一种银杏叶黄酮提取物及其制备方法和特征图谱构建方法与流程

1.本发明涉及生物技术及医药技术领域，特别是一种银杏叶黄酮提取物及其制备方法和特征图谱构建方法。


背景技术：

2.银杏叶提取物是广泛用于心脑血管疾病的天然植物药，主要成分为黄酮、内酯、有机酸等，其中黄酮为主要的活性物质与指标物质之一。银杏中黄酮结构少部分为苷元，其包括槲皮素、山柰酚、异鼠李素、杨梅素、木犀草素、芹菜素、丁香亭、二氢山柰酚等；大部分为上述苷元的3位或7位糖苷，糖基主要为d-葡萄糖、l-鼠李糖、芸香糖等单糖、二糖、三糖结构。此外，还含有桂皮酰基的黄酮糖苷如槲皮苷-2
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(6
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对-桂皮酰基葡萄糖基)(2
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(6
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p-coumaroylglucosyl)quercitrin)、山柰酚-3-(6”'-对-桂皮酰基葡萄糖基-鼠李糖苷)(kaempferol 3-(6”'-p-coumarylglucosyl-rhamnoside))等，这类桂皮酰黄酮糖苷是银杏中特有的成分，被认为是银杏中的药效活性成分。us20070037756“compositions and methods for the prevention and treatment of circulatory conditions(预防和治疗循环系统疾病的组合物和方法)”中报道了槲皮苷-2
”-
(6
”-
对-桂皮酰基葡萄糖基)和山柰酚-3-(6”'-对-桂皮酰基葡萄糖基-鼠李糖苷)作为血小板聚集抑制剂用于预防和治疗某些心血管疾病。其中，槲皮苷-2
”-
(6
”-
对-桂皮酰基葡萄糖基)和山柰酚-3-(6”'-对-桂皮酰基葡萄糖基-鼠李糖苷)的化学结构式如下：
[0003][0004]
黄酮类物质因其酚羟基结构表现出重金属络合以及抗氧化作用；有报道表明银杏中槲皮素糖苷可以降低血压，其机理可能是在血管收缩过程中加快超氧化物或过氧化氢的消除；其他临床研究报道表明槲皮素相关苷可以增强血管功能、抗免疫、抗感染等功能；银杏中山柰酚相关黄酮苷通过pi3k/akt/pkb信号通路的调控表现出抗凝血作用。可见，银杏叶黄酮类物质具有较多且显著的药理药效作用，提高银杏叶黄酮类物质的含量具有非常高的应用价值。
[0005]
以符合国家药典标准的银杏叶提取物(总黄酮醇苷含量不得少于24％(w/w)，萜类内酯含量不得少于6％(w/w))为原料制备银杏叶黄酮的提取方法已有相关报道。其中，郑向伟等在“酸性-极性相结合的改性大孔树脂柱色谱制备高纯度银杏黄酮醇苷”、(中国医药工业杂志,2018,49(9):1283～1288)一文中利用极性-酸性相结合的改性大孔树脂(lsa-12s)柱，湿法装柱(径高比1∶5)，湿法上样(上样比例1∶30)，依次用水、0.1％(v/v)碳酸钠溶液
(各5倍柱体积)洗脱，收集0.1％(v/v)碳酸钠溶液洗脱产物，减压浓缩至适当体积，用稀盐酸调至ph 1～3。将该酸性产物上样于聚酰胺柱(径高比1∶10，上样比例1∶30)，依次用水和20％(v/v)、80％(v/v)乙醇溶液(各5倍柱体积)，收集80％(v/v)乙醇洗脱部分，减压浓缩、干燥，得到纯度≥80％(w/w)的银杏黄酮醇苷产物；总黄酮醇苷含量为83.1
±
7.5％(w/w)，总黄酮醇苷转移率20.9
±
7.7％。文中未公开其所制备的银杏黄酮苷种类及对应含量。
[0006]
张静在“银杏黄酮纯化及生物活性的研究”(江南大学,2010)一文中采用聚酰胺树脂柱进行银杏黄酮的纯化，黄酮的上样浓度为1.41mg/ml，上样速度为2ml/min，用30％(v/v)的乙醇作为恒组成洗脱溶剂，产物中总黄酮含量由24％(w/w)提高到50％(w/w)以上；同时利用酸水解工艺制备黄酮苷元，水解温度80℃，盐酸为25％(v/v)，与甲醇配成体积分数为1:4溶液，原料浓度为1mg/ml的条件下，水解2h，黄酮的得率为90％(w/w)；采用液相色谱及液质联用检测水解后样品，结果表明水解前黄酮主要以糖苷形式存在，鉴定水解后产品主要含槲皮素、山柰酚和异鼠李素。该方法采用酸水解制备黄酮苷元，所制得成分与醇提不同，且所用酸水对环境污染大。
[0007]
张伟等在“高纯度银杏黄酮的制备”(安徽农业科学,2011,39(2):764～765,769)一文中固相填料为ods的色谱柱纯化银杏黄酮，甲醇∶0.5％(v/v)磷酸＝5∶5和7∶3(v∶v)的馏分为目标馏分，45℃浓缩和干燥温度，银杏黄酮质量百分含量≥90％，收率为78.3％。该工艺采用ods色谱柱制备银杏黄酮，其生产成本较高，不适合工业大生产使用。此外，也未公开其所制备的银杏黄酮种类及其水解后的黄酮苷元成分。
[0008]
可见，目前制备高纯度的银杏黄酮是研究热点，但这类高含量银杏黄酮成分的鉴别方法研究仍然较为罕见，更多的是银杏叶提取物成分鉴别方法，如yi-bing ji等在“development,optimization and validation of a fingerprint of ginkgo biloba extracts by high-performance liquid chromatography(银杏叶提取物高效液相色谱法指纹图谱的开发，优化和验证)”(j.chromatogr.a1066(2005):97～104)一文中采用c18柱，以乙腈(a)-0.1％(v/v)磷酸(b)为流动相，0～40min，流动相a为14％
→
30％，柱温30℃，检测波长350nm。通过标准品对照确定了指纹图谱中的黄酮种类为：芦丁、槲皮素、山柰酚-3-o-β-d-葡萄糖苷、山柰酚-3-o-(6-o-(α-l-鼠李糖基)-β-d-葡萄糖基)、槲皮素-3-o-(α-l-鼠李糖基)。
[0009]
cn107884483a“一种银杏叶及其制剂中黄酮类成分的含量测定方法及用途”(申请日2017.09.27，公开日2018.04.06)选择十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以乙腈为流动相a，以0.08％～0.12％(v/v)的乙酸-乙腈溶液为流动相b，流速为0.9～1.1ml/min，检测波长为355nm～365nm，柱温为38℃～42℃。洗脱梯度：0～25min，流动相a为10％
→
25％；25min～40min，流动相a为25％
→
35％；40min～45min，流动相a为35％
→
80％；45min～60min，流动相a为80％。指纹图谱中的黄酮种类为：槲皮素-3-o-(2”,6
”-
α-l-二鼠李糖)-β-d-葡萄糖、槲皮素-3-o-α-l-鼠李糖-2
”-
(6-对香豆酰基)-β-d-葡萄糖-7-o-β-d-葡萄糖、山柰素-3-o-α-l-鼠李糖-2
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(6
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p-对香豆酰基)-β-d-葡萄糖苷、异鼠李素-3-o-[2,6-di-o-(α-l-二鼠李糖)]-β-d-葡萄糖、芦丁、槲皮素-3-o-葡萄糖苷、槲皮素-3-o-(2
”-
β-d-葡萄糖)-α-l-鼠李糖苷、烟花苷、水仙苷、异鼠李素-3-o-β-d-葡萄糖苷和山柰素-3-o-葡萄糖鼠李糖苷。
[0010]
cn108362809a“一种银杏叶及其提取物与制剂的质量评价方法”(申请日
2018.02.01，公布日2018.08.03)以八或十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相a，以0.1％(v/v)甲酸水溶液为流动相b，梯度洗脱：0～20min，流动相a为15％
→
20％；20min～25min，流动相a为20％
→
30％；25min～30min，流动相a为30％
→
35％；30min～45min，流动相a为35％
→
40％；采用紫外检测器检测波长为210nm～360nm；流速为0.5ml/min～1.5ml/min，保持柱温20℃～45℃。通过高效液相法一测多评，同时定量银杏中槲皮素-3-o-(2”,6
”-
二-o-α-l-鼠李糖基)-β-d-葡萄糖苷、山柰酚-3-o-(2”,6
”-
二-o-α-l-鼠李糖基)-β-d-葡萄糖苷、槲皮素-3-o-芸香糖-7-o-葡萄糖苷、3'-甲基-杨梅素-3-o-芸香糖苷、槲皮素-3-o-葡萄糖苷、山柰酚-3-o-芸香糖苷、异鼠李素-3-o-β-d-芸香糖苷、山柰酚3-(2
”-
β-d-葡萄糖苷)-α-l-鼠李糖苷、槲皮素3-o-α-(6”'-p-香豆酰基-葡萄糖苷-β-1,4-鼠李糖苷)、山柰酚3-o-α-(6”'-p-香豆酰基-葡萄糖苷-β-1,2-鼠李糖苷)的含量。
[0011]
上述技术方案归属的黄酮成分非银杏特有黄酮，因此均无法解决银杏制剂中掺杂其他来源黄酮的鉴别，以及银杏黄酮质量充分反映的问题。而且，液相出峰时间较长，无法做到16min内快速检测。此外，银杏叶中黄酮提取物的特征图谱及其构建方法未见报道，且银杏叶中黄酮提取物相比银杏叶提取物，黄酮成分及含量均有所变化，无法直接使用上述报道的银杏叶提取物特征图谱构建方法来实现。
[0012]
因此，需要提供一种从银杏叶提取物中获得成分及含量明确的高纯度黄酮提取物，并在此基础上建立一种能充分反映高纯度黄酮提取物质量的特征图谱分析方法，鉴别黄酮成分来源，解决效应成分不明，质量控制困难的问题。


技术实现要素：

[0013]
本发明提供一种从银杏叶提取物(符合国家药典标准)中获得的高纯度黄酮提取物，提取物命名为银杏叶黄酮提取物，并提供该银杏叶黄酮提取物的制备方法和特征图谱构建方法，解决银杏叶黄酮提取物效应成分不明、质量控制困难的问题。
[0014]
本发明提供一种银杏叶黄酮提取物，该提取物总黄酮的含量不低于85％(w/w)，所述提取物药效成分由如下部分组成：杨梅素-3-o-芸香糖含量3％～6％(w/w)，杨梅素-3-o-葡萄糖3％～6％(w/w)，芦丁8％～11％(w/w)，万寿菊素-3-o-芸香糖5％～7％(w/w)，槲皮素-3-o-芸香糖5％～7％(w/w)，山柰酚-3-o-芸香糖6％～9％(w/w)，异鼠李素-3-o-芸香糖6％～10％(w/w)，槲皮苷-2
”-
(6
”-
对-桂皮酰基葡萄糖基)13％～15％(w/w)，山柰酚-3-(6”'-对-桂皮酰基葡萄糖基-鼠李糖苷)11％～15％(w/w)，槲皮苷-2
”-
(6
”-
对-桂皮酰基葡萄糖基)与芦丁的含量比为1.2～1.8，山柰酚-3-(6”'-对-桂皮酰基葡萄糖基-鼠李糖苷)与芦丁的含量比为1.0～1.8，槲皮素-3-o-芸香糖与山柰酚-3-o-芸香糖的含量比值为0.6～1.15。
[0015]
优选的，槲皮苷-2
”-
(6
”-
对-桂皮酰基葡萄糖基)与芦丁的含量比为1.33～1.64，山柰酚-3-(6”'-对-桂皮酰基葡萄糖基-鼠李糖苷)与芦丁的含量比为1.16～1.57，槲皮素-3-o-芸香糖与山柰酚-3-o-芸香糖的含量比值为0.75～0.91。
[0016]
进一步，银杏叶黄酮提取物的制备方法包括如下步骤：
[0017]
1)将符合国家药典标准的银杏叶提取物用沸水或乙醇溶液溶解制成上样液；进一步的，沸水为沸腾纯化水，乙醇溶液浓度不高于10％(v/v)，优选的，用8％(v/v)乙醇溶液溶解制成上样液。
[0018]
2)将上样液通过聚酰胺柱，用3～5倍柱体积的纯化水洗脱，弃去洗脱液，再用0.1％～0.5％(v/v)碳酸钠溶液5～8倍柱体积洗脱，收集碳酸钠溶液洗脱液；优选的，用4倍柱体积的纯化水洗脱，弃去洗脱液，再用0.15％(v/v)碳酸钠溶液7倍柱体积洗脱。
[0019]
3)将碳酸钠溶液洗脱液调节ph至1～5，制成二次上样液；优选的，调节ph至3。
[0020]
4)将二次上样液通过聚酰胺柱，用3～5倍柱体积纯化水洗脱，弃去洗脱液，再用5～8倍柱体积40％～80％(v/v)乙醇溶液洗脱，收集乙醇溶液洗脱液；优选的，用4倍柱体积纯化水洗脱，弃去洗脱液，用7倍柱体积60％(v/v)乙醇溶液洗脱。
[0021]
5)收集乙醇溶液洗脱液，浓缩干燥得银杏叶黄酮提取物。
[0022]
优选的，上述制备方法中的洗脱流速为1～4倍柱体积(bv)/h；
[0023]
优选的，上述制备方法中的聚酰胺柱为10～30目、30～60目、80～100目。
[0024]
进一步的，银杏叶黄酮提取物的特征图谱构建方法包括以下步骤：
[0025]
1)供试品的制备：取银杏叶黄酮提取物5～10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加50％(v/v)甲醇溶解，并稀释至刻度，滤膜过滤，取续滤液，即得；
[0026]
2)对照品的制备：取芦丁对照品适量，加甲醇制成对照品溶液；
[0027]
3)将供试品溶液进行超高效液相色谱(uplc)分析，得到超高效液相色谱特征图谱，根据与对照品的相对保留时间确定共有峰，采用uplc-ms法指证特征峰的化学成分，利用标准品对照，建立银杏叶黄酮提取物的超高效液相色谱特征图谱；所述uplc分析的条件为：
[0028]
色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的phenomenx luna omega(2.1
×
100mm，1.6μm)色谱柱。
[0029]
质谱条件：采用q-tof方法，一级质谱参数为干燥气温度300～400℃，干燥气流速10～15l/min，雾化器压力42～46psig，毛细管压力4500～5500v；二级质谱参数为干燥气温度300～400℃，干燥气流速10～15l/min，雾化器压力40～50psig，毛细管压力4500～5500v，碰撞能量90～120v；
[0030]
优选的，一级质谱参数为干燥气温度350℃，干燥气流速12l/min，雾化器压力45psig，毛细管压力5000v；二级质谱参数为干燥气温度350℃，干燥气流速12l/min，雾化器压力45psig，毛细管压力5000v，碰撞能量100v。
[0031]
流动相为乙腈(a)与0.08～0.12％(v/v)甲酸水溶液(b)，检测波长300～370nm，柱温27～33℃；
[0032]
优选的，流动相为乙腈(a)与0.10％(v/v)甲酸水溶液(b)，检测波长360nm，柱温为30℃。
[0033]
梯度洗脱：按照体积分数计，如表1所示：
[0034]
表1流动相洗脱梯度
[0035]
[0036]
进一步的，步骤(3)中所述特征峰为12个，其中峰1为杨梅素-3-o-芸香糖，相对保留时间为0.578；峰2为杨梅素-3-o-葡萄糖，相对保留时间为0.644；峰3为碟豆素，相对保留时间为0.725；峰4为芦丁，相对保留时间为1.000；峰5为万寿菊素-3-o-芸香糖，相对保留时间为1.083；峰6为槲皮素-3-o-芸香糖，相对保留时间为1.166；峰7为山柰酚-3-o-芸香糖，相对保留时间为1.441；峰8为异鼠李素-3-o-芸香糖，相对保留时间为1.490；峰9为槲皮苷，相对保留时间为1.632；峰10为山柰酚-3-o-葡萄糖-(1-2)鼠李糖苷，相对保留时间为2.099；峰11为槲皮苷-2
”-
(6
”-
对-桂皮酰基葡萄糖基)，相对保留时间为2.551；峰12为山柰酚-3-(6”'-对-桂皮酰基葡萄糖基-鼠李糖苷)，相对保留时间为2.835。
[0037]
进一步，利用构建的银杏叶黄酮提取物特征图谱进行银杏叶黄酮提取物鉴别的方法，取银杏叶黄酮提取物样品，按本发明同法操作，得到银杏叶黄酮提取物样品特征图谱，采用中药色谱指纹图谱相似性评价系统软件对所述样品特征图谱本发明的银杏叶黄酮提取物特征图谱进行分析，相似度大于0.9为合格产品。
[0038]
本发明具体有益效果如下：
[0039]
1、本发明提供了一种黄酮纯度高、效应成分明确、抗氧化性强的银杏黄酮提取物。本发明公开了银杏叶黄酮提取物中药效成分包括杨梅素-3-o-芸香糖含量3％～6％(w/w)，杨梅素-3-o-葡萄糖含量3％～6％(w/w)，芦丁含量8％～11％(w/w)，万寿菊素-3-o-芸香糖含量5％～7％(w/w)，槲皮素-3-o-芸香糖含量5％～7％(w/w)，山柰酚-3-o-芸香糖含量6％～9％(w/w)，异鼠李素-3-o-芸香糖含量6％～10％(w/w)，槲皮苷-2
”-
(6
”-
对-桂皮酰基葡萄糖基)含量13％～15％(w/w)，山柰酚-3-(6”'-对-桂皮酰基葡萄糖基-鼠李糖苷)含量11％～15％(w/w)。槲皮苷-2
”-
(6
”-
对-桂皮酰基葡萄糖基)与芦丁的含量比为1.2～1.8，山柰酚-3-(6”'-对-桂皮酰基葡萄糖基-鼠李糖苷)与芦丁的含量比为1.0～1.8，槲皮素-3-o-芸香糖与山柰酚-3-o-芸香糖的含量比值为0.6～1.15，总黄酮含量(以cgq为对照品测定)大于85％(w/w)。本发明解决了银杏叶黄酮提取物中黄酮纯度低、效应成分不明的问题，降低了质量控制难度。经uplc对比分析，银杏叶黄酮提取物基本保留了其原料银杏叶提取物中的黄酮种类，为银杏叶提取物来源的总黄酮的精制提供方法，并提高银杏叶黄酮物质的使用效率。同时，在此提取物的黄酮醇苷种类及含量下，其抗氧化性是银杏叶提取物标准品的1.86倍。
[0040]
黄酮类化合物具有抗氧化活性，黄酮的种类和含量直接影响抗氧化活性大小。在银杏黄酮成分研究中，特征图谱所示12个主要特征峰以外，还有多种其他黄酮，因此总黄酮含量与上述9种黄酮醇苷含量总值不同。特征图谱中响应值也表明上述9种黄酮醇苷所占比例较高，因此在抗氧化活性研究中有较好的参考作用。结合不同工艺下9种黄酮醇苷总含量对比，如表2所示，批号3～6的银杏黄酮醇苷总含量表明，批号4～6的9种黄酮醇苷总含量分别为68.37％(w/w)、68.97％(w/w)、67.31％(w/w)略高于批号3银杏黄酮醇苷总含量64.14％(w/w)，但批号4～6的清除率ic
50
值在0.010～0.011mg/ml，高于批号3的ic
50
值0.008mg/ml。由此可见，批号3的黄酮成分在抗氧化功能上存在协同作用。结合黄酮醇苷含量对比可得，实施例1～3所得的银杏叶黄酮提取物中，9种银杏黄酮醇苷为代表的黄酮成分在对应含量范围下存在抗氧化活性的协调作用，产生增效的结果。
[0041]
表2不同制备工艺下银杏叶中黄酮提取物的对比
[0042][0043]
注：ic
50
值越小，抗氧化活性越好。
[0044]
2、本发明还提供了一种银杏总黄酮转移率大于65.8％，生产成本较低，原料消耗少，适用工业化大生产的高纯度银杏黄酮提取物制备方法。本发明采用银杏叶提取物上样于聚酰胺柱由纯水、0.1％～0.50％(v/v)碳酸钠溶液洗脱，洗脱液再次上样聚酰胺柱经纯水、40％～80％(v/v)乙醇再次洗脱，得到银杏叶黄酮提取物。其中总黄酮醇苷含量(以药典方法测定)为56％～63％(w/w)，与银杏叶提取物(原料)的总黄酮醇苷含量24％(w/w)相比有极大的提高，银杏叶黄酮提取物中总黄酮醇苷转移率为65％～72％，降低原料消耗，减少资源浪费。本发明采用银杏叶提取物，经两步聚酰胺柱层析获得高纯度银杏黄酮提取物：第一步，聚酰胺层析采用碳酸钠溶液洗脱，将黄酮醇苷分子解离后洗脱而下，未解离杂质被初步分离；第二步，黄酮醇苷解离分子经酸化后重新形成分子形态，经乙醇洗脱时羟基置换后洗脱而下，羟基置换能力弱的杂质被再次分离；最后将洗脱液浓缩得到高纯度银杏黄酮提取物。所用聚酰胺柱可以采用碱洗除杂，酸洗活化，可重复使用，降低生产成本。
[0045]
采用现有技术中lsa-12s大孔树脂柱进行提取物精制，因粒径较小(粒径0.3mm～0.6mm)存在堵塞现象，故改用仅粒径稍增大的lsa-12大孔树脂柱(粒径0.8mm～1.3mm)进行银杏叶中黄酮提取物精制(实施例4)。经lsa-12大孔树脂柱获得的黄酮提取物总黄酮(以cgq为对照品测定)含量为75.94％(w/w)，低于本发明获得的银杏叶黄酮提取物总黄酮含量；经黄酮醇苷含量测定发现，经lsa-12获得的黄酮提取物中杨梅素-3-o-芸香糖、杨梅素-3-o-葡萄糖、芦丁、槲皮素-3-o-芸香糖、异鼠李素-3-o-芸香糖与本发明获得的银杏黄酮提取物有较大差距；此外在抗氧化功能上，经lsa-12大孔树脂柱获得的黄酮提取物清除率ic
50
值为0.011mg/ml，高于本发明获得的银杏叶黄酮提取物清除率ic
50
值0.007～0.008mg/ml，本发明获得的银杏叶黄酮提取物具有更好的抗氧化效果。本发明人发现在采用lsa-12大孔树脂柱洗脱过程中各个黄酮极性不相同，会有部分黄酮因极性小而无法被洗脱下来，导致最终提取物中黄酮醇苷含量的差异，采用聚酰胺柱在本发明的洗脱条件下能更好的分离抗氧化活性成分。
[0046]
本发明对首次洗脱的碱溶液进行优化发现，相同条件下0.15％(v/v)醋酸钠溶液洗脱(实施例5)得到的黄酮提取物总黄酮(以cgq为对照品测定)含量89.82％(w/w)，9种黄酮醇苷总含量68.97％(w/w)，清除率ic
50
值0.010mg/ml，相比于本发明相同条件下采用的0.15％(v/v)碳酸钠(实施例1)，总黄酮含量、9种黄酮醇苷总含量、抗氧化活性较低，其中万寿菊素-3-o-芸香糖、槲皮苷-2
”-
(6
”-
对-桂皮酰基葡萄糖基)含量显著降低。采用醋酸钠代替碳酸钠会影响总黄酮含量及转移率，主要因为相同浓度下醋酸钠碱性低于碳酸钠，碱性越小，洗脱能力越弱，导致总黄酮含量减少，转移率降低。
[0047]
同时对碳酸钠的百分比浓度进行考察，发现在相同条件下采用2％(v/v)碳酸钠溶液洗脱(实施例6)得到的总黄酮(以cgq为对照品测定)含量为73.64％(w/w)，9种黄酮醇苷总含量为67.31％(w/w)，清除率ic
50
值为0.010mg/ml，相比于本发明相同条件下采用的0.15％(v/v)碳酸钠(实施例1)，总黄酮含量、9种黄酮醇苷总含量、抗氧化活性较低。碳酸钠含量过高导致部分杂质被洗脱，导致总黄酮含量减少。结合实施例1～实施例3判断，含量0.1％～0.5％(v/v)的碳酸钠在银杏叶黄酮提取工艺中具有专属性。
[0048]
此外，中试结果表明(实施例6～7)，本发明的制备方法大规模生产的总黄酮含量及转移率与小批量相近；从各黄酮醇苷含量对比发现，批号8～10黄酮醇苷含量的批间精密度考察中，rad小于3％，工艺稳定性较好。
[0049]
3、本发明公开了建立银杏叶黄酮提取物的特征图谱的方法，该方法实现了银杏叶黄酮提取物中主要的12种黄酮醇苷的快速鉴别，可在16min内实现成分检测。通过中药色谱指纹图谱相似性评价系统软件对比样品特征图谱与本发明特征图谱，相似度大于0.9可判断样品质量合格。
[0050]
现有银杏叶提取物特征图谱中归属的一般黄酮成分槲皮素、异鼠李素、山柰酚等多种黄酮苷广泛存在于多种植物中，无法鉴别提取物中是否掺入其他植物成分，未能实现有效的质量检测。本发明构建的特征图谱分离并归属了槲皮苷-2
”-
(6
”-
对-桂皮酰基葡萄糖基)、山柰酚-3-(6”'-对-桂皮酰基葡萄糖基-鼠李糖苷)特征峰。此类桂皮酰黄酮苷作为血小板聚集抑制剂用于预防和治疗某些心血管疾病，属于药效活性成分；同时上述化合物为银杏叶特有成分。由此构建的特征图谱，不仅能同步检测药效活性成分，且质量检测具有专属性。
[0051]
4、银杏叶黄酮提取物未检测出银杏酸，满足中国药典要求的银杏叶提取物中银杏酸小于1ppm的要求，应用安全，可作为食品、保健品中的抗氧化剂。
附图说明
[0052]
图1为银杏叶黄酮提取物特征图谱，其中1为杨梅素-3-o-芸香糖，2为杨梅素-3-o-葡萄糖，3为碟豆素，4为芦丁，5为万寿菊素-3-o-芸香糖，6为槲皮素-3-o-芸香糖，7为山柰酚-3-o-芸香糖，8为异鼠李素-3-o-芸香糖，9为槲皮苷，10为山柰酚-3-o-葡萄糖-(1-2)鼠李糖苷，11为槲皮苷-2
”-
(6
”-
对-桂皮酰基葡萄糖基)，12为山柰酚-3-(6”'-对-桂皮酰基葡萄糖基-鼠李糖苷)。
[0053]
图2为银杏叶黄酮提取物特征图谱流动相条件优化结果，
①
为流动相乙腈(a)-0.12％(v/v)甲酸水溶液(b)，
②
为流动相乙腈(a)-0.10％(v/v)甲醇溶液(b)，
③
为流动相乙腈(a)-0.08％(v/v)甲醇溶液(b)。其中1为杨梅素-3-o-芸香糖，2为杨梅素-3-o-葡萄糖，3为碟豆素，4为芦丁，5为万寿菊素-3-o-芸香糖，6为槲皮素-3-o-芸香糖，7为山柰酚-3-o-芸香糖，8为异鼠李素-3-o-芸香糖，9为槲皮苷，10为山柰酚-3-o-葡萄糖-(1-2)鼠李糖苷，11为槲皮苷-2
”-
(6
”-
对-桂皮酰基葡萄糖基)，12为山柰酚-3-(6”'-对-桂皮酰基葡萄糖基-鼠李糖苷)。
[0054]
图3为银杏叶黄酮提取物特征图谱柱温条件优化结果，
①
为柱温27℃，
②
为柱温30℃，
③
为柱温33℃。其中1为杨梅素-3-o-芸香糖，2为杨梅素-3-o-葡萄糖，3为碟豆素，4为芦丁，5为万寿菊素-3-o-芸香糖，6为槲皮素-3-o-芸香糖，7为山柰酚-3-o-芸香糖，8为异鼠李
素-3-o-芸香糖，9为槲皮苷，10为山柰酚-3-o-葡萄糖-(1-2)鼠李糖苷，11为槲皮苷-2
”-
(6
”-
对-桂皮酰基葡萄糖基)，12为山柰酚-3-(6”'-对-桂皮酰基葡萄糖基-鼠李糖苷)。
[0055]
图4为银杏叶黄酮提取物特征图谱色谱柱优化结果，其中
①
为waters beh shield rp18色谱柱，
②
为waters acquity uplc hss t3色谱柱，
③
为phenomenx luna omega色谱柱。其中1为杨梅素-3-o-芸香糖，2为杨梅素-3-o-葡萄糖，3为碟豆素，4为芦丁，5为万寿菊素-3-o-芸香糖，6为槲皮素-3-o-芸香糖，7为山柰酚-3-o-芸香糖，8为异鼠李素-3-o-芸香糖，9为槲皮苷，10为山柰酚-3-o-葡萄糖-(1-2)鼠李糖苷，11为槲皮苷-2
”-
(6
”-
对-桂皮酰基葡萄糖基)，12为山柰酚-3-(6”'-对-桂皮酰基葡萄糖基-鼠李糖苷)。
[0056]
图5为银杏叶提取物与银杏叶黄酮提取物的uplc图对比，
①
为银杏叶提取物uplc图，
②
为银杏叶黄酮提取物uplc图。
具体实施方式
[0057]
下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。
[0058]
实施例1：银杏叶黄酮制备方法-1
[0059]
1)取符合国家药典标准的银杏叶提取物10g，加8％(v/v)乙醇溶液配制成2％(v/v)上样液；
[0060]
2)将上样液通过聚酰胺柱(30～60目)，流速2bv/h，先用4倍柱体积(bv)纯化水洗，流速2bv/h，弃去洗脱液，再用7倍柱体积0.15％(v/v)碳酸钠溶液洗脱，流速2bv/h，收集碳酸钠溶液洗脱液；
[0061]
3)碳酸钠溶液洗脱液用盐酸调ph至3，制成二次上样液；
[0062]
4)将二次上样液通过聚酰胺柱(参数同上)，流速2bv/h，先用4倍柱体积纯化水洗脱，流速4bv/h，弃去洗脱液，再用7倍柱体积60％(v/v)乙醇洗脱，流速4bv/h，收集乙醇溶液洗脱液；
[0063]
5)将乙醇溶液洗脱液浓缩、干燥、粉碎，即得提取物。设为批号1。
[0064]
实施例2：银杏叶黄酮制备方法-2
[0065]
1)取符合国家药典标准的银杏叶提取物10g，加10％(v/v)乙醇溶液配制成2％(v/v)上样液；
[0066]
2)将上样液通过聚酰胺柱(10～30目)，流速1bv/h，先用3倍柱体积(bv)纯化水洗，流速1bv/h，弃去洗脱液，再用5倍柱体积0.5％(v/v)碳酸钠溶液洗脱，流速1bv/h，收集碳酸钠溶液洗脱液；
[0067]
3)碳酸钠溶液洗脱液用盐酸调ph至5，制成二次上样液；
[0068]
4)将二次上样液通过聚酰胺柱(参数同上)，流速1bv/h，先用5倍柱体积纯化水洗脱，流速3bv/h，弃去洗脱液，再用5倍柱体积80％(v/v)乙醇洗脱，流速1bv/h，收集乙醇溶液洗脱液；
[0069]
5)将乙醇溶液洗脱液浓缩、干燥、粉碎，即得提取物。设为批号2。
[0070]
实施例3：银杏叶黄酮制备方法-3
[0071]
1)取符合国家药典标准的银杏叶提取物10g，加沸水(即沸腾纯化水)使溶解，再加水制成2％(v/v)上样液；
[0072]
2)将上样液通过聚酰胺柱(80～100目)，流速3bv/h，先用5倍柱体积(bv)纯化水
洗，流速4bv/h，弃去洗脱液，再用8倍柱体积0.1％(v/v)碳酸钠溶液洗脱，流速4bv/h，收集碳酸钠溶液洗脱液；
[0073]
3)将碳酸钠溶液洗脱液用盐酸调ph至1，制成二次上样液；
[0074]
4)将二次上样液通过聚酰胺柱(参数同上)，流速3bv/h，先用3倍柱体积纯化水洗脱，流速1bv/h，弃去洗脱液，再用8倍柱体积40％(v/v)乙醇洗脱，流速3bv/h，收集乙醇溶液洗脱液；
[0075]
5)将乙醇溶液洗脱液浓缩、干燥、粉碎，即得提取物。设为批号3。
[0076]
实施例4：银杏叶黄酮制备方法-4
[0077]
采用现有技术进行在实施例1工艺的基础上比较柱层析填料对黄酮含量及转移率的影响。该技术方案起初使用现有技术中采用的lsa-12s大孔树脂柱替代聚酰胺柱，因粒径较小(0.3mm～0.6mm)存在堵塞现象，故采用仅粒径稍作调整的lsa-12大孔树脂柱(粒径0.8mm～1.3mm)。
[0078]
1)取符合国家药典标准的银杏叶提取物10g，加8％(v/v)乙醇溶液配制成2％(v/v)上样液；
[0079]
2)将上样液通过lsa-12大孔树脂(粒径0.8mm～1.3mm)，流速2bv/h，先用4倍柱体积(bv)纯化水洗，流速2bv/h，弃去洗脱液，再用7倍柱体积0.15％(v/v)碳酸钠溶液洗脱，流速2bv/h，收集碳酸钠溶液洗脱液；
[0080]
3)将碳酸钠溶液洗脱液用盐酸调ph至3，制成二次上样液；
[0081]
4)将二次上样液通过聚酰胺柱(30～60目)，流速2bv/h，先用4倍柱体积纯化水洗脱，流速4bv/h，弃去洗脱液，再用7倍柱体积60％(v/v)乙醇洗脱，流速4bv/h，收集乙醇溶液洗脱液；
[0082]
5)将乙醇溶液洗脱液浓缩、干燥、粉碎，即得提取物。设为批号4。
[0083]
实施例5：银杏叶黄酮制备方法-5
[0084]
在实施例1工艺的基础上，采用醋酸钠替代碳酸钠进行洗脱，比较洗脱液对黄酮含量、转化率的影响。
[0085]
1)取符合国家药典标准的银杏叶提取物10g，加8％(v/v)乙醇溶液配制成2％(v/v)上样液；
[0086]
2)将上样液通过聚酰胺柱(30～60目)，流速2bv/h，先用4倍柱体积(bv)纯化水洗，流速2bv/h，弃去洗脱液，再用7倍柱体积0.15％(v/v)醋酸钠溶液洗脱，流速2bv/h，收集醋酸钠溶液洗脱液；
[0087]
3)将醋酸钠溶液洗脱液用盐酸调ph至3，制成二次上样液；
[0088]
4)将二次上样液通过聚酰胺柱(参数同上)，流速2bv/h，先用4倍柱体积纯化水洗脱，流速4bv/h，弃去洗脱液，再用7倍柱体积60％(v/v)乙醇洗脱，流速4bv/h，收集乙醇溶液洗脱液；
[0089]
5)将乙醇溶液洗脱液浓缩、干燥、粉碎，即得提取物。设为批号5。
[0090]
实施例6：银杏叶黄酮制备方法-6
[0091]
在实施例1工艺的基础上，调整碳酸钠浓度，比较洗脱液浓度对黄酮含量、转化率的影响。
[0092]
1)取符合国家药典标准的银杏叶提取物10g，加8％(v/v)乙醇溶液配制成2％(v/
v)上样液；
[0093]
2)将上样液通过聚酰胺柱(30～60目)，流速2bv/h，先用4倍柱体积(bv)纯化水洗，流速2bv/h，弃去洗脱液，再用7倍柱体积2％(v/v)碳酸钠溶液洗脱，流速2bv/h，收集碳酸钠溶液洗脱液；
[0094]
3)将碳酸钠溶液洗脱液用盐酸调ph至3，制成二次上样液；
[0095]
4)将二次上样液通过聚酰胺柱(参数同上)，流速2bv/h，先用4倍柱体积纯化水洗脱，流速4bv/h，弃去洗脱液，再用7倍柱体积60％(v/v)乙醇洗脱，流速4bv/h，收集乙醇溶液洗脱液；
[0096]
5)将乙醇溶液洗脱液浓缩、干燥、粉碎，即得提取物。设为批号6。
[0097]
实施例7：银杏叶黄酮制备方法-7
[0098]
在实施例1的基础上增加银杏叶提取物质量至100g，进行工艺放大。
[0099]
1)取符合国家药典标准的银杏叶提取物100g，加8％(v/v)乙醇溶液配制成2％(v/v)上样液；
[0100]
2)将上样液通过聚酰胺柱(30～60目)，流速2bv/h，先用4倍柱体积(bv)纯化水洗，流速2bv/h，弃去洗脱液，再用7倍柱体积0.15％(v/v)碳酸钠溶液洗脱，流速2bv/h，收集碳酸钠溶液洗脱液；
[0101]
3)将碳酸钠溶液洗脱液用盐酸调ph至3，制成二次上样液；
[0102]
4)将二次上样液通过聚酰胺柱(参数同上)，流速2bv/h，先用4倍柱体积纯化水洗脱，流速4bv/h，弃去洗脱液，再用7倍柱体积60％(v/v)乙醇洗脱，流速4bv/h，收集乙醇溶液洗脱液；
[0103]
5)将乙醇溶液洗脱液浓缩、干燥、粉碎，即得提取物。设为批号7。
[0104]
实施例8：银杏叶黄酮制备方法-8
[0105]
在实施例1的基础上增加银杏叶提取物质量至6000g，进行工艺放大；同时设置3批次银杏叶提取物，对制备工艺的稳定性进行考察。
[0106]
1)取符合国家药典标准的银杏叶提取物6000g，加8％(v/v)乙醇溶液配制成2％(v/v)上样液；
[0107]
2)将上样液通过聚酰胺柱(30～60目)，流速2bv/h，先用4倍柱体积(bv)纯化水洗，流速2bv/h，弃去洗脱液，再用7倍柱体积0.15％(v/v)碳酸钠溶液洗脱，流速2bv/h，收集碳酸钠溶液洗脱液；
[0108]
3)将碳酸钠溶液洗脱液用盐酸调ph至3，制成二次上样液；
[0109]
4)将二次上样液通过聚酰胺柱(参数同上)，流速2bv/h，先用4倍柱体积纯化水洗脱，流速4bv/h，弃去洗脱液，再用7倍柱体积60％(v/v)乙醇洗脱，流速4bv/h，收集乙醇溶液洗脱液；
[0110]
5)将乙醇溶液洗脱液浓缩、干燥、粉碎，即得提取物。采用3批次银杏叶提取物，分别得到批号8、9、10。
[0111]
实施例9：银杏叶黄酮总黄酮及总黄酮醇苷含量测定
[0112]
1、总黄酮测定(cgq对照方法)
[0113]
1.1对照品制备
[0114]
取槲皮苷-2
”-
(6
”-
对-桂皮酰基葡萄糖基)(cgq)对照品约20mg，精密称定，置
100ml量瓶中，加70％(v/v)乙醇溶液使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含cgq 0.2mg)。
[0115]
1.2标准曲线制备
[0116]
标准曲线的制备精密量取对照品溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml、1.2ml，分别置10ml量瓶中，各加70％(v/v)乙醇至3ml，加醋酸-醋酸钠缓冲液(ph 4.5)和0.1mol/l三氯化铝溶液各2ml，摇匀，加70％(v/v)乙醇至刻度，摇匀；以相应的试剂为空白，按照紫外-可见分光光度法(中国药典2015年版四部通则0401)试验，在270nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据对照品不同，分别绘制cgq为对照品的标准曲线。
[0117]
1.3样品溶液的制备
[0118]
测定法取本品约25mg，精密称定，置50ml量瓶中，用70％(v/v)乙醇溶液溶解并稀释至刻度，摇匀。
[0119]
1.4含量测定
[0120]
精密量取0.5ml，置10ml量瓶中，照标准曲线制备的方法，依法测定吸收度，分别从标准曲线1和标准曲线2上读出供试品溶液中相当于对照品的浓度，计算即得，并通过原料中总黄酮含量计算总黄酮转移率1。
[0121]
2、总黄酮醇苷测定(中国药典方法2015年四部通则0512方法)
[0122]
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.4％(v/v)磷酸溶液(50:50)为流动相；检测波长为360nm。理论板数按槲皮素峰计算应不低于2500。
[0123]
2.1对照品2溶液制备
[0124]
取槲皮素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml分别含60μg的溶液，即得。
[0125]
2.2供试品溶液的制备
[0126]
取银杏叶黄酮提取物约25mg，精密称定，加甲醇-25％盐酸溶液(4:1)的混合溶液25ml，置水浴中加热回流30min，迅速冷却至室温，转移至50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
[0127]
2.3测定法
[0128]
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，以槲皮素对照品的峰面积为对照，分别按下表相对应的校正因子计算槲皮素、山柰素和异鼠李素的含量，用待测成分色谱峰与槲皮素色谱峰的相对保留时间确定槲皮素、山柰素和异鼠李素的峰位，其相对保留时间应在规定值的
±
5％范围之内(若相对保留时间偏离超过5％，则应以相应的被替代对照品确证为准)，即得。相对保留时间及校正因子(f)见下表：
[0129][0130]
总黄酮醇苷含量＝(槲皮素含量 山柰素含量 异鼠李素含量)
×
2.51。通过原料中总黄酮含量计算总黄酮转移率2。
[0131]
2、试验结果：银杏叶黄酮中总黄酮含量与转移率试验结果见表3。
[0132]
表3总黄酮含量与转移率
[0133][0134]
试验结果表明，以cgq为对照品计算得到，批号1银杏叶黄酮中的总黄酮含量为92.98％(w/w)，转移率为72.31％，为最优；批号2与批号3中的总黄酮含量与转移率略低于批号1。采用实施例1～实施例3得到的总黄酮含量85％～93％(w/w)，转移率65％～73％。以药典方法得到的总黄酮醇苷含量相对于cgq方法的偏小，但趋势与cgq方法得到的结果相同。转移率为比值，因此改变标准品及对应的标准曲线对最终结果相近。
[0135]
cgq(分子量756.7)被美国药典(usp)设定为银杏叶提取物黄酮的平均分子量，中国药典、美国药典以及欧洲药典中均使用总黄酮醇苷作为质量标准，其公式为总黄酮醇苷＝(槲皮素 异鼠李素 山柰酚)
×
平均校正因子(2.51)或各自校正因子(槲皮素2.504、异鼠李素2.437、山柰酚2.588)，即黄酮苷元折算成为cgq含量。在检测方法上，如上述多国药典使用三种苷元折算，可以评价银杏中的黄酮醇苷元品质，但其他黄酮苷元(如杨梅素、二氢山柰酚等)物质未能检测到，总黄酮代表性有限。也有报道使用紫外可见分光光度计检测，通过三氯化铝显色，以芦丁为对照测定银杏相关制剂中总黄酮含量，但芦丁代表性差，也不能真实的体现黄酮含量。而且cgq作为银杏独有成分，且活性最强、含量较高的代表性物质。因此可选用cgq作为对照，进行银杏总黄酮的检测可以更好的评价总黄酮含量。
[0136]
以cgq为对照品计算得到，批号4的总黄酮含量为75.94％(w/w)，转移率为67.67％，明显低于批号1银杏叶黄酮，表明此工艺条件下聚酰胺柱的总黄酮含量和转移率明显高于lsa-12大孔树脂柱，聚酰胺吸附属于氢键吸附，主要与氢键缔合能力有关；大孔树脂吸附为极性吸附主要与物质极性有关。黄酮类化合物含有酚羟基结构，在聚酰胺柱中碳酸钠解吸附过程中能够选择性破坏酚羟基分子状态影响吸附状态，而大孔树脂对黄酮的选择性较低，因此杂质会被洗脱下来。采用聚酰胺柱进行银杏叶中黄酮的纯化为优化结果。
[0137]
以cgq为对照品计算得到，批号5的总黄酮含量为89.82％(w/w)，转移率为47.63％，总黄酮含量略低于批号1的92.98％(w/w)，转移率显著低于批号1的72.31％。采用醋酸钠代替碳酸钠会影响总黄酮含量及转移率，主要因为相同浓度下醋酸钠碱性低于碳酸钠，碱性越小，洗脱能力越弱，导致总黄酮含量减少，转移率降低。
[0138]
以cgq为对照品计算得到，批号6的总黄酮含量为73.64％(w/w)，转移率为69.70％，总黄酮含量与转移率显著低于批号1。碳酸钠浓度过高导致部分杂质被洗脱，导致总黄酮含量减少。由此可见，浓度0.1％～0.5％(v/v)的碳酸钠在银杏黄酮提取工艺中具有
专属性。
[0139]
以cgq为对照品计算得到，批号7的总黄酮含量为89.43％(w/w)，转移率为66.19％，总黄酮含量与转移率略低于批号1，与批号2与3相近。由此可见，实施例1对应工艺的中试情况下总黄酮含量与转移率无较大差别。
[0140]
以cgq为对照品计算得到，批号8～10的总黄酮含量分别为90.33％(w/w)、88.43％(w/w)和89.58％(w/w)，转移率分别为67.46％、66.91％和66.34％。在相同工艺条件下，进行工艺放大后得到的总黄酮含量与转移率的rad分别为1.34％和2.64％，与批号1以及中试放大的批号7相比无显著区别，说明该制备方法大规模生产的总黄酮含量及转移率与小批量相近，可用于工业化生产。具体如表4所示。
[0141]
表4批号1、7～10的总黄酮含量及转移率情况比较
[0142][0143]
实施例10：银杏叶黄酮提取物各黄酮含量测定
[0144]
1、uplc试验方法
[0145]
1)对照品溶液的制备：以杨梅素-3-o-芸香糖、杨梅素-3-o-葡萄糖、芦丁、万寿菊素-3-o-芸香糖、槲皮素-3-o-芸香糖、山柰酚-3-o-芸香糖、异鼠李素-3-o-芸香糖、槲皮苷-2
”-
(6
”-
对-桂皮酰基葡萄糖基)、山柰酚-3-(6”'-对-桂皮酰基葡萄糖基-鼠李糖苷)对照品。
[0146]
2)供试品溶液的制备：取批号1～10提取物各10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加50％(v/v)甲醇溶解并稀释至刻度，滤过，取续滤液，即得。
[0147]
3)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(phenomenx luna omega柱长为10cm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm)；以乙腈为流动相a，以0.1％(v/v)甲酸溶液为流动相b，按表1中的规定进行梯度洗脱；流速为0.4ml/min；柱温为30℃；检测波长为300nm。计算各个黄酮含量。
[0148]
表1流动相洗脱梯度
[0149][0150]
2、试验结果
[0151]
批号1～10提取物的黄酮含量检测结果如表5所示。
[0152]
表5批号1～10提取物的黄酮醇苷含量表
[0153][0154]
试验结果表明，批号1～3、7～10提取物中杨梅素-3-o-芸香糖含量3％～6％(w/w)、杨梅素-3-o-葡萄糖3％～6％(w/w)、芦丁8％～11％(w/w)、万寿菊素-3-o-芸香糖5％～7％(w/w)、槲皮素-3-o-芸香糖5％～7％(w/w)、山柰酚-3-o-芸香糖6％～9％(w/w)、异鼠李素-3-o-芸香糖6％～10％(w/w)、槲皮苷-2
”-
(6
”-
对-桂皮酰基葡萄糖基)13％～15％(w/w)、山柰酚-3-(6”'-对-桂皮酰基葡萄糖基-鼠李糖苷)11％～15％(w/w)。批号4～6的9种黄酮醇苷含量未全部落入上述范围内。
[0155]
与批号2与批号3相比，批号1对应的9种黄酮醇苷含量总计最高为85.14％(w/w)，批号3对应的黄酮醇苷含量总计最小为64.14％(w/w)。从黄酮醇苷类型进行对比，工艺变化对应各黄酮醇苷含量有所波动，但波动范围在
±
2％，实施例1的制备工艺为最优工艺。
[0156]
批号4的9种黄酮醇苷含量总计为68.37％(w/w)，其中杨梅素-3-o-芸香糖0.62％、(w/w)杨梅素-3-o-葡萄糖0.95％(w/w)、芦丁6.23％(w/w)，相比于批号1的杨梅素-3-o-芸香糖5.56％(w/w)、杨梅素-3-o-葡萄糖6.21％(w/w)和芦丁11.39％(w/w)显著减少；槲皮素-3-o-芸香糖9.76％(w/w)，相比于批号1的槲皮素-3-o-芸香糖6.60％(w/w)含量较高。原因在于实施例4采用lsa-12大孔树脂柱与实施例1采用的聚酰胺柱填料不同，因此洗脱过程中对不同黄酮醇苷的吸附效果不同，导致最终提取物中黄酮醇苷含量的区别。
[0157]
批号5的9种黄酮醇苷含量总计为68.97％(w/w)，其中万寿菊素-3-o-芸香糖3.38％(w/w)、槲皮苷-2
”-
(6
”-
对-桂皮酰基葡萄糖基)8.99％(w/w)相比于批号1的对应黄酮醇苷含量显著减少。实施例5采用醋酸钠代替碳酸钠进行洗脱，相同浓度下醋酸钠碱性低于碳酸钠，碱性越小，洗脱能力越弱，总黄酮醇苷含量相对减少。而且醋酸钠与碳酸钠，碱基类型有所区别，导致不同类型黄酮醇含量有所区别。
[0158]
批号6的9种黄酮醇苷含量总计为67.31％(w/w)，各黄酮醇苷含量相比与批号1均有减少。原因在于批号6采用2％(v/v)碳酸钠进行洗脱，碳酸钠含量过高导致部分杂质被洗脱，使各黄酮醇苷含量减少。由此可见，碳酸钠浓度范围直接影响各银杏黄酮醇苷含量，在碳酸钠浓度为0.1％～0.5％(v/v)范围内，银杏黄酮醇苷含量波动范围在
±
2％，质量稳定。
[0159]
批号7～10提取物为实施例1工艺的中试，批号7为100g银杏叶提取物的工艺放大，批号8～10提取物为6000g银杏叶提取物的工艺放大。批号7与8～10的9种黄酮醇苷含量接
近，但相比于与批号1略减少，原因可能在于工艺放大存在一定含量损失。从各黄酮醇苷含量对比发现，批号8～10的9种黄酮醇苷含量批间精密度考察中，rad小于3％，工艺稳定性较好。实施例1对应工艺稳定，但工艺放大存在一定含量损失，若需进一步提高各黄酮醇苷含量，则需要进一步优化工艺参数。批号8～10之间的黄酮醇苷的批间精密度考察如表6所示。
[0160]
表6批号8～10银杏叶黄酮提取物工艺批间精密度考察
[0161][0162]
实施例11：抗氧化研究
[0163]
1、试验方法
[0164]
为评价批号1～10黄酮提取物的抗氧化作用，将其与符合国家药典标准的银杏叶提取物进行抗氧化作用对比，以芦丁为阳性对照，确定其在抗氧化作用的功效。
[0165]
1)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(dpph)溶液配制：取dpph约25mg，精密称定，置250ml量瓶中，加乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得dpph溶液(每1ml中含0.1mg)。
[0166]
2)供试品母液配制：取芦丁、银杏叶提取物和批号1～10提取物约10mg，精密称定，置25ml量瓶中，加乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得芦丁、银杏叶提取物及银杏叶黄酮提取物供试品母液。
[0167]
3)吸光度测定：精密量取供试品母液使用乙醇稀释配制成浓度为约0、0.018mg/ml、0.035mg/ml、0.070mg/ml、0.139mg/ml、0.278mg/ml、0.557mg/ml溶液，平行3份，每份各加入溶液2ml、dpph溶液4ml，振荡摇匀。以乙醇为阴性对照，紫外-可见分光光度法测定519nm波长处吸光度。
[0168][0169]
a0：空白对照液吸光度；
[0170]
a：样品吸光度。
[0171]
计算清除率并通过spss(17.0)软件计算清除率ic
50
，ic
50
值越小，抗氧化性越好。
[0172]
2、试验结果
[0173]
试验结果如表7所示。结果表明，批号1～3、7～8的ic
50
值为0.007～0.008mg/ml，其中批号1的ic
50
值最小，为优选。批号4～6的ic
50
值为0.010～0.011mg/ml。
[0174]
结合表4中批号3～6的银杏黄酮醇苷含量对比表明，批号4～6的9种银杏黄酮醇苷总量分别为68.37％(w/w)、68.97％(w/w)、67.31％(w/w)略高于批号3的9种银杏黄酮醇苷总量64.14％(w/w)，但批号4～6的ic
50
值在0.010～0.011mg/ml，高于批号3的ic
50
值0.008mg/ml，批号3的9种黄酮成分在抗氧化功能上存在协同作用。
[0175]
结合总黄酮含量、黄酮醇苷含量对比可得，在实施例1～3所得的银杏叶黄酮提取物中，9种银杏黄酮醇苷为代表的黄酮成分在对应含量范围下存在抗氧化功能的协调作用，产生增效的结果。
[0176]
此外，银杏叶黄酮提取物抗氧化能力较银杏叶提取物强，可作为抗氧化剂使用，同时能减少使用量。
[0177]
表7清除率ic
50
[0178][0179]
注：
△
表示不同批号样品与芦丁ic
50
值比较p《0.05；
△△
表示不同批号样品与芦丁ic
50
值比较p《0.01；#表示不同批号样品与银杏叶提取物ic
50
值比较p《0.05；##表示不同批号样品与银杏叶提取物ic
50
值比较p《0.01。
[0180]
实施例12：特征图谱构建
[0181]
1、试验方法
[0182]
1.1仪器与试药
[0183]
1.1.1仪器
[0184]
waters i-class uplc超高效液相色谱仪；phenomenx luna omega(2.1
×
100mm，1.6μm)色谱柱，理论板数按芦丁峰计应不低于2500；msa 225s-1ce-du电子分析天平；milli-qa10纯水机。
[0185]
1.1.2供试品
[0186]
取符合国家药典标准的银杏叶提取物15批次，采用实施例1制备工艺获得5批次银杏叶黄酮提取物批号1，采用实施例2制备获得5批次银杏叶提取物批号2，采用实施例3制备获得5批次银杏叶黄酮提取物批号3。
[0187]
1.2测定法
[0188]
1.2.1色谱条件
[0189]
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的phenomenx luna omega(2.1
×
100mm，1.6μm)色谱柱；以乙腈为流动相a，以0.1％(v/v)甲酸溶液为流动相b，按表1中的规定进行梯度洗脱，流速0.4ml/min，柱温30℃，检测波长为360nm。
[0190]
表1洗脱梯度
[0191][0192]
1.2.2质谱条件
[0193]
采用q-tof方法，一级质谱参数为干燥气温度350℃，干燥气流速12l/min，雾化器压力45psig，毛细管压力5000v；二级质谱参数为干燥气温度350℃，干燥气流速12l/min，雾化器压力45psig，毛细管压力5000v，碰撞能量100v。
[0194]
1.2.3供试品溶液的制备
[0195]
取1.1.2试药银杏叶黄酮提取物各10mg，精密称定，置10ml量瓶中，加50％(v/v)甲醇溶解，并稀释至刻度，滤膜过滤，取续滤液，即得。
[0196]
1.2.4对照品溶液的制备
[0197]
取芦丁对照品适量，精密称定，加50％(v/v)甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，即得。
[0198]
1.2.5特征图谱构建
[0199]
分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪测定，记录色谱图，获得银杏叶黄酮提取物的uplc图谱。
[0200]
2、试验结果
[0201]
15批次的银杏叶黄酮提取物共有的12个色谱峰，确定了以4号峰芦丁为参照峰，并进一步计算了各批次各个特征峰与参照峰(芦丁，峰4)的相对保留时间。采用标准品对照对最主要色谱峰进行鉴别，采用15批次银杏叶黄酮提取物相对保留时间，相对保留时间应在规定值的
±
5％以内。峰1～峰12的化合物归属如表8所示，特征图谱如图1所示。
[0202]
表8银杏叶黄酮提取物相对保留时间平均值
[0203][0204]
实施例13：特征图谱质谱条件研究
[0205]
根据实施例12的试验方法，修改质谱条件以判断uplc-ms中质谱条件的适应性。
[0206]
质谱条件1：采用q-tof方法，一级质谱参数为干燥气温度300℃，干燥气流速10l/
min，雾化器压力42psig，毛细管压力4500v；二级质谱参数为干燥气温度300℃，干燥气流速10l/min，雾化器压力40psig，毛细管压力4500v，碰撞能量90v。
[0207]
质谱条件2：采用q-tof方法，一级质谱参数为干燥气温度400℃，干燥气流速15l/min，雾化器压力46psig，毛细管压力5500v；二级质谱参数为干燥气温度400℃，干燥气流速15l/min，雾化器压力50psig，毛细管压力5500v，碰撞能量120v。
[0208]
试验结果表明，质谱条件1和2，结合1.2.1色谱条件、1.2.3供试品溶液的制备、1.2.4对照品溶液和1.2.5特征图谱构建的技术方案均能实现特征图谱的构建，构建结果同实施例12，如图1所示。
[0209]
实施例14：特征图谱方法学研究
[0210]
1、流动相优化
[0211]
取符合国家药典标准的银杏叶提取物，按实施例12的方法制备1份银杏叶黄酮提取物，设置乙腈为流动相a，以0.8％(v/v)、0.10％(v/v)、0.12％(v/v)甲酸溶液为流动相b，在实施例12的试验方法下进样检测，检测结果如图2所示。
[0212]
试验结果表明，以乙腈为流动相a，0.08％(v/v)、0.10％(v/v)、0.12％(v/v)甲酸溶液为流动相b时，银杏叶黄酮提取物的液相图谱中特征峰峰型尖锐、分离度好。优选中间值0.10％(v/v)甲醇溶液为流动相b，进一步降低误差的风险。
[0213]
2、柱温优化
[0214]
取符合国家药典标准的银杏叶提取物，按实施例12的方法制备1份银杏叶黄酮提取物，设置柱温为27℃、30℃、33℃，在实施例12的试验方法下进样检测，检测结果如图3所示。
[0215]
试验结果表明，柱温为27℃、30℃、33℃时，银杏叶黄酮提取物的液相图谱中特征峰峰型尖锐、分离度好。优选中间值30℃柱温，进一步降低误差的风险。
[0216]
3、色谱柱耐用性试验
[0217]
取符合国家药典标准的银杏叶提取物，按实施例12的方法制备1份供试品溶液，分别在3根色谱柱进行检测，色谱柱型号见表9。结果见图4所示。
[0218]
表9色谱柱型号
[0219][0220]
1号～3号色谱柱的液相图谱保留时间与峰型有所区别，其中3个色谱柱对应的液相图谱中保留时间差异较大。与3号相比，1、2号色谱柱获得的uplc图超出特征图谱规定的相对保留时间
±
0.050的范围。而且，1号色谱柱在实施例12的色谱条件下各特征峰分离度不高，无法满足分离度r大于1.5的药典规定，2号色谱柱在实施例12的色谱条件下3号峰对应的特征峰无法实现有效分离。故推荐使用3号色谱柱(phenomenx luna omega，2.1*100mm，1.6μm)。
[0221]
4、重复性试验
[0222]
取符合国家药典标准的银杏叶提取物，按实施例12的方法制备6份供试品溶液，进样检测，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版本)以12个共有峰匹配，计
算相似度，结果见表10。相似度平均值为1.000，rsd为0.050％，说明样品重复性良好。
[0223]
表10重复性相似度评价结果
[0224][0225]
5、稳定性试验
[0226]
取符合国家药典标准的银杏叶提取物，按实施例12的方法制备1份供试品溶液，分别在0，2h，4h，8h，16h，24h进行检测，进样检测，计算相似度，结果见表11。相似度平均值为0.999，rsd为0.052％，说明样品重复性良好。
[0227]
表11稳定性相似度计算结果
[0228][0229]
6、中间精密度试验
[0230]
取符合国家药典标准的银杏叶提取物，于不同时间、不同人员按实施例12的方法制备6份供试品溶液，进样检测，计算相似度，结果见表12。相似度平均值为0.999，rsd为0.075％，说明方法中间精密度良好。
[0231]
表12样品检测相似度结果
[0232][0233]
实施例15：银杏叶黄酮提取物与原料的指纹图谱比较
[0234]
为评价银杏叶黄酮提取物总黄酮特征，将其与原料银杏叶提取物进行指纹图谱对比，确定提取物中不同黄酮的变化。
[0235]
1、试验方法
[0236]
取银杏叶黄酮提取物(批号1，经实施例1方法制得)与符合国家药典标准的银杏叶提取物(批号181107，浙江康恩贝制药股份有限公司)，分别制成供试品溶液，根据实施例12特征图谱方法进行uplc图谱对比。
[0237]
2、试验结果
[0238]
结果见图，表明银杏叶黄酮提取物与原料在0～2min峰区别明显，2～14min峰形无明显差异。经进一步物质确认，0～2min主要为有机酸物质，如奎宁酸、莽草酸、原儿茶酸、没食子酸、6-羟基犬脲奎宁酸、对羟基苯甲酸等；2～14min主要为黄酮物质，如杨梅素-3-o-芸香糖、杨梅素-3-o-葡萄糖、芦丁、万寿菊素-3-o-芸香糖、槲皮素-3-o-芸香糖、山柰酚-3-o-芸香糖、异鼠李素-3-o-芸香糖、槲皮苷-2
”-
(6
”-
对-桂皮酰基葡萄糖基)、山柰酚-3-(6”'-对-桂皮酰基葡萄糖基-鼠李糖苷)等。试验结果表明，银杏叶黄酮提取物基本保留了原料中的黄酮种类，为银杏叶提取物来源的总黄酮的精制与纯化，提高银杏叶黄酮物质的使用效率。