一种离体提高葡萄果皮中花色苷含量的方法与流程

1.本发明涉及葡萄果实处理技术领域，具体而言，涉及一种离体提高葡萄果皮中花色苷含量的方法。


背景技术：

2.葡萄以其汁多味美等特点深受广大消费者青睐。葡萄果实中富含的花色苷主要集中在葡萄果皮中,花色苷含量高低与葡萄果皮颜色呈正相关。花色苷是非常好的葡萄果酱及葡萄汁、酒原料，以其为原料制作的葡萄果酱色泽艳丽、花色苷含量高，酸甜适口，老少皆宜。现有的较大部分葡萄在采摘时仍存在着果实着色不良，成熟状况较差，花色苷含量较少的问题，影响葡萄果实及葡萄酒的品质，严重制约了我国葡萄酒产业的发展。


技术实现要素：

3.本发明在于提供一种离体提高葡萄果皮中花色苷含量的方法，其能够缓解上述问题。
4.为了缓解上述的问题，本发明采取的技术方案如下：
5.本发明提供了一种离体提高葡萄果皮中花色苷含量的方法，包括：
6.(1)在葡萄转色初期采摘葡萄果穗；
7.(2)将所述葡萄果穗置于托盘上后放置于人工气候培养箱；
8.(3)制备ebr溶液；
9.(4)向将所述ebr溶液喷洒至所述葡萄果穗；
10.(5)通过装有培养液的人工气候培养箱为所述葡萄果穗营造培养环境，其中包括对所述葡萄果穗进行80％光照强度的光照处理。
11.在本发明的一较佳实施方式中，所述ebr溶液的ebr浓度为0.40mg/l。
12.在本发明的一较佳实施方式中，所述ebr溶液的制备方法是：将ebr用无水乙醇溶解，并用去离子水稀释，吐温80作为展开剂，最终得到0.40mg/l的ebr溶液。
13.在本发明的一较佳实施方式中，所述无水乙醇和吐温80的体积分数均为0.1％。
14.在本发明的一较佳实施方式中，所述人工气候培养箱内为26
±
0.5℃的恒温，湿度为70％。
15.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过人工气候培养箱营造葡萄果实的培养环境，采用本发明方法有利于葡萄果实的转色效率高，表面不易出现皱缩状态；在本发明中，油菜素内酯(ebr)在葡萄果实花色苷的积累过程中起着至关重要的作用，ebr处理可提高葡萄果实含糖量，促进花色苷积累，使果实转色和成熟提前，本发明所采用的光照为影响葡萄生长发育的重要环境因子，对花色苷的形成至关重要，可以直接影响植物花色苷的分布。
16.为使本发明的上述目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举本发明实施例，并配合所附附图，作详细说明如下。
附图说明
17.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
18.图1示出了实施例中ebr和光照处理对离体葡萄果实花色苷含量的影响；
19.图2示出了实施例中ebr和光照处理对离体葡萄果皮vvpal基因表达量的影响；
20.图3示出了实施例中ebr和光照处理对离体葡萄果皮vvchs1基因表达量的影响；
21.图4示出了实施例中ebr和光照处理对离体葡萄果皮vvf3’h基因表达量的影响；
22.图5示出了实施例中ebr和光照处理对离体葡萄果皮vvdfr基因表达量的影响；
23.图6示出了实施例中ebr和光照处理对离体葡萄果皮vvldox基因表达量的影响；
24.图7示出了实施例中ebr和光照处理对离体葡萄果皮vvufgt基因表达量的影响。
具体实施方式
25.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。
26.因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
27.一、供试材料与处理
28.本试验供试材料为葡萄赤霞珠，于转色初期对生长势基本一致的植株进行穗采，带回实验室处理，处理方式如下：
29.(1)将葡萄果穗置于自来水下，流水冲洗15min；
30.(2)将葡萄果穗放入70％的乙醇中清洗30秒；
31.(3)将通过乙醇清洗后葡萄果穗快速转移到含2％有效氯的naclo溶液中清洗2min，清洗的过程中进行晃动，其中，葡萄果穗与naclo溶液的体积比为1：3。
32.(4)将通过naclo溶液清洗后的葡萄果穗转移到无菌水中清洗2min，同样边清洗边晃动；
33.(5)重复步骤(4)3次。
34.待葡萄果穗进行了以上清洗处理后，剪成带梗的果粒，随机摆放到孔板上，置于托盘上，托盘中盛有培养液，培养液是浓度为2％的蔗糖溶液(蔗糖溶液于115℃灭菌15min)，使果梗浸到糖溶液中，整体放置于人工气候培养箱中，人工气候培养箱设置为恒温26
±
0.5℃，湿度70％，人工气候培养箱能营造黑暗和光照环境，其中能营造的光照强度为80％。
35.二、试验设计
36.制备0.40mg/l的ebr溶液，制备方法是：将ebr用无水乙醇溶解，并用去离子水稀释至适宜的浓度，吐温80作为展开剂(无水乙醇和吐温80体积分数均为0.1％)，最终得到
0.40mg/l的ebr溶液。
37.制备无菌水溶液，制备方法是：向无菌水里添加同等体积分数的无水乙醇和吐温80，以保证单一变量，最终得到无菌水溶液。
38.将人工气候培养箱中的葡萄果粒均分为四份，分别标记为p1、p2、p3、p4，对该四份葡萄果粒分别进行以下处理：
39.(1)无菌水溶液 光照，记为ck l。
40.(2)0.40mg/l ebr溶液 光照，记为ebr l；
41.(3)无菌水溶液 遮光，记为ck d；
42.(4)0.40mg/l ebr溶液 遮光，记为ebr d。
43.其中，无菌水溶液和ebr溶液均采用喷洒的方式附着于葡萄果粒，直至葡萄果粒有水滴形成则可停止喷洒。之后，在24h、240h、480h、720h的时间点分别对葡萄果粒进行采样。
44.三、试验结果
45.对24h、240h、480h、720h这四个时间点所得到的样品进行分析，并得到对应的试验结果。
46.1、ebr和光照处理对离体葡萄果实表型的影响
47.由图1可知，随着处理后天数的增加，与ck d相比，ebr d处理果实颜色较深；与ck l相比，ebr l处理果实颜色较深；整体来看，l处理(ck l、ebr l)果实深于d处理(ck d、ebr d)，其中ebr l处理果实颜色最深，说明在光照和黑暗条件下进行ebr处理均能促进果实的转色，但光照条件下ebr处理更有利于果实的转色。随着果实的转色，果实均呈现不同程度的皱缩，黑暗条件下皱缩更为严重，说明果实在黑暗条件下失水更严重，而光照可以减缓果实的皱缩。
48.2、ebr和光照处理对离体葡萄果实花色苷含量的影响
49.由图1可知，随着处理后天数的增加，离体葡萄果皮的花色苷含量整体均呈现升高趋势，且处理后最后一次采样的花色苷含量最高。
50.ck l和ebr l处理的葡萄果皮花色苷含量显著高于ck d和ebr d处理，说明在离体培养体系中，葡萄果实在黑暗中虽然可以转色，但显而易见，光照条件更有利于葡萄果实花色苷的合成。
51.ebr l处理的葡萄果皮花色苷含量显著高于ck l处理，ebr d处理的葡萄果皮花色苷含量显著高于ck d处理，说明在黑暗和光照条件下，ebr均能显著增加离体葡萄果实花色苷的含量。且ebr l处理的花色苷含量显著高于其他3个处理，说明ebr和光照协同促进离体培养条件下葡萄果皮花色苷的合成。
52.ebr和光照处理可以显著增加离体培养条件下赤霞珠葡萄果皮花色苷的含量，葡萄果实可以在离体条件下完成转色。
53.3、ebr和光照处理对离体葡萄果皮花色苷合成基因表达量的影响
54.1)vvpal基因表达量
55.如图2所示，随着处理后天数的增加，葡萄果实的vvpal基因表达量呈现上升的趋势，在处理后最后一次采样即完全转色时达到最高。在果实转色中后期，与ck l处理相比，ebr l处理能显著增加vvpal基因的表达量，且ebr l处理的vvpal基因的表达量最高。与ck d处理相比，ebr d处理也能显著增加vvpal基因的表达量，说明在光照和黑暗条件下，ebr均
能显著增加vvpal基因的表达量；光照条件下(ck l、ebr l)vvpal的基因表达量显著高于黑暗条件(ck d、ebr d)，说明光照可以显著增加vvpal基因的表达量。
56.2)vvchs1基因表达量
57.由图3可知，随着果实的转色，葡萄果皮的vvchs1基因的表达量呈下降趋势，转色初期最高。ck d处理的vvchs1基因表达量最低，且随着果实的成熟无明显变化，ebr d处理显著高于ck d，说明黑暗条件抑制vvchs1基因的表达，而黑暗下ebr处理则促进vvchs1基因的表达。光照条件下vvchs1的基因表达量均显著高于黑暗条件，ebr l处理的vvchs1基因表达量显著高于ck l，且ebr l处理表达量最高，说明光照促进vvchs1基因的表达，且光照和ebr协同促进vvchs1基因的表达。
58.3)vvf3’h基因表达量
59.由图4可知，vvf3’h基因的表达量整体呈上升趋势，均在果实转色后期达到最大值。与ck l、ck d和ebr d处理相比，ebr l处理能显著增加vvf3’h基因的表达量，而ck d和ebr d处理间vvf3’h基因的表达量无显著差异，说明光照条件下ebr处理能显著促进vvf3’h基因的表达，而黑暗条件下ebr处理对vvf3’h基因的表达无显著影响。
60.4)vvdfr基因表达量
61.由图5可知，随着葡萄果实的转色，vvdfr基因的表达量呈上升趋势。与ck d和ebr d处理相比，ck l和ebr l处理能显著增加vvdfr基因的表达量，且ebr l处理的vvdfr基因的表达量显著高于ck l，说明光照促进vvdfr基因的表达，光照条件下ebr处理更有利于vvdfr基因表达量的增加。ck d和ebr d处理在果实的整个转色过程中变化不明显，且ebr d与ck d处理间无显著差异，说明黑暗条件不利用vvdfr基因的表达，且黑暗条件下ebr处理对vvdfr基因的表达无显著影响。
62.5)vvldox基因表达量
63.由图6可知，随着果实的成熟，葡萄vvldox基因的表达量在处理后的最后一次采样即转色后期快速增加，且ebr l处理显著高于其他处理，ck l、ck d和ebr d三个处理间无显著差异，说明ebr和光照协同促进vvldox基因的表达。
64.6)vvufgt基因表达量
65.由图7可知，随着处理天数的增加，葡萄vvufgt基因的表达量整体呈上升趋势，在转色后期缓慢下降。ebr l处理的vvufgt基因的表达量显著高于其他3个处理，其他3个处理间差异不显著，说明果皮ebr和光照协同促进vvufgt基因的表达。ck d和ebr d处理的vvufgt基因表达量均较低，且随着葡萄果实的转色无明显变化，说明黑暗条件抑制vvufgt基因的表达，且黑暗条件下ebr处理对vvufgt的基因表达量无显著影响。
66.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。