一种含内参的双标记免疫检测方法及其应用与流程

技术特征：
1.一种用于样品中目标蛋白的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：提供载体，所述载体上包被有第一结合蛋白和内参蛋白；加入待测样本和双标记免疫检测试剂，其中，所述双标记免疫检测试剂包括发光物1标记的第二结合蛋白和发光物2标记的内参质控蛋白，所述发光物1与发光物2属于两种不同的发光物，所述第二结合蛋白能够与目标蛋白特异性结合，所述第一结合蛋白与目标蛋白和/或发光物1标记的第二结合蛋白特异性结合，所述内参蛋白与发光物2标记的内参质控蛋白特异性结合；孵育反应后，洗涤去除未结合的双标记免疫检测试剂；检测得到发光物1的荧光信号值t’和发光物2的荧光信号值c’，将其按照t’rel
＝(t
’‑
b1)/(c
’‑
b2)，进行运算得到t’rel
，将t’rel
代入拟合标准曲线函数中得到对应浓度值，得到校准后的待测样本中分析物的浓度值；其中，b1、b2分别为发光物1与发光物2的背景信号检测值。2.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述拟合标准曲线函数的制备包括如下步骤：(1)检测双标记免疫检测试剂中两种发光物的背景信号值，分别为b1、b2；(2)准备n个不同浓度的目标蛋白标准品样本，将每个样本分别采用步骤(1)中的所述双标记免疫检测试剂进行检测，得到n个发光物1的荧光信号值t和n个发光物2的荧光信号值c；(3)将步骤(2)中得到的荧光信号值t和荧光信号值c按照公式：t
rel
＝(t-b1)/(c-b2)，计算得到n个新数据t
rel
；(4)曲线拟合：将步骤(3)得到的t
rel
值作为纵坐标，将目标蛋白标准品的浓度值作为横坐标，进行四参数回归得到对应的拟合曲线函数，作为试剂盒的校准曲线。3.根据权利要求1-2任一项所述检测方法，其特征在于，所述双标记免疫检测试剂中的发光物1和发光物2为分别独立选自碱性磷酸酶、吖啶酯、荧光素和镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥元素的离子络合物中的任意不同两种。4.根据权利要求3所述检测方法，其特征在于，所述发光物1和发光物2不同，所述发光物1选自碱性磷酸酶、吖啶酯、荧光素中的任意一种，所述发光物2选自镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥元素的离子络合物中的任意一种；或，所述发光物1选自镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥元素的离子络合物中的任意一种，所述发光物2选自碱性磷酸酶、吖啶酯、荧光素中的任意一种。5.根据权利要求3所述检测方法，其特征在于，所述发光物1和发光物2为分别独立选自镧、铈、镨、钕、钷、钐、铕、钆、铽、镝、钬、铒、铥、镱、镥元素的离子络合物中的任意不同两种。6.根据权利要求1-2任一项所述检测方法，其特征在于，所述内参质控蛋白选自鸡igy、羊抗鸡igy、生物素、亲和素、兔igg、羊抗兔igg中的任意一种。7.根据权利要求1所述检测方法，其特征在于，所述发光物1标记的第二结合蛋白浓度为1.0
×
10-3
mg/ml～2.0
×
10-5
mg/ml；发光物2标记内参质控蛋白浓度为2.0
×
10-4
mg/ml～2.0
×
10-5
mg/ml。8.根据权利要求2所述检测方法，其特征在于，所述拟合标准曲线函数制备的步骤(2)中，所述不同浓度目标蛋白标准品样本数量n为5～8的整数，不同浓度间相差1-20倍。
9.根据权利要求1-8任一项所述检测方法，其特征在于，所述检测方法为夹心免疫测定法或竞争性免疫测定法。10.根据权利要求9所述检测方法，其特征在于，所述目标蛋白为抗原或抗体；进一步地，目标蛋白为抗原时，所述双标记免疫检测试剂包括发光物1标记的目标抗原的检测抗体，发光物2标记的内参质控抗体；目标蛋白为抗体时，所述双标记免疫检测试剂包括发光物1标记的目标抗体的检测抗原，发光物2标记的内参质控抗原。11.权利要求1-10任一项所述检测方法在抗原检测中的应用。12.根据权利要求11所述应用，其特征在于，所述应用为在检测肌钙蛋白i中的应用。13.一种双标记免疫检测试剂盒，其特征在于，所述免疫检测试剂盒包括有双标记免疫检测试剂，所述双标记免疫检测试剂包括发光物1标记的第二结合蛋白和发光物2标记的内参质控蛋白，发光物1与发光物2属于两种不同的发光物；以及包被有第一结合蛋白和内参蛋白的载体。14.一种检测肌钙蛋白i的双标记试剂盒，其特征在于，所述检测肌钙蛋白i的双标记试剂盒包括：包被板，双标记抗体工作液，肌钙蛋白i抗体标准品；所述包被板上包被有肌钙蛋白i抗体与鸡igy；所述双标记抗体工作液包括铕标记肌钙蛋白i抗体和钐标记羊抗鸡igy。15.根据权利要求14所述检测肌钙蛋白i的双标记试剂盒，其特征在于，所述包被抗体中，肌钙蛋白i抗体浓度为1μg/ml-8μg/ml，鸡igy浓度为0.1μg/ml-2μg/ml。16.根据权利要求14-15任一项所述检测肌钙蛋白i的双标记试剂盒，其特征在于，所述双标记抗体工作液中，铕标记肌钙蛋白i抗体浓度为0.5μg/ml-1.5μg/ml，钐标记羊抗鸡igy浓度为0.2μg/ml-2.0μg/ml。17.一种定量检测肌钙蛋白i的方法，包括如下步骤：(1)根据权利要求14-16任一项所述检测肌钙蛋白i的双标记试剂盒，建立标准拟合曲线；(2)取待测样本与双标记抗体工作液同时加入包被板；(3)包被板在36℃～38℃孵育9～11分钟；(4)孵育结束后，用洗涤工作液洗涤4～6次；(5)包被板于室温下缓慢振荡后分别检测铕离子的荧光信号值t’和钐离子的荧光信号值c’，将通过公式t’rel
＝(t
’‑
b1)/(c
’‑
b2)计算得到的t’rel
作为该血清样本的相对信号值。将t’rel
代入拟合曲线中，得到校准后的待测样本中肌钙蛋白i浓度值。

技术总结
本发明涉及一种含内参的双标记免疫检测方法，用于检测样品中目标蛋白，通过将目标蛋白的第二结合蛋白和内参质控采用不同的标记物进行标记，并结合其标记物信号值代入发明人建立的校正公式进行计算，再将计算结果代入基于标准物建立的拟合曲线中，从而反求出实际样本的目标蛋白浓度。使用该方法可以有效减少免疫检测试剂检测结果受干扰因素影响导致精密度较差的问题，使得检测精密度能提高至CV<5％。同时，基于该方法，发明人还设计了一种检测肌钙蛋白I的双标记试剂盒，采用其检测可有效降低干扰因素对检测结果的影响，从而提高检测精密度，为提高现有免疫定量分析检测准确性，提供有力保障。提供有力保障。


技术研发人员：权利要求书2页说明书11页附图6页
受保护的技术使用者：广州万孚生物技术股份有限公司
技术研发日：2021.09.14
技术公布日：2022/1/28