子宫内膜异位症的诊断方法、疾病状态监测方法和试剂盒与流程

1.本公开内容涉及诊断子宫内膜异位症的方法或确定受试者是否受子宫内膜异位症影响的方法、确定受子宫内膜异位症影响的受试者的子宫内膜纤维化或粘连程度的方法、预测受子宫内膜异症影响的受试者的疼痛的方法、监测受子宫内膜异位症影响的受试者的病理状况的方法等，以及用于执行这些方法的试剂盒等。


背景技术：

2.子宫内膜异位症是一种雌激素依赖性炎症疾病，在6％-10％能够怀孕的妇女中观察到，并且在超过50％的患者中观察到不孕症或骨盆疼痛(npl1)。对于子宫内膜异位症的发病机制已经提出了各种假设(npl 2)，并且已经报道了与包括炎症细胞因子和趋化因子、生长因子和激素的各种因素的关系(npl 3)。已经开发出针对激素的药物，激素制剂如gnrh拮抗剂和黄体酮制剂已被证明减轻疼痛和改善病理状况(npl 4和5)。然而，长期使用激素制剂治疗的强烈副作用和困难展现出治疗问题(npl6)。同时，针对炎症细胞因子和趋化因子的药物正在开发中，并且抗il-8抗体在模拟子宫内膜异位症模型中显示出缓解病理状况的强烈效果(ptl 1)。
3.在子宫内膜异位症的诊断中，只能通过内窥镜观察或开腹手术等侵入性手段进行明确的诊断。此外，患者很难注意到与正常月经有关的症状(如疼痛)和早期子宫内膜异位症的症状之间的区别。因此，诊断一组候选患者的障碍很高，据认为从发病到明确诊断平均需要7到11年。明确诊断的延迟导致开始治疗子宫内膜异位症的时期推迟，这是一个很大的临床问题(npl 7和8)。因此，强烈希望采用对患者负担较小的非侵入性诊断方法，如血液标志物，但精确的诊断方法尚未建立(npl 9)。
4.引用列表
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[0017]
发明概述
[0018]
技术问题
[0019]
鉴于上述情况，实现了本公开内容。本公开内容的目的是提供诊断子宫内膜异位症的方法或确定受试者是否受子宫内膜异位症影响的方法、确定受子宫内膜异位症影响的受试者的子宫内膜纤维化或粘连程度的方法、预测受子宫内膜异位症影响的受试者的疼痛的方法、监测受子宫内膜异位症影响的受试者的病理状况的方法等，以及执行这些方法的试剂盒。
[0020]
问题的解决方案
[0021]
由于对子宫内膜异位症的诊断方法和监测病理状况的方法进行了专门研究，本公开内容的发明人发现，有一些标志物在子宫内膜异位症患者中的丰度与健康个体中的丰度不同，并且还发现通过测量这些标志物的丰度，可以诊断受试者是否受子宫内膜异位症的影响，可以确定子宫内膜纤维化或粘连的程度，可以预测受子宫内膜异位症影响的受试者的疼痛，并可以监测受子宫内膜异位症影响的受试者的病理状况。
[0022]
本公开内容基于这些发现，并具体涉及以下发明：
[0023]
[1]诊断子宫内膜异位症的方法，包括测量在从受试者获得的样品中选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5a所示的标志物、表6a所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度。
[0024]
[2]确定受试者是否受子宫内膜异位症影响的方法，包括测量在从受试者获得的样品中选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5a所示的标志物、表6a所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度。
[0025]
[3][1]或[2]的方法，进一步包括一步骤，其中如果在从受试者获得的样品中选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表5a所示的标志物和表6a所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度较高，或者选自由表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度较低，表明该样品所来自的受试者受子宫内膜异位症影响或潜在受影响。
[0026]
[4]确定受试者子宫内膜纤维化程度的方法，包括测量在从受试者获得的样品中选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5a所示的标志物、表6a所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b
所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度。
[0027]
[5][4]的方法，进一步包括一步骤，其中如果在从受试者获得的样品中选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表5a所示的标志物和表6a所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度较高，或者选自表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度较低，表明在该样品所来自的受试者中已经发生或潜在发生子宫内膜纤维化。
[0028]
[6]确定受试者子宫内膜粘连程度的方法，包括测量在从受试者获得的样品中选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5a所示的标志物、表6a所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度。
[0029]
[7][6]的方法，进一步包括一步骤，其中如果在从受试者获得的样品中选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表5a所示的标志物和表6a所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度较高，或者选自表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度较低，表明在该样品所来自的受试者中已经发生或潜在发生子宫内膜粘连。
[0030]
[8]预测受子宫内膜异位症影响或疑似受子宫内膜异位症影响的受试者中由于子宫内膜异位症引起的疼痛程度的方法，包括测量在从受试者获得的样品中选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5a所示的标志物、表6a所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度。
[0031]
[9][8]的方法，进一步包括一步骤，其中如果在从受试者获得的样品中选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表5a所示的标志物和表6a所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度较高，或者选自表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度较低，表明该样品所来自的受试者由于子宫内膜异位症而发生或潜在发生疼痛。
[0032]
[10]确定受子宫内膜异位症影响或疑似受子宫内膜异位症影响的受试者中子宫内膜异位症进展程度的方法，包括测量在从受试者获得的样品中选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5a所示的标志物、表6a所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度。
[0033]
[11][10]的方法，进一步包括一步骤，其中如果在从受试者获得的样品中选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表5a所示的标志物和表6a所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度较高，或者选自由表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度较低，表明子宫内膜异位症在该样品所来自的受试者中正在进展或潜在进展。
[0034]
[12][3]、[5]、[7]、[9]或[11]的方法，其中当选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表5a所示的标志物和表6a所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度高于从健康个体获得的样品中相同标志物的丰度时，则确定该丰度为高。
[0035]
[13][3]、[5]、[7]、[9]或[11]的方法，其中当选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物和表5a所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度为从健康个体获得的样品中相同标志物的丰度的2倍或更高，和/或当选自表6a所示的标志物的至少一种标志物的丰度为从健康个体获得的样品中相同标志物的丰度的1.6倍或更高时，则确定该丰度为高。
[0036]
[14][3]、[5]、[7]、[9]或[11]的方法，其中当选自由表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度低于从健康个体获得的样品中相同标志物的丰度时，则确定该丰度为低。
[0037]
[15][3]、[5]、[7]、[9]或[11]的方法，其中当选自由表1b所示的标志物、表2b所示的标志物和表5b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度为从健康个体获得的样品中相同标志物的丰度的0.5倍或更低，和/或当选自表6b所示的标志物的至少一种标志物的丰度为从健康个体获得的样品中相同标志物的丰度的0.625倍或更低时，则确定该丰度为低。
[0038]
[16]监测受子宫内膜异位症影响或疑似受子宫内膜异位症影响的受试者的子宫内膜异位症的病理状况的方法，包括测量在不同时间点从受试者收集的多个样品的每一个中选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5a所示的标志物、表6a所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度。
[0039]
[17][16]的方法，进一步包括一步骤，其中如果选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表5a所示的标志物和表6a所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度随着时间的推移而减少，或者选自表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度随着时间的推移而增加，表明在该样品所来自的受试者中子宫内膜异位症的病理状况正在改善或潜在改善。
[0040]
[18][16]的方法，进一步包括一步骤，其中如果选由自v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表5a所示的标志物和表6a所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度随着时间的推移而增加，或者选自由表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度随着时间的推移而减少，表明在该样品所来自的受试者中子宫内膜异位症的病理状况恶化或潜在恶化。
[0041]
[19][1]至[18]中任一项的方法，其中标志物作为多肽被测量。
[0042]
[20][1]至[19]中任一项的方法，其中样品是血液样品。
[0043]
[21][20]的方法，其中样品中标志物的丰度是血液样品中标志物的多肽的浓度。
[0044]
[21-1][20]或[21]的方法，其中v型胶原蛋白mmp降解产物在血液样品中的浓度是通过特异性识别seq id no:4或seq id no:6所代表的肽来测量的。
[0045]
[22]用于诊断子宫内膜异位症的试剂盒，包括用于测量选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5a所示的标志物、表6a所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度的试剂。
[0046]
[23]用于确定受试者是否受子宫内膜异位症影响的试剂盒，包括用于测量选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5a所示的标志物、表6a所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度的试剂。
[0047]
[24][22]或[23]的试剂盒，进一步包括说明书，说明：如果选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表5a所示的标志物和表6a所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度较高，或者选自由表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度较低，表明该样品所来自的受试者受子宫内膜异位症影响或潜在受影响。
[0048]
[25]用于确定受试者子宫内膜纤维化程度的试剂盒，包括用于测量选自由v型胶原mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5a所示的标志物、表6a所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度的试剂。
[0049]
[26][25]的试剂盒，进一步包括说明书，说明：如果选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表5a所示的标志物和表6a所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度较高，或者选自由表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度较低，表明在该样品所来自的受试者中已经发生或潜在发生子宫内膜纤维化。
[0050]
[27]用于确定受试者子宫内膜粘连程度的试剂，包括用于测量选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5a所示的标志物、表6a所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度的试剂。
[0051]
[28][27]的试剂盒，进一步包括说明书，说明：如果选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表5a所示的标志物和表6a所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度较高，或者选自由表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度较低，表明在该样品所来自的受试者中已经发生或潜在发生子宫内膜粘连。
[0052]
[29]用于预测受子宫内膜异位症影响或疑似受子宫内膜异位症影响的受试者中由于子宫内膜异位症引起的疼痛程度的试剂盒，包括用于测量选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5a所示的标志物、表6a所示的标志物、表5b所示的标志物、以及表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度的试剂。
[0053]
[30][29]的试剂盒，进一步包括说明书，说明：如果选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表5a所示的标志物和表6a所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度较高，或者选自由表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度较低，表明该样品所来自的受试者因子宫内膜异位症而发生或潜在发生疼痛。
[0054]
[31]用于确定受子宫内膜异位症影响或疑似受子宫内膜异位症影响的受试者的子宫内膜异位症进展程度的试剂盒，包括用于测量选自由v型胶原mmp降解产物、表1a所示
的标志物、表2a所示的标志物、表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5a所示的标志物、表6a所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度的试剂。
[0055]
[32][31]的试剂盒，进一步包括说明书，说明：如果选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表5a所示的标志物和表6a所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度较高，或者选自由表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度较低，表明子宫内膜异位症在该样品所来自的受试者中正在进展或潜在发展。
[0056]
[33][24]、[26]、[28]、[30]或[32]的试剂盒，其中如果选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表5a所示的标志物和表6a所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度高于从健康个体获得的样品中相同标志物的丰度，则确定该丰度为高。
[0057]
[34][24]、[26]、[28]、[30]或[32]的试剂盒，其中如果选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物和表5a所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度为从健康个体获得的样品中相同标志物的丰度的2倍或更高，和/或如果选自表6a所示的标志物的至少一种标志物的丰度为从健康个体获得的样品中相同标志物的丰度的1.6倍或更高，则确定该丰度为高。
[0058]
[35][24]、[26]、[28]、[30]或[32]的试剂盒，其中如果选自由表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度低于从健康个体获得的样品中相同标志物的丰度，则确定该丰度为低。
[0059]
[36][24]、[26]、[28]、[30]或[32]的试剂盒，其中如果选自由表1b所示的标志物、表2b所示的标志物和表5b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度为从健康个体获得的样品中的相同标志物的丰度的0.5倍或更低，和/或选自由表6b所示的标志物的至少一种标志物的丰度为从健康个体获得的样品中的相同标志物的丰度的0.625倍或更低，则确定该丰度为低。
[0060]
[37]用于监测受子宫内膜异位症影响或疑似受子宫内膜异位症影响的受试者的子宫内膜异位症的病理状况的试剂盒，包括用于测量选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5a所示的标志物、表6a所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物丰度的试剂。
[0061]
[38][37]的试剂盒，进一步包括说明书，说明：比较在不同时间点从受试者收集的多个样品中的每一个中选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5a所示的标志物、表6a所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度。
[0062]
[39][37]或[38]的试剂盒，进一步包括说明书，说明：如果选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表5a所示的标志物和表6a所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度随着时间的推移而减少，或者选自由表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度随着时间的推移而增加，表明在该样品所来自的受试者中子宫内膜异位症的病
理状况正在改善或潜在改善。
[0063]
[40][37]或[38]的试剂盒，进一步包括说明书，说明：如果选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表5a所示的标志物和表6a所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度随着时间的推移而增加，或选自由表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度随着时间的推移而减少，表明在该样品所来自的受试者中子宫内膜异位症的病理状况恶化或潜在恶化。
[0064]
[41][22]至[40]中任一项的试剂盒，其中标志物作为多肽被测量。
[0065]
[42][22]至[41]中任一项的试剂盒，其中样品是血液样品。
[0066]
[43][42]的试剂盒，其中样品中标志物的丰度是血液样品中标志物的多肽的浓度。
[0067]
[43-1][42]或[43]的试剂盒，其中血液样品中v型胶原蛋白mmp降解产物的浓度是通过特异性识别seq id no:4或seq id no:6所代表的肽来测量的。
[0068]
[44]试剂，用于测量选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5a所示的标志物、表6a所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度，以用于子宫内膜异位症的诊断。
[0069]
[45]试剂，用于测量选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5a所示的标志物、表6a所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度，以用于确定受试者是否受子宫内膜异位症影响。
[0070]
[46]试剂，用于测量选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5a所示的标志物、表6a所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度，以用于确定受试者的子宫内膜纤维化程度。
[0071]
[47]试剂，用于测量选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5a所示的标志物、表6a所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度，以用于确定受试者中子宫内膜粘连的程度。
[0072]
[48]试剂，用于测量选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5a所示的标志物、表6a所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度，以用于预测受子宫内膜异位症影响或疑似受子宫内膜异位症影响的受试者中由于子宫内膜异位症引起的疼痛程度。
[0073]
[49]试剂，用于测量选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5a所示的标志物、表6a所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度，以用于确定受子宫内膜异位症影响或疑似受子宫内膜异位症影响的受试者的子宫内膜异位症的进展程度。
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[50]试剂，用于测量选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5a所示的标志物、表6a所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度，以用于监测受子宫内膜异位症影响或疑似受子宫内膜异位症影响的受试者的子宫内膜异位症的病理状况。
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[51][44]至[50]中任一项的试剂，其中标志物作为多肽被测量。
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[52][44]至[51]中任一项的试剂，其中标志物的丰度是通过测量从受试者获得的血液样品中该标志物的多肽浓度来测量的。
[0077]
[53][51]的试剂，其中血液样品中v型胶原蛋白mmp降解产物的浓度是通过特异性识别存在于血液样品中的由seq id no:4或seq id no:6代表的多肽来测量的。
附图说明
[0078]
图1-1至图1-10示出了用lc-ms分析健康个体/子宫内膜异位症患者血浆中蛋白质的相对表达水平的结果。每个图的标题显示靶蛋白的基因符号:uniprot id。x轴代表样品的名称并且y轴代表蛋白质的相对表达水平。图中的条形代表由三次分析得到的三个数据集中的蛋白质相对表达水平的标准差。图1-1示出了基因符号:calu和uniprot id:o43852的数据。
[0079]
图1-2示出了基因符号:cat和uniprot id:p04040的数据。
[0080]
图1-3示出了基因符号:hba1和uniprot id:p69905的数据。
[0081]
图1-4示出了基因符号:hbb和uniprot id:p68871的数据。
[0082]
图1-5示出了基因符号:hbd和uniprot id:p02042的数据。
[0083]
图1-6示出了基因符号:ppia和uniprot id:p62937的数据。
[0084]
图1-7示出了基因符号:prdx1；prdx4和uniprot id:q06830的数据。
[0085]
图1-8示出了基因符号:s100a6和uniprot id:p06703的数据。
[0086]
图1-9示出了基因符号:tpi1和uniprot id:p60174的数据。
[0087]
图1-10示出了基因符号:ube2v1；ube2v2和uniprot id:q13404的数据。
[0088]
图2-1至图2-10示出了用分析健康个体/子宫内膜异位症患者血浆中蛋白质的表达水平的结果。每张图的标题示出靶蛋白的基因符号:uniprot id。x轴代表样品的名称并且y轴代表靶蛋白在中的适体信号值。图2-1示出了基因符号:bgn和uniprot id:p21810的数据。
[0089]
图2-2示出了基因符号:cdh12和uniprot id:p55289的数据。
[0090]
图2-3示出了基因符号:ddx19b和uniprot id:q9umr2的数据。
[0091]
图2-4示出了基因符号:il1b和uniprot id:p01584的数据。
[0092]
图2-5示出了基因符号:il2和uniprot id:p60568的数据。
[0093]
图2-6示出了基因符号:lag3和uniprot id:p18627的数据。
[0094]
图2-7示出了基因符号:mfge8和uniprot id:q08431的数据。
[0095]
图2-8示出了基因符号:pde5a和uniprot id:o76074的数据。
[0096]
图2-9示出了基因符号:serpine2和uniprot id:p07093的数据。
[0097]
图2-10示出了基因符号:smpdl3a和uniprot id:q92484的数据。
[0098]
图3示出了分析健康个体/子宫内膜异位症患者血浆中v型胶原蛋白降解产物(c5m)的表达水平的结果。x轴代表样品的名称并且y轴代表血浆中目标降解产物的浓度(ng/ml)。
[0099]
具体实施方式的描述
[0100]
标志物
[0101]
本公开内容中的标志物可以改称为生物标志物，并且指的是体内特定的化学物质，其可以作为正常生物过程、疾病发展过程或对治疗的药理反应性的指标进行客观测量和评价。这些标志物可用于评估疾病的存在与否、疾病的进展或对疾病的敏感性；评估或预测药剂的效果、最佳剂量或安全性；预测预后；或此类。本公开内容中的标志物由蛋白质名称、蛋白质片段名称或基因名称指定。用作标志物的基因优选以多肽或多核苷酸(包括dna的形式和mrna的形式)进行测量，而用作标志物的蛋白质或蛋白质片段优选以多肽进行测量。
[0102]
测量标志物丰度的方法
[0103]
标志物的丰度可以根据标志物的形式或要测量标志物丰度的样品的类型选择适当的方法来测量。当标志物为多肽形式时，可通过使用与多肽特异性结合的抗体的免疫学方法测量。这种方法的例子包括酶免疫测定法(elisa，eia)、氟免疫测定法(fia)、放射免疫测定法(ria)、发光免疫测定法(lia)、电化学发光(ecl)方法、western印迹法、表面等离子体共振法、使用抗体阵列的方法、免疫组化染色方法、荧光激活细胞分选(facs)方法、免疫层析方法、免疫沉淀方法、免疫浊度测定方法和乳胶凝集方法。当标志物为多核苷酸形式时，可以通过使用与多核苷酸特异性结合的寡核苷酸的基因工程方法来测量。这种方法的例子包括聚合酶链反应(pcr)方法、反转录pcr(rt-pcr)方法、实时定量pcr(q-pcr)方法、northern印迹法和杂交方法(包括使用寡核苷酸阵列如dna微阵列的方法)。
[0104]
当要测量的标志物是由基因表达的蛋白质时，丰度可以被改写为表达水平。在本公开内容中，"丰度"包括蛋白质的表达水平、基因的表达水平和蛋白质片段的浓度。
[0105]
在本公开内容的实施方案中，标志物的丰度可以是相对丰度。相对丰度可以通过比较从受试者获得的样品中特定标志物的水平和其他蛋白质/代谢物的水平与对照物来进行测量。相对丰度也可以通过lc/ms(液相色谱/质谱法)来测量。
[0106]
标志物丰度的标准
[0107]
在本公开内容中，"标志物的丰度高或大"是指该标志物的测量值高于或大于该标志物的预定值(对照水平)。"标志物的丰度低或小"是指其低于或小于该标志物的预定值(对照水平)或不大于对照水平。
[0108]
本公开内容中的预定值是指基于一定的科学依据而预先确定的值。它可以是任何值，只要它可以作为参照来确定是否存在子宫内膜异位症，确定受试者的子宫内膜纤维化程度，确定受试者的子宫内膜粘连程度，预测受子宫内膜异位症影响的受试者的疼痛程度，确定子宫内膜异位症的进展程度，或监测子宫内膜异位症的病理状况。本公开内容中的预定值可针对每个标志物确定。
[0109]
本公开内容中的预定值可以从自健康受试者(例如健康的成年人)获得的样品(对照样品)中的标志物的测量值确定。在本公开内容中已经发现，与从健康受试者获得的样品中的标志物的测量值相比，从受子宫内膜异位症影响的受试者获得的样品中的标志物的测
量值增加或减少。因此，一种可能的方法可以是将从多个健康受试者获得的样品中的标志物测量值的平均值作为预定值。另一种可能的方法可以是将从多个健康受试者获得的样品中的标志物测量值的平均值加上0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5或3.0倍的标准偏差作为预定值。因此，在本公开内容的一个实施方案中，表明确定测试受试者是否受子宫内膜异位症的影响，确定受试者中子宫内膜纤维化的程度，确定受试者中子宫内膜粘连的程度，预测受子宫内膜异位症影响或疑似受子宫内膜异位症影响的受试者的疼痛程度，确定子宫内膜异位症的进展程度，或监测子宫内膜异位症的病理状况，是通过比较从健康个体获得的样品(对照样品)中测得的标志物的丰度(对照水平)和从测试受试者获得的样品中测得的标志物的值来进行的。
[0110]
在本公开内容中，本公开内容中的标志物的测量值和预定值可以是通过任何方法量化的标志物丰度的测量结果。在本公开内容中，作为测量结果得到的值(例如显色强度)可以直接作为标志物的测量值或预定值，或者可以使用通过将其与单独制备的含有已知量标志物的阳性对照样品进行比较而从测量结果(例如浓度)转换的值。或者，也可以使用通过例如将如上所述获得的值归入某些区间并进行打分(例如1、2和3级)而给出的值。
[0111]
样品
[0112]
本公开内容中的样品可以被改称为生物样品，并且是指活体中包含的器官、组织、细胞、体液或其混合物。具体例子包括皮肤、呼吸道、肠道、泌尿生殖道、神经、肿瘤、骨髓、血细胞、血液(全血、血浆、血清)、淋巴、脑脊液、腹膜内液、滑液、肺内液、唾液、痰、尿液等。通过清洗这些获得的样品或通过体外培养这些获得的样品也包括在本公开内容的样品中。本公开内容中的优选样品是血液，特别优选的样品是血浆或血清。
[0113]
在本公开内容中，从受试者获得的样品在进行标志物丰度的测量之前可通过诸如浓缩、纯化、提取、分离或物理/化学处理等方法来处理。例如，血细胞或血浆成分可从血液样品中分离，dna或rna可从组织/细胞样品中提取。或者，不需要的成分可以通过加热或化学试剂进行变性/去除。进行这种处理主要是为了提高测量标志物丰度的敏感性和特异性。
[0114]
在本公开内容的确定子宫内膜纤维化的程度、确定子宫内膜粘连的程度、预测子宫内膜异位症引起的疼痛程度、确定子宫内膜异位症的进展程度以及监测子宫内膜异位症的病理状况时，从中获取样品的受试者可以是已经被诊断为受子宫内膜异位症影响的受试者或疑似受子宫内膜异位症影响的受试者。受子宫内膜异位症影响的受试者可以是任何受试者，只要他们受子宫内膜异位症影响。受试者可以是尚未接受或已经接受子宫内膜异位症治疗的受试者。
[0115]
本公开内容中的受试者是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯化的动物(例如牛、羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如人类和非人类灵长类动物如猴)、兔子和啮齿动物(如小鼠和大鼠)。在特定的实施方案中，受试者是人类。
[0116]
本公开内容中的标志物
[0117]
本公开内容的标志物包括v型胶原蛋白mmp(基质金属蛋白酶)降解产物(v型胶原蛋白衍生的多肽，在其n端包含seq id no:4中列出的氨基酸序列和/或在其c端包含seq id no:6中列出的氨基酸序列，例如seq id no:2和3列出的蛋白质片段)、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5a所示的标志物、表6a所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物。
[0118]
[表1a]
[0119]
[0120]
[0121][0122]
[表1b]
[0123]
uniprot id蛋白质名称基因名称q9coh2-3蛋白质20同源物3ttyh3
[0124]
[表2a]
[0125]
[0126]
[0127][0128]
[表2b]
[0129]
[0130]
[0131][0132]
[表5a]
[0133][0134]
[表5b]
[0135]
uniprot id蛋白质名称基因名称p10645嗜铬粒蛋白a(cga)chgaq9gzv9成纤维细胞生长因子23(fgf-23)fgf23p01266甲状腺球蛋白(tg)tg
[0136]
[表6a]
[0137]
uniprot id蛋白质名称基因名称p07996血小板反应蛋白-1 os＝智人 ox＝9606 gn＝thbs1 pe＝1 sv＝2thbs1p69905血红蛋白亚基α os＝智人 ox＝9606 gn＝hba1 pe＝1 sv＝2hba1p32119过氧化物氧化蛋白-2 os＝智人 ox＝9606 gn＝prdx2 pe＝1 sv＝5prdx2p00918碳酸酐酶2 os＝智人 ox＝9606 gn＝ca2 pe＝1 sv＝2ca2p30043黄素还原酶(nadph) os＝智人 ox＝9606 gn＝blvrb pe＝1blvrb076011角蛋白，i型表皮ha4 os＝智人 ox＝9606 gn＝krt34 pe＝1 sv＝2krt34p13716δ-氨基乙酰丙酸脱水酶 os＝智人 ox＝9606 gn＝alad pe＝1 sv＝1alad
p00568腺苷酸激酶同工酶1 os＝智人 ox＝9606 gn＝aki pe＝1 sv＝3ak1p07738二磷酸甘油酸变位酶 os＝智人 ox＝9606 gn＝bpgm pe＝1 sv＝2bpgmp02775血小板碱性蛋白 os＝智人 ox＝9606 gn＝ppbp pe＝1 sv＝3ppbpp22392核苷二磷酸激酶b os＝智人 ox＝9606 gn＝nme2 pe＝1 sv＝1nme2p10124丝甘蛋白聚糖 os＝智人 ox＝9606 gn＝srgn pe＝1 sv＝3srgnaoaoc4dh67免疫球蛋白κ可变区1-8 os＝智人 ox＝9606 gn＝igkv1-8 pe＝3igkv1-8p63241真核翻译起始因子5a-1 os＝智人 ox＝9606 gn＝eif5a pe＝1eif5ap02776血小板因子4 os＝智人 ox＝9606 gn＝pf4 pe＝1 sv＝2pf4aoa075b6s2免疫球蛋白κ可变区2d-29 os＝智人 ox＝9606 gn＝igkv2d-29 pe＝3igkv2d-29q9uku6促甲状腺素释放激素降解胞外酶os＝智人 ox＝9606 gn＝trhde pe＝2trhdeq8wum4程序性细胞死亡6相互作用蛋白os＝智人 ox＝9606 gn＝pdcd6ip pe＝1pdcd6ipp00441超氧化物歧化酶[cu-zn]os＝智人 ox＝9606 gn＝sod1 pe＝1sod1
[0138]
[表6b]
[0139][0140]
基于上述表格中示出的uniprot id，可以很容易地从本领域技术人员已知的数据库(uniprot:https://www.uniprot.org/)中检索这些表格中所列的标志物(mrna和蛋白质)的序列。具体来说，uniprot id可以用于搜索相应的uniprot条目以检索"序列"部分提供的序列。也可以从"序列"部分的描述中获得其他数据库(例如refseq、embl、genbank、ddbj、ccds、pir、unigene、ensemble、geneid、kegg和uscs)的id/登录号，并从那些数据库中检索更多序列。在本公开内容中，每个标志物的序列是指对应的uniprot条目的最新版本中提供的序列和id/登录号，其发布号早于2018-09(例如，2018-08；如果2018-08不存在，然后2018_07；如果2018_08和2018_07都不存在，然后2018_06；同样适用于早于2018_06的数字)。
[0141]
此外，在存储uniprot发布数据档案的ftp中(ftp://ftp.uniprot.org/pub/databases/uniprot/previous_releases/)，通过使用表中所示的uniprot id，也可以从"
release-2018_08/knowledgebase"目录("release-2018_08"中包含的"知识库"目录)中检索到上述表格中的标志物的氨基酸序列。
[0142]
上述表格中所列的标志物组包括指示纤维化的标志物(tgfb1、sparc等)。此外，上表中列出的标志物组包括许多被认为是来自血小板的分子。例如，uniprot说ppbp、thbs1、pf4、serpina1、timp3、app、calu、casp3、mmrn1、saa1、srgn、vwf等都参与血小板脱粒等。zhang等人在使用子宫内膜衍生细胞的体外实验系统中证明，由激活的血小板释放的tgfb1诱导上皮-间质转化(emt)和成纤维细胞到成纤维细胞的转分化(fmt)，增加胶原蛋白产生，并诱导纤维化(molecular和cellular endocrinology,428,1-16,2016)。这与本公开内容中选择tgfb1和血小板衍生蛋白作为标志物的事实相一致，表明这些蛋白的变化可能反映了血小板激活等的变化。
[0143]
v型胶原蛋白mmp降解产物也称为mmp介导的v型胶原蛋白降解，是由mmp降解v型胶原蛋白的α3链(refseq:np_056534.2,seq id no:1)而产生的产物。具体来说，v型胶原蛋白的mmp降解产物是由seq idno:1所示的v型胶原蛋白在1316(g)和1317(h)氨基酸之间的裂解产生的v型胶原蛋白降解产物(clin biochem.2012年5月；45(7-8)：541-6)。具体来说，任何多肽都包括在v型胶原蛋白mmp降解产物中，只要它们来自v型胶原蛋白并在n端包含seq id no:4中列出的氨基酸序列和/或在c端包含seq id no:6中列出的氨基酸序列。v型胶原蛋白mmp降解产物的例子包括seq id no:2或3中所示的蛋白质片段。在v型胶原蛋白mmp降解产物中，seq id no:4(hmgregrege)的肽片段有时被称为c5m。
[0144]
v型胶原蛋白mmp降解产物的存在是通过任何能够检测seq id no:1中列出的氨基酸1316(g)和1317(h)之间裂解后的v型胶原蛋白片段的方法来检测。在特定的实施方案中，可以使用特异性识别位于seq id no:2中所示v型胶原蛋白片段n端的肽hmgregrege(seq id no:4)的抗体来检测v型胶原蛋白mmp降解产物的丰度。在更具体的实施方案中，可以使用能够识别位于seq id no:2所示v型胶原蛋白片段n端的肽hmgregrege(seq id no:4)且不识别ghmgregrege(seq id no:5)的抗体来检测v型胶原蛋白mmp降解产物的丰度(使用这种抗体的elisa检测方法已在clin biochem.2012年5月；45(7-8)：541-6中建立)。在另一个实施方案中，可以使用特异性识别位于seq id no:3中列出的v型胶原蛋白片段c端的肽gppgkrgpsg(seq id no:6)的抗体来检测v型胶原蛋白mmp降解产物的丰度。在更具体的实施方案中，可以使用识别位于seq id no:3所示v型胶原蛋白片段c端的肽gppgkrgpsg(seq id no:6)且不识别gpgkrgpsgh(seq id no:7)的抗体来检测v型胶原蛋白mmp降解产物的丰度。
[0145]
在本公开内容中，选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5a所示的标志物、表6a所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组的蛋白质可单独用作标志物，或者可将所选蛋白质的组合用作标志物。当使用一种以上的蛋白质作为标志物时，可以单独测量每个标志物，然后将结果合并，或者可以将标志物一起测量。
[0146]
本公开内容的标志物的丰度可以使用本公开内容所述的测量方法或使用市售的测量试剂来测量。这里描述的每个标志物的具体测量值和预定值可以理解为使用上述测量试剂测量的值。
[0147]
为本公开内容的标志物确定的预定值(对照水平)可以根据测量每个标志物丰度
的受试者样品的类型而变化，但可以从例如0.1至100ng/ml的范围内确定。或者，可以从0.2至90ng/ml、0.3至80ng/ml、0.4至70ng/ml、0.5至60ng/ml、1.0至50ng/ml、1.5至40ng/ml、2.0至30ng/ml、2.5至20ng/ml、3.0至10ng/ml等范围确定，但不限于此。
[0148]
为本公开内容的每个标志物确定的预定值可以从诸如0.1ng/ml、0.2ng/ml、0.3ng/ml、0.4ng/ml、0.5ng/ml、0.6ng/ml、0.7ng/ml、0.8ng/ml、0.9ng/ml、1.0ng/ml、1.5ng/ml、2.0ng/ml、2.5ng/ml、3.0ng/ml、3.5ng/ml、4.0ng/ml、4.5ng/ml、5.0ng/ml、5.5ng/ml、6.0ng/ml、6.5ng/ml、7.0ng/ml、7.5ng/ml、8.0ng/ml、8.5ng/ml、9.0ng/ml、9.5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、45ng/ml、50ng/ml、60ng/ml、70ng/ml、80ng/ml、90ng/ml和100ng/ml的值确定，但不限于此。
[0149]
在本公开内容中，当本公开内容的每个标志物的丰度大于预定值(对照水平)时，可以判定为"丰度高"或"丰度大"。例如，在本公开内容中，当选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物和表5a所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度是从健康个体获得的样品中相同标志物的丰度，例如，1.1倍或更多，1.2倍或更多，1.3倍或更多，1.4倍或更多，1.5倍或更多，1.6倍或更多，1.7倍或更多，1.8倍或更多，1.9倍或更多，2.0倍或更多，2.1倍或更多，2.2倍或更多，2.3倍或更多，2.4倍或更多，2.5倍或更多，2.6倍或更多，2.7倍或更多，2.8倍或更多，2.9倍或更多，或3.0倍或更多，或更多时，且不限于此，可以判定为"丰度高"或"丰度大"。或者，在本公开内容中，当不限于选自表6a所示的标志物的至少一种标志物的丰度是从健康个体获得的样品中相同标志物丰度，例如，1.10倍或更多，1.15倍或更多，1.20倍或更多，1.25倍或更多，1.30倍或更多，1.35倍或更多，1.40倍或更多，1.45倍或更多，1.50倍或更多，1.55倍或更多，1.60倍或更多，1.65倍或更多，1.70倍或更多，1.75倍或更多，1.80倍或更多，1.85倍或更多，1.90倍或更多，1.95倍或更多，或2.00倍或更多，或更多时，可以判定为"丰度高"或"丰度大"。
[0150]
在本公开内容中，当本公开内容的每个标志物的丰度小于预定值(对照水平)时，可以判定为"丰度低"或"丰度小"。例如，在本公开内容中，当不限于选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1b所示的标志物、表2b所示的标志物和表5b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度是从健康个体获得的样品中相同标志物的丰度，例如，0.9倍或更少，0.8倍或更少，0.7倍或更少，0.6倍或更少，0.5倍或更少，0.4倍或更少，0.3倍或更少，0.2倍或更少，或0.1倍或更少，或更少时，可以判定为"丰度低"或"丰度小"。或者，在本公开内容中，当不限于选自表6b所示的标志物的至少一种标志物的丰度是从健康个体获得的样品中相同标志物的丰度，例如，0.9倍或更少，0.8倍或更少，0.7倍或更少，0.6倍或更少，0.5倍或更少，0.4倍或更少，0.3倍或更少，0.2倍或更少，或0.1倍或更少时，或更少时，可以判定为"丰度低"或"丰度小"。
[0151]
子宫内膜异位症的诊断和确定受试者是否受到子宫内膜异位症的影响
[0152]
本公开内容的一个方面涉及诊断子宫内膜异位症的方法或确定受试者是否受子宫内膜异位症影响的方法。本公开内容的一个方面还涉及检测子宫内膜异位症或其标志物的方法。本公开内容的一个方面还涉及协助诊断或确定的方法。本公开内容的一个方面还涉及为诊断或确定提供指示(instructions)的方法。本公开内容的一个方面涉及用于这些方法的试剂和试剂盒。
[0153]
上述各方法包括测量在从受试者获得的样品中选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、
表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5a所示的标志物、表6a所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度。该方法还可以包括将丰度与预定值(对照水平)进行比较。
[0154]
上述试剂是用于测量选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5a所示的标志物、表6a所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度的试剂。上述试剂盒含有这样的试剂。
[0155]
上述各方法可包括一步骤，其中如果在从受试者获得的样品中选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表5a所示的标志物和表6a所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度高于预定值(对照水平)，或者如果在从受试者获得的样品中选自由表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度低于预定值(对照水平)，则表明该样品所来自的受试者受到或潜在受到子宫内膜异位症的影响。
[0156]
上述各方法可以在体内和在体外进行，但优选在体外进行。
[0157]
此外，上述各方法还可包括从受试者获得样品。
[0158]
此外，上述各方法还可包括治疗已被证明受子宫内膜异位症影响或潜在受子宫内膜异位症影响的受试者。上述各方法还可包括向已被证明受子宫内膜异位症影响或潜在受子宫内膜异位症影响的受试者施用已知的治疗剂。因此，本发明涉及用上述各方法治疗已被证明受子宫内膜异位症影响或潜在受子宫内膜异位症影响的受试者的方法。用于子宫内膜异位症的各种治疗剂是本领域技术人员已知的，其例子包括但不限于雌激素/孕激素混合物、孕激素制剂、gnrh激动剂、gnrh拮抗剂和达那唑。
[0159]
上述试剂盒可进一步包括说明书，说明：如果选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表5a所示的标志物和表6a所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度高于预定值(对照水平)，或者如果选自由表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度低于预定值(对照水平)，则表明该样品所来自的受试者受到子宫内膜异位症的影响或潜在受子宫内膜异位症影响。
[0160]
确定受试者的子宫内膜纤维化程度
[0161]
本公开内容的一个方面涉及确定受试者子宫内膜纤维化程度的方法、协助该确定的方法、为该确定提供指示的方法，以及用于这些的试剂和试剂盒。
[0162]
上述各方法包括测量在从受试者获得的样品中选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5a所示的标志物、表6a所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度。该方法还可以包括将丰度与预定值(对照水平)进行比较。
[0163]
上述试剂是用于测量选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5a所示的标志物、表6a所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度的试剂。上述试剂盒包含此类试剂。
[0164]
上述各方法可包括一步骤，其中如果在从受试者获得的样品中选自由v型胶原蛋
白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表5a所示的标志物和表6a所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度高于预定值(对照水平)，或者如果在从受试者获得的样品中选自由表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度低于预定值(对照水平)，则表明在该样品所来自的受试者中子宫内膜纤维化正在发生或潜在发生。
[0165]
上述各方法可以在体内和在体外进行，但优选在体外进行。
[0166]
此外，上述各方法可包括从受试者获得样品。
[0167]
此外，上述各方法还可包括治疗已被证明已发生或潜在发生子宫内膜纤维化的受试者。上述各方法还可包括向已被证明发生或潜在发生子宫内膜纤维化的受试者施用已知的抑制子宫内膜纤维化的治疗剂。因此，本发明涉及抑制受试者纤维化的方法，该受试者被上述各方法显示已经发生或潜在发生子宫内膜纤维化。抑制子宫内膜纤维化的治疗剂的例子包括上述治疗子宫内膜异位症的治疗剂。
[0168]
上述试剂盒可进一步包括说明书，说明：如果在从受试者获得的样品中选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表5a所示的标志物和表6a所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度高于预定值(对照水平)，或者选自由表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度低于预定值(对照水平)，则表明在该样品所来自的受试者中已经发生或潜在发生子宫内膜纤维化。
[0169]
确定受试者中子宫内膜粘连的程度
[0170]
本公开内容的一个方面涉及确定受试者中子宫内膜粘连程度的方法、协助该确定的方法、为该确定提供指示的方法，以及用于这些方法的试剂和试剂盒。
[0171]
上述各方法包括测量在从受试者获得的样品中选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5a所示的标志物、表6a所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中至少一种标志物的丰度。该方法还可以包括将丰度与预定值(对照水平)进行比较。
[0172]
上述试剂是用于测量选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5a所示的标志物、表6a所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中至少一种标志物的丰度的试剂。上述试剂盒包含这样的试剂。
[0173]
上述各方法可包括一步骤，其中如果从受试者获得的样品中选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表5a所示的标志物和表6a所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度高于预定值(对照水平)，或者如果选自从表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度低于预定值(对照水平)，则表明在该样品所来自的受试者中已经发生或潜在发生子宫内膜粘连。
[0174]
上述各方法可以在体内和在体外进行，但优选在体外进行。
[0175]
此外，上述各方法可包括从受试者获得样品。
[0176]
此外，上述各方法还可包括治疗已被证明发生或潜在发生子宫内膜粘连的受试者。上述各方法还可包括向已被证明发生或潜在发生子宫内膜粘连的受试者施用抑制子宫
内膜粘连的已知治疗剂。因此，本发明涉及抑制受试者子宫内膜粘连的方法，该受试者被上述各方法显示已发生或潜在发生子宫内膜粘连。抑制子宫内膜粘连的治疗剂的例子包括上述治疗子宫内膜异位症的治疗剂。
[0177]
上述试剂盒可进一步包括说明书，说明如果在从受试者获得的样品中选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表5a所示的标志物和表6a所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度高于预定值(对照水平)，或者选自由表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度低于预定值(对照水平)，表明在该样品所来自的受试者中已经发生或潜在发生子宫内膜粘连。
[0178]
预测受子宫内膜异位症影响或疑似受子宫内膜异位症影响的受试者中由于子宫内膜异位症引起的疼痛程度
[0179]
本公开内容的一个方面涉及预测受子宫内膜异位症影响或疑似受子宫内膜异位症影响的受试者中由于子宫内膜异位症引起的疼痛程度的方法、协助该预测的方法、为该预测提供指示的方法，以及用于这些方法的试剂和试剂盒。
[0180]
上述各方法包括测量在从受试者获得的样品中选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5a所示的标志物、表6a所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度。该方法还可以包括将丰度与预定值(对照水平)进行比较。
[0181]
上述试剂是用于测量选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5a所示的标志物、表6a所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度的试剂。上述试剂盒包含这样的试剂。
[0182]
上述各方法可包括一步骤，其中如果在从受试者获得的样品中选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表5a所示的标志物和表6a所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度高于预定值(对照水平)，或者如果选自由表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度低于预定值(对照水平)，则表明该样品所来自的受试者由于子宫内膜异位症而发生或潜在发生疼痛。
[0183]
上述各方法可以在体内和在体外进行，但优选在体外进行。
[0184]
此外，上述各方法可包括从受试者获得样品。
[0185]
此外，上述各方法还可包括减轻在已被证明发展或潜在发展由于子宫内膜异位症引起的疼痛的受试者中子宫内膜异位症引起的的疼痛。上述各方法还可包括向已被证明因子宫内膜异位症而发展或潜在发展疼痛的受试者施用用于抑制子宫内膜异位症引起的疼痛的已知治疗剂。因此，本发明涉及抑制受试者子宫内膜异位症引起的疼痛的方法，该受试者已被上述各方法证明发展或潜在发展由于子宫内膜异位症引起的疼痛。抑制子宫内膜异位症引起的疼痛的治疗剂的例子包括上述子宫内膜异位症治疗剂。
[0186]
上述试剂盒可进一步包括说明书，说明如果在从受试者获得的样品中选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表5a所示的标志物和表6a所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度高于预定值(对照水平)，或者选自由表
1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度低于预定值(对照水平)，该样品所来自的受试者被证明因子宫内膜异位症而发展或潜在发展子宫内膜异位症引起疼痛。
[0187]
确定子宫内膜异位症的进展程度
[0188]
本公开内容的一个方面涉及确定受子宫内膜异位症影响或疑似受子宫内膜异位症影响的受试者中子宫内膜异位症的进展程度的方法、协助该确定的方法、为该确定提供指示的方法，以及用于这些方法的试剂和试剂盒。
[0189]
上述各方法包括测量在从受试者获得的样品中选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5a所示的标志物、表6a所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度。该方法还可以包括将丰度与预定值(对照水平)进行比较。
[0190]
上述试剂是用于测量选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5a所示的标志物、表6a所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度的试剂。上述试剂盒包含这样的试剂。
[0191]
上述各方法可包括一步骤，其中如果在从受试者获得的样品中选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表5a所示的标志物和表6a所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度高于预定值(对照水平)，或者如果选自由表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度低于预定值(对照水平)，则表明子宫内膜异位症在该样品所来自的受试者中正在进展或潜在进展。
[0192]
上述各方法可以在体内和在体外进行，但优选在体外进行。
[0193]
此外，上述各方法可包括从受试者获得样品。
[0194]
此外，上述各方法还可包括治疗受试者，其中该受试者已显示出子宫内膜异位症正在进展或潜在进展。上述各方法还可包括向已显示子宫内膜异位症正在进展或潜在进展的受试者施用用于抑制子宫内膜异位症进展的已知治疗剂。因此，本发明涉及抑制受试者中子宫内膜异位症进展的方法，其中该受试者通过上述各方法显示子宫内膜异位症正在进展或潜在进展。抑制子宫内膜异位症进展的治疗剂的例子包括上述治疗子宫内膜异位症的治疗剂。
[0195]
上述试剂盒可进一步包括说明书，说明如果在从受试者获得的样品中选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表5a所示的标志物和表6a所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度高于预定值(对照水平)，或者选自表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物的丰度组成的组中的至少一种标志物的丰度低于预定值(对照水平)，表明子宫内膜异位症在该样品所来自的受试者中正在进展或潜在进展。
[0196]
监测子宫内膜异位症的病理状况
[0197]
本公开内容的一个方面涉及监测受子宫内膜异位症影响或疑似受子宫内膜异位症影响的受试者的子宫内膜异位症的病理状况的方法、协助该监测的方法、为该监测提供指示的方法，以及用于这些方法的试剂和试剂盒。
[0198]
本公开内容中的监测包括评估治疗效果和/或提供关于未来治疗方案或治疗政策的信息。
[0199]
上述各方法包括测量在从受试者获得的样品中选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5a所示的标志物、表6a所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度。
[0200]
上述试剂是用于测量选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5a所示的标志物、表6a所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度的试剂。上述试剂盒包含这样的试剂。
[0201]
上述各方法可包括测量在不同时间点从受试者收集的多个样品中的每个样品中选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5a所示的标志物、表6a所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的每一个丰度。这些方法还可以包括比较在不同时间点收集的多个样品中每个样品的标志物的丰度。在本公开内容中，收集样品的时间和次数不受限制，必要时可在治疗前、治疗中和治疗后的各个时间点收集样品。也可以在治疗前、治疗中和治疗后的每个时期内的不同时间点收集样品。在本公开内容中，"多个"没有特别限制，其例子包括2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。
[0202]
上述试剂盒可包括说明书，说明将在不同时间点从受试者收集的多个样品中的每个样品中选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5a所示的标志物、表6a所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度进行比较。
[0203]
上述各方法可包括一步骤，其中如果选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表5a所示的标志物和表6a所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度随着时间的推移而减少，或者如果选自由表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度随着时间的推移而增加，则表明子宫内膜异位症的病理状况在该样品所来自的受试者中正在改善或潜在改善。
[0204]
上述各方法可包括一步骤，其中如果选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表5a所示的标志物和表6a所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度随着时间的推移而增加，或者如果选自由表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度随着时间的推移而减少，则表明子宫内膜异位症的病理状况在该样品所来自的受试者中正在恶化或潜在恶化。
[0205]
上述各方法可以在体内和在体外进行，但优选在体外进行。
[0206]
此外，上述各方法可以包括从受试者获得样品。
[0207]
此外，上述各方法可包括治疗已显示子宫内膜异位症的病理状况正在恶化或潜在恶化的受试者。上述各方法还可包括向已被证明子宫内膜异位症的病理状况正在恶化或潜在恶化的受试者施用已知的子宫内膜异位症治疗剂。因此，本发明涉及治疗受试者子宫内
膜异位症的方法，其中该受试者通过上述各方法已表明子宫内膜异位症的病理状况正在恶化或可能恶化。上述药剂可作为子宫内膜异位症的治疗剂。
[0208]
上述试剂盒可包括说明书，说明如果选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表5a所示的标志物和表6a所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度随着时间的推移而减少，或者如果选自由表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度随着时间的推移而增加，则表明子宫内膜异位症的病理状况在该样品所来自的受试者中正在改善或可能改善。
[0209]
上述试剂盒可包括说明书，说明如果选自由v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表5a所示的标志物和表6a所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度随着时间的推移而增加，或者如果选自由表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成的组中的至少一种标志物的丰度随着时间的推移而减少，则表明子宫内膜异位症的病理状况在该样品所来自的受试者中正在恶化或可能恶化。
[0210]
试剂/试剂盒
[0211]
只要可以测量标志物的丰度，那么本公开内容的试剂盒中包含的试剂没有特别限制。可以根据标志物的形式适当地选择试剂。当标志物的形式是多肽时，包含与多肽特异性结合的抗体的试剂是优选的。当标志物的形式是多核苷酸时，包含与多核苷酸特异性结合的寡核苷酸的试剂是优选的。在本公开内容中，抗体或多核苷酸本身可以是试剂。在本公开内容中，多核苷酸包括dna形式和mrna形式的多核苷酸。
[0212]
本公开内容中的抗体可以是嵌合抗体、人源化抗体或人类抗体。在一些实施方案中，抗体可以是多特异性抗体，例如，双特异性抗体。另外，本公开内容的抗体可以是抗体片段或其修饰产物。例如，抗体片段包括fab、f(ab')2、fv或单链fv(scfv)，其中h链fv和l链fv用适当的接头连接。这些抗体可以通过本领域技术人员公知的方法获得。
[0213]
抗体可以通过通常已知的方法进行标记。可以使用本领域技术人员已知的标记物质，如荧光染料、酶、辅酶、化学发光物质和放射性物质。
[0214]
本公开内容的寡核苷酸可以是任何寡核苷酸，其与作为本公开内容的标志物的多核苷酸的至少一部分或其互补链特异性杂交。这种用于检测多核苷酸的寡核苷酸的核苷酸序列选自与本公开内容的标志物的正义链互补的核苷酸序列。寡核苷酸的长度通常为至少15bp或更大。
[0215]
本公开内容的寡核苷酸也可以在通过通常已知的方法进行标记后使用。本公开内容的寡核苷酸可以通过例如市售寡核苷酸合成仪来生产。
[0216]
本公开内容的试剂盒优选含有阳性对照样品，作为测量标志物丰度的参考。只要事先确定了其中所含标志物的量，阳性对照样品就没有特别的限制，并且可以根据试剂盒所测量的标志物的形式而适当地制备。例如，当标志物的形式是多肽时，阳性对照样品优选是包含通过分离、纯化和定量与标志物相同的多肽而制备的多肽的样品。
[0217]
除上述外，本发明的试剂盒可包括例如无菌水、盐水、植物油、表面活性剂、脂质、增溶剂、缓冲液、蛋白质稳定剂(如bsa和明胶)、防腐剂、封闭溶液、反应溶液、反应停止溶液，以及必要时用于处理样品的试剂。
[0218]
本公开内容还包括v型胶原蛋白mmp降解产物、表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5a所示的标志物、表6a所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物的套组。这样的套组可用于诊断子宫内膜异位症，确定是否存在子宫内膜异位症，确定受子宫内膜异位症影响的患者的子宫内膜纤维化或粘连的程度，预测受子宫内膜异位症影响的患者的疼痛，监测受子宫内膜异位症影响的患者的病理状况，以及此类。
[0219]
此处引用的所有现有技术文件均通过引用并入本文。
实施例
[0220]
本公开内容将通过以下实施例进一步说明，但不限于此。
[0221]
(实施例1)利用健康人个体和子宫内膜异位症患者的血浆通过lc-ms分析寻找生物标志物
[0222]
(1-1)获得人血浆样品
[0223]
从proteogenex购买健康个体和子宫内膜异位症患者的血浆。
[0224]
(1-2)血浆蛋白的lc-ms分析
[0225]
使用seppro igy14柱(sigma aldrich)，将每个血浆样品中高丰度的蛋白质与柱结合，并通过制造商推荐的方法去除。流动部分中没有与柱结合的蛋白质用甲醇/氯仿方法沉淀，并溶解在8m尿素/400mm碳酸氢铵溶液中。溶解的蛋白质被还原和烷基化，然后用赖氨酰内肽酶和胰蛋白酶消化成肽。按照制造商推荐的方法，用monospin c18(gl science)对多肽溶液进行脱矿。
[0226]
按照制造商推荐的方法，用tmt10plex mass tag labeling kits and reagents(thermofisher scientific)(以下简称tmt 10-plex)标记肽。按照制造商推荐的方法，用pierce
tm high ph reversed-phase peptide fractionation kit(thermofisher scientific)对标记的多肽进行分馏。每个馏分由lc-ms分析系统进行分析，其中orbitrap fusion lumos(thermofisher scientific)与nano-lc系统(ultimate3000，dionex)连接。分析样品包括七个样品：从三位健康个体和三位子宫内膜异位症患者中的每一个的血浆中获得的肽，以及由这六个肽溶液等量混合而制备的样品(对照)。每个样品被分析三次，然后对每次分析中的独立数据集进行分析(n＝3，以下简称数据集tmt1、2和3)。
[0227]
通过maxquant软件(http://www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant)从lc-ms分析的原始数据中鉴定样品中的蛋白质，并分析其相对表达水平。用于蛋白质鉴定的数据库搜索是用以下参数进行的。分类法：uniprot人，固定修饰：氨基甲酰基甲基化(c)，可变修饰：氧化(m)；脱酰胺(nq)，乙酰化(蛋白质n端)，和fdr(蛋白质，肽)《1％。相对表达水平按以下公式计算。
[0228]
公式：
[0229][0230]
上述公式中使用的靶蛋白信号值是使用蛋白质组.txt中的"校正的报告子强度"列来计算的，该文件是maxqunat的输出文件之一，对于tmt10-plex的每个标记，使用管道试点(biovia)，强度之和除以对照样品的强度之和，并乘以1x10
11
。
[0231]
(1-3)生物标志物候选分子的选择
[0232]
通过统计编程环境r和microsoft excel对tmt1、2、3各数据集的lc-ms结果数据进行分析。从每个样品(3位健康个体和3位子宫内膜异位症患者)中每种蛋白质的相对表达水平中，根据每个数据集的以下标准选出58个在子宫内膜异位症患者中发现表达改变的蛋白质(表3a和表3b)。
[0233][0234]-在三位健康个体和三位子宫内膜异位症患者中蛋白质的相对表达水平在welch t检验中为p《0.05。
[0235]
[表3a]
[0236]
[0237]
[0238]
[0239][0240]
所选的蛋白质有希望作为诊断子宫内膜异位症的生物标志物。图1-1至1-10示出了其中代表性蛋白的相对表达水平图。
[0241]
(实施例2)利用健康人个体和子宫内膜异位症患者的血浆，通过适体结合蛋白分析寻找生物标志物
[0242]
(2-1)获得人类血浆样品
[0243]
从proteogenex公司购买健康人和子宫内膜异位症患者的血浆。
[0244]
(2-2)血浆蛋白的分析
[0245]
通过somascan(注册商标，somalogic)分析血浆样品(三位健康个体和三位子宫内膜异位症患者)中的低表达蛋白。具体来说，制备了每种都能与1310种蛋白质特异性结合的适体，与血浆混合，并使其与血浆中的蛋白质结合。然后，与适体结合的蛋白质被生物素化，并且适体-蛋白质复合物用链霉菌素珠纯化。接着，洗脱适体并通过微阵列检测，从而分析血浆中与适体结合的蛋白质的表达水平。
[0246]
(2-3)生物标志物候选者的选择
[0247]
通过统计编程环境r和microsoft excel对的适体信号数据进行分
析。根据以下标准，选出200个在子宫内膜异位症患者中发现表达改变的蛋白质(表4a和表4b)。
[0248][0249]
在上述计算中，最大适体信号值小于1000的蛋白质被认为是低于检测限，并被排除在分析之外。
[0250]
[表4a]
[0251]
[0252]
[0253]
[0254]
[0255]
[0256]
[0257]
[0258]
[0259][0260]
所选的蛋白质有希望作为诊断子宫内膜异位症的生物标志物。图2-1至2-10示出了其中代表性蛋白的表达水平图。
[0261]
(实施例3)利用健康人个体和子宫内膜异位症患者的血浆，通过细胞外基质降解产物分析寻找生物标志物
[0262]
(3-1)人血浆样品的获取
[0263]
从proteogenex公司购买健康个体和子宫内膜异位症患者的血浆。
[0264]
(3-2)血浆蛋白的细胞外基质测量
[0265]
用elisa系统分析血浆样品(3位健康个体和3位子宫内膜异位症患者)，用细胞外基质裂解位点的特异性抗体，并分析样品中细胞外基质的总量和细胞外基质的降解/合成状态(nordic bioscience)。具体来说，当iii、iv、v或vi型胶原蛋白、装饰蛋白(decorin)或巢蛋白(nidogen)降解时，用针对降解产物中包含的裂解位点的抗体，分析每个降解产物的表达水平。结果显示，在三位患者中，有两位患者的v型胶原蛋白mmp降解产物(c5m)明显增加(在两位c5m增加的患者血浆中，c5m浓度为10.2ng/ml和11.8ng/ml)，而所有健康个体的血浆c5m浓度都低于检测限。因此，认为c5m作为子宫内膜异位症的生物标志物很有前景。图3示出了v型胶原蛋白mmp降解产物(c5m)的血浆浓度图。
[0266]
(实施例4)利用健康人个体和子宫内膜异位症患者的血浆，通过luminex xmap
tm
技术寻找生物标志物
[0267]
(4-1)人血浆样品的获取
[0268]
健康个体的血浆(5个分泌期的血浆样品和5个增殖期的血浆样品)购自proteogenex。作为子宫内膜异位症患者的血浆，从37位子宫内膜异位症患者身上共获得111份血浆样品，分别在手术前、手术后3天和手术后1个月时获得。
[0269]
(4-2)用luminexxmap
tm
技术分析血浆蛋白
[0270]
通过luminex xmap
tm
(luminex的商标)分析血浆样品中的蛋白质。luminex xmap
tm
技术是用两种不同浓度的荧光染料组合对大珠子进行染色，并在每个珠子上固定能与每个分析目标结合的物质，从而用荧光染料的含量作为识别码，用少量的样品就能同时分析多个项目的技术。
[0271]
在本实施例中，使用蛋白质测量板选择并分析152种蛋白质。具体来说，对每个板，将与靶蛋白结合的抗体固定在珠子上，血浆样品与珠子上的抗体反应，针对靶蛋白的报告抗体(用荧光染料标记)进一步反应，通过流式细胞仪技术(使用luminex100设备)，用两种激光器测量荧光强度，分析靶蛋白的表达水平。
[0272]
(4-3)生物标志物候选物的选择
[0273]
通过microsoft excel对获得的各种蛋白质的血浆浓度进行分析。根据以下标准，选择24种在子宫内膜异位症患者中发现表达改变的蛋白质(表7a和表7b)。
[0274][0275]
在所选的24种蛋白质中，有12种蛋白质在子宫内膜异位症患者手术时显示出最高值，手术后一个月显示出下降值，且在健康个体中也显示出最低值。
[0276]
[表7a]
[0277]
[0278][0279]
[表7b]
[0280]
uniprot id蛋白质名称基因名称丰度比p10645嗜铬粒蛋白a(cga)chga0.38q9gzv9成纤维细胞生长因子23(fgf-23)fgf230.22p01266甲状腺球蛋白(tg)tg0.47
[0281]
(实施例5)利用健康人个体和子宫内膜异位症患者的血浆，通过lc-ms分析寻找生物标志物
[0282]
(5-1)人类血浆样品的获取
[0283]
健康个体的血浆(5个分泌期的血浆样品和5个增殖期的血浆样品)从proteogenex购买。作为子宫内膜异位症患者的血浆，从39位子宫内膜异位症患者中共获得125份血浆样品，分别在手术前、手术后3天和手术后1个月获得。
[0284]
(5-2)血浆蛋白的lc-ms分析
[0285]
使用high select
tm top14 abundant protein depletion mini spin columns(thermo)，将每个血浆样品中的高丰度蛋白与柱子结合，并通过制造商推荐的方法去除。用甲醇/氯仿法沉淀流过部分中没有与柱子结合的蛋白质，并将其溶解在8m尿素/400mm碳酸氢铵溶液中。溶解的蛋白质被还原和烷基化，然后用赖氨酰内肽酶和胰蛋白酶消化成肽。按照制造商推荐的方法，用monospin c18(gl science)对肽溶液进行脱矿。
[0286]
按照制造商推荐的方法，用tmt10plex标记肽。使用assaymap反相(rp-s)盒(agilent technologies)，通过高ph反相法用三乙胺对标记的肽进行分馏。每个馏分由lc-ms分析系统进行分析，其中orbitrap fusion lumos(thermofisher scientific)与纳米lc系统(easy-nlc
tm 1200系统，thermofisher scientific)相连接。分析样品是从5位健康个体(各处于分泌期和增殖期；共10个样品)和39位子宫内膜异位症患者(手术前、手术后3天和手术后1个月；共125个样品)的血浆中各获得的肽。将健康个体的7个样品和子宫内膜异位症患者的7个样品等量混合后制备的样品作为每次分析的对照，购买这些样品以在测量之间进行校正，每次分析使用10个样品。每个样品被分析三次，在分析过程中它们被整合。
[0287]
通过thermo scientific
tm proteome discoverer
tm
从lc-ms分析的原始数据中鉴定样品中的蛋白质，并分析其相对表达水平。用以下参数进行蛋白质鉴定的数据库搜索。
[0288]
分类法：uniprot人
[0289]
静态修饰：tmt6plex/ 229.163da(任意n末端),脲基甲基(carbamidomethyl)/ 57.021da(c,c-末端),tmt6plex/ 229.163da(k,c-末端)
[0290]
动态修饰：氧化/ 15.995da(m),乙酰基/ 42.011da(n-末端)
[0291]
fdr：靶标fdr(严格)/0.01，靶标fdr(放松)/0.05
[0292]
通过分析软件(proteome discoverer)计算出手术前子宫内膜异位症患者血浆样品中靶标蛋白相对于健康个体血浆样品中靶标蛋白的相对表达水平。
[0293]
(5-3)生物标志物候选分子的选择
[0294]
用proteome discoverer对lc-ms结果数据进行分析。从样品(来自5位健康个体的分泌期和增殖期的10个样品和来自39位子宫内膜异位症患者手术前的样品)中每种蛋白质的相对表达水平中，根据以下标准选择在子宫内膜异位症患者中发现表达改变的27种蛋白质(表8a和表8b)。
[0295]-对于丰度比，在方差分析和tukey hsd事后分析中，p值≤0.5；和
[0296]-丰度比≤0.6250或≥1.6000
[0297][0298]
在所选的27种蛋白质中，有16种蛋白质在子宫内膜异位症患者手术时显示出最高值，手术后一个月显示出下降值，在健康个体中也显示出最低值。
[0299]
[表8a]
[0300]
[0301][0302]
[表8b]
[0303][0304]
工业适用性
[0305]
本公开内容证明，通过测量在从受试者获得的样品中v型胶原蛋白mmp降解产物的浓度或选自由表1a所示的标志物、表2a所示的标志物、表1b所示的标志物、表2b所示的标志物、表5a所示的标志物和表6a所示的标志物、表5b所示的标志物和表6b所示的标志物组成组的至少一种标志物的丰度，可以诊断出受试者是否受到子宫内膜异位症的影响。本公开内容的发明可以通过非侵入性手段诊断子宫内膜异位症，对该疾病的诊断和治疗非常有用。