录机器等的一个或多个结合位点。[0208]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含适配体序列。适配体序列可结合至本文所述的任何靶(例如，核酸分子、小分子、蛋白、碳水化合物、脂质等)。适配体序列具有可以结合靶的二级结构。在一些实施例中，适配体序列具有可以结合靶的三级结构。在一些实施例中，适配体序列具有可以结合靶的四级结构。环状多核糖核苷酸可以通过适配体序列结合至靶以形成复合物。在一些实施例中，复合物可检测持续至少5天。在一些实施例中，复合物可检测持续至少2天、3天、4天、5天、6天、7天，8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天。靶[0209]所述至少一个结合位点可与靶结合。所述至少一个结合位可包含至少一个与靶结合的适配体序列。在一些实施例中，circrna包含针对一个或多个靶的一个或多个结合位点。靶包括但不限于核酸(例如rna、dna、rna-dna杂交体)、小分子(例如药物、荧光团、代谢产物)、适配体、多肽、蛋白、脂质、碳水化合物、抗体、病毒、病毒颗粒、膜、多组分复合物、细胞器、细胞、其他细胞部分，其任何片段及其任何组合。(参见例如，fredriksson等人,(2002)natbiotech[自然生物技术]20:473-77；gullberg等人,(2004)pnas[美国国家科学院院刊],101:8420-24)。例如，靶是单链rna、双链rna、单链dna、双链dna、包含一个或多个双链区域和一个或多个单链区域的dna或rna、rna-dna杂交体、小分子、适配体、多肽、蛋白质、脂质、碳水化合物、抗体、抗体片段、抗体混合物、病毒颗粒、膜、多组分复合物、细胞、细胞部分、其任何片段、或其任何组合。[0210]在一些实施例中，靶是多肽、蛋白质、或其任何片段。例如，靶可以是纯化的多肽、分离的多肽、融合标记多肽、附着于或跨越细胞或病毒或病毒粒子的膜的多肽、细胞质蛋白、细胞内蛋白、细胞外蛋白、激酶、酪氨酸激酶、丝氨酸/苏氨酸激酶、磷酸酶、芳香化酶、磷酸二酯酶、环化酶、解旋酶、蛋白酶、氧化还原酶、还原酶、转移酶、水解酶、切割酶、异构酶、糖基化酶、细胞外基质蛋白、连接酶、泛素连接酶、影响翻译后修饰的任何连接酶、离子转运蛋白、离子转运通道、离子转运孔、凋亡蛋白、细胞粘附蛋白、致病蛋白、异常表达的蛋白、转录因子、转录调节物、翻译蛋白、表观遗传因子、表观遗传调节物、染色质调节物、分子伴侣、分泌蛋白、配体、激素、细胞因子、趋化因子、核蛋白、受体、跨膜受体、受体酪氨酸激酶、g蛋白偶联受体、生长因子受体、核受体、激素受体、信号转导物、抗体、膜蛋白、整合膜蛋白、外周膜蛋白、细胞壁蛋白、球状蛋白、纤维蛋白、糖蛋白、脂蛋白、染色体蛋白、原癌基因、癌基因、抑癌基因、其任何片段或其任何组合。在一些实施例中，靶是异源多肽。在一些实施例中，靶是使用分子技术(诸如转染)在细胞中过表达的蛋白质。在一些实施例中，靶是重组多肽。例如，靶是在由细菌(例如，大肠杆菌)、酵母、哺乳动物或昆虫细胞(例如，生物体过表达的蛋白质)产生的样品中。在一些实施例中，靶是具有突变、插入、缺失或多态性的多肽。在一些实施例中，靶是细胞(例如，健康细胞或与疾病或病症相关的细胞)天然表达的多肽。在一些实施例中，靶是抗原，诸如用于免疫生物体或在生物体中生成免疫应答，诸如用于抗体产生的多肽。[0211]在一些实施例中，靶是抗体。抗体可以特异性结合至另一个分子的特定空间和极性组织。抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体、或重组抗体，并且可以通过本领域熟知的技术制备，这些技术诸如免疫宿主并收集血清(多克隆)，或通过制备连续的杂交细胞系并收集分泌蛋白(单克隆)，或通过克隆和表达核苷酸序列或其诱变形式，这些核苷酸序列或其诱变形式至少编码天然抗体的特异性结合所需的氨基酸序列。天然存在的抗体可以是包含通过二硫键相互连接的至少两个重(h)链和两个轻(l)链的蛋白质。每个重链可以由重链可变区(vh)和重链恒定区构成。重链恒定区可以包含三个结构域，ch1、ch2和ch3。每条轻链可以包含轻链可变区(vl)和轻链恒定区。轻链恒定区可包含一个结构域cl。vh和vl区可以进一步再分为高变区，称为互补决定区(cdr)，其间插着更为保守的区，称为框架区(fr)。每个vh和vl由从氨基末端至羧基末端按以下顺序排列的三个cdr和四个fr构成：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、和fr4。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)以及经典补体系统的第一组分(c1q))的结合。抗体可以是任何同种型(例如，igg、ige、igm、igd、iga和igy)、类别(例如，lgg1、lgg2、lgg3、lgg4、lga1和lga2)、亚类或其经修饰的形式。抗体可以包括完整的免疫球蛋白或其片段。抗体片段可以是指抗体的保留特异性结合至结合部分(诸如抗原)的能力的一个或多个片段。另外，还包括免疫球蛋白或其片段的聚集体、聚合物和缀合物，只要维持对特定分子的结合亲和力即可。抗体片段的实例包括fab片段，一种由vl、vh、cl和ch1结构域组成的单价片段；f(ab)2片段，一种包含由二硫桥在铰链区连接的两个fab片段的双价片段；由vh和ch1结构域组成的fd片段；由抗体的单一臂的vl和vh结构域组成的fv片段；由vh结构域组成的单结构域抗体(dab)片段(ward等人,(1989)nature[自然]341:544-46)；以及分离的cdr和单链片段(scfv)，其中vl和vh区配对以形成单价分子(称为单链fv(scfv)；参见例如bird等人,(1988)science[科学]242:423-26；和huston等人,(1988)pnas[美国国家科学院院刊]85:5879-83)。因此，抗体片段包括fab、f(ab)2、scfv、fv、dab等。尽管两个结构域vl和vh由单独的基因编码，但是可以使用重组方法将这两个结构域通过能够使它们形成为单条蛋白质链的人工肽接头来接合。此类单链抗体包括一个或多个抗原结合部分。抗体可以是多价抗体，例如二价、三价、四价、五价、六价、七价或八价抗体。抗体可以是多特异性抗体。例如，可以例如通过重组地结合任何两种或更多种抗原结合剂(例如，fab、f(ab)2、scfv、fv、igg)来生成双特异性、三特异性、四特异性、五特异性、六特异性、七特异性或八特异性抗体。可以使用多特异性抗体使两个或更多个靶紧密接近，例如，降解机器和要降解的靶底物，或泛素连接酶和要泛素化的底物。这些抗体片段可以使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且可以以与完整抗体相同的方式筛选这些片段的效用。抗体可以是人的、人源化的、嵌合的、分离的、狗、猫、驴、绵羊、任何植物、动物、或哺乳动物的。[0212]在一些实施例中，靶是核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)的聚合形式，诸如dna或rna(例如，mrna)。dna包括在线性dna分子(例如，限制性片段)、病毒、质粒、和染色体中发现的双链dna。在一些实施例中，多核苷酸靶是单链、双链、小干扰rna(sirna)、信使rna(mrna)、转运rna(trna)、染色体、基因、非编码基因组序列、基因组dna(例如，片段化的基因组dna)、经纯化的多核苷酸、分离的多核苷酸、杂交的多核苷酸、转录因子结合位点、线粒体dna、核糖体rna、真核多核苷酸、原核多核苷酸、合成的多核苷酸、连接的多核苷酸、重组多核苷酸、含有核酸类似物的多核苷酸、甲基化多核苷酸、脱甲基化多核苷酸、其任何片段、或其任何组合。在一些实施例中，靶是重组多核苷酸。在一些实施例中，靶是异源多核苷酸。例如，靶是由细菌(例如，大肠杆菌)、酵母、哺乳动物或昆虫细胞产生的多核苷酸(例如，与生物体异源的多核苷酸)。在一些实施例中，靶是具有突变、插入、缺失或多态性的多核苷酸。[0213]在一些实施例中，靶是适配体。适配体是分离的核酸分子，其以高特异性和亲和力结合至结合部分或靶分子，例如蛋白。适配体是保持为一种或多种特定构象的三维结构，所述三维结构提供化学接触以特异性结合其给定靶。尽管适配体是基于核酸的分子，但适配体与其他核酸分子(诸如基因和mrna)之间存在根本差异。在这些其他核酸分子中，核酸结构通过其线性碱基序列编码信息，因此此序列对信息存储的功能很重要。完全相反，基于靶分子的特异性结合的适配体功能并不完全依赖于保守的线性碱基序列(非编码序列)，而是特定的二级/三级/四级结构。适配体可能具有的任何编码潜能都是偶然的，并且不认为在适配体与其同源靶的结合中起作用。适配体与结合某些蛋白的天然存在的核酸序列不同。这些后者的序列是嵌入生物体基因组内的天然存在的序列，这些序列与参与天然存在的核酸(例如，核酸结合蛋白)的转录、翻译和转运的蛋白质的特定亚组结合。另一方面，适配体是非天然存在的核酸分子。尽管可以鉴定出结合核酸结合蛋白的适配体，但在大多数情况下，此类适配体与自然界中由核酸结合蛋白识别的序列具有极少或没有序列同一性。更重要的是，适配体可以结合几乎任何蛋白(不仅是结合核酸的蛋白)以及几乎任何目的伴侣，包括小分子、碳水化合物、肽等。对于大多数伴侣，甚至蛋白，与其结合的天然存在的核酸序列不存在。对于确实具有这种序列的那些配偶体，例如核酸结合蛋白，由于与紧密结合的适配体相比，自然界中使用的结合亲和力相对较低，因此此类序列将不同于适配体。适配体能够特异性结合至选择的配偶体并且例如通过结合来调节配偶体的活性或结合相互作用，适配体可以阻断其配偶体起功能的能力。与配偶体特异性结合的功能特性是适配体的固有特性。适配体可以是6-35kda。适配体可以是20至500个核苷酸。适配体能以微摩尔至亚纳摩尔分子亲和力结合其伴侣，并且可以区分紧密相关的靶(例如，适配体可以选择性地结合来自相同基因家族的相关蛋白)。在某些情况下，适配体仅结合一个分子。在某些情况下，适配体结合目的分子的家族成员。适配体在某些情况下结合多个不同的分子。适配体能够使用通常见到的分子间相互作用，诸如氢键、静电互补性、疏水性接触和空间排阻来与特定配偶体结合。适配体具有用作治疗和诊断的许多期望的特征，包括高特异性和亲和力、低免疫原性、生物学功效以及优异的药代动力学特性。适配体可以包含由共价连接的互补多核苷酸的杂交形成的分子茎和环结构(例如，发夹环结构)。茎包含杂交的多核苷酸，并且环是共价连接两个互补多核苷酸的区域。适配体可以是包含适配体序列的线性核糖核酸(例如，线性适配体)或包含适配体序列的环状多核糖核酸(例如，环状适配体)。[0214]在一些实施例中，靶是小分子。例如，小分子可以是大环分子、抑制剂、药物、或化合物。在一些实施例中，小分子含有不超过五个氢键供体。在一些实施例中，小分子含有不超过十个氢键受体。在一些实施例中，小分子具有500道尔顿或更小的分子量。在一些实施例中，小分子具有从约180至500道尔顿的分子量。在一些实施例中，小分子含有不超过五的辛醇-水分配系数lopp。在一些实施例中，小分子具有从-0.4至5.6的分配系数logp。在一些实施例中，小分子具有从40至130的摩尔折射率。在一些实施例中，小分子含有从约20至约70个原子。在一些实施例中，小分子具有140埃2或更小的极性表面积。[0215]在一些实施例中，circrna包含与单个靶或多个(例如，两个或更多个)靶的结合位点。在一个实施例中，单个circrna包含针对单个靶的2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个不同的结合位点。在一个实施例中，单个circrna包含针对单个靶的2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个相同的结合位点。在一个实施例中，单个circrna包含针对一个或多个不同靶的2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个不同的结合位点。在一个实施例中，样品中有两个或更多个靶，例如靶的混合物或文库，并且样品包含circrna，所述circrna包含两个或更多个与所述两个或更多个靶结合的结合位点。[0216]在一些实施例中，单个靶或多个(例如，两个或更多个)靶具有多个结合部分。在一个实施例中，单个靶可以具有2、3、4、5、6、7、8、9、10个、或更多个结合部分。在一个实施例中，样品中有两个或更多个靶，诸如靶的混合物或文库，并且样品包含两个或更多个结合部分。在一些实施例中，单个靶或多个靶包含多个不同的结合部分。例如，多个可以包括至少约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、500、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、25,000、或30,000个结合部分。[0217]靶可以包含多个结合部分，所述多个结合部分包含至少2个不同的结合部分。例如，结合部分可以包含多个结合部分，所述多个结合部分包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1,000、2,000、3,000、4,000、5,000、6,000、7,000、8,000、9,000、10,000、11,000、12,000、13,000、14,000、15,000、16,000、17,000、18,000、19,000、20,000、21,000、22,000、23,000、24,000、或25,000个不同的结合部分。环状多核糖核苷酸元件[0218]在一些实施例中，除了包含编码蛋白质(例如，治疗性蛋白质)和/或至少一个结合位点的序列之外，环状多核糖核苷酸还包含如本文所述的元件中的一种或多种。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少聚a尾。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少复制元件。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少ires。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少帽。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括如特此通过援引以其全文并入本文的wo2019/118919中披露的任何特征或特征的任何组合。[0219]例如，环状多核糖核苷酸包含编码除了以上披露那些之外的一种或多种多肽或肽的序列。一些实例包括但不限于荧光标签或标记物、抗原、治疗性肽、天然生物活性肽的合成或类似物肽、激动剂或拮抗剂肽、抗微生物肽、成孔肽、双环肽、靶向或细胞毒性肽、降解或自毁肽、以及多种降解或自毁肽。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸进一步包含编码如本文所述的另外的治疗性蛋白质的表达序列。在wo2019/118919的段落[0151]-[0153]中描述了调控元件的其他实例，所述专利特此通过援引以其全文并入。[0220]例如，环状多核糖核苷酸包含调控元件，例如修饰环状多核糖核苷酸内表达序列的表达的序列。调控元件可以包括与编码表达产物的表达序列相邻定位的序列。调控元件可以可操作地连接至相邻序列。与不存在调控元件时表达的产物的量相比，调控元件可以增加表达的产物的量。另外，一个调控元件可以增加串联连接的多个表达序列表达的产物的量。因此，一个调控元件可以增强一个或多个表达序列的表达。也可以使用多种调控元件，例如，差异性地调控不同表达序列的表达。在一些实施例中，本文提供的调控元件可以包括选择性翻译序列。如本文所用，术语“选择性翻译序列”是指选择性地起始或激活环状多核糖核苷酸中的表达序列的翻译的核酸序列，例如某些核糖开关适体酶。调控元件还可以包括选择性降解序列。如本文所用，术语“选择性降解序列”是指起始环状多核糖核苷酸或环状多核糖核苷酸的表达产物的降解的核酸序列。在一些实施例中，调控元件是翻译调节子。翻译调节子可以调节环状多核糖核苷酸中表达序列的翻译。翻译调节子可以是翻译增强子或翻译抑制子。在一些实施例中，翻译起始序列可以充当调控元件。在wo2019/118919的段落[0154]-[0161]中描述了调控元件的其他实例，所述专利特此通过援引以其全文并入。[0221]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含编码蛋白质(例如，治疗性蛋白质)和/或至少一个结合位点的序列，并且包含翻译起始序列，例如起始密码子。在一些实施例中，翻译起始序列包括科扎克或夏因-达尔加诺(shine-dalgarno)序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与表达序列相邻的翻译起始序列，例如科扎克序列。在一些实施例中，翻译起始序列是非编码起始密码子。在一些实施例中，翻译起始序列(例如，科扎克序列)存在于每个表达序列的一侧或两侧，导致表达产物的隔开。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与表达序列相邻的至少一个翻译起始序列。在一些实施例中，翻译起始序列为环状多核糖核苷酸提供构象柔性。在一些实施例中，翻译起始序列基本上在环状多核糖核苷酸的单链区域内。在wo2019/118919的段落[0163]-[0165]中描述了翻译起始序列的其他实例，所述专利特此通过援引以其全文并入。[0222]在一些实施例中，本文所述的环状多核糖核苷酸包含内部核糖体进入位点(ires)元件。包括在环状多核糖核苷酸中的合适的ires元件可以是能够接合真核核糖体的rna序列。在wo2019/118919的段落[0166]-[0168]中描述了ires的其他实例，所述专利特此通过援引以其全文并入。[0223]环状多核糖核苷酸可以包括一个或多个表达序列(例如，治疗性蛋白)，并且每个表达序列可以具有或可以不具有终止元件。在wo2019/118919的段落[0169]-[0170]中描述了终止元件的其他实例，所述专利特此通过援引以其全文并入。[0224]本披露的环状多核糖核苷酸可以包含交错元件。术语“交错元件”是指在翻译期间诱导核糖体暂停的部分，诸如核苷酸序列。在一些实施例中，交错元件是具有强α-螺旋倾向的氨基酸的非保守序列，然后是共有序列-d(v/i)exnpgp，其中x＝任何氨基酸。在一些实施例中，交错元件可以包括化学部分，诸如甘油、非核酸连接部分、化学修饰、经修饰的核酸、或其任何组合。[0225]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与表达序列相邻的至少一个交错元件。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与每个表达序列相邻的交错元件。在一些实施例中，交错元件存在于每个表达序列的一侧或两侧，导致例如一种或多种肽和/或一种或多种多肽的表达产物的隔开。在一些实施例中，交错元件是一个或多个表达序列的一部分。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个表达序列，并且所述一个或多个表达序列中的每一个通过环状多核糖核苷酸上的交错元件与后继的表达序列隔开。在一些实施例中，所述交错元件阻止由(a)单个表达序列的两轮翻译或(b)两个或更多个表达序列的一轮或多轮翻译生成单一多肽。在一些实施例中，所述交错元件是与所述一个或多个表达序列分离的序列。在一些实施例中，所述交错元件包含所述一个或多个表达序列中的表达序列的一部分。[0226]在wo2019/118919的段落[0172]-[0175]中描述了交错元件的实例，所述专利特此通过援引以其全文并入。[0227]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个调控核酸序列或包括一个或多个编码调控核酸(例如，修饰内源基因和/或外源基因的表达的核酸)的表达序列。在一些实施例中，本文提供的环状多核糖核苷酸的表达序列可以包含与调控核酸像非编码rna诸如但不限于trna、lncrna、mirna、rrna、snrna、microrna、sirna、pirna、snorna、snrna、exrna、scarna、yrna和hnrna反义的序列。[0228]在wo2019/118919的段落[0177]-[0194]中描述了示例性的调控核酸，所述专利特此通过援引以其全文并入。[0229]在一些实施例中，如本文提供的环状多核糖核苷酸的翻译效率大于参考物，例如线性对应物、线性表达序列、或线性环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，如本文提供的环状多核糖核苷酸的翻译效率比参考物的翻译效率高至少约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、125％、150％、175％、200％、250％、300％、350％、400％、450％、500％、600％、70％、800％、900％、1000％、2000％、5000％、10000％、100000％、或更高。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的翻译效率比线性对应物的翻译效率高10％。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的翻译效率比线性对应物的翻译效率高300％。[0230]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸产生化学计量比的表达产物。滚环翻译连续地以基本上当量的比率产生表达产物。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有化学计量的翻译效率，使得表达产物以基本上当量的比率产生。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有多种表达产物(例如，来自2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个表达序列的产物)的化学计量翻译效率。[0231]在一些实施例中，一旦起始环状多核糖核苷酸的翻译，在完成环状多核糖核苷酸的至少一轮翻译之前，结合至环状多核糖核苷酸的核糖体不会与环状多核糖核苷酸脱离。在一些实施例中，如本文所述的环状多核糖核苷酸能够滚环翻译。在一些实施例中，在滚环翻译期间，一旦起始环状多核糖核苷酸的翻译，在完成环状多核糖核苷酸的至少2轮、至少3轮、至少4轮、至少5轮、至少6轮、至少7轮、至少8轮、至少9轮、至少10轮、至少11轮、至少12轮、至少13轮、至少14轮、至少15轮、至少20轮、至少30轮、至少40轮、至少50轮、至少60轮、至少70轮、至少80轮、至少90轮、至少100轮、至少150轮、至少200轮、至少250轮、至少500轮、至少1000轮、至少1500轮、至少2000轮、至少5000轮、至少10000轮、至少105轮或至少106轮翻译之前，结合至环状多核糖核苷酸的核糖体不会与环状多核糖核苷酸脱离。[0232]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的滚环翻译导致生成多肽产物，所述多肽产物由环状多核糖核苷酸的多于一轮翻译出(“连续”表达产物)。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含交错元件，并且环状多核糖核苷酸的滚环翻译导致生成多肽产物，所述多肽产物由环状多核糖核苷酸的单轮翻译或少于单轮翻译生成(“离散”表达产物)。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸被配置为使得环状多核糖核苷酸的滚环翻译期间生成的总多肽(摩尔/摩尔)中的至少10％、20％、30％、40％、50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％是离散多肽。在一些实施例中，在体外翻译系统中测试离散产物相对于总多肽的量比。在一些实施例中，用于测试量比的体外翻译系统包含兔网织红细胞裂解物。在一些实施例中，在体内翻译系统如真核细胞或原核细胞、培养细胞或生物体中的细胞中测试量比。[0233]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含非翻译区(utr)。包含基因的基因组区域的utr可以转录但不翻译。在一些实施例中，utr可以被包括在本文所述的表达序列的翻译起始序列的上游。在一些实施例中，utr可以被包括在本文所述的表达序列的下游。在一些情况下，第一表达序列的一个utr与第二表达序列的另一个utr相同或连续或重叠。在一些实施例中，内含子是人内含子。在一些实施例中，内含子是全长人内含子，例如zkscan1。[0234]在wo2019/118919的段落[0197]-[201]中描述了示例性的非翻译区，所述专利特此通过援引以其全文并入。[0235]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括聚a序列。在wo2019/118919的段落[0202]-[0205]中描述了示例性的聚a序列，所述专利特此通过援引以其全文并入。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少聚a序列。[0236]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一种或多种核糖开关。在wo2019/118919的段落[0232]-[0252]中描述了示例性的核糖开关，所述专利特此通过援引以其全文并入。[0237]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含适体酶。在wo2019/118919的段落[0253]-[0259]中描述了示例性适体酶，所述专利特此通过援引以其全文并入。[0238]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个rna结合位点。微小rna(或mirna)抗原是短非编码rna，可与核酸分子的3'utr结合并通过降低核酸分子的稳定性或通过抑制翻译来下调基因表达。环状多核糖核苷酸可以包含一种或多种微小rna靶序列、微小rna序列或微小rna种子。此类序列可以对应于任何已知的微小rna，如在美国公开us2005/0261218和美国公开us2005/0059005中传授的那些，其内容通过援引以其全文并入本文。在wo2019/118919的段落[0206]-[0215]中描述了rna结合位点的其他实例，所述专利特此通过援引以其全文并入。[0239]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个蛋白结合位点，使得蛋白质例如核糖体能够结合至rna序列中的内部位点。在wo2019/118919的段落[0218]-[0221]中描述了蛋白结合位点的其他实例，所述专利特此通过援引以其全文并入。[0240]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含加密原以降低、逃避或避免细胞的先天性免疫应答。在一方面，本文提供了环状多核糖核苷酸，当被递送至细胞(例如，接触)时，所述环状多核糖核苷酸与由参考化合物(例如对应于所述环状多核糖核苷酸的线性多核苷酸或缺少加密原的环状多核糖核苷酸)引发的应答相比，导致宿主的免疫应答降低。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的免疫原性比缺少加密原的对应物的免疫原性小。[0241]在一些实施例中，加密原增强了稳定性。关于utr在核酸分子的稳定性和翻译方面发挥调控作用的证据越来越多。utr的调控特征可以包含在加密原中，以增强环状多核糖核苷酸的稳定性。[0242]在一些实施例中，5’或3’utr可以构成环状多核糖核苷酸中的加密原。例如，utrau富集元件(are)的去除或修饰可用于调节环状多核糖核苷酸的稳定性或免疫原性。[0243]在一些实施例中，去除表达序列中的au富集元件(are)的修饰(例如可翻译区)可用于调节环状多核糖核苷酸的稳定性或免疫原性。[0244]在一些实施例中，加密原包含mirna结合位点或与任何其他非编码rna的结合位点。例如，将mir-142位点掺入本文所述的环状多核糖核苷酸中不仅可以调节造血细胞中的表达，还可以降低或消除对环状多核糖核苷酸编码的蛋白质的免疫应答。[0245]在一些实施例中，加密原包含一个或多个蛋白结合位点，使得蛋白质(例如，免疫蛋白质)能够结合至rna序列。通过将蛋白结合位点工程化至环状多核糖核苷酸中，通过掩蔽环状多核糖核苷酸而免受宿主免疫系统组分的影响，环状多核糖核苷酸可以逃避宿主的免疫系统的检测或具有减少的宿主的免疫系统的检测、具有经调节的降解、或经调节的翻译。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含至少一个免疫蛋白结合位点，例如用于逃避免疫反应，例如ctl反应。在一些实施例中，免疫蛋白结合位点是结合至免疫蛋白并且有助于掩蔽为外源的环状多核糖核苷酸的核苷酸序列。[0246]在一些实施例中，加密原包含一种或多种经修饰的核苷酸。示例性修饰可以包括对糖、核碱基、核苷间键(例如至连接的磷酸酯/至磷酸二酯键/至磷酸二酯主链)及其任何组合进行的可防止或降低针对环状多核糖核苷酸的免疫应答的任何修饰。以下详细描述了本文提供的一些示例性修饰。[0247]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个如本文其他处所述的修饰，以与由参考化合物(例如缺少修饰的环状多核糖核苷酸)引发的应答相比，降低宿主的免疫应答。特别地，已显示添加一个或多个肌苷区分rna是内源性还是病毒性。参见例如，yu,z等人,(2015)rnaeditingbyadar1marksdsrnaas“self”[通过adar1进行的rna编辑将dsrna标记为“自身”].cellres[细胞研究].25,1283-1284，将所述文献通过援引以其全文并入本文。[0248]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括一个或多个shrna的表达序列或可被加工成sirna的rna序列，并且shrna或sirna靶向rig-i并降低rig-i的表达。rig-i可以感知外源环状rna并引起外源环状rna的降解。因此，具有靶向rig-i的shrna、sirna或任何其他调控核酸的序列的环状多核苷酸可以降低针对环状多核糖核苷酸的免疫力，例如宿主细胞免疫力。[0249]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少有助于环状多核糖核苷酸减少、逃避或避免细胞先天免疫应答的序列、元件或结构。在一些此类实施例中，环状多核糖核苷酸可能缺少聚a序列、5’端、3’端、磷酸酯基团、羟基基团或其任何组合。[0250]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含间隔序列。在一些实施例中，多核糖核苷酸的元件可以通过间隔区序列或接头彼此隔开。在wo2019/118919的段落[0293]-[0302]中描述了示例性的间隔区序列，所述专利特此通过援引以其全文并入。[0251]本文所述的环状多核糖核苷酸还可以包含非核酸接头。在wo2019/118919的段落[0303]-[0307]中描述了示例性的非核酸接头，所述专利特此通过援引以其全文并入。[0252]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸还包括另一种核酸序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包含其他序列，这些其他序列包括dna、rna、或人工核酸。其他序列可以包括但不限于基因组dna，cdna或编码trna、mrna、rrna、mirna、grna、sirna、或其他rnai分子的序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括sirna，以靶向与环状多核糖核苷酸相同的基因表达产物的不同基因座。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括sirna，以靶向与环状多核糖核苷酸中存在的基因表达产物不同的基因表达产物。[0253]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少5’‑utr。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少3’‑utr。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少聚a序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少终止元件。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少内部核糖体进入位点。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少核酸外切酶的降解易感性。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少降解易感性的事实可能意味着环状多核糖核苷酸不被核酸外切酶降解，或在仅存在核酸外切酶时被降解的有限程度例如与不存在核酸外切酶时相当或相似。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸不被核酸外切酶降解。在一些实施例中，当暴露于核酸外切酶时，环状多核糖核苷酸降解减少。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少与帽结合蛋白的结合。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少5’帽。[0254]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少5’‑utr，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少3’‑utr，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少聚a序列，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少终止元件，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少内部核糖体进入位点，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少帽，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少5’‑utr、3’‑utr和ires，并且能够从其一个或多个表达序列表达蛋白。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸进一步包含以下序列中的一个或多个：编码一个或多个mirna的序列、编码一个或多个复制蛋白的序列、编码外源基因的序列、编码治疗剂的序列、调控元件(例如翻译调节子，例如翻译增强子或抑制子)、翻译起始序列、靶向内源基因(例如，sirna、lncrna、shrna)的一种或多种调控核酸和编码治疗性mrna或蛋白质的序列。[0255]作为其环化的结果，环状多核糖核苷酸可能包括某些使其区别于线性rna的特征。例如，与线性rna相比，环状多核糖核苷酸较不易被核酸外切酶降解。这样，环状多核糖核苷酸可以比线性rna更稳定，尤其是在核酸外切酶存在下孵育时。与线性rna相比，环状多核糖核苷酸的稳定性提高，可使环状多核糖核苷酸作为产生多肽(例如，引发抗体反应的抗原和/或表位)的细胞转化试剂更加有用。与线性rna相比，环状多核糖核苷酸的稳定性提高，可使环状多核糖核苷酸与线性rna相比，更易储存更长时间。可以使用本领域标准的方法测试用核酸外切酶处理的环状多核糖核苷酸的稳定性，所述方法确定是否已经发生rna降解(例如，通过凝胶电泳)。[0256]此外，与线性rna不同，当环状多核糖核苷酸与磷酸酶诸如小牛肠磷酸酶一起孵育时，环状多核糖核苷酸可能不太容易去磷酸化。[0257]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含特定的序列特征。例如，环状多核糖核苷酸可以包含特定的核苷酸组成。在一些此类实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括一个或多个嘌呤(腺嘌呤和/或鸟嘌呤)富集区。在一些此类实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括一个或多个嘌呤富集区。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括一个或多个au富集区或元件(are)。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括一个或多个腺嘌呤富集区。[0258]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以包括一个或多个本文其他处所述的重复元件。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含一个或多个本文其他处所述的修饰。[0259]环状多核糖核苷酸相对于参考序列可以包括一个或多个取代、插入和/或添加、缺失和共价修饰。例如，相对于亲本多核糖核苷酸具有一个或多个插入、添加、缺失和/或共价修饰的环状多核糖核苷酸包括在本披露的范围内。在wo2019/118919的段落[0310]-[0325]中描述了示例性的修饰，所述专利特此通过援引以其全文并入。[0260]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含高阶结构，例如二级或三级结构。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的互补区段将其自身折叠成双链区段，与氢键结合配对(例如，a-u和c-g)。在一些实施例中，螺旋，也称为茎，在分子内形成，具有连接至端环的双链区段。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有至少一个具有准双链二级结构的区段。[0261]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的一个或多个序列包括基本上单链的与双链的区域。在一些实施例中，单链与双链的比率可以影响环状多核糖核苷酸的功能。[0262]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的一个或多个序列基本上是单链的。在一些实施例中，基本上是单链的环状多核糖核苷酸的一个或多个序列可以包括蛋白质或rna结合位点。在一些实施例中，基本上是单链的环状多核糖核苷酸序列可以是构象柔性的以允许增加相互作用。在一些实施例中，有目的地将环状多核糖核苷酸的序列工程化以包含此类二级结构，从而结合蛋白质或核酸或增加蛋白质或核酸结合。[0263]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸序列基本上是双链的。在一些实施例中，基本上是双链的环状多核糖核苷酸的一个或多个序列可以包括构象识别位点，例如核糖开关或适体酶。在一些实施例中，基本上是双链的环状多核糖核苷酸序列可以是构象刚性的。在一些此类实例中，构象刚性序列可能在空间上阻碍环状多核糖核苷酸结合蛋白质或核酸。在一些实施例中，有目的地将环状多核糖核苷酸的序列工程化以包含此类二级结构，从而避免或减少蛋白质或核酸结合。[0264]有16种可能的碱基配对，但是其中的六种(au、gu、gc、ua、ug、cg)可能形成实际的碱基对。其余的称为错配，并且以极低的频率出现在螺旋中。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的结构不容易被破坏，从而对其功能无影响且无致命后果，这提供了维持二级结构的选择。在一些实施例中，茎的一级结构(即其核苷酸序列)仍可变化，同时仍维持螺旋区。碱基的性质是高阶结构的第二位，并且只要它们保留二级结构，就可以进行取代。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有准螺旋结构。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有至少一个具有准螺旋结构的区段。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括富u或富a序列或其组合中的至少一个。在一些实施例中，富u和/或富a序列以将产生三联准螺旋结构的方式排列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有双准螺旋结构。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有一个或多个具有双准螺旋结构的区段(例如，2、3、4、5、6、或更多个)。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括富c和/或富g的序列中的至少一种。在一些实施例中，富c和/或富g序列以将产生三联准螺旋结构的方式排列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有有助于稳定的分子内三联准螺旋结构。[0265]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有两个准螺旋结构(例如，通过磷酸二酯键隔开)，使得它们末端的碱基对堆叠，并且准螺旋结构变为共线性，导致“同轴堆叠”的子结构。[0266]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含具有一个或多个基序的三级结构，例如假结结构、g-四链体、螺旋和同轴堆叠。[0267]在wo2019/118919的段落[0326]-[0333]中描述了如本文所披露的环状多核糖核苷酸的结构的其他实例，所述专利特此通过援引以其全文并入。[0268]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸是至少约20个核苷酸、至少约30个核苷酸、至少约40个核苷酸、至少约50个核苷酸、至少约75个核苷酸、至少约100个核苷酸、至少约200个核苷酸、至少约300个核苷酸、至少约400个核苷酸、至少约500个核苷酸、至少约1,000个核苷酸、至少约2,000个核苷酸、至少约5,000个核苷酸、至少约6,000个核苷酸、至少约7,000个核苷酸、至少约8,000个核苷酸、至少约9,000个核苷酸、至少约10,000个核苷酸、至少约12,000个核苷酸、至少约14,000个核苷酸、至少约15,000个核苷酸、至少约16,000个核苷酸、至少约17,000个核苷酸、至少约18,000个核苷酸、至少约19,000个核苷酸、或至少约20,000个核苷酸。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸可以具有足够的大小以容纳核糖体的结合位点。本领域技术人员可以理解，环状多核糖核苷酸的最大大小可以与产生环状多核糖核苷酸和/或使用环状多核糖核苷酸的技术限制内的一样大。不受理论的束缚，有可能的是，可以从dna产生rna的多个区段并且其5'游离端和3'游离端退火以产生一“串”rna，当仅留有一个5'游离端和一个3'游离端时，所述“串”rna最终可以被环化。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的最大尺寸可能受包装rna并将其递送至靶的能力所限制。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸的大小是足以编码有用的多肽的长度，并且因此至少20,000个核苷酸、至少15,000个核苷酸、至少10,000个核苷酸、至少7,500个核苷酸或至少5,000个核苷酸、至少4,000个核苷酸、至少3,000个核苷酸、至少2,000个核苷酸、至少1,000个核苷酸、至少500个核苷酸、至少400个核苷酸、至少300个核苷酸、至少200个核苷酸、至少100个核苷酸的长度可能是有用的。[0269]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸能够在来自水产养殖动物(鱼、蟹、虾、牡蛎等)的细胞、哺乳动物细胞(例如，来自宠物或动物园动物(猫、狗、蜥蜴、鸟、狮子、老虎和熊等)的细胞、来自农场或役用动物(马、牛、猪、鸡等)的细胞、人细胞)、培养的细胞、原代细胞或细胞系、干细胞、祖细胞、分化细胞、生殖细胞、癌细胞(例如，致瘤的、转移的)、非致瘤细胞(正常细胞)、胎儿细胞、胚胎细胞、成年细胞、有丝分裂细胞、非有丝分裂细胞、或其任何组合中复制或者在其中复制。在一些实施例中，本发明包括包含本文所述的环状多核糖核苷酸的细胞，其中所述细胞是来自水产养殖动物(鱼、蟹、虾、牡蛎等)的细胞、哺乳动物细胞(例如，来自宠物或动物园动物(猫、狗、蜥蜴、鸟、狮子、老虎和熊等)的细胞、来自农场或役用动物(马、牛、猪、鸡等)的细胞、人细胞)、培养的细胞、原代细胞或细胞系、干细胞、祖细胞、分化细胞、生殖细胞、癌细胞(例如，致瘤的、转移的)、非致瘤细胞(正常细胞)、胎儿细胞、胚胎细胞、成年细胞、有丝分裂细胞、非有丝分裂细胞、或其任何组合。稳定性和半衰期[0270]在一些实施例中，本文提供的环状多核糖核苷酸具有比参考物，例如具有相同核苷酸序列，未被环化的线性多核糖核苷酸(线性对应物)增加的半衰期。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸基本上对降解(例如核酸外切酶的降解)有抗性。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸抗自降解。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少酶促裂解位点，例如dicer裂解位点。在wo2019/118919的段落[0308]-[0309]中描述了如本文所披露的环状多核糖核苷酸的稳定性和半衰期的其他实例，所述专利特此通过援引以其全文并入。[0271]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有的半衰期至少是线性对应物(例如，线性表达序列或线性环状多核糖核苷酸)的半衰期。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸具有的半衰期相对于线性对应物的半衰期延长。在一些实施例中，半衰期增加了约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、或更多。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在细胞中的半衰期或持续性是至少约1小时至约30天，或至少约2小时、6小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天或更长时间或其间的任何时间。在某些实施例中，环状多核糖核苷酸在细胞中的半衰期或持续性为不超过约10分钟至约7天、或不超过约1小时、2小时，3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时、4天、5天、6天、7天或其间的任何时间。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在正进行细胞分裂的细胞中具有半衰期或持续性。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在分裂后细胞中具有半衰期或持续性。在某些实施例中，环状多核糖核苷酸在正进行分裂的细胞中具有的半衰期或持续性大于约10分钟至约30天，或为至少约1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、60天或更长时间或其间的任何时间。[0272]在一些实施例中，至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％量的环状多核糖核苷酸在细胞中持续至少约3、4、5、6、7、8、9、10、12、14或16天的时间段。[0273]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在哺乳动物例如人中是非免疫原性的。生产方法[0274]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括非天然存在的脱氧核糖核酸序列，并且可以使用重组技术(例如，使用dna质粒体外衍生)或化学合成或其组合产生。[0275]在本披露的范围内，用于产生rna环的dna分子可以包括天然存在的原始核酸序列的dna序列、其修饰形式或编码通常未在自然界中发现的合成多肽的dna序列(例如，嵌合分子或融合蛋白，诸如包含多种抗原和/或表位的融合蛋白)。dna和rna分子可以使用多种技术修饰，这些多种技术包括但不限于经典诱变技术和重组技术，诸如定点诱变、化学处理核酸分子以诱导突变、限制性酶裂解核酸片段、连接核酸片段、聚合酶链式反应(pcr)扩增和/或诱变核酸序列的选定区域、合成寡核苷酸混合物以及连接混合物基团以“建造”核酸分子混合物、及其组合。[0276]环状多核糖核苷酸可以根据任何可用的技术制备，所述技术包括但不限于化学合成和酶促合成。在一些实施例中，线性初级构建体或线性mrna可以被环化、或连环化以产生本文所述的环状多核糖核苷酸。环化或连环化的机制可以通过诸如但不限于化学、酶促、夹板连接或核酶催化的方法来发生。新形成的5'-/3'-键可以是分子内键或分子间键。[0277]制备本文所述的环状多核糖核苷酸的方法描述于以下文献中：例如，khudyakov和fields,artificialdna:methodsandapplications[人工dna：方法与应用],crcpress[crc出版社](2002)；zhao,syntheticbiology:toolsandapplications[合成生物学：工具与应用](第一版),academicpress[学术出版社](2013)；以及egli和herdewijn,chemistryandbiologyofartificialnucleicacids[人工核酸的化学与生物学],(第一版),wiley-vch[威利-vch出版社](2012)。[0278]多种合成环状多核糖核苷酸的方法也在本领域中进行了描述(参见例如，美国专利号us6210931、美国专利号us5773244、美国专利号us5766903、美国专利号us5712128、美国专利号us5426180、美国公开号us20100137407、国际公开号wo1992001813和国际公开号wo2010084371；其各自的内容通过援引以其全文并入本文)。[0279]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸是纯化的，例如，去除了游离核糖核酸、线性或带切口的rna、dna、蛋白质等。在一些实施例中，可以通过本领域通常使用的任何已知方法纯化环状多核糖核苷酸。非限制性纯化方法的实例包括柱色谱法、凝胶切除、尺寸排阻等。环化[0280]在一些实施例中，线性环状多核糖核苷酸可以被环化或连环化。在一些实施例中，线性环状多核糖核苷酸可以在配制和/或递送之前被体外环化。在一些实施例中，线性环状多核糖核苷酸可以在细胞内环化。细胞外环化[0281]在一些实施例中，使用化学方法环化、或连环化线性环状多核糖核苷酸以形成环状多核糖核苷酸。在一些化学方法中，核酸(例如，线性环状多核糖核苷酸)的5'端和3'端包括化学反应性基团，当这些化学反应性基团彼此靠近时，可以在分子的3'端与5'端之间形成新的共价键。5'端可以含有nhs酯反应性基团，并且3'端可以含有3'-氨基末端的核苷酸，使得在有机溶剂中，线性rna分子3'端上的3'-氨基末端的核苷酸将在5'-nhs-酯部分上经历亲核攻击，从而形成新的5'-/3'-酰胺键。[0282]在一些实施例中，dna或rna连接酶可用于将5'-磷酸化的核酸分子(例如，线性环状多核糖核苷酸)酶促连接至核酸(例如，线性核酸)的3'-羟基，形成新的磷酸二酯键。在示例性反应中，根据制造商的方案，将线性环状多核糖核苷酸与1-10单位的t4rna连接酶(马萨诸塞州伊普斯威奇新英格兰生物学实验室公司(newenglandbiolabs,ipswich,ma))在37℃下孵育1小时。连接反应可以在存在线性核酸时发生，所述线性核酸能够与并列的5'和3'区域两者碱基配对，以辅助酶促连接反应。在一些实施例中，连接是夹板连接。例如，可以使用夹板连接酶(像连接酶)进行夹板连接。对于夹板连接，单链多核苷酸(夹板)(像单链rna)可以被设计为与线性多核糖核苷酸的两个末端杂交，使得在与单链夹板杂交时可以将两个末端并列。因此，夹板连接酶可以催化线性多核糖核苷酸并列的两个末端的连接，生成环状多核糖核苷酸。[0283]在一些实施例中，dna或rna连接酶可用于环状多核苷酸的合成。作为一个非限制性实例，连接酶可以是circ连接酶或环状连接酶。[0284]在一些实施例中，线性环状多核糖核苷酸的5'-或3'-末端可编码连接酶核酶序列，使得在体外转录期间，所得线性环状多核糖核苷酸包括活性核酶序列，所述活性核酶序列能够将线性环状多核糖核苷酸的5'-末端连接至线性环状多核糖核苷酸的3'-末端。连接酶核酶可以衍生自第i组内含子、丁型肝炎病毒、发夹核酶，或者可以通过selex(通过指数富集进行的配体系统进化)进行选择。核酶连接酶反应在0℃与37℃之间的温度下可能需要1至24小时。[0285]在一些实施例中，可以通过使用至少一个非核酸部分将线性环状多核糖核苷酸环化或连环化。在一方面，至少一个非核酸部分可以与线性环状多核糖核苷酸的5'末端附近和/或3'末端附近的区域或特征反应，以环化或连环化线性环状多核糖核苷酸。在另一方面，至少一个非核酸部分可以位于或连接至或邻近线性环状多核糖核苷酸的5'末端和/或3'末端。设想的非核酸部分可以是同源或异源的。作为一个非限制性实例，非核酸部分可以是键，诸如疏水键、离子键、可生物降解的键和/或可裂解的键。作为另一个非限制性实例，非核酸部分是连接部分。作为又另一个非限制性实例，非核酸部分可以是寡核苷酸或肽部分，诸如本文所述的适体或非核酸接头。[0286]在一些实施例中，线性环状多核糖核苷酸可以由于非核酸部分而被环化或连环化，所述非核酸部分引起位于、邻近或连接至线性环状多核糖核苷酸的5'和3'端的原子、分子表面之间的吸引力。作为一个非限制性实例，可以通过分子间作用力或分子内作用力将一个或多个线性环状多核糖核苷酸环化或连环化。分子间作用力的非限制性实例包括偶极-偶极力、偶极诱导偶极力、诱导偶极诱导偶极力、范德华力和色散力。分子内作用力的非限制性实例包括共价键、金属键、离子键、共振键、抓氢键(agnosticbond)、偶极键、缀合、超缀合和反向键。[0287]在一些实施例中，线性环状多核糖核苷酸可在5'末端附近和3'末端附近包含核酶rna序列。当序列暴露于核酶的其余部分时，核酶rna序列可以共价地连接至肽。在一方面，共价地连接至5'末端和3'末端附近的核酶rna序列的肽可以彼此缔合，从而引起线性环状多核糖核苷酸环化或连环化。在另一方面，共价地连接至核酶rna序列5'末端和3'末端附近的肽可以引起线性初级构建体或线性mrna在使用本领域已知的方法(诸如但不限于蛋白连接)进行连接后环化或连环化。用于在本发明的线性初级构建体或线性rna中使用的核酶的非限制性实例，或掺入和/或共价地连接肽的方法的非穷举列表在美国专利申请号us20030082768中描述，将所述专利申请的内容通过援引以其全文并入本文。[0288]在一些实施例中，线性环状多核糖核苷酸可以包括例如通过以下方式被转化为5'单磷酸的核酸的5'三磷酸：使5'三磷酸与rna5'焦磷酸水解酶(rpph)或atp二磷酸水解酶(三磷酸腺苷双磷酸酶)接触。替代性地，将线性环状多核糖核苷酸的5'三磷酸转化为5'单磷酸可以通过两步反应发生，所述两步反应包括：(a)使线性环状多核糖核苷酸的5'核苷酸与磷酸酶(例如，热敏磷酸酶、虾碱性磷酸酶或小牛肠磷酸酶)接触以去除所有三个磷酸；以及(b)在步骤(a)之后，使5'核苷酸与添加单一磷酸的激酶(例如，多核苷酸激酶)接触。[0289]在一些实施例中，本文提供的环化方法的环化效率是至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、或100％。在一些实施例中，本文提供的环化方法的环化效率是至少约40％。[0290]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括至少一个剪接元件。在wo2019/118919的段落[0270]-[0275]中描述了示例性的剪接元件，所述专利特此通过援引以其全文并入。其他环化方法[0291]在一些实施例中，线性环状多核糖核苷酸可以包括互补序列，包括单独内含子内或跨侧接内含子的重复或非重复核酸序列。重复核酸序列是在环状多核糖核苷酸的区段内出现的序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括重复核酸序列。在一些实施例中，重复核苷酸序列包括聚ca序列或聚ug序列。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包括与环状多核糖核苷酸的另一区段中的互补重复核酸序列杂交的至少一个重复核酸序列，其中杂交的区段形成内部双链。在一些实施例中，来自两个单独的环状多核糖核苷酸的重复核酸序列和互补重复核酸序列杂交以生成单一环化多核糖核苷酸，其中杂交的区段形成内部双链。在一些实施例中，互补序列存在于线性环状多核糖核苷酸的5’端和3’端。在一些实施例中，互补序列包括约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、或更多个配对的核苷酸。[0292]在一些实施例中，环化化学方法可用于生成环状多核糖核苷酸。此类方法可以包括但不限于点击化学(例如，基于炔烃和叠氮化物的方法，或可点击的碱基)、烯烃复分解、氨基磷酸酯连接、半缩醛胺-亚胺交联、碱基修饰、及其任何组合。[0293]在一些实施例中，环化酶促方法可用于生成环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，连接酶(例如，dna或rna连接酶)可用于生成环状多核糖核苷酸或互补体的模板、环状多核糖核苷酸的互补链、或环状多核糖核苷酸。[0294]环状多核糖核苷酸的环化可以通过本领域已知的方法完成，例如，petkovic和muller,“rnacircularizationstrategiesinvivoandinvitro[体内外核糖核酸环化策略]”nucleicacidsres[核酸研究],2015,43(4):2454-2465，和muller和appel,“invitrocircularizationofrna[核糖核酸的体外环化]”rnabiol[rna生物学],2017,14(8):1018-1027中描述的那些方法。[0295]环状多核糖核苷酸可以编码可用于复制的序列和/或基序。示例性复制元件包括rna聚合酶的结合位点。在wo2019/118919的段落[0280]-[0286]中描述了复制元件的其他类型，所述专利特此通过援引以其全文并入。在一些实施例中，如本文所披露的环状多核糖核苷酸缺少复制元件，例如缺少rna依赖性rna聚合酶结合位点。[0296]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸缺少聚a序列和复制元件。施用至受试者的组合物[0297]包含本文所述环状多核糖核苷酸的细胞可以包含在用于施用至受试者的各种组合物、制剂、悬浮液或医疗装置中。[0298]例如，如本文所述的细胞(例如，分离的细胞)在用于施用至受试者的药物组合物中。本发明包括与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合的组合物。[0299]药学上可接受的赋形剂可以是非载体赋形剂。非载体赋形剂用作组合物(诸如，如本文所述的环状多核糖核苷酸)的媒介物或介质。非载体赋形剂用作组合物(诸如，如本文所述的线性多核糖核苷酸)的媒介物或介质。非载体赋形剂的非限制性实例包括溶剂、水性溶剂、非水溶剂、分散介质、稀释剂、分散剂、助悬剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、聚合物、肽、蛋白质、细胞、透明质酸酶、分散剂、制粒剂、崩解剂、粘合剂、缓冲剂(例如，磷酸盐缓冲盐水(pbs))、润滑剂、油及其混合物。非载体赋形剂可以是经美国食品和药物管理局(fda)批准并列在非活性成分数据库中的不表现出细胞穿透作用的任一种非活性成分。药物组合物可以任选地包含一种或多种另外的活性物质，例如治疗和/或预防活性物质。本发明的药物组合物可以是无菌的和/或无热原的。可以在以下中找到药剂的配制和/或制造中的一般考虑：例如，remington:thescienceandpracticeofpharmacy[雷明顿：药物科学与实践]第21版,lippincottwilliams&wilkins[利平科特·威廉斯和威尔金斯出版公司],2005(通过援引并入本文)。[0300]在一些实施例中，本文提供的药物组合物(例如，包含如本文所述的环状多核糖核苷酸的细胞)适于施用至受试者，其中所述受试者是非人动物，例如适合兽用。为了使组合物适于施用给各种动物而对适于施用至人的药物组合物的修饰是熟知的，并且普通兽医药理师可以仅通过普通的实验(如果有的话)来设计和/或进行这种修饰。预期施用药物组合物的受试者包括但不限于任何动物，诸如人和/或其他灵长类；哺乳动物，包括与商业有关的哺乳动物，例如宠物和牲畜动物，诸如牛、猪、马、绵羊、猫、狗、小鼠和/或大鼠；和/或鸟类，包括商业相关的鸟类，诸如家禽、鸡、鸭、鹅和/或火鸡；动物园动物，例如猫科动物；非哺乳类动物，例如爬行动物、鱼类、两栖动物等。[0301]本文所述的药物组合物的配制品可以通过药理学领域中已知的或以后开发的任何方法来制备。通常，此类制备方法包括以下步骤：使活性成分与赋形剂和/或一种或多种其他辅助成分结合，并且然后，如果必要和/或期望的话，将产品分开、成形和/或包装。[0302]本文描述的细胞组合物可以作为药物组合物使用或施用。在一些实施例中，药物组合物包含含有环状聚核糖核酸的细胞。药物组合物可以进一步包含一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。[0303]在一些实施例中，药学上可接受的载体或赋形剂是糖(例如，蔗糖、乳糖、甘露醇、麦芽糖、山梨糖醇或果糖)、中性盐(例如，氯化钠、硫酸镁、氯化镁、硫酸钾、碳酸钠、亚硫酸钠、磷酸钾或乙酸钠)、酸性组分(例如，富马酸、马来酸、己二酸、柠檬酸或抗坏血酸)、碱性组分(例如，三(羟甲基)氨基甲烷(tris)、葡甲胺、钠或钾的三元或二元磷酸盐)或氨基酸(例如，甘氨酸或精氨酸)。[0304]在一些实施例中，药物组合物包含多个细胞或细胞制剂，其中所述制剂包含或所述多个是至少105个细胞，例如，至少106或至少107或至少108或至少109或至少1010或至少1011个细胞，例如5x105个细胞至1x107个细胞。在一些实施例中，所述多个是12.5x105个细胞至4.4x1011个细胞。在一些实施例中，药物组合物包含作为目标受试者的单位剂量的多个细胞或细胞制剂，例如，药物组合物包含105-109个细胞/kg目标受试者，例如，106-108个细胞/kg目标受试者(例如，目标受试者，诸如有需要的受试者)。例如，体重为50kg的目标受试者的单位剂量可以是包含5x107至2.5x1010个细胞，例如5x107至2.5x109个细胞，例如5x108至5x109个细胞的药物组合物。[0305]作为另一个实例，用于如本文所述的细胞疗法的细胞(例如，分离的细胞)在制剂中。制剂可以包含1x105至9x1011个细胞，例如，1x105-9x105个细胞、1x106-9x106个细胞、1x107-9x107个细胞、1x108-9x108个细胞、1x109-9x109个细胞、1x1010-9x1010个细胞、1x1011-9x1011个细胞，例如，5x105个细胞至4.4x1011个细胞，所述制剂被配置用于肠胃外递送至受试者，其中所述制剂包含如本文所述的多个(例如，制剂中至少1％的细胞)细胞或分离的细胞。例如，制剂中至少50％的细胞、至少60％的细胞，例如50-70％的细胞是包含如本文所述的合成的外源环状rna的细胞。在一些实施例中，制剂呈本文所述的单位剂量形式。在一些实施例中，递送是注射或输注(例如，iv注射或输注)。制剂可以包含如本文所披露的5x105个细胞至4.4x1011个细胞，其被配置用于递送(例如，静脉内施用)至受试者。在一些实施例中，制剂包含如本文所披露的5x105个细胞至1x107个细胞、5x105个细胞至1x108个细胞、5x105个细胞至1x109个细胞、5x105个细胞至1x1010个细胞、5x105个细胞至1x1011个细胞、5x105个细胞至2x1011个细胞、5x105个细胞至3x1011个细胞、5x105个细胞至4x1011个细胞、1x106个细胞至1x107个细胞、1x106个细胞至1x108个细胞、1x106个细胞至1x109个细胞、1x106个细胞至1x1010个细胞、1x106个细胞至1x1011个细胞、1x106个细胞至2x1011个细胞、1x106个细胞至3x1011个细胞、1x106个细胞至4x1011个细胞、1x107个细胞至1x108个细胞、1x107个细胞至1x109个细胞、1x107个细胞至1x1010个细胞、1x107个细胞至1x1011个细胞、1x107个细胞至2x1011个细胞、1x107个细胞至3x1011个细胞、1x107个细胞至4x1011个细胞、1x108个细胞至1x109个细胞、1x108个细胞至1x1010个细胞、1x108个细胞至1x1011个细胞、1x108个细胞至2x1011个细胞、1x108个细胞至3x1011个细胞、1x108个细胞至4x1011个细胞，或其间的任何范围的细胞。在一些实施例中，制剂被配置用于注射或输注。在一些实施例中，制剂呈如本文所披露的5x105个细胞至1x107个细胞、5x105个细胞至1x108个细胞、5x105个细胞至1x109个细胞、5x105个细胞至1x1010个细胞、5x105个细胞至1x1011个细胞、5x105个细胞至2x1011个细胞、5x105个细胞至3x1011个细胞、5x105个细胞至4x1011个细胞、1x106个细胞至1x107个细胞、1x106个细胞至1x108个细胞、1x106个细胞至1x109个细胞、1x106个细胞至1x1010个细胞、1x106个细胞至1x1011个细胞、1x106个细胞至2x1011个细胞、1x106个细胞至3x1011个细胞、1x106个细胞至4x1011个细胞、1x107个细胞至1x108个细胞、1x107个细胞至1x109个细胞、1x107个细胞至1x1010个细胞、1x107个细胞至1x1011个细胞、1x107个细胞至2x1011个细胞、1x107个细胞至3x1011个细胞、1x107个细胞至4x1011个细胞、1x108个细胞至1x109个细胞、1x108个细胞至1x1010个细胞、1x108个细胞至1x1011个细胞、1x108个细胞至2x1011个细胞、1x108个细胞至3x1011个细胞、1x108个细胞至4x1011、12.5x105个细胞至4.4x1011个细胞，或其间的任何范围的细胞的单位剂量形式。在一些实施例中，制剂包含5x105个细胞/kg至6x108个细胞/kg的剂量。在一些实施例中，制剂包含5x105个细胞/kg至6x108个细胞/kg、5x105个细胞/kg至6x109个细胞/kg、5x104个细胞/kg至6x108个细胞/kg、5x104个细胞/kg至6x109个细胞/kg、5x105个细胞/kg至6x106个细胞/kg、5x105个细胞/kg至6x107个细胞/kg，或其间的任何范围的细胞/kg的剂量。[0306]在一些实施例中，用于如本文所述的细胞疗法的细胞在静脉注射袋或输注产品中。静脉注射袋或其他输注产品可以包含分离的细胞的悬浮液，其中悬浮液中的多个细胞(例如，制剂中至少1％的细胞)是本文所述的任何细胞或分离的细胞。在实施例中，悬浮液包含1x105-9x105个细胞、1x106-9x106个细胞、1x107-9x107个细胞、1x108-9x108个细胞、1x109-9x109个细胞、1x1010-9x1010个细胞、1x1011-9x1011个细胞，例如，5x105个细胞至4.4x1011个细胞，iv袋被配置用于肠胃外递送至受试者。在一些实施例中，悬浮液中至少50％的细胞、至少60％的细胞，例如50-70％的细胞是包含如本文所述的合成的外源环状rna的细胞。在一些实施例中，iv袋包含本文所述的单位剂量的细胞。静脉注射袋或输注产品可以包含如本文所述的细胞的悬浮液，所述细胞的悬浮液包含如本文所披露的5x105个细胞至1x107个细胞，被配置用于递送至受试者。在一些实施例中，悬浮液包含如本文所披露的12.5x105个细胞至4.4x1011个细胞。在一些实施例中，细胞的悬浮液包含如本文所披露的5x105个细胞至1x107个细胞、5x105个细胞至1x108个细胞、5x105个细胞至1x109个细胞、5x105个细胞至1x1010个细胞、5x105个细胞至1x1011个细胞、5x105个细胞至2x1011个细胞、5x105个细胞至3x1011个细胞、5x105个细胞至4x1011个细胞、1x106个细胞至1x107个细胞、1x106个细胞至1x108个细胞、1x106个细胞至1x109个细胞、1x106个细胞至1x1010个细胞、1x106个细胞至1x1011个细胞、1x106个细胞至2x1011个细胞、1x106个细胞至3x1011个细胞、1x106个细胞至4x1011个细胞、1x107个细胞至1x108个细胞、1x107个细胞至1x109个细胞、1x107个细胞至1x1010个细胞、1x107个细胞至1x1011个细胞、1x107个细胞至2x1011个细胞、1x107个细胞至3x1011个细胞、1x107个细胞至4x1011个细胞、1x108个细胞至1x109个细胞、1x108个细胞至1x1010个细胞、1x108个细胞至1x1011个细胞、1x108个细胞至2x1011个细胞、1x108个细胞至3x1011个细胞、1x108个细胞至4x1011、12.5x105个细胞至4.4x1011个细胞，或其间的任何范围的细胞。在一些实施例中，悬浮液包含5x105个细胞/kg至6x108个细胞/kg的剂量。在一些实施例中，悬浮液包含5x105个细胞/kg至6x108个细胞/kg、5x105个细胞/kg至6x109个细胞/kg、5x104个细胞/kg至6x108个细胞/kg、5x104个细胞/kg至6x109个细胞/kg、5x105个细胞/kg至6x106个细胞/kg、5x105个细胞/kg至6x107个细胞/kg，或其间的任何范围的细胞/kg的剂量。[0307]在一些实施例中，用于如本文所述的细胞疗法的细胞(例如，分离的细胞)在医疗装置中。医疗装置可以包含多个细胞，例如1x105-9x105个细胞、1x106-9x106个细胞、1x107-9x107个细胞、1x108-9x108个细胞、1x109-9x109个细胞、1x1010-9x1010个细胞、1x1011-9x1011个细胞，例如，5x105个细胞至4.4x1011个细胞，所述医疗装置被配置用于植入受试者，其中所述医疗装置中至少40％的细胞是如本文所述的细胞或分离的细胞。例如，医疗装置中至少50％的细胞、至少60％的细胞，例如50-70％的细胞是包含如本文所述的合成的外源环状rna的细胞。医疗装置可以包含如本文所披露的被配置用于植入受试者的细胞。在一些实施例中，医疗装置包含如本文所披露的5x105个细胞至1x107个细胞。在一些实施例中，医疗装置包含如本文所披露的12.5x105个细胞至4.4x1011个细胞。在一些实施例中，医疗装置包含如本文所披露的5x105个细胞至1x107个细胞、5x105个细胞至1x108个细胞、5x105个细胞至1x109个细胞、5x105个细胞至1x1010个细胞、5x105个细胞至1x1011个细胞、5x105个细胞至2x1011个细胞、5x105个细胞至3x1011个细胞、5x105个细胞至4x1011个细胞、1x106个细胞至1x107个细胞、1x106个细胞至1x108个细胞、1x106个细胞至1x109个细胞、1x106个细胞至1x1010个细胞、1x106个细胞至1x1011个细胞、1x106个细胞至2x1011个细胞、1x106个细胞至3x1011个细胞、1x106个细胞至4x1011个细胞、1x107个细胞至1x108个细胞、1x107个细胞至1x109个细胞、1x107个细胞至1x1010个细胞、1x107个细胞至1x1011个细胞、1x107个细胞至2x1011个细胞、1x107个细胞至3x1011个细胞、1x107个细胞至4x1011个细胞、1x108个细胞至1x109个细胞、1x108个细胞至1x1010个细胞、1x108个细胞至1x1011个细胞、1x108个细胞至2x1011个细胞、1x108个细胞至3x1011个细胞、1x108个细胞至4x1011、12.5x105个细胞至4.4x1011个细胞，或其间的任何范围的细胞。在一些实施例中，医疗装置包含5x105个细胞/kg至6x108个细胞/kg的剂量。在一些实施例中，医疗装置包含5x105个细胞/kg至6x108个细胞/kg、5x105个细胞/kg至6x109个细胞/kg、5x104个细胞/kg至6x108个细胞/kg、5x104个细胞/kg至6x109个细胞/kg、5x105个细胞/kg至6x106个细胞/kg、5x105个细胞/kg至6x107个细胞/kg，或其间的任何范围的细胞/kg的剂量。在一些实施例中，医疗装置被配置为在植入受试者时产生并释放所述多个细胞。在一些实施例中，医疗装置被配置为在植入受试者时产生并释放蛋白质(例如，分泌蛋白或可裂解蛋白)。[0308]在一些实施例中，用于如本文所述的细胞疗法的细胞(例如，分离的细胞)在生物相容性基质中。生物相容性基质可以包含多个细胞，其中所述生物相容性基质被配置用于植入受试者。生物相容性基质可以包含1x105-9x105个细胞、1x106-9x106个细胞、1x107-9x107个细胞、1x108-9x108个细胞、1x109-9x109个细胞、1x1010-9x1010个细胞、1x1011-9x1011个细胞，例如，5x105个细胞至4.4x1011个细胞，其中生物相容性基质中至少50％的细胞、至少60％的细胞，例如，50％-70％的细胞是包含如本文所述的合成的外源环状rna的细胞。例如，生物相容性基质是afibromertm基质。例如，生物相容性基质可以是描述于以下中的基质：bose等人2020.natbiomedeng.[自然生物医学工程]2020.doi:10.1038/s41551-020-0538-5，将其通过援引并入本文。生物相容性基质可以包含如本文所披露的被配置用于植入受试者的细胞。在一些实施例中，生物相容性基质包含如本文所披露的5x105个细胞至1x107个细胞。在一些实施例中，生物相容性基质包含如本文所披露的12.5x105个细胞至4.4x1011个细胞。在一些实施例中，生物相容性基质包含如本文所披露的5x105个细胞至1x107个细胞、5x105个细胞至1x108个细胞、5x105个细胞至1x109个细胞、5x105个细胞至1x1010个细胞、5x105个细胞至1x1011个细胞、5x105个细胞至2x1011个细胞、5x105个细胞至3x1011个细胞、5x105个细胞至4x1011个细胞、1x106个细胞至1x107个细胞、1x106个细胞至1x108个细胞、1x106个细胞至1x109个细胞、1x106个细胞至1x1010个细胞、1x106个细胞至1x1011个细胞、1x106个细胞至2x1011个细胞、1x106个细胞至3x1011个细胞、1x106个细胞至4x1011个细胞、1x107个细胞至1x108个细胞、1x107个细胞至1x109个细胞、1x107个细胞至1x1010个细胞、1x107个细胞至1x1011个细胞、1x107个细胞至2x1011个细胞、1x107个细胞至3x1011个细胞、1x107个细胞至4x1011个细胞、1x108个细胞至1x109个细胞、1x108个细胞至1x1010个细胞、1x108个细胞至1x1011个细胞、1x108个细胞至2x1011个细胞、1x108个细胞至3x1011个细胞、1x108个细胞至4x1011、12.5x105个细胞至4.4x1011个细胞，或其间的任何范围的细胞。在一些实施例中，生物相容性基质包含5x105个细胞/kg至6x108个细胞/kg的剂量。在一些实施例中，生物相容性基质包含5x105个细胞/kg至6x108个细胞/kg、5x105个细胞/kg至6x109个细胞/kg、5x104个细胞/kg至6x108个细胞/kg、5x104个细胞/kg至6x109个细胞/kg、5x105个细胞/kg至6x106个细胞/kg、5x105个细胞/kg至6x107个细胞/kg，或其间的任何范围的细胞/kg的剂量。在一些实施例中，生物相容性基质被配置为在植入受试者时产生并释放所述多个细胞。在一些实施例中，生物相容性基质被配置为在植入受试者时产生并释放蛋白质(例如，分泌蛋白或可裂解蛋白)。[0309]在一些实施例中，用于如本文所述的细胞疗法的细胞(例如，分离的细胞)在施用至受试者之前在生物反应器中。生物反应器可包含多个细胞，例如，1x105-9x105个细胞、1x106-9x106个细胞、1x107-9x107个细胞、1x108-9x108个细胞、1x109-9x109个细胞、1x1010-9x1010个细胞、1x1011-9x1011个细胞，例如，5x105个细胞至4.4x1011个细胞，其中生物反应器中至少50％的细胞、至少60％的细胞，例如，50％-70％的细胞是包含如本文所述的合成的外源环状rna的细胞。生物反应器可以在培养物中包含如本文所述的细胞。在一些实施例中，生物反应器包括2d细胞培养物。在一些实施例中，生物反应器包括3d细胞培养物。在一些实施例中，来自生物反应器的细胞在用于施用至受试者的药物组合物中，并且所述药物组合物包含如本文所披露的5x105个细胞至1x107个细胞、5x105个细胞至1x108个细胞、5x105个细胞至1x109个细胞、5x105个细胞至1x1010个细胞、5x105个细胞至1x1011个细胞、5x105个细胞至2x1011个细胞、5x105个细胞至3x1011个细胞、5x105个细胞至4x1011个细胞、1x106个细胞至1x107个细胞、1x106个细胞至1x108个细胞、1x106个细胞至1x109个细胞、1x106个细胞至1x1010个细胞、1x106个细胞至1x1011个细胞、1x106个细胞至2x1011个细胞、1x106个细胞至3x1011个细胞、1x106个细胞至4x1011个细胞、1x107个细胞至1x108个细胞、1x107个细胞至1x109个细胞、1x107个细胞至1x1010个细胞、1x107个细胞至1x1011个细胞、1x107个细胞至2x1011个细胞、1x107个细胞至3x1011个细胞、1x107个细胞至4x1011个细胞、1x108个细胞至1x109个细胞、1x108个细胞至1x1010个细胞、1x108个细胞至1x1011个细胞、1x108个细胞至2x1011个细胞、1x108个细胞至3x1011个细胞、1x108个细胞至4x1011、12.5x105个细胞至4.4x1011个细胞，或其间的任何范围的细胞。在一些实施例中，来自生物反应器的细胞在用于施用至受试者的药物组合物中，并且所述药物组合物包含5x105个细胞/kg至6x108个细胞/kg的剂量。在一些实施例中，来自生物反应器的细胞在用于施用至受试者的药物组合物中，并且所述药物组合物包含5x105个细胞/kg至6x108个细胞/kg、5x105个细胞/kg至6x109个细胞/kg、5x104个细胞/kg至6x108个细胞/kg、5x104个细胞/kg至6x109个细胞/kg、5x105个细胞/kg至6x106个细胞/kg、5x105个细胞/kg至6x107个细胞/kg，或其间的任何范围的细胞/kg的剂量。[0310]在一些实施例中，用于细胞疗法的细胞是表现出与环状多核糖核苷酸的蛋白质和/或至少一个结合位点相关的表型或基因型的细胞。例如，所述细胞表达蛋白质(例如，car)，由于通过与环状多核糖核苷酸的结合位点结合在细胞中螯合靶而对药物敏感，或者所述细胞是经编辑的细胞。例如，如本文所述的细胞包含编码能够在细胞中编辑核酸的核酸酶的环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，编辑分离的细胞或多个分离的细胞的核酸的方法包括提供分离的细胞或多个分离的细胞，并使分离的细胞或多个分离的细胞与编码核酸酶和/或包含指导核酸的环状多核糖核苷酸接触，从而产生用于施用至受试者的经编辑的细胞或多个经编辑的细胞。核酸酶可以是锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶或cas蛋白。在一些实施例中，cas蛋白是cas9蛋白、cas12蛋白、cas14蛋白或cas13蛋白。在一些实施例中，核酸酶编辑靶序列，其中靶序列在分离的细胞中。在一些实施例中，指导核酸包含具有与靶序列互补的序列的第一区域和与核酸酶杂交的第二区域。分离的细胞或多个分离的细胞可以是如本文所述的任何细胞。在一些实施例中，所述方法进一步包括用药学上可接受的赋形剂配制经编辑的细胞或多个经编辑的细胞。在一些实施例中，所述方法进一步包括向受试者施用经编辑的或多个经编辑的细胞。在一些实施例中，所述方法进一步包括以如本文所披露的5x105个细胞至1x107个细胞、5x105个细胞至1x108个细胞、5x105个细胞至1x109个细胞、5x105个细胞至1x1010个细胞、5x105个细胞至1x1011个细胞、5x105个细胞至2x1011个细胞、5x105个细胞至3x1011个细胞、5x105个细胞至4x1011个细胞、1x106个细胞至1x107个细胞、1x106个细胞至1x108个细胞、1x106个细胞至1x109个细胞、1x106个细胞至1x1010个细胞、1x106个细胞至1x1011个细胞、1x106个细胞至2x1011个细胞、1x106个细胞至3x1011个细胞、1x106个细胞至4x1011个细胞、1x107个细胞至1x108个细胞、1x107个细胞至1x109个细胞、1x107个细胞至1x1010个细胞、1x107个细胞至1x1011个细胞、1x107个细胞至2x1011个细胞、1x107个细胞至3x1011个细胞、1x107个细胞至4x1011个细胞、1x108个细胞至1x109个细胞、1x108个细胞至1x1010个细胞、1x108个细胞至1x1011个细胞、1x108个细胞至2x1011个细胞、1x108个细胞至3x1011个细胞、1x108个细胞至4x1011、12.5x105个细胞至4.4x1011个细胞，或其间的任何范围的细胞的剂量施用所述多个经编辑的细胞。在一些实施例中，所述方法进一步包括以5x105个细胞/kg至6x108个细胞/kg、5x105个细胞/kg至6x109个细胞/kg、5x104个细胞/kg至6x108个细胞/kg、5x104个细胞/kg至6x109个细胞/kg、5x105个细胞/kg至6x106个细胞/kg、5x105个细胞/kg至6x107个细胞/kg，或其间的任何范围的细胞/kg的剂量施用所述多个经编辑的细胞。在一些实施例中，所述方法进一步包括分两个后续剂量，以5x105个细胞/kg至6x108个细胞/kg、5x105个细胞/kg至6x109个细胞/kg、5x104个细胞/kg至6x108个细胞/kg、5x104个细胞/kg至6x109个细胞/kg、5x105个细胞/kg至6x106个细胞/kg、5x105个细胞/kg至6x107个细胞/kg，或其间的任何范围的细胞/kg的剂量施用所述多个经编辑的细胞。在一些实施例中，两个后续剂量间隔至少约28天、35天、42天或60天，或其间的任何天数。作为另一个实例，如本文所述的细胞包含编码转录因子(诸如oct4、klf4、sox2、cmyc或其组合)的环状多核糖核苷酸，其能够在细胞中重编程(例如，重编程以产生诱导性多能干细胞)。在一些实施例中，重编程分离的细胞或多个分离的细胞的核酸的方法包括提供分离的细胞或多个分离的细胞，并使分离的细胞或多个分离的细胞与编码转录因子的环状多核糖核苷酸接触，从而产生用于施用至受试者的重编程细胞或多个重编程细胞。转录因子可以是oct4、klf4、sox2或cmyc。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸编码一种或多种转录因子。在一些实施例中，转录因子各自由单独的环状多核糖核苷酸编码，并且这些环状多核糖核苷酸(例如，多个环状多核糖核苷酸)与分离的细胞或多个分离的细胞接触。分离的细胞或多个分离的细胞可以是如本文所述的任何细胞。在一些实施例中，所述方法进一步包括用药学上可接受的赋形剂配制重编程细胞或多个重编程细胞。在一些实施例中，所述方法进一步包括向受试者施用重编程细胞或多个重编程细胞。在一些实施例中，方法进一步包括将重编程细胞或多个分化细胞分化成细胞类型(例如，β细胞、造血干细胞等)以产生分化细胞或多个分化细胞，然后将分化细胞或多个分化细胞施用至受试者。在一些实施例中，所述方法进一步包括以如本文所披露的5x105个细胞至1x107个细胞、5x105个细胞至1x108个细胞、5x105个细胞至1x109个细胞、5x105个细胞至1x1010个细胞、5x105个细胞至1x1011个细胞、5x105个细胞至2x1011个细胞、5x105个细胞至3x1011个细胞、5x105个细胞至4x1011个细胞、1x106个细胞至1x107个细胞、1x106个细胞至1x108个细胞、1x106个细胞至1x109个细胞、1x106个细胞至1x1010个细胞、1x106个细胞至1x1011个细胞、1x106个细胞至2x1011个细胞、1x106个细胞至3x1011个细胞、1x106个细胞至4x1011个细胞、1x107个细胞至1x108个细胞、1x107个细胞至1x109个细胞、1x107个细胞至1x1010个细胞、1x107个细胞至1x1011个细胞、1x107个细胞至2x1011个细胞、1x107个细胞至3x1011个细胞、1x107个细胞至4x1011个细胞、1x108个细胞至1x109个细胞、1x108个细胞至1x1010个细胞、1x108个细胞至1x1011个细胞、1x108个细胞至2x1011个细胞、1x108个细胞至3x1011个细胞、1x108个细胞至4x1011、12.5x105个细胞至4.4x1011个细胞，或其间的任何范围的细胞的剂量施用多个重编程的细胞或多个分化细胞。在一些实施例中，所述方法进一步包括以5x105个细胞/kg至6x108个细胞/kg、5x105个细胞/kg至6x109个细胞/kg、5x104个细胞/kg至6x108个细胞/kg、5x104个细胞/kg至6x109个细胞/kg、5x105个细胞/kg至6x106个细胞/kg、5x105个细胞/kg至6x107个细胞/kg，或其间的任何范围的细胞/kg的剂量施用多个重编程的细胞或多个分化细胞。在一些实施例中，所述方法进一步包括分两个后续剂量，以5x105个细胞/kg至6x108个细胞/kg、5x105个细胞/kg至6x109个细胞/kg、5x104个细胞/kg至6x108个细胞/kg、5x104个细胞/kg至6x109个细胞/kg、5x105个细胞/kg至6x106个细胞/kg、5x105个细胞/kg至6x107个细胞/kg，或其间的任何范围的细胞/kg的剂量施用所述多个经编辑的细胞。在一些实施例中，两个后续剂量间隔至少约28天、35天、42天或60天，或其间的任何天数。受试者可以是如本文所述的任何受试者。产生和施用细胞疗法的方法[0311]用于细胞疗法的细胞可以通过在其中环状多核糖核苷酸被内化到分离的细胞或多个分离的细胞中的条件下，使如本文所述的分离的细胞或多个分离的细胞与如本文所述的多个环状多核糖核苷酸接触来产生。在一些实施例中，产生细胞的方法包括提供如本文所述的分离的细胞或多个分离的细胞，提供如本文所述的环状多核糖核苷酸，并使环状多核糖核苷酸与分离的细胞或多个分离的细胞接触。在一些实施例中，产生细胞或多个细胞的方法包括提供分离的细胞或多个分离的细胞；提供如本文所述的环状多核糖核苷酸的制剂，并使环状多核糖核苷酸与分离的细胞或多个分离的细胞接触，其中分离的细胞或多个分离的细胞能够表达环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，与细胞接触的环状多核糖核苷酸的制剂包含不超过1ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、300ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、600ng/ml、1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200g/ml、300μg/ml、400μg/ml、500μg/ml、600μg/ml、700μg/ml、800μg/ml、900μg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml、或2mg/ml的线性多核糖核苷酸分子。在一些实施例中，相对于环状多核糖核苷酸的制剂(例如，药物制剂)中的总核糖核苷酸分子，与细胞接触的环状多核糖核苷酸的制剂包含至少30％(w/w)、40％(w/w)、50％(w/w)、60％(w/w)、70％(w/w)、80％(w/w)、85％(w/w)、90％(w/w)、91％(w/w)、92％(w/w)、93％(w/w)、94％(w/w)、95％(w/w)、96％(w/w)、97％(w/w)、98％(w/w)、或99％(w/w)的环状多核糖核苷酸分子。在一些实施例中，制剂中总核糖核苷酸分子的至少30％(w/w)、40％(w/w)、50％(w/w)、60％(w/w)、70％(w/w)、80％(w/w)、85％(w/w)、90％(w/w)、91％(w/w)、92％(w/w)、93％(w/w)、94％(w/w)、95％(w/w)、96％(w/w)、97％(w/w)、98％(w/w)、或99％(w/w)是环状多核糖核苷酸分子。在一些实施例中，与标准化的未接触分离的细胞或多个标准化的未接触分离的细胞相比，接触后分离的细胞或多个分离的细胞的生存力为至少40％。在一些实施例中，所述方法进一步包括在与受试者接触后施用细胞或多个细胞。[0312]在一些实施例中，与标准化的未接触分离的细胞或多个标准化的未接触分离的细胞相比，分离的细胞或多个分离的细胞的生存力为至少30％、40％、50％、60％、70％、80％90％95％、99％或100％。在一些实施例中，产生用于移植的细胞或多个细胞的方法包括在用于移植的组织或器官中提供细胞或多个细胞，提供如本文所述的环状多核糖核苷酸，并使环状多核糖核苷酸与用于移植的组织或器官中的细胞或多个细胞接触，从而产生用于移植的细胞或多个细胞。在一些实施例中，在接触前，从受试者移除用于移植的组织或器官，例如通过手术移除。在一些实施例中，在接触后，所述方法包括将用于移植的细胞或多个细胞移植到受试者中。在一些实施例中，用于移植的组织或器官从受试者移除并移植回受试者中。在一些实施例中，用于移植的组织或器官从受试者移除并移植到不同的受试者中。[0313]在一些实施例中，用于细胞疗法的细胞被配置(例如，在医疗装置中)或适于在受试者中肠胃外施用，例如，作为输注产品或注射产品。产生输注产品的方法可以包括从多个细胞富集细胞类型，扩增细胞类型，使多个细胞类型的细胞与足以将环状多核糖核苷酸内化到多个细胞中的多个环状多核糖核苷酸接触，其中所述多个环状多核糖核苷酸包含至少一个编码赋予细胞至少一种治疗特征的蛋白质的表达序列、至少一个赋予细胞至少一种治疗特征的结合位点、或其组合，并提供接触的多个细胞作为输注产品。产生注射产品的方法可以包括从多个细胞富集细胞类型，扩增细胞类型，使多个细胞类型的细胞与足以将环状多核糖核苷酸内化到多个细胞中的多个环状多核糖核苷酸接触，其中所述多个环状多核糖核苷酸包含至少一个编码赋予细胞至少一种治疗特征的蛋白质的表达序列、至少一个赋予细胞至少一种治疗特征的结合位点、或其组合，并提供接触的多个细胞作为注射产品。在一些实施例中，产生注射产品的方法包括扩增分离的细胞以产生多个分离的细胞，使多个分离的细胞与多个环状多核糖核苷酸接触，其中所述多个环状多核糖核苷酸包含至少一个编码赋予细胞至少一种治疗特征的蛋白质的表达序列、至少一个赋予细胞至少一种治疗特征的结合位点、或其组合，并提供接触的多个细胞作为注射产品。在一些实施例中，所述至少一个结合位点的治疗特征赋予分离的细胞中的核酸活性(例如，所述至少一个结合位点是导致包含mirna的细胞中核酸降解的mirna结合位点)。[0314]然后可以将用于细胞疗法的所产生细胞作为细胞疗法施用至有需要的受试者。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在一段时间后(例如，通过降解或缺少复制)在产生的细胞中不存在，并将这种产生的细胞施用至受试者。例如，制剂中至少50％的细胞、至少60％的细胞，例如50-70％的产生的细胞是包含如本文所述的合成的外源环状多核糖核苷酸的细胞。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸存在于产生的细胞中，并将这种产生的细胞施用至受试者。在一些实施例中，如本文所披露的细胞疗法包括包含环状多核糖核苷酸的细胞。在一些方面，细胞疗法包括细胞，其中所述细胞包含如本文所述的环状多核糖核苷酸。细胞疗法可以用作治疗有需要的受试者的方法或用作治疗方法。在一些实施例中，细胞疗法的方法包括提供如本文所披露的环状多核糖核苷酸，并使环状多核糖核苷酸与离体细胞(例如，分离的细胞)接触。在一些实施例中，细胞疗法的方法包括将如本文所披露的包含如本文所披露环状多核糖核苷酸的细胞施用至有需要的受试者。在一些实施例中，治疗有需要的受试者的方法包括提供如本文所披露的细胞，使离体细胞(例如，分离的细胞)与如本文所披露的包含一个或多个表达序列的环状多核糖核苷酸接触，其中所述一个或多个表达序列的表达产物包含用于治疗受试者的蛋白质。在一些实施例中，治疗的方法包括提供如本文所披露的细胞，并使离体细胞(例如，分离的细胞)与如本文所披露的包含一个或多个表达序列的环状多核糖核苷酸接触，其中所述一个或多个表达序列中的至少一个编码用于治疗有需要的受试者的蛋白质。在进一步的实施例中，在接触后将细胞施用至有需要的受试者。接触[0315]在一些实施例中，所述接触包括使如本文所述的分离的细胞或多个分离的细胞与如本文所述的多个环状多核糖核苷酸接触。在一些实施例中，所述接触包括使离体细胞(例如，分离的细胞)与环状多核糖核苷酸接触。在一些实施例中，所述接触包括使离体细胞(例如，分离的细胞)与环状多核糖核苷酸接触，接触方式足以将环状多核糖核苷酸或环状多核糖核苷酸内化到细胞中。在一些实施例中，所述接触包括使用阳离子脂质、电穿孔、裸环状rna、适配体、阳离子聚合物(例如，pei、聚芳烃、deae-葡聚糖)、病毒样颗粒(例如，来自hpv的l1、来自多瘤病毒的vp1)、外来体；纳米结构的磷酸钙；肽转导结构域(例如，tat、polyr、sp、pvec、synb1等)；外来体；囊泡(例如，vsv-g、tamel)；细胞挤压；纳米颗粒；磁转染；或其任何组合；或将生物分子内化到细胞中的任何方法。[0316]在一些实施例中，与标准化的未接触细胞相比，接触后细胞的生存力为至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％。[0317]在接触后，环状多核糖核苷酸可以在细胞中持续存在。在接触后，环状多核糖核苷酸可以持续至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约12天、至少约14天、至少约16天、至少约18天、至少约20天、至少约25天、至少约30天、至少约40天、或至少约50天。在接触后，环状多核糖核苷酸可以持续1天至2天、2天至3天、3天至4天、4天至5天、5天至6天、6天至7天、7天至8天、8天至9天、9天至10天、10天至12天、12天至14天、14天至16天、16天至18天、18天至20天、20天至25天、25天至30天、30天至40天、40天至50天、1天至14天、1天至30天、7天至14天、7天至30天、或14天至30天。[0318]在一些实施例中，在接触后，至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％量的环状多核糖核苷酸在细胞中持续至少约3、4、5、6、7、8、9、10、12、14或16天的时间段。[0319]在一些实施例中，持续包括与接触后立即的多核糖核苷酸的量相比，维持至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约92％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的多核糖核苷酸的量。在一些实施例中，持续包括与接触后立即的多核糖核苷酸的量相比，维持10％至15％、15％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至35％、35％至40％、40％至45％、45％至50％、50％至55％、55％至60％、60％至65％、65％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至92％、92％至94％、94％至95％、95％至96％、96％至97％、97％至98％、98％至99％、10％至30％、10％至40％、10％至50％、10％至60％、10％至70％、10％至80％、10％至90％、10％至95％、40％至50％、40％至60％、40％至70％、40％至80％、40％至90％、40％至95％、60％至80％、60％至90％、60％至95％、或60％至98％的多核糖核苷酸的量。[0320]在一些实施例中，与总多肽相比，一个或多个表达序列产生一定量的离散多肽，其中所述量是多肽摩尔数占多肽总量的百分比。多肽可以在环状多核糖核苷酸的滚环翻译过程中产生。每个离散的多肽均可以由单一表达序列产生。在一些实施例中，离散多肽的量是总多肽的至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、或至少98％(摩尔/摩尔)。在一些实施例中，离散多肽的量是总多肽的10％至15％、15％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至35％、35％至40％、40％至45％、45％至50％、50％至55％、55％至60％、60％至65％、65％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至92％、92％至94％、94％至95％、95％至96％、96％至97％、97％至98％、98％至99％、10％至30％、10％至40％、10％至50％、10％至60％、10％至70％、10％至80％、10％至90％、10％至95％、40％至50％、40％至60％、40％至70％、40％至80％、40％至90％、40％至95％、60％至80％、60％至90％、60％至95％、或60％至98％(摩尔/摩尔)。[0321]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含比线性多核糖核苷酸对应物产生更大量表达产物的表达序列。在一些实施例中，表达产物的更大量比线性多核糖核苷酸对应物的量大至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍或至少25倍。在一些实施例中，表达产物的更大量比线性多核糖核苷酸对应物的量大1.5倍至1.6倍、1.6倍至1.7倍、1.7倍至1.8倍、1.8倍至1.9倍、1.9倍至2倍、2倍至2.5倍、2.5倍至3倍、3倍至3.5倍、3.5倍至4倍、4倍至4.5倍、4.5倍至5倍、5倍至6倍、6倍至7倍、7倍至8倍、8倍至9倍、9倍至10倍、10倍至15倍、15倍至20倍、20倍至25倍、2倍至5倍、2倍至6倍、2倍至7倍、2倍至10倍、2倍至20倍、4倍至5倍、4倍至6倍、4倍至7倍、4倍至10倍、4倍至20倍、5倍至6倍、5倍至7倍、5倍至10倍、5倍至20倍、或10倍至20倍。在一些实施例中，在接触后，更大量的表达产物在细胞中产生至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约12天、至少约14天、至少约16天、至少约18天、至少约20天、至少约25天、至少约30天、至少约40天、或至少约50天。在一些实施例中，在接触后，更大量的表达产物在细胞中产生1天至2天、2天至3天、3天至4天、4天至5天、5天至6天、6天至7天、7天至8天、8天至9天、9天至10天、10天至12天、12天至14天、14天至16天、16天至18天、18天至20天、20天至25天、25天至30天、30天至40天、40天至50天、1天至14天、1天至30天、7天至14天、7天至30天、或14天至30天。[0322]环状多核糖核苷酸可以表达一个或多个表达序列，其中所述一个或多个表达序列的表达水平在接触后维持一段时间。在一些实施例中，所述表达维持在一段时间内变化不超过约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约92％、约94％、约95％、约96％、约97％、或约98％的水平。在一些实施例中，所述表达维持在一段时间内变化不超过5％至10％、10％至15％、15％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至35％、35％至40％、40％至45％、45％至50％、50％至55％、55％至60％、60％至65％、65％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至92％、92％至94％、94％至95％、95％至96％、96％至97％、97％至98％、98％至99％、10％至30％、10％至40％、10％至50％、10％至60％、10％至70％、10％至80％、10％至90％、10％至95％、40％至50％、40％至60％、40％至70％、40％至80％、40％至90％、40％至95％、60％至80％、60％至90％、60％至95％、或60％至98％的水平。在一些实施例中，在接触后，维持表达的时间段为至多1天、至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约12天、至少约14天、至少约16天、至少约18天、至少约20天、至少约25天、至少约30天、至少约40天、或至少约50天。在一些实施例中，在接触后，维持表达的时间段为1天至2天、2天至3天、3天至4天、4天至5天、5天至6天、6天至7天、7天至8天、8天至9天、9天至10天、10天至12天、12天至14天、14天至16天、16天至18天、18天至20天、20天至25天、25天至30天、30天至40天、40天至50天、1天至14天、1天至30天、7天至14天、7天至30天、或14天至30天。在一些实施例中，所述时间段在接触后1天开始。[0323]在一些实施例中，所述表达在一段时间内减少不大于约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约92％、约94％、约95％、约96％、约97％、或约98％。在一些实施例中，所述时间段是接触后的1天。在一些实施例中，所述表达在一段时间内减少不大于5％至10％、10％至15％、15％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至35％、35％至40％、40％至45％、45％至50％、50％至55％、55％至60％、60％至65％、65％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至92％、92％至94％、94％至95％、95％至96％、96％至97％、97％至98％、98％至99％、10％至30％、10％至40％、10％至50％、10％至60％、10％至70％、10％至80％、10％至90％、10％至95％、40％至50％、40％至60％、40％至70％、40％至80％、40％至90％、40％至95％、60％至80％、60％至90％、60％至95％、或60％至98％。在一些实施例中，所述时间段是接触后的1天。[0324]在一些实施例中，在接触后，在细胞中至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14或16天的时间段内，一个或多个表达序列在细胞中产生的表达产物比线性对应物大至少1.5倍。在一些实施例中，在细胞与环状多核糖核苷酸接触后的至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14或16天的时间段内，一个或多个表达序列在细胞中的表达维持在变化不超过约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的水平。在一些实施例中，所维持的表达水平是所述接触后一天的表达水平。在一些实施例中，所维持的表达水平是所述接触后一天的最高表达水平。在一些实施例中，在细胞与环状多核糖核苷酸接触后的至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14或16天的时间段内，一个或多个表达序列在细胞中的表达水平减少不大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施例中，减少不大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的表达水平是所述接触后一天的表达水平。在一些实施例中，与使细胞与环状多核糖核苷酸接触后一天的最高表达水平相比，表达水平减少不大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。[0325]翻译后，蛋白质可以在细胞中(例如，也包括在细胞膜中)或细胞外(例如，作为分泌蛋白)检测到。在一些实施例中，在接触后的至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、20、30、40、50、60或更多天的时间段内，在细胞中检测蛋白质。在一些实施例中，在接触后的至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、20、30、40、50、60或更多天的时间段内，在细胞表面上检测蛋白质。在一些实施例中，在至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、20、30、40、50、60或更多天的时间段内，检测分泌蛋白。在一些实施例中，所述时间段在细胞与编码蛋白质的环状多核糖核苷酸接触后一天开始。可使用本领域已知的用于蛋白质检测的任何技术来检测蛋白质，诸如通过流式细胞术。环状多核糖核苷酸组合物[0326]本文描述的环状多核糖核苷酸可以包含在用于接触如本文所述细胞的组合物中。所述组合物可以是药物组合物。药物组合物可以不含任何载体。药物组合物可以包含载体。[0327]在一些实施例中，将环状多核糖核苷酸或其药物组合物作为裸递送配制品递送至(例如，通过接触)细胞(例如，分离的细胞)。裸递送配制品在不借助载体并且不对环状多核糖核苷酸进行共价修饰或者不部分或完全包封环状多核糖核苷酸的情况下将环状多核糖核苷酸递送至细胞。[0328]裸递送配制品是不含载体的配制品并且其中环状多核糖核苷酸没有结合有助于递送至细胞的部分的共价修饰，或者没有对环状多核糖核苷酸的部分或完全包封。在一些实施例中，没有与有助于递送至细胞的部分结合的共价修饰的环状多核糖核苷酸是未与有助于递送至细胞的蛋白质、小分子、颗粒、聚合物、或生物聚合物共价结合。没有与有助于递送至细胞的部分结合的未修饰的环状多核糖核苷酸可以不含经修饰的磷酸酯基团。例如，没有与有助于递送至细胞的部分结合的环状多核糖核苷酸可以不含硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼代磷酸盐、硼代磷酸酯、磷酸氢盐、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯或磷酸三酯。[0329]在一些实施例中，裸递送配制品可以不含以下中的任一种或全部：转染试剂、阳离子载体、碳水化合物载体、纳米颗粒载体、或蛋白质载体。例如，裸递送配制品可以不含植物糖原辛烯基琥珀酸酯、植物糖原β-糊精、酸酐修饰的植物糖原β-糊精、lipofectamine、聚乙烯亚胺、聚(三亚甲基亚胺)、聚(四亚甲基亚胺)、聚丙烯亚胺、氨基糖苷-多胺、双脱氧-二氨基-b-环糊精、精胺、亚精胺、聚(2-二甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯、聚(赖氨酸)、聚(组氨酸)、聚(精氨酸)、阳离子化明胶、树状聚合物、壳聚糖、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(dotap)、n-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(dotma)、1-[2-(油酰基氧基)乙基]-2-油烯基-3-(2-羟乙基)咪唑啉鎓氯化物(dotim)、2,3-二油酰基氧基-n-[2(精胺甲酰胺基)乙基]-n,n-二甲基-1-丙烷铵三氟乙酸酯(dospa)、3b-[n—(n\n'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐(dc-胆固醇hcl)、双十七烷基酰胺基甘氨酰亚精胺(dogs)、n,n-二硬脂基-n,n-二甲基溴化铵(ddab)、n-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-n,n-二甲基-n-羟乙基溴化铵(dmrie)、n,n-二油烯基-n,n-二甲基氯化铵(dodac)、人血清白蛋白(hsa)、低密度脂蛋白(ldl)、高密度脂蛋白(hdl)、或球蛋白。[0330]裸递送配制品可以包含非载体赋形剂。在一些实施例中，非载体赋形剂可以包括非活性成分。在一些实施例中，非载体赋形剂可以包括缓冲液，例如pbs。在一些实施例中，非载体赋形剂可以是溶剂、非水性溶剂、稀释剂、悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂、乳化剂、防腐剂、聚合物、肽、蛋白质、细胞、透明质酸酶、分散剂、制粒剂、崩解剂、粘合剂、缓冲剂、润滑剂、或油。[0331]在一些实施例中，裸递送配制品可以包含稀释剂。稀释剂可以是液体稀释剂或固体稀释剂。在一些实施例中，稀释剂可以是rna增溶剂、缓冲液、或等渗剂。rna增溶剂的实例包括水、乙醇、甲醇、丙酮、甲酰胺、和2-丙醇。缓冲液的实例包括2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)、bis-tris、2-[(2-氨基-2-氧乙基)-(羧甲基)氨基]乙酸(ada)、n-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙烷磺酸(aces)、哌嗪-n,n′‑双(2-乙烷磺酸)(pipes)、2-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙-2-基]氨基]乙烷磺酸(tes)、3-(n-吗啉代)丙磺酸(mops)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(hepes)、tris、tricine、gly-gly、bicine或磷酸盐。等渗剂的实例包括甘油、甘露醇、聚乙二醇、丙二醇、海藻糖、或蔗糖。[0332]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸或其药物组合物可以与载体一起递送至细胞(例如，分离的细胞)。本文描述的药物组合物可以被配制成例如包括载体，诸如药物载体，例如膜、脂质双层和/或聚合物载体，例如脂质体或颗粒(诸如纳米颗粒，例如脂质纳米颗粒)，并通过已知方法(诸如经由部分或完全包封环状多核糖核苷酸)递送至用于有需要的受试者(例如人或非人农业动物或家畜，例如牛、狗、猫、马、家禽)的细胞。此类方法包括但不限于转染(例如，脂质介导的阳离子聚合物、磷酸钙、树状聚合物)；病毒递送(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、aav病毒)、fugene、原生质体融合、外来体介导的转移、脂质纳米颗粒介导的转移、及其任何组合。cationiclipid-mediateddeliveryofproteinsenablesefficientprotein-basedgenomeeditinginvitroandinvivo[阳离子脂质介导的蛋白质递送能够在体外和体内实现高效的基于蛋白质的基因组编辑].natbiotechnol[自然生物技术].2014年10月30日；33(1):73-80。递送方法也描述于例如gori等人,deliveryandspecificityofcrispr/cas9genomeeditingtechnologiesforhumangenetherapy[用于人类基因疗法的crispr/cas9基因组编辑技术的递送和特异性].humangenetherapy[人类基因疗法疗].2015年7月,26(7):443-451.doi:10.1089/hum.2015.074；和zuris等人。[0333]另外的递送方法包括电穿孔(例如，使用流动电穿孔装置)或其他膜破裂方法(例如，核转染)、微注射、微注射轰击(“基因枪”)、直接声波加载、细胞挤压、光学转染、穿刺、磁转染、及其任何组合。例如，流动电穿孔装置包括用于容纳待穿孔的细胞(诸如如本文所述的细胞(例如，分离的细胞))悬浮液的腔室，所述腔室至少部分由可反向充电的电极限定，其中所述腔室的热阻小于大约110℃/瓦。基于细胞和囊泡的载体[0334]本文所述的环状多核糖核苷酸可以包含在如本文所述的用于接触细胞的组合物中，其中所述组合物(例如，药物组合物)包含在囊泡或其他基于膜的载体中。[0335]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸、其组合物、或其药物组合物在细胞、囊泡或其他基于膜的载体中或者经由细胞、囊泡或其他基于膜的载体递送(例如，通过接触)至如本文所述的细胞。在一些实施例中，环状多核糖核苷酸、其组合物、或其药物组合物配制在脂质体或其他类似的囊泡中。脂质体是球形囊泡结构，这些球形囊泡结构由围绕内部水性隔室的单层或多层的脂质双层和相对不可渗透的外部亲脂性磷脂双层构成。脂质体可以是阴离子的、中性的或阳离子的。脂质体具有生物相容性，无毒，可以递送亲水性和亲脂性药物分子，保护其货物免受血浆酶的降解，并且将其负载转运穿过生物膜和血脑屏障(bbb)(关于综述，参见例如，spuch和navarro,journalofdrugdelivery[药物递送杂志],第2011卷,文章id469679,第12页,2011.doi:10.1155/2011/469679)。[0336]囊泡可以由若干种不同类型的脂质制成；然而，磷脂最常用于生成脂质体作为药物载体。制备多层囊泡脂质的方法是本领域已知的(参见例如美国专利号6,693,086，其关于多层囊泡脂质制备的教导通过援引并入本文)。尽管当脂质膜与水性溶液混合时，囊泡形成可以是自发的，但也可以通过经由使用均质器、超声波仪或挤压设备以振荡的形式施加力来加快囊泡形成(关于综述，参见例如，spuch和navarro,journalofdrugdelivery[药物递送杂志],第2011卷,文章id469679,第12页,2011.doi:10.1155/2011/469679)。可以通过挤出通过具有减小尺寸的过滤器来制备挤出的脂质，如templeton等人,naturebiotech[自然生物技术],15:647-652,1997中所述，将所述文献关于挤出脂质制备的传授内容通过援引并入本文中。[0337]脂质纳米颗粒是为如本文所述的环状多核糖核苷酸或其药物组合物提供生物相容性和可生物降解的递送系统的载体的另一个实例。纳米结构化的脂质载体(nlc)是经修饰的固体脂质纳米颗粒(sln)，这些经修饰的固体脂质纳米颗粒保留了sln的特征、改善了药物稳定性和负载能力、并且防止了药物泄漏。聚合物纳米颗粒(pnp)是药物递送的重要组成部分。这些纳米颗粒可以有效地将药物递送指导至特定靶并且改善药物稳定性和受控的药物释放。也可以使用脂质聚合物纳米颗粒(pln)，即一种组合了脂质体和聚合物的新型载体。这些纳米颗粒具有pnp和脂质体的互补优势。pln由核-壳结构构成；聚合物核提供了稳定的结构，并且磷脂壳提供了良好的生物相容性。这样，这两种组分增加了药物包封效率、促进了表面修饰、并且防止了水溶性药物的泄漏。对于综述，参见例如，li等人2017,nanomaterials[纳米材料]7,122；doi:10.3390/nano7060122。[0338]载体的另外的非限制性实例包括碳水化合物载体(例如，酸酐修饰的植物糖原或糖原型材料)、蛋白质载体(例如，共价连接至环状多核糖核苷酸的蛋白质)、或阳离子载体(例如，阳离子脂质聚合物或转染试剂)。碳水化合物载体的非限制性实例包括植物糖原辛烯基琥珀酸酯、植物糖原β-糊精、和酸酐修饰的植物糖原β-糊精。阳离子载体的非限制性实例包括lipofectamine、聚乙烯亚胺、聚(三亚甲基亚胺)、聚(四亚甲基亚胺)、聚丙烯亚胺、氨基糖苷-多胺、双脱氧-二氨基-b-环糊精、精胺、亚精胺、聚(2-二甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯、聚(赖氨酸)、聚(组氨酸)、聚(精氨酸)、阳离子化明胶、树状聚合物、壳聚糖、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷(dotap)、n-[1-(2,3-二油酰基氧基)丙基]-n,n,n-三甲基氯化铵(dotma)、1-[2-(油酰基氧基)乙基]-2-油烯基-3-(2-羟乙基)咪唑啉鎓氯化物(dotim)、2,3-二油酰基氧基-n-[2(精胺甲酰胺基)乙基]-n,n-二甲基-1-丙烷铵三氟乙酸酯(dospa)、3b-[n—(n\n'-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇盐酸盐(dc-胆固醇hcl)、双十七烷基酰胺基甘氨酰亚精胺(dogs)、n,n-二硬脂基-n,n-二甲基溴化铵(ddab)、n-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-n,n-二甲基-n-羟乙基溴化铵(dmrie)、和n,n-二油烯基-n,n-二甲基氯化铵(dodac)。蛋白质载体的非限制性实例包括人血清白蛋白(hsa)、低密度脂蛋白(ldl)、高密度脂蛋白(hdl)、或球蛋白。[0339]外来体也可以用作本文所述的环状多核糖核苷酸或其药物组合物的药物递送媒介物。对于综述，参见ha等人2016年7月.actapharmaceuticasinicab[药学学报]第6卷第4期,第287-296页；https://doi.org/10.1016/j.apsb.2016.02.001。[0340]离体分化的红细胞也可以用作本文所述的环状多核糖核苷酸或其药物组合物的载体。参见例如，wo2015073587；wo2017123646；wo2017123644；wo2018102740；wo2016183482；wo2015153102；wo2018151829；wo2018009838；shi等人2014.procnatlacadsciusa[美国国家科学院院刊].111(28):10131-10136；美国专利9,644,180；huang等人2017.naturecommunications[自然通讯]8:423；shi等人2014.procnatlacadsciusa[美国国家科学院院刊].111(28):10131-10136。[0341]例如，如wo2018208728中所述的融合体组合物也可以用作载体来递送本文所述的环状多核糖核苷酸或其药物组合物。[0342]病毒体和病毒样颗粒(vlp)也可用作本文所述环状多核糖核苷酸或其药物组合物至细胞(例如，分离的细胞)的载体。[0343]本发明进一步涉及宿主或宿主细胞，所述宿主或宿主细胞包含本文所述的环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，宿主或宿主细胞是植物、昆虫、细菌、真菌、脊椎动物、哺乳动物(例如，人)或其他生物体或细胞。[0344]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸在宿主中是非免疫原性的。在一些实施例中，与由参考化合物(例如对应于所述环状多核糖核苷酸的线性多核苷酸或缺少加密原的环状多核糖核苷酸)引发的反应相比，环状多核糖核苷酸降低或不能产生宿主免疫系统反应。一些免疫应答包括但不限于体液免疫应答(例如，抗原特异性抗体的产生)和细胞介导的免疫应答(例如，淋巴细胞增殖)。[0345]在一些实施例中，使宿主或宿主细胞接触(例如，递送至或施用至)环状多核糖核苷酸。在一些实施例中，宿主是哺乳动物，诸如人。可以在施用后的任何时间测量宿主中环状多核糖核苷酸、表达产物、或两者的量。在某些实施例中，测定培养物中宿主生长的时程。如果在环状多核糖核苷酸存在时生长增加或减少，则环状多核糖核苷酸或表达产物或两者都被鉴定为在增加或减少宿主的生长方面是有效的。施用[0346]在一些实施例中，使用本文所述的任何递送方法进行在与有需要的受试者的接触后的细胞施用。在一些实施例中，所述细胞是肠胃外施用的在一些实施例中，经由静脉内注射向受试者施用所述细胞。在一些实施例中，包含环状多核糖核苷酸的细胞的施用包括但不限于产前施用、新生儿施用、产后施用、口服、通过注射(例如静脉内、动脉内、腹膜内、皮内、皮下和肌肉内)、眼科施用和鼻内施用。在一些实施例中，所述递送是通过包含如本文所述细胞的医疗装置、通过包含如本文所述细胞的生物相容性基质、或来自生物反应器的如本文所述的细胞来施用如本文所述的细胞、如本文所述的多个细胞、如本文所述细胞的药物组合物、如本文所述细胞的制剂。[0347]在一些实施例中，细胞疗法的方法包括施用如本文所述的细胞、如本文所述的多个细胞、如本文所述细胞的药物组合物、如本文所述细胞的制剂、植入包含如本文所述细胞的医疗装置、植入包含如本文所述细胞的生物相容性基质、或施用来自生物反应器的如本文所述的细胞。在一些实施例中，细胞疗法的方法包括将药物组合物、细胞、多个细胞、制剂、静脉注射袋中的多个细胞、医疗装置中的多个细胞、生物相容性基质中的多个细胞、或来自如本文所述生物反应器的多个细胞施用至有需要的受试者。在一些实施例中，施用的药物组合物、多个细胞、细胞制剂、静脉注射袋中的多个细胞、医疗装置中的多个细胞、或生物相容性基质中的多个细胞包含受试者的单位剂量，例如包含105-109个细胞/kg受试者，例如106-108个细胞/kg受试者。例如，体重为50kg的目标受试者的单位剂量可以是包含5x107至2.5x1010个细胞，例如5x107至2.5x109个细胞，例如5x108至5x109个细胞的药物组合物。[0348]在一些实施例中，药物组合物、多个细胞、制剂、静脉注射袋、医疗装置或生物相容性基质包含一定剂量的例如1x105至9x1011个细胞，例如，1x105-9x105个细胞、1x106-9x106个细胞、1x107-9x107个细胞、1x108-9x108个细胞、1x109-9x109个细胞、1x1010-9x1010个细胞、1x1011-9x1011个细胞、例如5x105个细胞至4.4x1011个细胞，其中至少1％的细胞是如本文所述的细胞或分离的细胞。例如，所述多个、细胞制剂、静脉注射袋、医疗装置或生物相容性基质中至少50％的细胞、至少60％的细胞，例如50％-70％的细胞是包含如本文所述的合成的外源环状rna的细胞。在一些实施例中，所述方法包括以1x105至9x1011个细胞，例如，1x105-9x105个细胞、1x106-9x106个细胞、1x107-9x107个细胞、1x108-9x108个细胞、1x109-9x109个细胞、1x1010-9x1010个细胞、1x1011-9x1011个细胞，例如，5x105个细胞/kg至6x108个细胞/kg的剂量施用药物组合物、多个细胞或制剂。在一些实施例中，所述方法包括以多次施用或剂量施用药物组合物、多个细胞或制剂。在一些实施例中，多个(例如，两个)后续剂量间隔至少约7天、14周、28天、35天、42天或60天或更长，或其间的任何天数施用。[0349]在一些实施例中，药物组合物、多个细胞、制剂、静脉注射袋、医疗装置或生物相容性基质中的多个细胞、或来自生物反应器的多个细胞包含5x105个细胞/kg至6x108个细胞/kg的剂量。在一些实施例中，药物组合物、多个细胞、制剂、静脉注射袋、医疗装置或生物相容性基质中的多个细胞、或来自生物反应器的多个细胞包含5x105个细胞/kg至6x108个细胞/kg、5x105个细胞/kg至6x109个细胞/kg、5x104个细胞/kg至6x108个细胞/kg、5x104个细胞/kg至6x109个细胞/kg、5x105个细胞/kg至6x106个细胞/kg、5x105个细胞/kg至6x107个细胞/kg，或其间的任何范围的细胞/kg的剂量。在一些实施例中，细胞疗法的方法包括分两个后续剂量，以5x105个细胞/kg至6x108个细胞/kg的剂量施用药物组合物、多个细胞或制剂。在一些实施例中，细胞疗法的方法包括分两个后续剂量，以5x105个细胞/kg至6x108个细胞/kg、5x105个细胞/kg至6x109个细胞/kg、5x104个细胞/kg至6x108个细胞/kg、5x104个细胞/kg至6x109个细胞/kg、5x105个细胞/kg至6x106个细胞/kg、5x105个细胞/kg至6x107个细胞/kg，或其间的任何范围的细胞/kg施用药物组合物、多个细胞或制剂。在一些实施例中，两个后续剂量间隔至少约7天、14天、28天、35天、42天或60天或更长，或其间的任何天数施用。[0350]在施用后，环状多核糖核苷酸可以在细胞中持续存在。在施用后，环状多核糖核苷酸可以持续至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约12天、至少约14天、至少约16天、至少约18天、至少约20天、至少约25天、至少约30天、至少约40天、或至少约50天。在施用后，环状多核糖核苷酸可以持续1天至2天、2天至3天、3天至4天、4天至5天、5天至6天、6天至7天、7天至8天、8天至9天、9天至10天、10天至12天、12天至14天、14天至16天、16天至18天、18天至20天、20天至25天、25天至30天、30天至40天、40天至50天、1天至14天、1天至30天、7天至14天、7天至30天、或14天至30天。[0351]在一些实施例中，在施用后，至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％量的环状多核糖核苷酸在细胞中持续至少约3、4、5、6、7、8、9、10、12、14或16天的时间段。[0352]在一些实施例中，持续包括与接触后立即的多核糖核苷酸的量相比，维持至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约92％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、或至少约99％的多核糖核苷酸的量。在一些实施例中，持续包括与施用后立即的多核糖核苷酸的量相比，维持10％至15％、15％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至35％、35％至40％、40％至45％、45％至50％、50％至55％、55％至60％、60％至65％、65％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至92％、92％至94％、94％至95％、95％至96％、96％至97％、97％至98％、98％至99％、10％至30％、10％至40％、10％至50％、10％至60％、10％至70％、10％至80％、10％至90％、10％至95％、40％至50％、40％至60％、40％至70％、40％至80％、40％至90％、40％至95％、60％至80％、60％至90％、60％至95％、或60％至98％的多核糖核苷酸的量。[0353]在一些实施例中，与总多肽相比，一个或多个表达序列产生一定量的离散多肽，其中所述量是多肽摩尔数占多肽总量的百分比。多肽可以在环状多核糖核苷酸的滚环翻译过程中产生。每个离散的多肽均可以由单一表达序列产生。在一些实施例中，离散多肽的量是总多肽的至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、或至少98％(摩尔/摩尔)。在一些实施例中，离散多肽的量是总多肽的10％至15％、15％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至35％、35％至40％、40％至45％、45％至50％、50％至55％、55％至60％、60％至65％、65％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至92％、92％至94％、94％至95％、95％至96％、96％至97％、97％至98％、98％至99％、10％至30％、10％至40％、10％至50％、10％至60％、10％至70％、10％至80％、10％至90％、10％至95％、40％至50％、40％至60％、40％至70％、40％至80％、40％至90％、40％至95％、60％至80％、60％至90％、60％至95％、或60％至98％(摩尔/摩尔)。[0354]在一些实施例中，环状多核糖核苷酸包含在如本文所述细胞中比线性多核糖核苷酸对应物产生更大量表达产物的表达序列。在一些实施例中，表达产物的更大量比细胞中线性多核糖核苷酸对应物的量大至少1.5倍、至少1.6倍、至少1.7倍、至少1.8倍、至少1.9倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少4.5倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍、至少10倍、至少15倍、至少20倍或至少25倍。在一些实施例中，表达产物的更大量比细胞中线性多核糖核苷酸对应物的量大1.5倍至1.6倍、1.6倍至1.7倍、1.7倍至1.8倍、1.8倍至1.9倍、1.9倍至2倍、2倍至2.5倍、2.5倍至3倍、3倍至3.5倍、3.5倍至4倍、4倍至4.5倍、4.5倍至5倍、5倍至6倍、6倍至7倍、7倍至8倍、8倍至9倍、9倍至10倍、10倍至15倍、15倍至20倍、20倍至25倍、2倍至5倍、2倍至6倍、2倍至7倍、2倍至10倍、2倍至20倍、4倍至5倍、4倍至6倍、4倍至7倍、4倍至10倍、4倍至20倍、5倍至6倍、5倍至7倍、5倍至10倍、5倍至20倍或10倍至20倍。在一些实施例中，在接触后，更大量的表达产物在细胞中产生至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约12天、至少约14天、至少约16天、至少约18天、至少约20天、至少约25天、至少约30天、至少约40天、或至少约50天。在一些实施例中，在施用后，更大量的表达产物在细胞中产生1天至2天、2天至3天、3天至4天、4天至5天、5天至6天、6天至7天、7天至8天、8天至9天、9天至10天、10天至12天、12天至14天、14天至16天、16天至18天、18天至20天、20天至25天、25天至30天、30天至40天、40天至50天、1天至14天、1天至30天、7天至14天、7天至30天、或14天至30天。[0355]环状多核糖核苷酸可以表达一个或多个表达序列，其中所述一个或多个表达序列的表达水平在与如本文所述的细胞接触后和施用所述细胞后维持一段时间。在一些实施例中，所述表达维持在一段时间内变化不超过约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约92％、约94％、约95％、约96％、约97％、或约98％的水平。在一些实施例中，所述表达维持在一段时间内变化不超过5％至10％、10％至15％、15％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至35％、35％至40％、40％至45％、45％至50％、50％至55％、55％至60％、60％至65％、65％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至92％、92％至94％、94％至95％、95％至96％、96％至97％、97％至98％、98％至99％、10％至30％、10％至40％、10％至50％、10％至60％、10％至70％、10％至80％、10％至90％、10％至95％、40％至50％、40％至60％、40％至70％、40％至80％、40％至90％、40％至95％、60％至80％、60％至90％、60％至95％、或60％至98％的水平。在一些实施例中，在施用后，维持表达的时间段为至多1天、至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约12天、至少约14天、至少约16天、至少约18天、至少约20天、至少约25天、至少约30天、至少约40天、或至少约50天。在一些实施例中，在施用后，维持表达的时间段为1天至2天、2天至3天、3天至4天、4天至5天、5天至6天、6天至7天、7天至8天、8天至9天、9天至10天、10天至12天、12天至14天、14天至16天、16天至18天、18天至20天、20天至25天、25天至30天、30天至40天、40天至50天、1天至14天、1天至30天、7天至14天、7天至30天、或14天至30天。在一些实施例中，所述时间段在施用后1天开始。[0356]在一些实施例中，所述表达在一段时间内减少不大于约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约92％、约94％、约95％、约96％、约97％、或约98％。在一些实施例中，所述时间段是施用后的1天。在一些实施例中，所述表达在一段时间内减少不大于5％至10％、10％至15％、15％至20％、20％至25％、25％至30％、30％至35％、35％至40％、40％至45％、45％至50％、50％至55％、55％至60％、60％至65％、65％至70％、70％至75％、75％至80％、80％至85％、85％至90％、90％至92％、92％至94％、94％至95％、95％至96％、96％至97％、97％至98％、98％至99％、10％至30％、10％至40％、10％至50％、10％至60％、10％至70％、10％至80％、10％至90％、10％至95％、40％至50％、40％至60％、40％至70％、40％至80％、40％至90％、40％至95％、60％至80％、60％至90％、60％至95％、或60％至98％。在一些实施例中，所述时间段是施用后的1天。[0357]在一些实施例中，在施用后，在细胞中至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14或16天的时间段内，一个或多个表达序列在细胞中产生的表达产物比线性对应物大至少1.5倍。在一些实施例中，在施用后的至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14或16天的时间段内，一个或多个表达序列在细胞中的表达维持在变化不超过约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的水平。在一些实施例中，所述时间段在施用细胞后一天开始。在一些实施例中，所维持的表达水平是所述施用后一天的表达水平。在一些实施例中，所维持的表达水平是所述施用后一天的最高表达水平的水平。在一些实施例中，在施用后，在至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14或16天的时间段内，一个或多个表达序列在细胞中的表达减少不大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施例中，减少不大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的表达水平是所述施用后一天的表达水平。在一些实施例中，与施用后一天的最高表达水平相比，表达水平减少不大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。[0358]翻译后，蛋白质可以在细胞中检测到或作为分泌蛋白检测到。在一些实施例中，在施用后的至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、20、30、40、50、60或更多天的时间段内，在细胞中检测蛋白质。在一些实施例中，在施用后的至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、20、30、40、50、60或更多天的时间段内，在细胞表面上检测蛋白质。在一些实施例中，在至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、20、30、40、50、60或更多天的时间段内，检测分泌蛋白。在一些实施例中，在至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14、16、20、30、40、50、60或更多天的时间段内，检测分泌蛋白。在一些实施例中，所述时间段在施用表达蛋白质的细胞后一天开始。可使用本领域已知的用于蛋白质检测的任何技术来检测蛋白质，诸如通过流式细胞术。受试者[0359]有需要的受试者可以是人或非人动物。人可以是青少年、青年(18-25岁)、成人或新生儿。[0360]有需要的受试者可能患有疾病或病症。在一些实施例中，受试者患有过度增殖性疾病。在一些实施例中，受试者患有癌症。在一些实施例中，受试者患有神经退行性疾病。在一些实施例中，受试者患有代谢性疾病。在一些实施例中，受试者患有代谢性疾病。在一些实施例中，受试者患有炎性疾病。在一些实施例中，受试者患有自身免疫性疾病。在一些实施例中，受试者患有感染性疾病。在一些实施例中，受试者患有遗传性疾病。[0361]在一些实施例中，用于细胞疗法的细胞和施用所述细胞的受试者是同种异体的。在一些实施例中，用于细胞疗法的细胞和施用所述细胞的受试者是自体的。示例性细胞疗法[0362]细胞疗法可以是如本文所述的用于治疗有需要的受试者的细胞、组合物或方法的组合。示例性细胞疗法包括1x106-1x1011个人细胞(例如，t细胞)，例如，1x107至5x1010个人细胞，例如，1x108-1x109个人细胞的制剂，其用适于肠胃外施用的赋形剂配制，其中制剂中至少50％(例如，50％-70％)的细胞包含表达本文所述的嵌合抗原受体的外源环状rna，并且其中所述制剂在被配制用于肠胃外递送至人的医疗装置(诸如输液袋)中。细胞疗法进一步包括一种治疗被诊断患有癌症，例如白血病或淋巴瘤(例如，急性淋巴细胞白血病或者复发或难治性弥漫性大b细胞淋巴瘤)的人受试者的方法，其包括向受试者施用用适于肠胃外施用的赋形剂配制的自体t细胞的制剂，其中制剂中至少50％(例如，50％-70％)的细胞包含表达本文所述的嵌合抗原受体的外源环状rna，其中所述制剂以1x105至1x109个细胞/kg受试者的剂量，经由被配制用于肠胃外递送至人的医疗装置(诸如输液袋)来施用。[0363]第二种示例性细胞疗法包括1x106-1x1011个人细胞(例如，cd34 造血干细胞或hsc，例如，nk细胞)，例如，1x107至5x1010个人细胞，例如，1x108-1x109个人细胞的制剂，其用适于肠胃外施用的赋形剂配制，其中制剂中至少50％(例如，50％-70％)的细胞包含表达血红蛋白亚基β(β球蛋白或血红蛋白β链或hbb)以用于治疗地中海贫血或镰状细胞疾病，或者表达abc转运蛋白以用于治疗脑肾上腺脑白质营养不良的外源环状rna，并且其中所述制剂在被配制用于肠胃外递送至人的医疗装置(诸如输液袋)中，并且其中所述制剂以1x105至1x109个细胞/kg受试者的剂量，经由被配制用于肠胃外递送至人的医疗装置(诸如输液袋)来施用。[0364]另一种示例性细胞疗法包括1x106-1x1011个人细胞(例如，cd34 造血干细胞或hsc，例如，nk细胞)，例如，1x107至5x1010个人细胞，例如，1x108-1x109个人细胞的制剂，其用适于肠胃外施用的赋形剂配制，其中制剂中至少50％(例如，50％-70％)的细胞包含表达(a)血红蛋白亚基β(β球蛋白或血红蛋白β链或hbb)以用于治疗地中海贫血或镰状细胞疾病，或(b)abc转运蛋白以用于治疗脑肾上腺脑白质营养不良，或(c)腺苷脱氨酶(ada)以用于治疗ada-scid，或(d)was蛋白以用于治疗wiskott-aldrich，或(e)cybb蛋白以用于治疗x连锁慢性肉芽肿病或(f)arsa以用于治疗异染性脑白质营养不良，或(g)α-l-艾杜糖苷酶以用于治疗mps-i，或(h)n-磺基葡萄糖胺磺基水解酶以用于治疗mps-iiia或(i)n-乙酰-α-氨基葡萄糖苷酶以用于治疗mps-iiib的外源环状rna，并且其中所述制剂在被配制用于肠胃外递送至人的医疗装置(诸如输液袋)中，并且其中所述制剂以1x105至1x109个细胞/kg受试者的剂量，经由被配制用于肠胃外递送至人的医疗装置(诸如输液袋)来施用。在一些实施例中，所述剂量是iv剂量，例如，例如100-500万个细胞的单次iv剂量。[0365]本文引用的所有参考文献和出版物特此通过援引并入。上述实施例可以组合以实现上述功能特征。编号的实施例#1[1]一种包含环状多核糖核苷酸的细胞，其中所述环状多核糖核苷酸包含至少一个编码治疗性蛋白质的表达序列。[2]一种包含治疗性蛋白质和环状多核糖核苷酸的细胞，其中所述环状多核糖核苷酸包含至少一个编码所述治疗性蛋白质的表达序列。[3]一种包含蛋白质和环状多核糖核苷酸的治疗性细胞，其中所述环状多核糖核苷酸包含至少一个编码赋予所述细胞至少一种治疗特征的蛋白质的表达序列。[4]一种包含环状多核糖核苷酸的治疗性细胞，其中所述环状多核糖核苷酸包含至少一个赋予所述细胞至少一种治疗特征的结合位点。[5]一种包含环状多核糖核苷酸的治疗性细胞，其中所述环状多核糖核苷酸包含至少一个赋予所述细胞至少一种治疗特征的结合位点。[6]如前述实施例中任一项所述的细胞，其中所述细胞是治疗性细胞。[7]如前述实施例中任一项所述的细胞或治疗性细胞，其中所述细胞是离体细胞。[8]如前述实施例中任一项所述的细胞或治疗性细胞，其中所述细胞是真核细胞。[9]如前述实施例中任一项所述的细胞或治疗性细胞，其中所述细胞是动物细胞。[10]如前述实施例中任一项所述的细胞或治疗性细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。[11]如前述实施例中任一项所述的细胞或治疗性细胞，其中所述细胞是人细胞。[12]如前述实施例中任一项所述的细胞或治疗性细胞，其中所述细胞是免疫细胞、癌细胞、祖细胞或干细胞。[13]如前述实施例中任一项所述的细胞或治疗性细胞，其中所述细胞是外周血单核细胞。[14]如前述实施例中任一项所述的细胞或治疗性细胞，其中所述细胞是淋巴细胞。[15]如前述实施例中任一项所述的细胞或治疗性细胞，其中所述细胞是外周血淋巴细胞。[16]如前述实施例中任一项所述的细胞或治疗性细胞，其中所述细胞选自由以下组成的组：t细胞、b细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤t细胞、巨噬细胞、树突细胞、红细胞、网织红细胞、髓系祖细胞和巨核细胞。[17]如前述实施例中任一项所述的细胞或治疗性细胞，其中所述细胞选自由以下组成的组：间充质干细胞、胚胎干细胞、胎儿干细胞、胎盘来源的干细胞、诱导多能干细胞、脂肪干细胞、造血干细胞、皮肤干细胞、成体干细胞、骨髓干细胞、脐带血干细胞、脐带干细胞、角膜缘干细胞、祖干细胞和神经干细胞。[18]如前述实施例中任一项所述的细胞或治疗性细胞，其中所述细胞是成纤维细胞。[19]如前述实施例中任一项所述的细胞或治疗性细胞，其中所述细胞是软骨细胞。[20]如前述实施例中任一项所述的细胞或治疗性细胞，其中所述蛋白质是治疗性蛋白质。[21]如前述实施例中任一项所述的细胞或治疗性细胞，其中所述蛋白质是促进细胞扩增、细胞永生化和/或细胞对靶的定位的蛋白质。[22]如前述实施例中任一项所述的细胞或治疗性细胞，其中所述蛋白质或所述治疗性蛋白质是细胞内蛋白、膜蛋白或分泌蛋白。[23]如前述实施例中任一项所述的细胞或治疗性细胞，其中所述蛋白质或所述治疗性蛋白质具有抗氧化活性、结合活性、运货受体活性、催化活性、分子载体活性、分子功能调节物、分子换能器活性、营养储库活性、蛋白质标签、结构分子活性、毒素活性、转录调节物活性、翻译调节物活性或转运蛋白活性。[24]如前述实施例中任一项所述的细胞或治疗性细胞，其中所述治疗性蛋白质是嵌合抗原受体。[25]如前述实施例中任一项所述的细胞或治疗性细胞，其中嵌合抗原受体是cd19特异性嵌合抗原受体、taa特异性嵌合抗原受体、bcma特异性嵌合抗原受体、her2特异性嵌合抗原受体、cd2特异性嵌合抗原受体、ny-eso-1特异性嵌合抗原受体、cd20特异性嵌合抗原受体、间皮细胞特异性嵌合抗原受体、ebv特异性嵌合抗原受体、或cd33特异性嵌合抗原受体。[26]如前述实施例中任一项所述的细胞或治疗性细胞，其中所述治疗性蛋白质是表皮生长因子、促红细胞生成素或苯丙氨酸羟化酶。[27]如前述实施例中任一项所述的细胞或治疗性细胞，其中所述蛋白质或所述治疗性蛋白质特异性结合抗原。[28]如前述实施例中任一项所述的细胞或治疗性细胞，其中在至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14或16天的时间段内，在细胞中检测蛋白质或治疗性蛋白质。[29]如前述实施例中任一项所述的细胞或治疗性细胞，其中在至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14或16天的时间段内，在细胞表面上检测蛋白质或治疗性蛋白质。[30]如前述实施例中任一项所述的细胞或治疗性细胞，其中蛋白质或治疗性蛋白质是在至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14或16天的时间段内检测到的分泌蛋白。[31]如前述实施例中任一项所述的细胞或治疗性细胞，其中所述至少一个结合位点是适配体。[32]如前述实施例中任一项所述的细胞或治疗性细胞，其中所述至少一个结合位点与所述细胞表面上的细胞受体结合。[33]如前述实施例中任一项所述的细胞或治疗性细胞，其中当所述至少一个结合位点与所述细胞表面上的细胞受体结合时，所述环状多核糖核苷酸被内化到所述细胞中。[34]如前述实施例中任一项所述的细胞或治疗性细胞，其中所述环状多核糖核苷酸包含至少一个编码治疗性蛋白质的表达序列和至少一个结合位点。[35]如前述实施例中任一项所述的细胞或治疗性细胞，其中所述环状多核糖核苷酸能够滚环翻译，并且缺少终止元件。[36]如前述实施例中任一项所述的细胞或治疗性细胞，其中所述环状多核糖核苷酸进一步在这些表达序列中的至少一个的3’端处包含交错元件，并且缺少终止元件。[37]如实施例[36]所述的细胞或治疗性细胞，其中所述交错元件在所述环状多核糖核苷酸的滚环翻译过程中使核糖体停滞。[38]如实施例[36]或[37]所述的细胞或治疗性细胞，其中所述交错元件编码具有c末端共有序列为d(v/i)exnpgp的序列，其中x＝任何氨基酸。[39]如前述实施例中任一项所述的细胞或治疗性细胞，其中所述环状多核糖核苷酸缺少帽、内部核糖体进入位点、聚a尾、复制元件或两者。[40]如前述实施例中任一项所述的细胞或治疗性细胞，其中所述一个或多个表达序列包含科扎克起始序列。[41]如前述实施例中任一项所述的细胞或治疗性细胞，其中所述环状多核糖核苷酸进一步包含选自以下的至少一种结构元件：(a)加密原；(b)调控元件；(c)复制元件；以及(d)准双链二级结构。[42]如前述实施例中任一项所述的细胞或治疗性细胞，其中所述环状多核糖核苷酸包含至少一种选自以下的功能特征：(i)高于线性对应物的翻译效率；(ii)多种翻译产物的化学计量翻译效率；(iii)低于缺少加密原的对应物的免疫原性；(iv)相比线性对应物增加的半衰期；以及(v)细胞分裂过程中的持续性。[43]如实施例[33]-[42]中任一项所述的细胞或治疗性细胞，其中所述终止元件包含终止密码子。[44]如前述实施例中任一项所述的细胞或治疗性细胞，其中所述环状多核糖核苷酸进一步包含被配置为介导所述环状多核糖核苷酸的自我复制的复制结构域。[45]如前述实施例中任一项所述的细胞或治疗性细胞，其中所述环状多核糖核苷酸在细胞分裂过程中持续。[46]如前述实施例中任一项所述的细胞或治疗性细胞，其中至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％量的环状多核糖核苷酸在细胞中持续至少约3、4、5、6、7、8、9、10、12、14或16天的时间段。[47]如前述实施例中任一项所述的细胞或治疗性细胞，其中表达所述一个或多个表达序列生成所述环状多核糖核苷酸的滚环翻译期间生成的总多肽(摩尔/摩尔)中的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％离散多肽，并且其中这些离散多肽中的每一个都是由单个表达序列生成。[48]如前述实施例中任一项所述的细胞或治疗性细胞，其中在所述细胞中至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14或16天的时间段内，所述一个或多个表达序列在所述细胞中产生的表达产物比线性对应物大至少1.5倍。[49]如前述实施例中任一项所述的细胞或治疗性细胞，其中在至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14或16天的时间段内，一个或多个表达序列在细胞中的表达维持在变化不超过约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的水平。[50]如前述实施例中任一项所述的细胞或治疗性细胞，其中在至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14或16天的时间段内，一个或多个表达序列在细胞中的表达减少不大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。[51]一种药物组合物，其包含：如前述实施例中任一项所述的细胞或治疗性细胞；以及药学上可接受的载体或赋形剂。[52]一种细胞疗法的方法，其包括将如前述实施例中任一项所述的细胞或治疗性细胞或者如实施例[48]所述的药物组合物施用至有需要的受试者。[53]一种细胞疗法的方法，其包括：提供包含一个或多个表达序列、至少一个结合位点、或其组合的环状多核糖核苷酸，并且使所述环状多核糖核苷酸与离体细胞接触。[54]一种治疗有需要的受试者的方法，其包括：提供细胞，并且使所述离体细胞与包含一个或多个表达序列、至少一个结合位点、或其组合的环状多核糖核苷酸接触，其中所述一个或多个表达序列的表达产物包含用于治疗所述受试者的蛋白质。[55]一种治疗方法，其包括：提供细胞；并且使所述离体细胞与包含一个或多个表达序列、至少一个结合位点、或其组合的环状多核糖核苷酸接触，其中所述一个或多个表达序列中的至少一个编码用于治疗有需要的受试者的蛋白质。[56]如前述实施例中任一项所述的方法进一步包括在与有需要的受试者接触后施用所述细胞。[57]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述接触进一步包括所述细胞内化所述环状多核糖核苷酸。[58]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述接触包括使用阳离子脂质、电穿孔(例如，使用流动电穿孔装置)、裸环状rna、适配体、阳离子聚合物(例如，pei、聚芳烃、deae-葡聚糖)、病毒样颗粒(例如，来自hpv的l1、来自多瘤病毒的vp1)、外来体；纳米结构的磷酸钙；肽转导结构域(例如，tat、polyr、sp、pvec、synb1等)；囊泡(例如，vsv-g、tamel)；外来体；细胞挤压；纳米颗粒；磁转染、或其任何组合。[59]如前述实施例中任一项所述的方法，其中与标准化的未接触细胞相比，所述接触后所述细胞的生存力为至少40％。[60]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述有需要的受试者患有疾病或病症。[61]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述有需要的受试者患有过度增殖性疾病。[62]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述有需要的受试者患有癌症。[63]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述有需要的受试者患有神经退行性疾病。[64]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述有需要的受试者患有代谢性疾病。[65]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述有需要的受试者患有炎性疾病。[66]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述有需要的受试者患有自身免疫性疾病。[67]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述有需要的受试者患有感染性疾病。[68]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述有需要的受试者患有遗传性疾病。[69]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述环状多核糖核苷酸在细胞分裂过程中持续。[70]如前述实施例中任一项所述的方法，其中在所述接触后，至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％量的所述环状多核糖核苷酸在所述细胞中持续至少约3、4、5、6、7、8、9、10、12、14或16天。[71]如前述实施例中任一项所述的方法，其中在所述施用后，至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％量的所述环状多核糖核苷酸在所述细胞中持续至少约3、4、5、6、7、8、9、10、12、14或16天。[72]如前述实施例中任一项所述的方法，其中表达所述一个或多个表达序列生成所述环状多核糖核苷酸的滚环翻译期间生成的总多肽(摩尔/摩尔)中的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％离散多肽，并且其中这些离散多肽中的每一个都是由单个表达序列生成。[73]如前述实施例中任一项所述的方法，其中在所述接触后的至少第3、4、5、6、7、8、9、10、12、14或16天，所述一个或多个表达序列在所述细胞中产生的表达产物比线性对应物大至少1.5倍。[74]如前述实施例中任一项所述的方法，其中在所述施用后的至少第3、4、5、6、7、8、9、10、12、14或16天，所述一个或多个表达序列在所述细胞中产生的表达产物比线性对应物大至少1.5倍。[75]如前述实施例中任一项所述的方法，其中在至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14或16天内，所述一个或多个表达序列在所述细胞中的表达维持在变化不超过约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的水平。[76]如实施例69所述的方法，其中变化不超过约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的水平是在所述施用后1天所述一个或多个表达序列的表达水平。[77]如实施例69所述的方法，其中变化不超过约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的水平是在所述接触后1天所述一个或多个表达序列的表达水平。[78]如前述实施例中任一项所述的方法，其中在至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14或16天的时间段内，所述一个或多个表达序列在所述细胞中的表达减少不大于约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。[79]如实施例[78]所述的方法，其中至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14或16天的时间段在所述接触后1天开始。[80]如实施例[78]所述的方法，其中至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14或16天的时间段在所述施用后1天开始。[81]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述细胞是治疗性细胞。[82]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述细胞是真核细胞。[83]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述细胞是动物细胞。[84]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。[85]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述细胞是人细胞。[86]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述细胞是免疫细胞、癌细胞、祖细胞或干细胞。[87]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述细胞是外周血单核细胞。[88]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述细胞是淋巴细胞。[89]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述细胞是外周血淋巴细胞。[90]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述细胞选自由以下组成的组：t细胞、b细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤t细胞、巨噬细胞、树突细胞、巨核细胞、红细胞、网织红细胞和髓系祖细胞。[91]如前述实施例中任一项所述的方法或如前述实施例中任一项所述的细胞，其中所述细胞选自由以下组成的组：间充质干细胞、胚胎干细胞、胎儿干细胞、胎盘来源的干细胞、诱导多能干细胞、脂肪干细胞、造血干细胞(例如，cd34 细胞)、皮肤干细胞、成体干细胞、骨髓干细胞、脐带血干细胞、脐带干细胞、角膜缘干细胞、祖干细胞和神经干细胞。[92]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述细胞是成纤维细胞。[93]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述细胞是软骨细胞。[94]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述细胞对受试者是自体的。[95]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述细胞对受试者是同种异体的。[96]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述一个或多个表达序列的表达产物包含治疗性蛋白质或赋予所述细胞治疗特征的蛋白质。[97]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述蛋白质促进细胞扩增、细胞永生化和/或细胞对靶的定位。[98]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述蛋白质或所述治疗性蛋白质是细胞内蛋白、膜蛋白或分泌蛋白。[99]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述蛋白质或所述治疗性蛋白质具有抗氧化活性、结合活性、运货受体活性、催化活性、分子载体活性、分子功能调节物、分子换能器活性、营养储库活性、蛋白质标签、结构分子活性、毒素活性、转录调节物活性、翻译调节物活性或转运蛋白活性。[100]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述治疗性蛋白质是嵌合抗原受体。[101]如前述实施例中任一项所述的方法或如前述实施例中任一项所述的细胞，其中所述嵌合抗原受体是cd19特异性嵌合抗原受体、taa特异性嵌合抗原受体、bcma特异性嵌合抗原受体、her2特异性嵌合抗原受体、cd2特异性嵌合抗原受体、ny-eso-1特异性嵌合抗原受体、cd20特异性嵌合抗原受体、间皮细胞特异性嵌合抗原受体、ebv特异性嵌合抗原受体、或cd33特异性嵌合抗原受体。[102]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述治疗性蛋白质是促红细胞生成素、表皮生长因子、苯丙氨酸羟化酶或嵌合抗原受体。[103]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述蛋白质或治疗性蛋白质特异性结合抗原。[104]如前述实施例中任一项所述的方法，其中在所述接触后的至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14或16天的时间段内，在所述细胞中检测所述蛋白质或所述治疗性蛋白质。[105]如前述实施例中任一项所述的方法，其中在所述接触后的至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14或16天的时间段内，在所述细胞表面上检测所述蛋白质或所述治疗性蛋白质。[106]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述蛋白质或所述治疗性蛋白质是在所述接触后的至少3、4、5、6、7、8、9、10、12、14或16天的时间段内检测到的分泌蛋白。[107]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述至少一个结合位点是适配体。[108]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述至少一个结合位点与所述细胞表面上的细胞受体结合。[109]如前述实施例中任一项所述的方法，其中当所述至少一个结合位点与所述细胞表面上的细胞受体结合时，所述环状多核糖核苷酸被内化到所述细胞中。[110]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述环状多核糖核苷酸能够滚环翻译，并且缺少终止元件。[111]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述环状多核糖核苷酸进一步在这些表达序列中的至少一个的3’端处包含交错元件，并且缺少终止元件。[112]如实施例[111]所述的方法，其中所述交错元件在所述环状多核糖核苷酸的滚环翻译过程中使核糖体停滞。[113]如实施例[111]或[112]所述的方法，其中所述交错元件编码具有c末端共有序列为d(v/i)exnpgp的序列，其中x＝任何氨基酸。[114]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述环状多核糖核苷酸缺少内部核糖体进入位点。[115]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述一个或多个表达序列包含科扎克起始序列。[116]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述环状多核糖核苷酸进一步包含选自以下的至少一种结构元件：(a)加密原；(b)调控元件；(c)复制元件；以及(d)准双链二级结构。[117]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述环状多核糖核苷酸包含至少一种选自以下的功能特征：(i)高于线性对应物的翻译效率；(ii)多种翻译产物的化学计量翻译效率；(iii)低于缺少加密原的对应物的免疫原性；(iv)相比线性对应物增加的半衰期；以及(v)细胞分裂过程中的持续性。[118]如实施例[110]-[117]中任一项所述的方法，其中所述终止元件包含终止密码子。[119]如前述实施例中任一项所述的方法，其中所述环状多核糖核苷酸进一步包含被配置为介导所述环状多核糖核苷酸的自我复制的复制结构域编号的实施例#2[1]一种药物组合物，其包含：a)药学上可接受的载体或赋形剂；以及b)包含环状多核糖核苷酸的细胞，其中所述环状多核糖核苷酸(1)包含至少一个结合位点，(2)编码蛋白质，其中所述蛋白质是分泌蛋白或细胞内蛋白，或(3)(1)和(2)的组合。[2]一种药物组合物，其包含：a)药学上可接受的载体或赋形剂；以及b)包含环状多核糖核苷酸的细胞，其中所述环状多核糖核苷酸(1)包含至少一个结合位点，(2)编码膜蛋白，或(3)(1)和(2)的组合，其中所述膜蛋白不是嵌合抗原受体、t细胞受体或t细胞受体融合蛋白，或者所述细胞不是免疫细胞。[3]一种药物组合物，其包含：a)药学上可接受的载体或赋形剂；以及b)包含环状多核糖核苷酸的细胞，其中所述环状多核糖核苷酸包含至少一个结合位点并编码蛋白质，其中所述蛋白质是分泌蛋白、膜蛋白或细胞内蛋白。[4]一种包含环状多核糖核苷酸的分离的细胞，其中所述环状多核糖核苷酸(1)包含至少一个结合位点，(2)编码蛋白质，其中所述蛋白质是分泌蛋白或细胞内蛋白，或(3)(1)和(2)的组合，并且其中所述分离的细胞被施用至受试者[5]一种包含环状多核糖核苷酸的分离的细胞或制剂，其中所述环状多核糖核苷酸(1)包含至少一个结合位点，(2)编码膜蛋白，或(3)(1)和(2)的组合，其中所述膜蛋白不是嵌合抗原受体、t细胞受体或t细胞受体融合蛋白，或者所述分离的细胞不是免疫细胞，并且其中所述分离的细胞被施用至受试者。[6]一种包含环状多核糖核苷酸的分离的细胞，其中所述环状多核糖核苷酸包含至少一个结合位点并编码蛋白质，其中所述蛋白质是分泌蛋白、膜蛋白或细胞内蛋白，并且其中所述分离的细胞被施用至受试者。[7]如实施例[1]所述的药物组合物或如实施例[4]所述的分离的细胞，其中所述蛋白质是膜蛋白，并且所述细胞是非免疫细胞。[8]如前述实施例中任一项所述的药物组合物或分离的细胞，其中所述细胞内蛋白、膜蛋白或分泌蛋白是治疗性蛋白质。[9]如前述实施例中任一项所述的药物组合物或分离的细胞，其中所述膜蛋白是跨膜蛋白。[10]如前述实施例中任一项所述的药物组合物或分离的细胞，其中所述膜蛋白是细胞外基质蛋白。[11]如前述实施例中任一项所述的药物组合物或分离的细胞，其中所述细胞内蛋白、膜蛋白或分泌蛋白促进细胞扩增、细胞分化、细胞永生化和/或所述细胞对靶的定位。[12]如前述实施例中任一项所述的药物组合物或分离的细胞，其中所述细胞内蛋白、膜蛋白或分泌蛋白具有抗氧化活性、结合活性、运货受体活性、催化活性、分子载体活性、分子换能器活性、营养储库活性、结构分子活性、毒素活性、转录调节物活性、翻译调节物活性、耐受性活性、或转运蛋白活性。[13]如前述实施例中任一项所述的药物组合物或分离的细胞，其中所述细胞内蛋白、膜蛋白或分泌蛋白起蛋白质标签的作用。[14]如前述实施例中任一项所述的药物组合物或分离的细胞，其中所述细胞内蛋白、膜蛋白或分泌蛋白是分子功能调节物。[15]如前述实施例中任一项所述的药物组合物或分离的细胞，其中所述细胞内蛋白、膜蛋白或分泌蛋白是耐受性因子(例如，hla-g、pd-l1、cd47或cd24)。[16]如前述实施例中任一项所述的药物组合物或分离的细胞，其中所述细胞内蛋白、膜蛋白或分泌蛋白是表皮生长因子、促红细胞生成素、苯丙氨酸羟化酶、嵌合抗原受体、核酸酶、锌指核酸酶蛋白、转录激活因子样效应核酸酶或cas蛋白。[17]如前述实施例中任一项所述的药物组合物或分离的细胞，其中所述至少一个结合位点赋予所述细胞至少一种治疗特征。[18]如前述实施例中任一项所述的药物组合物或分离的细胞，其中所述至少一个结合位点赋予所述细胞或分离的细胞核酸定位。[19]如前述实施例中任一项所述的药物组合物或分离的细胞，其中所述至少一个结合位点是适配体。[20]如前述实施例中任一项所述的药物组合物或分离的细胞，其中所述至少一个结合位点是蛋白结合位点、dna结合位点或rna结合位点。[21]如前述实施例中任一项所述的药物组合物或分离的细胞，其中所述至少一个结合位点是mirna结合位点。[22]如前述实施例中任一项所述的药物组合物或分离的细胞，其中所述至少一个结合位点与所述细胞表面上的细胞受体结合。[23]如前述实施例中任一项所述的药物组合物或分离的细胞，其中在所述至少一个结合位点与所述细胞表面上的细胞受体结合后，所述环状多核糖核苷酸被内化到所述细胞中。[24]如前述实施例中任一项所述的药物组合物或分离的细胞，其中所述细胞或分离的细胞是真核细胞、动物细胞、哺乳动物细胞或人细胞。[25]如前述实施例中任一项所述的药物组合物或分离的细胞，其中所述细胞或分离的细胞是免疫细胞、祖细胞、干细胞、神经细胞、心脏细胞、脂肪细胞、肝细胞或β细胞。[26]如前述实施例中任一项所述的药物组合物或分离的细胞，其中所述细胞或分离的细胞是外周血单核细胞、外周血淋巴细胞或淋巴细胞。[27]如前述实施例中任一项所述的药物组合物或分离的细胞，其中所述细胞或分离的细胞选自由以下组成的组：t细胞(例如，调节性t细胞、γδt细胞、αβt细胞、cd8 t细胞或cd4 t细胞)、b细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤t细胞、巨噬细胞、树突细胞、红细胞、网织红细胞、髓系祖细胞和巨核细胞。[28]如前述实施例中任一项所述的药物组合物或分离的细胞，其中所述细胞或分离的细胞选自由以下组成的组：间充质干细胞、胚胎干细胞、胎儿干细胞、胎盘来源的干细胞、诱导多能干细胞、脂肪干细胞、造血干细胞(例如cd34 细胞)、皮肤干细胞、成体干细胞、骨髓干细胞、脐带血干细胞、脐带干细胞、角膜缘干细胞、祖干细胞和神经干细胞。[29]如前述实施例中任一项所述的药物组合物或分离的细胞，其中所述细胞或分离的细胞选自由以下组成的组：成纤维细胞、软骨细胞、心肌细胞、多巴胺能神经元、小胶质细胞、少突胶质细胞、肠神经元和肝细胞。[30]如前述实施例中任一项所述的药物组合物或分离的细胞，其中所述细胞或分离的细胞是非复制型的。[31]如前述实施例中任一项所述的包含多个细胞的药物组合物，其中所述多个是5x105个细胞至1x107个细胞。[32]如前述实施例中任一项所述的包含如前述实施例中任一项所述的多个分离的细胞(例如，包含多个所述分离的细胞的制剂)的药物组合物，其中所述多个是5x105个细胞至1x107个细胞。[33]如前述实施例中任一项所述的包含多个细胞或分离的细胞的药物组合物，其中所述多个是12.5x105个细胞至4.4x1011个细胞。[34]如前述实施例中任一项所述的包含如前述实施例中任一项所述的多个分离的细胞的药物组合物，其中所述多个是12.5x105个细胞至4.4x1011个细胞。[35]如前述实施例中任一项所述的药物组合物，其用于施用(例如，通过静脉内施用)至受试者。[36]如前述实施例中任一项所述的药物组合物或分离的细胞，其中所述受试者是人或非人动物。[37]如前述实施例中任一项所述的药物组合物或分离的细胞，其中所述受试者患有疾病或病症。[38]如前述实施例中任一项所述的药物组合物或分离的细胞，其中所述受试者患有过度增殖性疾病、癌症、神经退行性疾病、代谢性疾病、炎性疾病、自身免疫性疾病、感染性疾病或遗传性疾病。[39]如前述实施例中任一项所述的药物组合物或分离的细胞，其中所述受试者和所述细胞或分离的细胞是同种异体的或自体的。[40]如前述实施例中任一项所述的药物组合物或分离的细胞，其中所述环状多核糖核苷酸缺少帽、内部核糖体进入位点、聚a尾、复制元件或其组合。[41]如前述实施例中任一项所述的分离的细胞，其用药学上可接受的赋形剂(例如稀释剂)配制。[42]一种包含细胞的药物组合物，其中所述细胞包含环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含编码抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域的序列，并且包含至少一个结合位点。[43]一种包含环状多核糖核苷酸的分离的细胞，所述环状多核糖核苷酸包含编码嵌合抗原受体的序列并包含至少一个结合位点，其中所述分离的细胞用于施用(例如，静脉内施用)至受试者。[44]一种细胞，其包含：a)环状多核糖核苷酸，所述环状多核糖核苷酸包含i)至少一个编码与抗原结合的抗原结合蛋白的靶结合序列，或ii)编码抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域的序列，并且任选地包含至少一个结合位点；以及b)编码蛋白质的第二核苷酸序列，其中所述蛋白质的表达在抗原与抗原结合蛋白结合时被激活。[45]一种细胞，其包含编码对抗原具有亲和力的t细胞受体(tcr)的环状多核糖核苷酸和编码双特异性抗体的环状多核糖核苷酸，其中所述细胞在所述细胞表面上表达所述tcr和双特异性抗体。[46]如实施例[43]所述的分离的细胞，其中所述嵌合抗原受体包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。[47]如实施例[44]所述的细胞，其中所述抗原结合蛋白包含抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。[48]如实施例[42]所述的药物组合物、如实施例[46]所述的分离的细胞，或如实施例[44]或[47]所述的细胞，其中所述抗原结合结构域连接至所述跨膜结构域，所述跨膜结构域连接至所述细胞内信号传导结构域以产生嵌合抗原受体。[49]如实施例[42]或[48]所述的药物组合物、如实施例[46]或[48]所述的分离的细胞，或如实施例[44]或[47]-[48]所述的细胞，其中所述抗原结合结构域与肿瘤抗原、耐受原或病原体抗原结合，或者所述抗原是肿瘤抗原或病原体抗原。[50]如实施例[42]或[48]-[49]中任一项所述的药物组合物、如实施例[46]或[48]-[49]中任一项所述的分离的细胞，或如实施例[44]或[47]-[49]所述的细胞，其中所述抗原结合结构域是抗体或其抗体片段(例如，scfv、fv、fab)。[51]如实施例[42]或[48]-[50]中任一项所述的药物组合物、如实施例[46]或[48]-[50]中任一项所述的分离的细胞，或如实施例[44]或[47]-[50]所述的细胞，其中所述抗原结合结构域是双特异性抗体。[52]如实施例[45]所述的细胞或如实施例[51]所述的药物组合物、细胞或分离的细胞，其中所述双特异性抗体具有结合第一表位的第一免疫球蛋白可变结构域和结合第二表位的第二免疫球蛋白可变结构域。[53]如实施例[52]所述的药物组合物、细胞或分离的细胞，其中所述第一表位和所述第二表位是相同的。[54]如实施例[52]所述的药物组合物、细胞或分离的细胞，其中所述第一表位和所述第二表位是不同的。[55]如实施例[42]或[48]-[54]中任一项所述的药物组合物、如实施例[46]或[48]-[54]中任一项所述的分离的细胞，或如实施例[44]或[47]-[54]所述的细胞，其中所述跨膜结构域连接所述抗原结合结构域和所述细胞内信号传导结构域。[56]如实施例[42]或[48]-[55]中任一项所述的药物组合物、如实施例[46]或[48]-[55]中任一项所述的分离的细胞，或如实施例[44]或[47]-[55]所述的细胞，其中所述跨膜结构域是铰链蛋白(例如，免疫球蛋白铰链)、多肽接头(例如，gs接头)、kir2ds2铰链、cd8a铰链或间隔子。[57]如实施例[42]或[48]-[56]中任一项所述的药物组合物、如实施例[46]或[48]-[56]中任一项所述的分离的细胞，或如实施例[44]或[47]-[56]所述的细胞，其中所述细胞内信号传导结构域包含t细胞信号传导分子中的至少一部分。[58]如实施例[42]或[48]-[57]中任一项所述的药物组合物、如实施例[46]或[48]-[57]中任一项所述的分离的细胞，或如实施例[44]或[47]-[57]所述的细胞，其中所述细胞内信号传导结构域包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序。[59]如实施例[42]或[48]-[58]中任一项所述的药物组合物、如实施例[46]或[48]-[58]中任一项所述的分离的细胞，或如实施例[44]或[47]-[58]所述的细胞，其中所述细胞内信号传导结构域包含cd3ζ、普通fcrγ(fcer1g)、fcγriia、fcrβ(fcεrib)、cd3γ、cd3δ、cd3ε、cd79a、cd79b、dap10、dap12、或其任何组合的至少一部分。[60]如实施例[42]或[48]-[59]中任一项所述的药物组合物、如实施例[46]或[48]-[59]中任一项所述的分离的细胞，或如实施例[44]或[47]-[59]所述的细胞，其中所述细胞内信号传导结构域进一步包含共刺激细胞内信号传导结构域。[61]如实施例[60]中任一项所述的药物组合物、细胞或分离的细胞，其中所述共刺激细胞内信号传导结构域包含tnf受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整合素、信号传导淋巴细胞活化分子或活化nk细胞受体蛋白中的至少一种或多种。[62]如实施例[60]或[61]所述的药物组合物、细胞或分离的细胞，其中所述共刺激细胞内信号传导结构域包含cd27、cd28、4-1bb、ox40、gitr、cd30、cd40、pd-1、icos、baffr、hvem、icam-1、lfa-1、cd2、cds、cd7、cd287、light、nkg2c、nkg2d、slamf7、nkp80、nkp30、nkp44、nkp46、cd160、cd19、cd4、cd8α、cd8β、il2rβ、il2rγ、il7rα、itga4、vla1、cd49a、ia4、cd49d、itga6、vla6、cd49f、itgad、cd103、itgal、itgam、itgax、itgb1、cd29、itgb2、cd18、itgb7、tnfr2、trance/trankl、cd226、slamf4、cd84、cd96、ceacam1、crtam、cd229、cd160、psgl1、cd100、cd69、slamf6、slamf1、slamf8、cd162、ltbr、lat、gads、slp-76、pag/cbp、cd19a、b7-h3或与cd83结合的配体thab中的至少一种或多种。[63]如实施例[42]-[62]中任一项所述的药物组合物、细胞、或分离的细胞，其中所述环状多核糖核苷酸缺少帽、内部核糖体进入位点、聚a尾、复制元件或其组合。[64]如实施例[42]-[63]中任一项所述的药物组合物、细胞或分离的细胞，其中所述细胞是免疫效应细胞。[65]如实施例[42]-[64]中任一项所述的药物组合物、细胞或分离的细胞，其中所述细胞或分离的细胞是t细胞(例如，αβt细胞或γδt细胞)或nk细胞。[66]如实施例[42]-[65]中任一项所述的药物组合物、细胞或分离的细胞，其中所述细胞或分离的细胞是同种异体细胞或自体细胞。[67]如实施例[44]、[45]或[47]-[66]中任一项所述的细胞，其中所述抗原表达自肿瘤或癌症。[68]如实施例[44]或[47]-[67]中任一项所述的细胞，其中所述蛋白质是细胞因子(例如，il-12)或共刺激配体(例如，cd40l或4-1bbl)。[69]如实施例[44]或[47]-[68]中任一项所述的细胞，其中所述蛋白质是分泌蛋白。[70]一种5x105个细胞至4.4x1011个细胞的制剂，其被配置用于递送(例如，通过注射或输注)至受试者，其中所述5x105个细胞至4.4x1011个细胞的细胞是如前述实施例中任一项所述的细胞或分离的细胞；其中所述制剂任选地呈单位剂量形式。[71]一种静脉注射袋或输注产品，其包含被配置用于递送(例如通过注射或输注)至受试者的多个细胞的悬浮液，其中所述多个中的细胞是如前述实施例中任一项所述的细胞或分离的细胞。[72]一种包含多个细胞的医疗装置，其中所述多个中的细胞是如前述实施例中任一项所述的细胞或分离的细胞，并且其中所述医疗装置被配置用于植入受试者。[73]一种包含多个细胞的生物相容性基质，其中所述多个中的细胞是如前述实施例中任一项所述的细胞或分离的细胞，并且其中所述生物相容性基质被配置用于植入受试者。[74]一种包含多个细胞的生物反应器，其中所述多个中的细胞是如前述实施例中任一项所述的细胞或分离的细胞。[75]如前述实施例中任一项所述的生物反应器，其中所述生物反应器包括2d细胞培养物。[76]如前述实施例中任一项所述的生物反应器，其中所述生物反应器包括3d细胞培养物。[77]如实施例[72]所述的医疗装置或如实施例[73]所述的生物相容性基质，其被配置为在植入所述受试者时产生并释放所述多个细胞。[78]如实施例[72]所述的医疗装置或如实施例[73]所述的生物相容性基质，其被配置为在植入所述受试者时产生并释放所述蛋白质(例如，分泌蛋白或可裂解蛋白)。[79]如实施例[70]-[73]或[77]-[78]中任一项所述的制剂、静脉注射袋、医疗装置或生物相容性基质，其中所述受试者是人或非人动物。[80]如实施例[70]-[79]中任一项所述的制剂、静脉注射袋、医疗装置、生物相容性基质或生物反应器，其中所述多个细胞用药学上可接受的载体或赋形剂配制。[81]一种产生细胞或多个细胞的方法，其包括：提供分离的细胞或多个分离的细胞；提供如前述实施例中任一项所述的环状多核糖核苷酸，并且使所述环状多核糖核苷酸与所述分离的细胞或多个分离的细胞接触。[82]如前述实施例中任一项所述的方法，其中与标准化的未接触分离的细胞或多个标准化的未接触分离的细胞相比，所述接触后所述分离的细胞或多个分离的细胞的生存力为至少40％。[83]如实施例[81]或[82]中任一项所述的方法，其进一步包括在与受试者接触后施用所述细胞或多个细胞。[84]一种产生用于施用至受试者的细胞的方法，其包括：a)提供分离的细胞，并且b)使所述分离的细胞与如前述实施例中任一项所述的环状多核糖核苷酸接触；从而产生用于施用至所述受试者的细胞。[85]如实施例[84]所述的方法，其中所述细胞中的所述环状多核糖核苷酸在施用至所述受试者之前被降解。[86]一种产生输注产品的方法，其包括：a)从多个细胞富集细胞类型；b)扩增所述细胞类型；c)使所述细胞类型的多个细胞与多个环状多核糖核苷酸接触，其中所述多个中的环状多核糖核苷酸是如前述实施例中任一项所述的环状多核糖核苷酸；并且d)提供悬浮液中的接触的多个细胞作为输注产品。[87]一种产生注射产品的方法，其包括：a)从多个细胞富集细胞类型；b)扩增所述细胞类型；c)使所述细胞类型的多个细胞与多个环状多核糖核苷酸接触，其中所述多个中的环状多核糖核苷酸是如前述实施例中任一项所述的环状多核糖核苷酸；以及d)提供悬浮液中的接触的多个细胞作为注射产品。[88]一种细胞疗法的方法，其包括将如前述实施例中任一项所述的药物组合物、细胞、多个细胞、制剂、静脉注射袋中的多个细胞、医疗装置中的多个细胞、生物相容性基质中的多个细胞、或来自生物反应器的多个细胞施用至受试者。[89]如实施例[88]所述的方法，其中所述药物组合物、所述多个细胞、所述制剂、所述静脉注射袋中的多个细胞、所述医疗装置中的多个细胞、所述生物相容性基质中的多个细胞或来自所述生物反应器的多个细胞包含5x105个细胞至4.4x1011个细胞的剂量。[90]如实施例[88]或[89]所述的方法，其包括以5x105个细胞/kg至6x108个细胞/kg的剂量施用所述药物组合物、多个细胞、制剂、所述静脉注射袋中的多个细胞、所述医疗装置中的多个细胞、所述生物相容性基质中的多个细胞或来自所述生物反应器的多个细胞。[91]如实施例[88]-[90]中任一项所述的方法，其包括分两个后续剂量，以5x105个细胞/kg至6x108个细胞/kg的剂量施用所述药物组合物、多个细胞、制剂、所述静脉注射袋中的多个细胞、所述医疗装置中的多个细胞、所述生物相容性基质中的多个细胞或来自所述生物反应器的多个细胞。[92]如实施例[91]所述的方法，其中两个后续剂量间隔至少约28天、35天、42天或60天施用。[93]一种编辑分离的细胞或多个分离的细胞的核酸的方法，其包括a)提供分离的细胞或多个分离的细胞；b)使所述分离的细胞或所述多个分离的细胞与编码核酸酶和/或包含指导核酸的环状多核糖核苷酸接触；从而产生经编辑的细胞或多个经编辑的细胞，用于施用至受试者。[94]如实施例[93]所述的方法，其进一步包括用药学上可接受的赋形剂配制经编辑的细胞或多个经编辑的细胞。[95]如实施例[93]或[94]所述的方法，其进一步包括将所述经编辑的细胞或所述多个经编辑的细胞施用至所述受试者。[96]如实施例[93]-[95]中任一项所述的方法，其进一步包括以5x105个细胞/kg至6x108个细胞/kg的剂量施用所述多个经编辑的细胞。[97]如实施例[93]-[96]中任一项所述的方法，其进一步包括分两个后续剂量，以5x105个细胞/kg至6x108个细胞/kg的剂量施用所述多个经编辑的细胞。[98]如实施例[97]所述的方法，其中两个后续剂量间隔至少约28天、35天、42天或60天施用。[99]如实施例[93]-[98]中任一项所述的方法，其中核酸酶是锌指核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶或cas蛋白。[100]如实施例[93]-[99]中任一项所述的方法，其中核酸酶是cas9蛋白、cas12蛋白、cas14蛋白或cas13蛋白。[101]如实施例[93]-[100]中任一项所述的方法，其中核酸酶编辑靶序列。[102]如实施例[93]-[101]中任一项所述的方法，其中所述指导核酸包含具有与靶序列互补的序列的第一区域和与所述核酸酶杂交的第二区域。[103]如实施例[101]所述的方法，其中所述靶序列是所述分离的细胞或多个分离的细胞的序列。[104]如实施例[93]-[103]中任一项所述的方法，其中所述分离的细胞是真核细胞、动物细胞、哺乳动物细胞或人细胞。[105]如实施例[93]-[104]中任一项所述的方法，其中所述分离的细胞是免疫细胞、祖细胞、干细胞、神经细胞、心脏细胞、肝细胞或β细胞。[106]如实施例[93]-[105]中任一项所述的方法，其中所述分离的细胞是外周血单核细胞、外周血淋巴细胞或淋巴细胞。[107]如实施例[93]-[106]中任一项所述的方法，其中所述分离的细胞选自由以下组成的组：t细胞(例如，调节性t细胞、γδt细胞、αβt细胞、cd8 t细胞或cd4 t细胞)、b细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤t细胞、巨噬细胞、树突细胞、红细胞、网织红细胞、髓系祖细胞和巨核细胞。[108]如实施例[93]-[104]中任一项所述的方法，其中所述分离的细胞选自由以下组成的组：间充质干细胞、胚胎干细胞、胎儿干细胞、胎盘来源的干细胞、诱导多能干细胞、脂肪干细胞、造血干细胞(例如cd34 细胞)、皮肤干细胞、成体干细胞、骨髓干细胞、脐带血干细胞、脐带干细胞、角膜缘干细胞、祖干细胞和神经干细胞。[109]如实施例[93]-[104]中任一项所述的方法，其中所述分离的细胞选自由以下组成的组：成纤维细胞、软骨细胞、心肌细胞、多巴胺能神经元、小胶质细胞、少突胶质细胞、肠神经元和肝细胞。[110]如实施例[93]-[109]中任一项所述的方法，其中所述分离的细胞是非复制型的。[111]如实施例[93]-[110]中任一项所述的方法，其中所述多个经编辑的细胞是5x105个细胞至1x107个细胞。[112]如实施例[93]-[111]中任一项所述的方法，其中所述多个经编辑的细胞是12.5x105个细胞至4.4x1011个细胞。[113]如实施例[83]-[85]或[88]-[112]中任一项所述的方法，其中所述受试者是人或非人动物。[114]如实施例[83]-[85]或[88]-[113]中任一项所述的方法，其中所述细胞或分离的细胞对所述受试者(例如，治疗的受试者或有需要的受试者)是自体的，或者所述细胞或分离的细胞对所述受试者(例如，治疗的受试者或有需要的受试者)是同种异体的。[115]如实施例[83]-[85]或[88]-[114]中任一项所述的方法，其中所述受试者患有疾病或病症。[116]如实施例[83]-[85]或[88]-[115]中任一项所述的方法，其中所述受试者患有过度增殖性疾病、癌症、神经退行性疾病、代谢性疾病、炎性疾病、自身免疫性疾病、感染性疾病或遗传性疾病。实例[0366]提供以下实例以进一步说明本发明的一些实施例，但并非旨在限制本发明的范围；通过其示例性性质将理解，可以替代性地使用本领域技术人员已知的其他程序、方法或技术。实例1：来自环状rna的细胞内蛋白质在细胞中的表达[0367]此实例展示了环状rna的细胞内蛋白质在细胞中的表达的体外评估。[0368]在此实例中，环状rna被设计为包含ires和编码gfp的orf。使用t4rna连接酶2经由夹板介导的连接在体外生成环状rna。使用cd3/cd28动态珠激活原代人t细胞(在t细胞优化培养基中3天)。去除珠子后，使用电穿孔系统(赛默科技公司(thermoscientific))，用0.6皮摩尔(约250ng)的环状rna电穿孔激活的t细胞。[0369]在每个时间点，从电穿孔后24小时开始，重悬t细胞，并通过流式细胞术测定一部分样品的gfp表达。简而言之，将细胞沉淀(300g，5分钟室温)，并在黑暗中重悬于含有dapi(1:1000稀释度)的流动缓冲液(pbs 5％fbs)中5分钟。在流动缓冲液中洗涤2次后，在流式细胞仪(赛默科技公司)上运行样品以测定gfp表达。在测量gfp表达之前，从目标群体中去除死亡细胞和双重体。[0370]如图1中所示，在电穿孔后1天(约90％的gfp 细胞)检测到来自环状和线性rna两者的gfp表达。对于线性和环形mrna电穿孔的细胞两者，gfp 细胞的百分比在施用后2天维持不变。然而，用线性mrna电穿孔的gfp 细胞的平均荧光强度(mfi)在第2天下降了大约54％，而环形mrna电穿孔的细胞仅下降了约16％。在第3、6和10天，线性rna表达下降，而环状rna表达保持稳定(在第3天为81％线性相比于92％环状，在第6天为53％线性相比于80％环状，并且在第10天为36％线性相比于72％环状)。[0371]总的来说，结果表明，与用线性rna处理的细胞相比，用环状rna转染的细胞显示出延长的细胞内蛋白质表达。这些结果进一步表明，与线性rna相比，环状rna的毒性降低。实例2：来自环状rna的治疗性膜蛋白在细胞上的表达[0372]此实例展示了在细胞中由环状rna表达膜蛋白的体外评估。[0373]在此实例中，环状rna被设计为包含ires和编码cd19嵌合抗原受体(car)的orf。经由内含子自剪接在体外生成环状rna。使用cd3/cd28珠在t细胞培养基中激活原代人t细胞3天，并用0.6皮摩尔(约400ng)的环状rna电穿孔。在每个时间点，从电穿孔后24小时开始，重悬t细胞，并通过流式细胞术测定一部分细胞的cd19car表面表达以及靶抗原结合。简而言之，通过首先用生物素化的兔抗鼠igg(h l)抗体(1:1000稀释度，室温下黑暗中1小时)染色细胞，洗涤两次，然后与链霉亲和素-apc第二抗体(1:500稀释度，室温下黑暗中1小时)一起孵育来检测cd19car的表达。在流动缓冲液中洗涤2次后，在流式细胞仪(赛默科技公司)上运行样品，以测定cd19car表达和抗原结合。在测量cd19car表达之前，从目标群体中去除死亡细胞和双重体。[0374]如图2中所示，在电穿孔后1天检测到来自环形(c)和线性(l)rna两者的cd19car表达(分别为97％和95％)。环状rna电穿孔的细胞中cd19car表面表达的强度比线性rna电穿孔的细胞高约3倍。[0375]总的来说，结果表明用环状rna转染的细胞显示膜蛋白的表达。实例3：细胞中分泌蛋白的环状rna表达[0376]此实例展示了与线性rna相比，当递送到细胞中时，表达分泌蛋白的环状rna的半衰期增加。[0377]将非天然存在的环状rna工程化，以在细胞中表达具有生物活性的分泌蛋白。如以下实例中所示，来自环状rna的蛋白质表达与来自编码相同蛋白质的线性rna的表达相比以更高的水平存在，这展示环状rna在细胞中的半衰期更长。[0378]在此实例中，环状rna和线性rna被设计为包含ires和编码高斯萤光素酶的orf和两个侧接ires-orf的间隔元件。如下在体外生成环状rna：使用t7rna聚合酶通过体外转录从dna区段合成未修饰的线性rna。将转录的rna用rna纯化系统(新英格兰生物学实验室公司(newenglandbiolabs,inc.))纯化，按照制造商的说明用rna5'-焦磷酸水解酶(rpph，新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并且再次用rna纯化系统纯化。通过用t4rna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)处理转录的线性rna和dna夹板来生成夹板连接的环状rna。[0379]为了纯化环状rna，在4％变性page上解析连接混合物，并且切除对应于环状和线性rna中的每一种的rna条带。使用相同的4％变性page凝胶纯化线性rna。压碎切除的rna凝胶片段(线性或环状)，并且用凝胶洗脱缓冲液(0.5mnaoac，1mmedta和0.1％sds)在37℃下洗脱rna。收获上清液，并且通过将凝胶洗脱缓冲液添加至压碎凝胶中再洗脱一次rna，并孵育一小时。通过离心过滤器去除凝胶碎片，并且用乙醇沉淀rna。[0380]为了监测来自rna的蛋白质在细胞中的表达，用基于脂质的转染试剂(英杰公司(invitrogen))和2nm的线性或环状rna成功地反向转染5x103个细胞。使用高斯萤光素酶快速测定试剂盒并按照制造商的说明，在细胞培养上清液中每天监测高斯萤光素酶活性长达14天，作为表达的量度。[0381]图3显示，与线性rna的4-6天相比，在hela细胞中，来自环状rna的分泌蛋白表达更长，持续超过9天。实例4：人原代t细胞从编码cd19car的环状和线性rna构建体表达cd19car[0382]此实例展示了环状rna在人原代t细胞中表达功能性嵌合抗原受体(car)作为膜蛋白的能力。[0383]在此实例中，环状rna被设计为包含具有编码cd19嵌合抗原受体(car)的orf的ires，所述orf的上游和下游侧接来源于鱼腥藻前trna的自剪接基序。使用t7rna聚合酶通过体外转录从dna区段生成环状rna。用rna纯化系统(新英格兰生物学实验室公司)纯化转录的rna。自剪接反应含有gtp(最终浓度：2mm)和nebuffer4(neb，目录号b7004s)，并使用rna纯化系统(新英格兰生物学实验室公司)进行纯化。为了去除残留的线性rna，将样品用rna酶r(路茨根公司(lucigen)，目录号rnr07250)处理。环状rna经过urea-page纯化，在缓冲液(0.5m乙酸钠、0.1％sds、1mmedta)中洗脱，乙醇沉淀并重悬于rna酶储存溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号am7000)中。在使用之前，将rna稀释至1pmol/μl的浓度。另外，生成线性rna对应物，并包含相同的cd19carorf，其分别在上游和下游侧接人α球蛋白5’和3’utr。[0384]使用cd3/cd28动态珠(赛默飞世尔科技公司，目录号11132d)在t细胞优化培养基(赛默飞世尔科技公司，目录号a1048501)中激活原代人t细胞3天。去除珠子后，使用氖电穿孔系统(赛默飞世尔科技公司)，用0.65皮摩尔(约500ng)的环状或线性rna电穿孔激活的t细胞(100,000个细胞)。将单独的rna储存溶液用作仅媒介物对照。[0385]在电穿孔后24小时，重悬t细胞，并通过流式细胞术测定一部分样品的cd19car表面表达。简而言之，将细胞用重悬于流动缓冲液(pbs 5％fbs)中的fitc缀合重组cd19(百普赛斯生物科技股份有限公司(acrobiosystems)，目录号cd9-hf2h2)染色，并在4度下在黑暗中孵育1小时。将细胞用流动缓冲液洗涤两次，并在黑暗中用dapi(在流动缓冲液中以1:1000稀释)染色5分钟。在流动缓冲液中最后洗涤后，在调谐nxt流式细胞仪(赛默科技公司)上运行样品以测量cd19-fitc结合。在测量cd19结合之前，从目标群体中去除细胞碎片、双重体和死亡细胞。[0386]如图4中所示，在电穿孔后24小时检测到来自环状和线性rna两者的cd19car表达，并观察到高于仅媒介物对照。观察到来自环状rna电穿孔细胞的cd19car表达比线性rna电穿孔细胞高大约三倍。[0387]此实例展示了cd19car在用编码cd19car蛋白的环状和线性rna构建体电穿孔的原代人t细胞上作为膜蛋白成功地表达。实例5：从环状rna构建体表达cd19car的t细胞可以杀死肿瘤细胞[0388]此实例展示了环状rna在人原代t细胞中表达功能性嵌合抗原受体作为膜蛋白的能力。[0389]在此实例中，环状rna被设计为包含具有编码cd19嵌合抗原受体(car)的orf的ires，所述orf的上游和下游侧接来源于鱼腥藻前trna的自剪接基序。使用t7rna聚合酶通过体外转录从dna区段生成环状rna。用rna纯化系统(新英格兰生物学实验室公司)纯化转录的rna。自剪接反应含有gtp(最终浓度：2mm)和nebuffer4(neb，目录号b7004s)，并使用rna纯化系统(新英格兰生物学实验室公司)进行纯化。为了去除残留的线性rna，将样品用rna酶r(路茨根公司，目录号rnr07250)处理。环状rna经过urea-page纯化，在缓冲液(0.5m乙酸钠、0.1％sds、1mmedta)中洗脱，乙醇沉淀并重悬于rna酶储存溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号am7000)中。在使用之前，将rna稀释至1pmol/μl的浓度。[0390]使用cd3/cd28动态珠(赛默飞世尔科技公司，目录号11132d)在t细胞优化培养基(赛默飞世尔科技公司，目录号a1048501)中激活原代人t细胞3天。去除珠子后，使用氖电穿孔系统(赛默飞世尔科技公司)，用0.65皮摩尔(约500ng)的环状rna电穿孔激活的t细胞(100,000个细胞)。将单独的rna储存溶液用作仅媒介物对照。[0391]通过肿瘤细胞杀伤测定确定表达cd19car的t细胞杀伤肿瘤细胞的能力(图5)。简言之，根据制造商的说明将表达cd19表面抗原的拉吉(raji)肿瘤细胞用膜染料phk26(西格玛公司(sigma)，目录号mini26)染色，然后与表达cd19car的t细胞在37度下以范围为1:1至20:1的效应物-靶比率孵育18小时。之后，将细胞悬浮液用dapi(在流动缓冲液中以1:1000稀释)在黑暗中染色5分钟。将细胞悬浮液直接转移至facs管，并在调谐nxt流式细胞仪(赛默科技公司)上运行，以通过门控双阳性(pkh 、dapi )细胞来测量肿瘤细胞杀伤，其代表总细胞群中死亡拉吉(肿瘤细胞)的％。在测量肿瘤细胞杀伤测定之前，从目标群体中去除细胞碎片和双重体。[0392]如图6中所示，与仅媒介物对照相比，表达来源于转染的环状rna的cd19car的t细胞表现出更大的拉吉肿瘤细胞杀伤能力。这表明cd19car依赖于对拉吉肿瘤细胞的杀伤。[0393]此实例展示了功能性cd19car在用编码cd19car序列的环状rna构建体电穿孔的原代人t细胞上作为膜蛋白成功地表达。它进一步展示了电穿孔的t细胞的cd19car依赖性下游效应子功能具有治疗意义。携带从环状rna表达的cd19car的t细胞能够杀死肿瘤细胞。实例6：将环状rna或具有载体的经修饰线性rna递送至人视网膜细胞系并翻译成蛋白质[0394]此实例展示了将未修饰的环状rna递送至人视网膜色素上皮细胞系arpe-19。[0395]在此实例中，egfpmrna是购买的(垂林克生物技术公司(trilinkbiotechnologies)，l-7201)，并且含有不同于环状rna模板的密码子优化的egfporf。所述mrna含有最佳帽依赖翻译所必需的常规修饰(5’和3’人β-球蛋白utr、5’帽、3’聚(a)尾、100％甲氧基-假尿苷核苷酸取代)。[0396]在此实例中，环状rna被设计为具有脑心肌炎病毒(emcv)内部核糖体进入位点(ires)和编码增强型绿色荧光蛋白(egfp)的开放阅读框(orf)。[0397]在体外生成环状rna。未修饰的线性rna从包括上面列出的所有基序的dna模板以及用于驱动转录的t7rna聚合酶启动子体外转录(路茨根公司，asf3507)。将转录的rna用rna纯化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，t2050)纯化，用rna5’磷酸水解酶(rpph)(新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并用相同类型的rna纯化柱再次纯化。使用夹板dna(5’‑ggctattcccaatagccgtt-3’)和t4rna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)将rna环化。将环状rna进行尿素-page纯化，在缓冲液(0.5m乙酸钠，0.1％sds，1mmedta)中洗脱，乙醇沉淀，并在无菌条件下重悬于水中。[0398]将rna在水中稀释至浓度为45g/l(1um)，然后以10ul的总体积与lipofectamine载体(赛默飞世尔科技公司，lmrna003)络合。将总共0.1皮摩尔的rna转染到5,000个arpe-19细胞中，在37℃下置于补充有10％胎牛血清(fbs)的杜尔贝科氏改良伊格培养基(dmem):f12(美国类型细胞培养公司(americantypecellculture)，30-2006)中。所有试剂在混合前达到室温，并且在使用之前按照制造商的说明立即制备混合物。作为阴性对照，使用未经处理的对照(无载体且无rna)。[0399]为了确定rna翻译在细胞中的持久性，通过使用evos细胞成像系统m7000(赛默飞世尔科技公司)每天分析培养板的绿色荧光。以4倍、10倍和20倍放大，在明视场(可见波长)和绿色荧光(“gfp通道”，510nm)中拍摄培养物图像。当与完整细胞共定位时，荧光信号被认为是阳性的，因为来自明视场和荧光的图像被叠加。[0400]在用环状rna转染后16小时以及用修饰的mrna转染后，在细胞中检测到egfp的荧光信号。[0401]此实例展示了在载体存在下经由转染，环状rna在人视网膜细胞培养物arpe-19细胞中被成功递送并有效翻译。实例7：功能性苯丙氨酸羟化酶在细胞中的环状rna表达，将苯丙氨酸转化为酪氨酸[0402]此实例展示了环状rna在细胞中表达具有治疗效果的功能酶的能力。[0403]苯丙氨酸羟化酶(pah)是一种催化羟基化苯丙氨酸以生成酪氨酸的酶。人类苯丙氨酸的主要来源是摄入的蛋白质，其中大部分然后通过pah分解代谢以形成酪氨酸，然后在后续的分解代谢步骤中被分解。编码pah的基因的突变可能导致苯丙酮尿症，这是一种严重的代谢病症，体内苯丙氨酸水平升高。疾病中功能性pah的表达可以降低体内苯丙氨酸水平，因此具有治疗益处。[0404]在此实例中，环状rna被设计为包含具有编码小鼠苯丙氨酸水解酶(mpah)的orf的cvb3ires和间隔子(is或e1e2)。为了生成环状rna，使用t7rna聚合酶通过体外转录从dna区段生成线性rna。将转录的rna用rna纯化柱(新英格兰生物学实验室公司，t2050)纯化，按照制造商的说明用rna5’焦磷酸水解酶(rpph)(新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并且再次用rna纯化柱(英格兰生物学实验室公司，t2050)纯化。使用夹板dna(对于is为5’‑gtttttcggctattcccaatagccgttttg-3’，并且对于e1e2为5’‑gtcaacggattttcccaagtccgtagcgtctc-3’)和t4rna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)环化经rpph处理的线性rna。将环状rna进行尿素-page纯化，在缓冲液(0.5m乙酸钠，0.1％sds，1mmedta)中洗脱，乙醇沉淀，并且重悬于rna储存溶液(赛默飞世尔科技公司，am7000)中。[0405]然后根据制造商的说明，使用massengermax(英杰公司)将每个环状rna转染到hek293t细胞中。将2皮摩尔的环状rna用于转染一百万个细胞，并铺在6孔板上。对于阴性对照，仅使用媒介物。[0406]为了制备用于下游分析的细胞提取物，在24和72小时后通过刮取收集转染的细胞，并通过离心沉淀。将细胞沉淀物重悬于含有50mm蔗糖、0.2mmpmsf和蛋白酶抑制剂混合物的pbs缓冲液(ph7.4)(赛默飞世尔科技公司，78430)中。使细胞通过细针(20倍)进行匀浆。然后将蔗糖浓度增加到0.25m，并经由离心(14000g，10分钟，4℃)澄清提取物。使用bca蛋白质测定法(赛默飞世尔科技公司)对蛋白质浓度进行归一化。[0407]通过蛋白质印迹评估pah水平。简言之，在12％双-三凝胶(英杰公司)上分离1.5ug于lds样品缓冲液(英杰公司)中的蛋白质，并通过iblot2干燥印迹系统转移至硝酸纤维素膜。用抗pah(艾博抗公司(abcam))和β肌动蛋白(艾博抗公司，负载对照)的兔抗体作为主要抗体，以及辣根过氧化物酶连接的抗兔免疫球蛋白g作为次要抗体来检测蛋白质。使用成像系统(li-cor)，通过增强化学发光(赛默科技公)来检测膜结合抗体。通过蛋白质印迹观察到pah蛋白，并且与仅使用媒介物的对照相比，在使用两种测试的环状rna的细胞中的表达程度更大(图7)。[0408]为了测量pah活性，将10ug细胞裂解物与1mml-苯丙氨酸和1mg/ml过氧化氢酶在100mmna-hepes(ph7.3)中预孵育5分钟(30℃)。将硫酸亚铁铵添加至100um的最终浓度，并孵育1分钟。通过添加bh4(75μm最终浓度)和dtt(2mm最终浓度)起始反应，并在30℃下孵育2小时。通过在95℃下将样品孵育10分钟来停止反应，并经由离心(14000g，3分钟)澄清。根据制造商的说明，通过酪氨酸测定试剂盒(西格玛公司，mak2019)来测量反应过程中由pah从苯丙氨酸转化的酪氨酸水平。[0409]如图8中所示，由两种测试的环状rna在细胞中表达的pah蛋白是有功能的，并且能够将苯丙氨酸转化为酪氨酸。用环状rna处理的细胞中的酪氨酸水平高于仅用媒介物对照处理的细胞。从带有pahorf的环状rna表达的pah显示出显著的酶活性，相对于仅媒介物的对照高大约10倍。由体外测定显示的酶活性与pah蛋白的表达有关，并持续长达3天。[0410]此实例展示了由环状rna在hek293细胞中成功表达功能性蛋白。实例8：环状rna在细胞中比线性rna更稳定[0411]此实例展示了与线性rna相比，当递送到细胞中时，表达分泌蛋白的环状rna的稳定性增加。[0412]将非天然存在的环状rna工程化，以在细胞中表达具有生物活性的分泌蛋白。如以下实例中所示，与编码相同蛋白质的线性rna相比，检测到的环状rna更长，这展示环状rna在细胞中的半衰期更长。[0413]在此实例中，环状rna和线性rna被设计为包含ires和编码高斯萤光素酶的orf和两个侧接ires-orf的间隔元件。如下在体外生成环状rna：使用t7rna聚合酶通过体外转录从dna区段合成未修饰的线性rna。将转录的rna用rna纯化系统(新英格兰生物学实验室公司)纯化，按照制造商的说明用rna5’‑焦磷酸水解酶(rpph，新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并且再次用rna纯化系统纯化。通过用t4rna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)处理转录的线性rna和dna夹板来生成夹板连接的环状rna。[0414]为了纯化环状rna，在4％变性page上解析连接混合物，并且切除对应于环状和线性rna中的每一种的rna条带。使用相同的4％变性page凝胶纯化线性rna。压碎切除的rna凝胶片段(线性或环状)，并且用凝胶洗脱缓冲液(0.5mnaoac，1mmedta和0.1％sds)在37℃下洗脱rna。收获上清液，并且通过将凝胶洗脱缓冲液添加至压碎凝胶中再洗脱一次rna，并孵育一小时。通过离心过滤器去除凝胶碎片，并且用乙醇沉淀rna。[0415]为了监测细胞中的rna稳定性，用基于脂质的转染试剂(英杰公司)和2nm的线性或环状rna成功地反向转染5x103个细胞。收集细胞裂解物，以通过定量rt-pcr监测rna水平。在转染后6小时和1-4天通过gluc特异性q-pcr分析环状rna水平。简而言之，使用powersybr绿细胞至ct试剂盒(赛默飞世尔科技公司，目录号4402953)并且按照制造商的说明，通过随机引发从细胞裂解物中生成cdna。使用pfaffl方法计算倍数变化，使用β-肌动蛋白作为管家基因。[0416]图9示出了相比于线性rna的2天，环状rna在hela细胞中稳定超过4天(120小时)。实例9：环状rna在细胞中的免疫原性低于线性rna[0417]此实例展示了与线性rna相比，当递送到细胞中时，由表达分泌蛋白的环状rna引发的免疫原性反应较低。[0418]将非天然存在的环状rna工程化，以在细胞中表达具有生物活性的分泌蛋白。如以下实例中所示，与编码相同蛋白质的线性rna相比，环状rna诱导免疫应答基因rigi和mda5的表达较少，这展示细胞中来自环状rna的免疫原性较低。[0419]在此实例中，环状rna和线性rna被设计为包含ires和编码高斯萤光素酶的orf和两个侧接ires-orf的间隔元件。如下在体外生成环状rna：使用t7rna聚合酶通过体外转录从dna区段合成未修饰的线性rna。将转录的rna用rna纯化系统(新英格兰生物学实验室公司)纯化，按照制造商的说明用rna5’‑焦磷酸水解酶(rpph，新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并且再次用rna纯化系统纯化。通过用t4rna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)处理转录的线性rna和dna夹板来生成夹板连接的环状rna。[0420]为了纯化环状rna，在4％变性page上解析连接混合物，并且切除对应于环状和线性rna中的每一种的rna条带。使用相同的4％变性page凝胶纯化线性rna。压碎切除的rna凝胶片段(线性或环状)，并且用凝胶洗脱缓冲液(0.5mnaoac，1mmedta和0.1％sds)在37℃下洗脱rna。收获上清液，并且通过将凝胶洗脱缓冲液添加至压碎凝胶中再洗脱一次rna，并孵育一小时。通过离心过滤器去除凝胶碎片，并且用乙醇沉淀rna。[0421]为了监测细胞中的rna稳定性，用基于脂质的转染试剂(英杰公司)和2nm的线性或环状rna成功地反向转染5x103个细胞。收集细胞裂解物，以通过定量rt-pcr监测rna水平。在转染后6小时和1-4天通过gluc特异性q-pcr分析环状rna水平。简而言之，使用powersybr绿细胞至ct试剂盒(赛默飞世尔科技公司，目录号4402953)并且按照制造商的说明，通过随机引发从细胞裂解物中生成cdna。使用pfaffl方法计算倍数变化，使用β-肌动蛋白作为管家基因。[0422]结果显示，与线性rna相比，hela细胞中来自环状rna的细胞中免疫原性更低。实例10：环状rna在细胞中的毒性低于线性rna[0423]此实例展示了与线性rna相比，当递送到细胞中时，由表达分泌蛋白的环状rna引发的细胞毒性较小。[0424]将非天然存在的环状rna工程化，以在细胞中表达具有生物活性的分泌蛋白。如以下实例中所示，当与编码相同蛋白质的线性rna相比时，当用环状rna转染细胞时，细胞生长受到的影响较小，这展示细胞中来自环状rna的细胞毒性较小。[0425]在此实例中，环状rna和线性rna被设计为包含ires和编码高斯萤光素酶的orf和两个侧接ires-orf的间隔元件。如下在体外生成环状rna：使用t7rna聚合酶通过体外转录从dna区段合成未修饰的线性rna。将转录的rna用rna纯化系统(新英格兰生物学实验室公司)纯化，按照制造商的说明用rna5’‑焦磷酸水解酶(rpph，新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并且再次用rna纯化系统纯化。通过用t4rna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)处理转录的线性rna和dna夹板来生成夹板连接的环状rna。[0426]为了纯化环状rna，在4％变性page上解析连接混合物，并且切除对应于环状和线性rna中的每一种的rna条带。使用相同的4％变性page凝胶纯化线性rna。压碎切除的rna凝胶片段(线性或环状)，并且用凝胶洗脱缓冲液(0.5mnaoac，1mmedta和0.1％sds)在37℃下洗脱rna。收获上清液，并且通过将凝胶洗脱缓冲液添加至压碎凝胶中再洗脱一次rna，并孵育一小时。通过离心过滤器去除凝胶碎片，并且用乙醇沉淀rna。[0427]为了监测细胞中的细胞毒性，用基于脂质的转染试剂(英杰公司)和2nm的线性或环状rna成功地反向转染5x103个细胞。将细胞活力用作细胞毒性的直接量度。将明视场成像以及atp产生用于监测细胞活力。将细胞在培养物中成像，并且收集细胞裂解物以使用celltite-glo试剂盒(普洛麦格公司(promega))来监测atp水平，并按照制造商的说明测量发光。[0428]图10显示与线性rna相比，环状rna对细胞毒性较小。实例11：环状rna介导的直接递送至特定细胞类型[0429]此实例展示了经由包含在环状rna中的rna适配体序列将环状rna靶向靶细胞上治疗相关蛋白质的能力。[0430]对于此实例，环状rna包含已知与人转铁蛋白受体竞争性结合的c2min适配体序列(5’‑gggggaucaauccaagggacccggaaacgcucccuuacacccc-3’)；或已知与人转铁蛋白受体非竞争性结合的36a(5’‑gggugaaugguucuacgauaaacguuaaugaccagcuuauggcuggcaguuccuauagcaccc-3’)适配体序列。环状rna被设计为包含间隔区，用于荧光单链dna寡核苷酸的杂交，以便可视化。还使用了对照环状rna，其包含被预测不与人转铁蛋白受体结合的适配体序列。这些环状rna的示意图在图11中示出。[0431]在体外生成环状rna。未修饰的线性rna从包括上面列出的所有基序的dna模板以及用于驱动转录的t7rna聚合酶启动子体外转录。转录的rna用rna纯化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，t2050)纯化，按照制造商的说明用rna5’磷酸水解酶(rpph)(新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并再次用rna纯化柱纯化。使用夹板dna(5’‑tgttgtgtcttggttggt-3’或5’‑tgttgtgtgttggttggt-3’)和t4rna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)环化经rpph处理的线性rna。将环状rna进行尿素-page纯化，在缓冲液(0.5m乙酸钠，0.1％sds，1mmedta)中洗脱，乙醇沉淀，并且重悬于rna酶储存溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号am7000)中。[0432]将具有alexafluor488的短单链dna寡核苷酸用于标记适配体以用于细胞内可视化(5’‑af488-tgttgtgtcttggttggt-3’或5’‑af488-tgttgtgtgttggttggt-3’，集成dna技术，idt)。将荧光ssdna寡核苷酸以3倍于环状rna的摩尔过量添加，在60℃下孵育10分钟，随后在150mmkcl存在下于室温下孵育20分钟。使用microbiospin柱(伯乐公司(biorad))将rna缓冲液交换到pbs中。[0433]将用alexafluor488-dna寡核苷酸退火的环状rna以0.1μm最终浓度添加至于100μloptimem培养基中的hela细胞。在37℃下孵育一小时后，将细胞用磷酸盐缓冲盐水溶液洗涤，并用dapi溶液转移至fluorobrite。使用evos细胞成像仪(赛默飞世尔科技公司)对细胞进行成像。[0434]通过荧光显微镜评价与人转铁蛋白结合的环状rna。当c2min和36a适配体包含在环状rna中时，在hela细胞内检测到alexafluor488活性为点状荧光信号(图12)。相比之下，对于含有非结合适配体序列的对照环状rna，没有观察到荧光信号。这表明包含在环状rna中的适配体序列经由转铁蛋白受体结合负责内化。[0435]此实例展示了环状rna中编码的rna适配体序列结合靶蛋白，并且可以经由与特定表面受体的相互作用增加进入哺乳动物细胞的摄取。实例12：与含有rna适配体序列的单链rna寡核苷酸杂交的环状rna可以靶向表面蛋白质并且能够摄取环状rna[0436]此实例描述了经由包含在与环状rna杂交的单链rna寡核苷酸中的核糖核酸适配体序列，将环状rna靶向靶细胞上的治疗相关蛋白质。[0437]在此实例中，线性单链rna寡核苷酸包含已知与人转铁蛋白受体竞争性结合的c2min适配体序列(5’‑gggggaucaauccaagggacccggaaacgcucccuuacacccc-3’)；或已知与人转铁蛋白受体非竞争性结合的36a(5’‑gggugaaugguucuacgauaaacguuaaugaccagcuuauggcuggcaguuccuauagcaccc-3’)适配体序列。这种线性单链rna寡核苷酸还包含用于与环状rna杂交的结合基序。环状rna包含用于含适配体的单链寡核苷酸杂交的互补结合区，以及emcvires和高斯萤光素酶(gluc)orf。使用与如上所述相同的环状rna生成对照复合物，所述环状rna与包含预测不与人转铁蛋白受体结合的适配体序列的单链线性rna寡核苷酸杂交。这些实体的示意图在图13中示出。[0438]在体外生成环状rna。未修饰的线性rna在体外从包括上面列出的所有基序的dna模板以及驱动转录的t7rna聚合酶启动子转录。转录的rna用rna纯化试剂盒(新英格兰生物学实验室公司，t2050)纯化，按照制造商的说明用rna5’磷酸水解酶(rpph)(新英格兰生物学实验室公司，m0356)处理，并再次用rna纯化柱纯化。使用夹板dna(5’‑tgttgtgtcttggttggt-3’或5’‑tgttgtgtgttggttggt-3’)和t4rna连接酶2(新英格兰生物学实验室公司，m0239)环化经rpph处理的线性rna。将环状rna进行尿素-page纯化，在缓冲液(0.5m乙酸钠，0.1％sds，1mmedta)中洗脱，乙醇沉淀，并且重悬于rna酶储存溶液(赛默飞世尔科技公司，目录号am7000)中。[0439]在此实例中，线性单链rna寡核苷酸是通过集成dna技术(idt)定制合成的，并且含有前述适配体序列和结合基序。[0440]线性单链rna寡核苷酸(1)是未修饰的；或(2)含有5’‑氟修饰，如kratschmer等人,(2017)nucleicacidther[核酸治疗学].27(6):335-344中所述；或(3)被修饰以包含修饰，诸如5’‑羟基部分或2’‑邻甲基修饰。[0441]将单链rna寡核苷酸以3倍于环状的摩尔过量添加，在60℃下孵育10分钟，然后在150mmkcl存在下逐渐冷却至室温。使用microbiospin柱(伯乐公司)将rna缓冲液交换到pbs中。通过琼脂糖凝胶电泳证实退火。[0442]将用含适配体的rna寡核苷酸退火的环状rna以0.1μm最终浓度添加至于100μloptimem培养基中的hela细胞。研究了多个时间点。在37℃下孵育1小时、6小时、12小时、24小时和48小时后，收获细胞。[0443]使用qrt-pcr来测量每种构建体的递送效率。在收获后，根据制造商的说明，将powersybr绿色细胞至ct试剂盒(英杰公司，目录号4402953)用于裂解细胞和逆转录。qrt-pcr将用gluc特异性引物(正向；cctgagattcctgggttcaag反向；cttcttgagcaggtcagaaca)和itaquniversalsybrgreensupermix(伯乐公司，目录号1725120)进行，并通过实时pcr检测系统(伯乐公司)监测。实例13：环状rna的分离和纯化[0444]此实例展示了环状rna的纯化。[0445]在某些实施例中，如先前实例中所述，环状rna可以在表达编码的蛋白质产物之前被分离和纯化。此实例展示了使用urea凝胶分离进行的分离。如以下实例中所示，分离并纯化环状rna。[0446]circrna1被设计为编码没有终止密码子的三联flag标签化egf(264nt)。它在用于翻译起始的起始密码子处具有科扎克序列(seqidno:11)。cirrna2具有与环状rna1相同的序列，除了它具有终止元件(三联终止密码子)(273nt，seqidno:12)。环状rna3被设计为编码如下的三联flag标签化egf，其侧接交错元件(2a序列)、无终止元件(终止密码子)(330nt，seqidno:28)。circrna4具有与环状rna3相同的序列，除了它具有终止元件(三联终止密码子)(339nt)。circrna5被设计为编码如下的flag标签化egf，其侧接2a序列且后接flag标签化纳米萤光素酶(873nt，seqidno:29)。circrna6具有与环状rna5相同的序列，除了它在egf与纳米萤光素酶基因之间包括终止元件(三联终止密码子)和在纳米萤光素酶序列端部包括终止元件(三联终止密码子)(762nt，seqidno:30)。如本文所述分离circrna1、circrna2、circrna3、circrna4、circrna5、和circrna6。[0447]在此实例中，如所述生成线性和环状rna。为了纯化环状rna，在6％变性page上解析连接混合物，并且切除对应于环状rna中的每一种的rna条带。压碎切除的rna凝胶片段，并且用800μl300mmnacl过夜洗脱rna。通过离心过滤器去除凝胶碎片，并且在0.3m乙酸钠存在时用乙醇沉淀rna。通过6％变性page分析洗脱的环状rna，参见图14。[0448]通过page可视化具有可变大小的环状rna的单条条带。实例14：环状rna在细胞中展示了比线性rna更长的半衰期[0449]此实例展示了环状rna被递送至细胞中并且在细胞中具有与线性rna相比增加的半衰期。[0450]将非天然存在的环状rna工程化，以表达具有生物活性的治疗性蛋白质。如以下实例中所示，环状rna与其线性rna对应物相比以更高的水平存在，这展示环状rna的半衰期更长。[0451]在此实例中，环状rna和线性rna被设计为编码科扎克egf，其侧接2a、终止序列或无终止序列(seqidno:9-12)。为了监测rna在细胞中的半衰期，将0.1x106个细胞铺板至12孔板的每个孔中。1天后，使用基于脂质的转染试剂(英杰公司)将1μg线性rna或环状rna转染至每个孔中。转染后二十四小时，使用基于酚的提取试剂(英杰公司)从细胞中分离总rna。将总rna(500ng)进行逆转录以生成cdna。使用基于染料的定量pcr混合物(伯乐公司)进行qrt-pcr分析。引物序列如下：用于线性rna或环状rna的引物，f：acgacggtgtgtgcatgtat，r：ttcccaccacttcaggtctc；用于环状rna的引物，f：tacgcctgcaactgtgttgt，r：tcgatgatcttgtcgtcgtc。[0452]环状rna及其线性对应物成功转染至293t细胞中。24小时后，使用qpcr测量剩余的环状rna和线性rna。如图15a和图15b中所示，显示了环状rna在细胞中具有与线性rna相比更长的半衰期。实例15：合成环状rna在细胞中展示了免疫原性基因表达降低[0453]此实例展示了工程化以与线性rna相比具有降低的免疫原性的环状rna。[0454]编码治疗性蛋白质的环状rna在受体细胞中提供与线性rna相比减少的免疫原性相关基因(rig-i、mda5、pka和ifn-β)诱导。rig-i可以识别短的5’三磷酸酯无帽双链或单链rna，而mda5可以识别更长的dsrna。rig-i和mda5均可参与激活mavs并且触发抗病毒应答。pkr可以被dsrna激活，并且被干扰素(诸如ifn-β)诱导。如以下实例中所示，如通过q-pcr通过rig-i、mda5、pkr和ifn-β的表达评估的，显示了环状rna在293t细胞中具有与类似线性rna相比减少的免疫相关基因激活。[0455]环状rna和线性rna被设计为编码(1)科扎克3xflag-egf序列，无终止元件(seqidno:9)；(2)科扎克3xflag-egf，其侧接终止元件(终止密码子)(seqidno:21)；(3)科扎克3xflag-egf，其侧接2a序列(seqidno:10)；或(4)科扎克3xflag-egf序列，其侧接2a序列、后接终止元件(终止密码子)(seqidno:11)。[0456]在此实例中，通过将0.1x106个细胞铺板至12孔板的每个孔中来监测细胞中先天性免疫应答基因的水平。1天后，使用基于脂质的转染试剂(英杰公司)将1μg线性rna或环状rna转染至每个孔中。转染后二十四小时，使用基于酚的提取试剂(英杰公司)从细胞中分离总rna。将总rna(500ng)进行逆转录以生成cdna。使用基于染料的定量pcr混合物(伯乐公司)进行qrt-pcr分析。[0457]使用的引物序列：用于gapdh的引物，f：agggctgcttttaactctggt，r：ccccacttgattttggaggga；rig-i，f：tgtgggcaatgtcatcaaaa，r：gaagcacttgctacctcttgc；mda5，f：ggcaccatgggaagtgatt，r：atttggtaaggcctgagctg；pkr，f：tcgctggtatcactcgtctg，r：gattctgaagaccgccagag；ifn-β，f：ctctcctgttgtgcttctcc，r：gtcaaagttcatcctgtccttg。[0458]如图16中所示，与线性rna转染细胞相比，用环状rna转染的293t细胞的免疫相关基因的qrt-pcr水平显示出rig-i、mda5、pkr和ifn-β的降低。因此，与线性rna转染细胞相比，在环状rna转染的细胞中受体细胞中免疫原性相关基因的诱导减少。实例16：在细胞中合成环状rna经由滚环翻译的表达增加[0459]此实例展示了在细胞中合成环状rna经由滚环翻译的表达增加。[0460]环状rna被设计为包含具有纳米萤光素酶基因或egf阴性对照基因的ires，无终止元件(终止密码子)。用以下转染细胞：egf阴性对照(seqidno:13)；nluc终止(seqidno:14)：emcvires、交错序列(2a序列)、3xflag标签化nluc序列、交错序列(2a序列)、和终止密码子；或nluc交错(seqidno:15)：emcvires、交错序列(2a序列)、3xflag标签化nluc序列、和交错序列(2a序列)。如图17中所示，两种环状rna均产生具有功能性萤光素酶活性的翻译产物。[0461]在此实例中，在细胞中监测环状rna的翻译。具体而言，将0.1x106个细胞铺板至12孔板的每个孔中。1天后，使用基于脂质的转染试剂(英杰公司)将300ng环状rna转染至每个孔中。24小时后，通过添加100μlripa缓冲液收获细胞。根据制造商的方案(普洛麦格公司)，使用萤光素酶测定系统测量裂解物中的纳米萤光素酶活性。[0462]如图17中所示，两种环状rna均在细胞中表达蛋白质。然而，具有交错元件(例如，2a序列)、缺少终止元件(终止密码子)的环状rna比具有终止元件(终止密码子)的环状rna产生了更高水平的具有功能性萤光素酶活性的蛋白质产物。实例17：由环状rna表达的蛋白质增加[0463]此实例展示了在细胞中的合成环状rna翻译。另外，此实例显示，环状rna比其线性对应物产生更多具有正确分子量的表达产物。[0464]线性rna和环状rna被设计为包含具有终止元件(终止密码子)的纳米萤光素酶基因。用以下转染细胞：媒介物：仅转染试剂；线性nluc(seqidno:14)：emcvires、交错元件(2a序列)、3xflag标签化nluc序列、交错元件(2a序列)、和终止元件(终止密码子)；或环状nluc(seqidno:14)：emcvires、交错元件(2a序列)、3xflag标签化nluc序列、交错元件(2a序列)、和终止元件(终止密码子)。如图18中所示，与线性rna相比，环状rna产生更高水平的具有正确分子量的蛋白质。[0465]24小时后，通过添加100μlripa缓冲液收获细胞。以1400xg离心5min后，在10％-20％梯度聚丙烯酰胺/sds凝胶上分析上清液。[0466]使用干转移法电转移至硝酸纤维素膜上后，将印迹与抗flag抗体和抗小鼠igg过氧化物酶一起孵育。用ecl试剂盒可视化印迹并且通过imagej测量蛋白质印迹条带强度。[0467]如图18中所示，环状rna在细胞中被翻译成蛋白质。特别地，环状rna与其线性rna对应物相比产生更高水平的具有正确分子量的蛋白质。实例18：细胞分裂期间环状rna的持续性[0468]此实例展示了环状多核糖核苷酸在细胞分裂期间的持续性。经工程化以包含一种或多种所期望特性的非天然存在的环状rna可以通过细胞分裂在细胞中持续存在而不会被降解。如以下实例中所示，在hela细胞中在72h内监测表达环状高斯萤光素酶(gluc)的环状rna。[0469]在此实例中，1307nt环状rna包含cvb3ires、编码高斯萤光素酶(gluc)的orf、和两个侧接ires-orf的间隔元件。[0470]在hela细胞中监测环状rna在细胞分裂中的持续性。将96孔板中5000个细胞/孔用环状rna悬浮转染。在avos成像仪(赛默飞世尔公司)中进行亮细胞成像，并且在0h、24h、48h、72h和96h使用发光细胞活力测定(普洛麦格公司)进行细胞计数。通过使用高斯萤光素酶活性测定(赛默科技皮尔斯公司)，每天监测高斯萤光素酶活性以作为蛋白质表达的量度，并且在每24h从孔中移取的上清液中每天监测gluc表达。将50μl1xgluc底物添加至5μl血浆中，以进行gluc萤光素酶活性测定。在混合后立即在发光检测仪器(普洛麦格公司)上读取板。[0471]在正进行分裂的细胞中，检测到的环状rna的蛋白质表达水平高于线性rna(图19)。在所有测量时间点，与线性rna相比，具有环状rna的细胞具有更高的细胞分裂率。此实例展示了在细胞分裂期间环状rna的检测与其线性rna对应物相比增加。实例19：环状rna显示出相比于线性rna更低的毒性[0472]此实例展示了环状rna的毒性比线性rna低。[0473]对于此实例，环状rna包含emcvires、编码具有3xflag标签的nanoluc且两侧侧接交错元件(2a)的orf和终止元件(终止密码子)。如本文所述在体外生成环状rna并纯化。在此实例中使用的线性rna是具有球蛋白utr、编码nluc的经帽修饰的聚a尾rna或未经帽修饰的聚a尾rna。[0474]为了监测rna在细胞中的毒性，将bj人成纤维细胞铺板至96孔板的每个孔。在零、四十八和七十二小时后，按照制造商的建议使用基于脂质的转染试剂(赛默飞世尔公司)转染50ng环状或帽修饰的聚a尾线性rna。在96h在avos成像仪(赛默飞世尔公司)中进行亮细胞成像。使用imagej分析每种条件下的总细胞。[0475]如图20中所示，与线性rna相比，环状rna的转染展示了降低的毒性。实例20：获得用于非病毒环状rna细胞疗法的自体细胞[0476]在此实例中，获得用于非病毒、环状rna细胞疗法的细胞。使用car表达的治疗性细胞疗法已使用自体t细胞得到证实。此实例展示了获得用于非病毒环状rna细胞疗法的自体t细胞。[0477]鉴定符合cart细胞疗法条件的患者，并通过白细胞分离程序收集外周血单核细胞(pbmc)。然后在gmp条件下培养pbmc，用于t细胞工程化和扩增。通过免疫磁性细胞分离程序，使用阴性选择从pbmc中分离cd8 细胞毒性t细胞。然后使用激活的cd3/cd28动态珠激活患者t细胞(在t细胞优化培养基中3天)，并准备好用编码car的mrna电穿孔，并且随后输注到患者体内。实例21：获得用于非病毒环状rna细胞疗法的同种异体细胞[0478]在此实例中，获得用于非病毒、环状rna细胞疗法的细胞。使用car表达的治疗性细胞疗法已使用同种异体nk细胞得到证实。此实例展示了获得用于非病毒环状rna细胞疗法的同种异体nk细胞。[0479]通过白细胞分离程序从供体中收集外周血单核细胞(pbmc)。然后在gmp条件下培养pbmc，以使用标准方法进行nk细胞工程化和扩增(例如，shimasaki等人,cytotherapy[细胞疗法],2012；14:830-840aclinicallyadaptablemethodtoenhancethecytotoxicityofnaturalkillercellsagainstb-cellmalignancies[一种增强自然杀伤细胞抗b细胞恶性肿瘤细胞毒性的临床适应性方法])。然后，同种异体nk细胞准备好用编码car的mrna电穿孔，并且随后输注到患者体内。实例22：体外环状rna产生[0480]此实例描述了环状rna的体外产生。[0481]环状rna被设计为具有图21中所示的起始密码子(seqidno:1)、一个或多个orf(seqidno:2)、一个或多个交错元件(seqidno:3)、一个或多个加密原(seqidno:4)、和ires(seqidno:5)。环化使得能够滚环翻译多个开放阅读框(orf)，所述多个开放阅读框具有用于离散orf表达和受控的蛋白质化学计量的交替性交错元件、用于减弱或减轻rna免疫原性的一个或多个加密原、以及靶向rna用于核糖体进入的任选ires，而没有聚a序列。[0482]在此实例中，如下生成环状rna。使用t7rna聚合酶，通过体外转录由具有5’‑和3’‑zkscan1内含子和编码连接至2a序列的gfp的orf的dna区段合成未修饰的线性rna。将转录的rna用rna纯化系统(凯杰公司(qiagen))纯化，按照制造商的说明用碱性磷酸酶(赛默飞世尔科技公司，ef0652)处理，并且再次用rna纯化系统纯化。[0483]通过使用t4dna连接酶(新英格兰生物公司(newenglandbio,inc.)，m0202m)处理转录的线性rna和dna夹板来生成夹板连接环状rna，并且在用rna酶r处理富集后分离出环状rna。rna质量通过琼脂糖凝胶或自动电泳(安捷伦公司(agilent))进行评估。实例23：体内环状rna产生，细胞培养[0484]此实例描述了环状rna的体内产生。[0485]将gfp(seqidno:2)克隆至表达载体，例如pcdna3.1( )(阿德基因公司(addgene))(seqidno:6)中。将此载体诱变以诱导细胞中的环状rna产生(seqidno:6且如kramer等人2015所述)，如图22中所示。[0486]将hela细胞在37℃和5％co2下，在补充有青霉素-链霉素和10％胎牛血清、含高葡萄糖的杜尔贝科氏改良伊格培养基(dmem)(生命技术公司)中生长。使用脂质转染试剂(生命技术公司)转染一微克上述表达质粒，并且根据制造商的说明，在转染后的1小时与20天之间，使用基于酚的rna分离试剂(生命技术公司)从转染的细胞中分离总rna。[0487]为了测量gfp环状rna和mrna水平，使用随机六聚体进行qpcr逆转录。简而言之，对于rt-qpcr，将来自同一来源的hela细胞的总rna和rna酶r消化的rna用作rt-pcr的模板。为了制备gfpmrna和环状gfprna的cdna，根据制造商的说明，使用逆转录酶(super-scriptii:rna酶h；英杰公司)和随机六聚体进行逆转录反应。使用6％page分析扩增的pcr产物，并且通过溴化乙锭染色可视化。为了估算富集因子，通过光密度法(imagequant；分子动力学公司(moleculardynamics))定量pcr产物，并且通过uv吸光度测量总rna样品的浓度。[0488]用rna印迹分析进行另外的rna测量。简言之，使用基于酚的试剂(trizol)获得全细胞提取物，或者使用商业试剂盒(cellytic核提取试剂盒，西格玛公司)对细胞进行分级分离来获得核蛋白提取物和细胞质蛋白提取物。为了抑制rna聚合酶ii转录，在37℃下用夫拉平度(flavopiridol)(终浓度1mm；西格玛公司)处理细胞0-6h。对于rna酶r处理，将10mg的总rna用20u的rna酶r(奕必城公司(epicentre))在37℃下处理1h。[0489]使用寡核苷酸探针的rna印迹如下进行。使用标准引物设计工具设计寡核苷酸探针、pcr引物。将t7启动子序列添加至反向引物以获得体外转录反应中的反义探针。根据制造商的说明，使用t7rna聚合酶与dig-rna标记混合物进行体外转录。通过dnai消化去除dna模板，并且通过酚氯仿提取和随后的沉淀纯化rna探针。探针以50ng/ml使用。使用乙二醛上样染料(安拜昂公司(ambion))使总rna(2μg-10μg)变性，并且在mops缓冲液中的1.2％琼脂糖凝胶上解析。将凝胶在1×tbe中浸泡20min，并且使用半干印迹系统(伯乐公司)将其转移至hybond-n 膜(通用电气医疗集团(gehealthcare))上持续1h(15v)。将膜干燥，并且在120,000μjcm-2下进行1次uv交联(在265nm)。在68℃下进行预杂交1h，并且将dig标记的体外转录的rna探针杂交过夜。将膜在2×ssc、0.1％sds中在68℃下洗涤三次持续30min，随后在0.2×ssc、0.1％sds中在68℃下洗涤三次(30min)。用与碱性磷酸酶抗体直接缀合的抗dig进行免疫检测。使用化学发光碱性磷酸酶底物(cdpstar试剂)和图像检测和定量系统(las-4000检测系统)可视化免疫反应条带。实例24：环状rna的制备和体外翻译[0490]此实例描述了环状rna的基因表达和基因产物的检测。[0491]在此实例中，环状rna被设计为具有起始密码子(seqidno:1)、gfporf(seqidno:2)、一个或多个交错元件(seqidno:3)、一个或多个人源加密原(seqidno:4)且具有或不具有ires(seqidno:5)，参见图23。在此实例中，在体外或细胞中生成环状rna，如实例22和23中所述。[0492]将环状rna在兔网织红细胞裂解物(普洛麦格公司，美国威斯康星州菲奇堡(fitchburg,wi,usa))中在30℃下孵育5h或过夜。反应混合物的最终组成包含70％兔网织红细胞裂解物、10μm甲硫氨酸和亮氨酸、20μm除甲硫氨酸和亮氨酸以外的氨基酸和0.8u/μlrna酶抑制剂(东洋纺公司，日本大阪)。从混合物中取出等分试样，并且在10％-20％梯度聚丙烯酰胺/十二烷基硫酸钠(sds)凝胶(安进公司，日本东京)上分离。去除上清液，并且将沉淀物在70℃下溶解于2×sds样品缓冲液(0.125mtris-hcl，ph6.8，4％sds，30％甘油，5％2-巯基乙醇，0.01％溴酚蓝)中持续15min。在此过程中去除血红蛋白，而浓缩除血红蛋白以外的蛋白质。[0493]以1,400×g离心5min后，在10％-20％梯度聚丙烯酰胺/sds凝胶上分析上清液。使用可商购获得的标准品(伯乐公司)作为大小标记物。使用半干法电转移至聚偏二氟乙烯(pvdf)膜(默克密理博公司)之后，使用化学发光试剂盒(安诺伦公司)可视化印迹。实例25：环状rna的化学计量蛋白质表达[0494]此实例描述了环状rna化学计量表达蛋白质的能力。[0495]在此实例中，一种环状rna被设计为包含加密原(seqidno:4)和编码gfp的orf(seqidno:2)和编码rfp的orf(seqidno:7)，具有侧接gfp和rfporf的交错元件(seqidno:3)，参见图24a。类似地设计另一种环状rna，然而它将在gfp与rfporf之间具有终止和起始密码子，而不是侧接2a序列，参见图24b。在体外或细胞中生成环状rna，如实例22和23中所述。[0496]将环状rna在兔网织红细胞裂解物(普洛麦格公司，美国威斯康星州菲奇堡)中在30℃下孵育5h或过夜。反应混合物的最终组成包含70％兔网织红细胞裂解物、10μm甲硫氨酸和亮氨酸、20μm除甲硫氨酸和亮氨酸以外的氨基酸和0.8u/μlrna酶抑制剂(东洋纺公司，日本大阪)。从混合物中取出等分试样，并且在10％-20％梯度聚丙烯酰胺/十二烷基硫酸钠(sds)凝胶(安进公司，日本东京)上分离。去除上清液，并且将沉淀物在70℃下溶解于2×sds样品缓冲液(0.125mtris-hcl，ph6.8，4％sds，30％甘油，5％2-巯基乙醇，0.01％溴酚蓝)中持续15min。在此过程中去除血红蛋白，而浓缩除血红蛋白以外的蛋白质。[0497]以1,400×g离心5min后，在10％-20％梯度聚丙烯酰胺/sds凝胶上分析上清液。使用可商购获得的标准品(伯乐公司)作为大小标记物。使用半干法电转移至聚偏二氟乙烯(pvdf)膜(默克密理博公司)之后，使用化学发光试剂盒(安诺伦公司)可视化印迹。[0498]预期gfp和rfporf未被终止密码子和起始密码子隔开的环状rna将具有相等量的每种蛋白质，而使用在orf之间包括起始密码子和终止密码子的环状rna处理的细胞将具有不同量的每种蛋白质。序列表seqidno:1(起始密码子)augseqidno:2(gfp)egfp：seqidno:3(交错元件)p2a：gctactaacttcagcctgctgaagcaggctggcgacgtggaggagaaccctggacctt2a：gagggcaggggaagtctactaacatgcggggacgtggaggaaaatcccggcccae2a：cagtgtactaattatgctctcttgaaattggctggagatgttgagagcaacccaggtccc其他：f2a、bmcpv2a、bmifv2aseqidno:4zkscan内含子或seqidno:5(ires)ires(emcv)：seqidno:6(addgenep3.1漆酶)pcdna3.1( )漆酶2mcs外显子载体序列6926bpseqidno:7(rfp)mcherry：序列id9科扎克3xflag-egf无终止(264bp)5-13：科扎克序列14-262：3xflag-egfseqidno:10科扎克3xflag-egfp2a无终止(330bp)5-13：科扎克序列14-262：3xflag-egf263-328：p2aseqidno:11科扎克3xflag-egf无终止(264bp)5-13：科扎克序列14-262：3xflag-egfseqidno:12科扎克3xflag-egf终止(273bp)5-13：科扎克序列14-262：3xflag-egf263-271：三联终止密码子seqidno:13emcvirest2a3xflag-egfp2a无终止(954bp)5-574：emcvires575-637：t2a638-886：3xfalg-egf887-952：p2aseqidno:14emcvt2a3xflagnlucp2a终止(1314nt)5-574：emcvires575-637：t2a638-1237：3xflagnluc1238-1303：p2a1304-1312：三联终止密码子seqidno:15emcvt2a3xflagnlucp2a无终止(1305nt)5-574：emcvires575-637：t2a638-1237：3xflagnluc1238-1303：p2aseqidno:16cd19carorf：seqidno:17cvb3ires：seqidno:18人α球蛋白5’utr：actcttctggtccccacagactcagagagaacccaccseqidno:19人α球蛋白3’utr：seqidno:20具有退火区的c2最小序列seqidno:21具有退火区的非结合序列seqidno:22具有退火区的36a序列seqidno:23增强型绿色荧光蛋白dna模板seqidno:24cvb3mpahisseqidno:25cvb3mpahe1e2seqidno:26cvb3iresseqidno:27mpah(苯丙氨酸羟化酶，小鼠)seqidno:28科扎克3xflag-egfp2a无终止(330bp)5-13：科扎克序列14-262：3xflag-egf263-328：p2aseqidno:29科扎克1xflag-egft2a1xflag-nlucp2a无终止(873bp)5-13：科扎克序列14-202：1xflag-egf203-265：t2a266-805：1xflag-nluc806-871：p2aseqidno:30科扎克1xflag-egf终止1xflag-nluc终止(762bp)5-13：科扎克序列14-202：1xflag-egf203-211：三联终止密码子212-751：1xflag-nluc752-760：三联终止密码子当前第1页12当前第1页12