一套具包容性且精准鉴定、挖掘并克隆稻瘟病Pita抗病基因家族等位基因的技术体系的制作方法

技术特征：
1.一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病pita抗病基因家族等位基因的技术体系，其特征在于，该技术体系由“功能性单倍型-抗病等位基因”两级检测标记组成并逐级推进，供试品种是否携带目标基因由其综合结果而决定；具体地，所述技术体系包含：(1)该基因家族之功能性单倍型/非功能性单倍型的检测程序：通过家族内功能基因/非功能基因的序列比较而界定单倍型分化清晰的基因组区域；设计2个单倍型特异性分子标记并进行基于pcr技术的功能基因/非功能基因参考品种的单倍型分析而确认其可靠性；只有同时被判断为功能性基因型的品种方为功能性单倍型品种；在后续的检测中，非功能性品种可被排除；(2)该基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因pita-ym的检测程序：通过家族内功能基因的序列比较而界定目标基因特异性的snp，并设计1个最优的功能特异性分子标记；进行基于pcr技术的功能性单倍型品种之目标基因的特异性基因型分析而确认其可靠性；pita-ym基因携带者应该属于pita抗病基因家族之功能性单倍型，而且该功能特异性分子标记之基因型与pita-ym参考品种的基因型相同的品种(个体)；反之，任一检测标记不符合本技术体系的检测结果都不是目标基因pita-ym；(3)该基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因pita-kt的检测程序：通过家族内功能基因的序列比较而界定目标基因特异性的snp，并设计1个最优的特异性分子标记组合；进行基于pcr技术的功能性单倍型品种之目标基因的特异性基因型分析而确认其可靠性；pita-kt基因携带者应该属于pita抗病基因家族之功能性单倍型，而且该功能特异性分子标记组合之基因型与pita-kt参考品种的基因型相同的品种(个体)；反之，任一检测标记不符合本技术体系的检测结果都不是目标基因pita-kt；(4)该基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因pita-9311的检测程序：通过家族内功能基因的序列比较而界定目标基因特异性的snp，并设计2个最优的特异性分子标记；进行基于pcr技术的功能性单倍型品种之目标基因的特异性基因型分析而确认其可靠性；pita-9311基因携带者应该属于pita抗病基因家族之功能性单倍型，而且2个功能特异性分子标记之基因型都与pita-9311 参考品种的基因型相同的品种(个体)；反之，任一检测标记不符合本技术体系的检测结果都不是目标基因pita-9311；(5)该基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因pita-q15的检测程序：通过家族内功能基因的序列比较而界定目标基因特异性的snp，并设计2个最优的特异性分子标记；进行基于pcr技术的功能性单倍型品种之目标基因的特异性基因型分析而确认其可靠性；pita-q15基因携带者应该属于pita抗病基因家族之功能性单倍型，而且2个功能特异性分子标记之基因型都与pita-q15参考品种的基因型相同的品种(个体)；反之，任一检测标记不符合本技术体系的检测结果都不是目标基因pita-q15；(6)该基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因pita-ksl的检测程序：通过家族内功能基因的序列比较而界定目标基因特异性的snp，并设计2个最优的特异性分子标记；进行基于pcr技术的功能性单倍型品种之目标基因的特异性基因型分析而确认其可靠性；pita-ksl基因携带者应该属于pita抗病基因家族之功能性单倍型，而且2个功能特异性分子标记之基因型都与pita-ksl参考品种的基因型相同的品种(个体)；反之，任一检测标记不符合本技术体系的检测结果都不是目标基因pita-ksl。
2.根据权利要求1所述技术体系，其特征在于：(1)中最优且最简化的单倍型特异性分子标记组合为pita-f/n
g444c
及pita-f/n
a527t
；其序列分别为seq id no.1～2和seq id no.3～4所示；其中，标记说明：f/n，功能性(functional)/非功能性(non-functional)；上标g444c，意为位于目标基因#444位置的特异性snp，如此类推；(2)中最优的目标基因特异性分子标记为pita-ym
t3387c
；其序列为seq id no.5～6所示；(3)中最优的目标基因特异性分子标记组合为上述pita-ym
t3387c
以及pita-kt/ym
g384c
及pita-kt/ym
g4217t
；其序列为seq id no.5～6,seq id no.7～8,seq id no.9～10所示；(4)中最优的目标基因特异性分子标记组合为pita-9311/co
g17t
及pita-9311
t959c
；其序列为seq id no.11～12,seq id no.13～14所示；(5)中最优的目标基因特异性分子标记组合为pita-q15
a352g
及pita-q15
g4231a
；其序列为seq id no.15～16,seq id no.17～18所示；(6)中最优的目标基因特异性分子标记组合为pita-ksl
a984g
及pita-ksl
c1991t
；其序列为seq id no.19～20,seq id no.21～23所示；特别地，pita-ksl
c1991t
之pcr扩增由2条正向及1条反向引物组成。3.权利要求1或2所述技术体系的应用，其特征在于，应用于在复杂的稻瘟病pita抗病基因家族中对新旧等位基因进行系统而精准的包容性鉴别及挖掘，包括但不限于如下5个目标基因：稻瘟病pita抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因pita-ym，序列如genbank af207842.1所示；稻瘟病pita抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因pita-kt，序列如genbank ok169585所示；稻瘟病pita抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因pita-9311，序列如genbank ok169579所示；稻瘟病pita抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因pita-q15，序列如genbank ok169583所示；稻瘟病pita抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因pita-ksl，序列如genbank ok169582所示。4.权利要求1或2所述技术体系的应用，其特征在于，应用于在功能性单倍型品种中，通过上述标记基因型的综合结果推断并挖掘包括但不限于如下2个新型的目标基因：稻瘟病pita抗病基因家族之功能性单倍型之新型抗病等位基因pita-co及pita-zs；稻瘟病pita抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因pita-co，序列如genbank ok169580所示；稻瘟病pita抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因pita-zs，序列如genbank ok169584所示。5.权利要求1或2所述技术体系的应用，其特征在于，应用于在未知目标基因的种质资源中鉴定该基因家族的已知功能基因，以及挖掘包括但不限于1个新型的目标基因：稻瘟病pita抗病基因家族之功能性单倍型之新型抗病等位基因pita-ir36；
稻瘟病pita抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因pita-ir36，序列如genbank ok169581所示。6.权利要求1或2所述技术体系的应用，其特征在于，应用于精准甄别在该基因家族中因测序错误而普遍存在的真假基因特异性snp以及真假目标基因。7.权利要求1或2所述技术体系的应用，其特征在于，应用于基于抗病等位基因不同的基因组序列特征，分离、克隆并验证目标基因的抗性功能。8.权利要求1或2所述技术体系的应用，其特征在于，应用于挖掘包括但不限于如下所述7个新型的抗病等位基因及其序列在植物抗病育种计划中的应用：稻瘟病pita抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因pita-kt，序列如genbank ok169585所示；稻瘟病pita抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因pita-9311，序列如genbank ok169579所示；稻瘟病pita抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因pita-q15，序列如genbank ok169583所示；稻瘟病pita抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因pita-ksl，序列如genbank ok169582所示；稻瘟病pita抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因pita-co，序列如genbank ok169580所示；稻瘟病pita抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因pita-zs，序列如genbank ok169584所示；稻瘟病pita抗病基因家族之功能性单倍型之抗病等位基因pita-ir36，序列如genbank ok169581所示。

技术总结
本发明公开了一套具有包容性且精准鉴别、挖掘并克隆稻瘟病Pita抗病基因家族等位基因的技术体系。该技术体系根据该基因家族存在清晰的“功能性单倍型-抗病等位基因”等两级分化而设置其两级检测标记。该技术体系可用于稻瘟病Pita抗病等位基因家族等位基因的鉴定、挖掘及克隆，具有系统而严谨的包容性及可比较性。可广泛应用于提高禾本科作物包括但不限于水稻种质资源利用的目的性及效率，提高抗病育种工作的目的性及效率，以及提高抗病品种的合理布局并延长其使用寿命。布局并延长其使用寿命。布局并延长其使用寿命。


技术研发人员：潘庆华 张亚玲 梁志坚 汪金燕 姚永祥 孙瑛 王玲
受保护的技术使用者：华南农业大学
技术研发日：2021.09.23
技术公布日：2022/1/28