Cdc37在类风湿关节炎预防或治疗方面的应用的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，涉及Cdc37(细胞分裂周期蛋白37)在类风湿关节炎预防或治疗方面的应用，具体涉及Cdc37作为类风湿关节炎的预防及治疗靶点方面的应用、Cdc37基因的抑制剂在制备预防或治疗类风湿关节炎药物方面的应用、Cdc37基因的抑制剂在制备预防或治疗类风湿关节炎药物方面的应用、Cdc37在筛选类风湿关节炎预防/治疗药物方面应用。

背景技术

类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种累及周围关节为主的多系统炎症性自身免疫疾病。RA病情顽固，致残率极高，进展至后期严重影响日常生活及工作能力，是造成我国劳动力丧失和致残的主要疾病之一。多种类型的细胞，如成纤维细胞样滑膜细胞(FLS)和巨噬细胞，都参与了RA的慢性炎症过程。既往研究表明，RA关节中促炎细胞因子激活的FLS具有与肿瘤细胞相同的增殖能力，这是RA细胞异常增殖的发病机制之一。FLS分泌的细胞因子和其他因子，如白细胞介素(IL)-6、IL-1β、基质金属蛋白酶(MMP)-3和MMP-9，被认为在持续的炎症、滑膜增生和关节破坏发展中起着主要作用。目前其确切病因尚不清楚。RA的致炎过程极为复杂，是由多种细胞因子、黏附分子和趋化因子等参与的复杂的免疫炎症过程，对于RA的生物治疗，近年来取得了充足的发展，但其疗效仍十分有限。因此，寻找RA特异性预防/治疗靶点势在必行。

细胞分裂周期蛋白37(Cdc37)作为分子伴侣参与许多生理过程，例如细胞周期进程，细胞信号传导，细胞增殖。Cdc37招募不稳定的激酶到Hsp90，并调节细胞信号通路，如已被证明与RA的发生密切相关的ERK和PI3K/AKT信号通路，然而，Cdc37在RA中的生物学功能尚未见报道。若能将Cdc37作为治疗RA的特异性靶点，并研制相应的药物，将对RA的诊疗具有重要意义。

技术实现要素：

发明目的：针对现有技术中存在问题或不足，本发明提供Cdc37(细胞分裂周期蛋白37)在类风湿关节炎预防或治疗方面的应用，具体涉及Cdc37作为类风湿关节炎的预防及治疗靶点方面的应用、Cdc37基因的抑制剂在制备预防或治疗类风湿关节炎药物方面的应用、Cdc37基因的抑制剂在制备预防或治疗类风湿关节炎药物方面的应用、Cdc37在筛选类风湿关节炎预防/治疗药物方面应用。

为实现上述发明目的，本发明的实施例提供Cdc37作为类风湿关节炎的预防及治疗靶点方面的应用。

本发明的实施例还提供Cdc37基因的抑制剂在制备预防或治疗类风湿关节炎药物方面的应用。

进一步的，Cdc37基因的抑制剂降低Cdc37在FLS中的表达，进而抑制FLS的增殖，并减弱FLS的炎症反应和迁移能力，从而达到预防/治疗RA的效果。

进一步的，所述Cdc37基因的抑制剂选自Cdc37基因特异性的Cdc37-siRNA。

优选的，所述Cdc37-siRNA的序列如下：

Cdc37-siRNA正义链序列为5'-CGAAUAGAGAAGGCCAUGATT-3'；

Cdc37-siRNA反义链序列为5'-UCAUGGCCUUCUCUAUUCGTT-3'。

本发明的实施例还提供一种诊断类风湿关节炎的试剂或试剂盒，其特征在于，包括对Cdc37具有检测特异性的抗体、免疫组化的试剂盒。

本发明的实施例还提供Cdc37在筛选类风湿关节炎预防/治疗药物方面应用，其特征在于，筛选采用检测Cdc37表达量的试剂或试剂盒；所采用的生物样品为滑膜组织。

本发明的实施例还提供一种Cdc37蛋白的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采用滑膜组织及FLS的提取，(2)石蜡切片的制备，(3)蛋白裂解法获取全蛋白，蛋白浓度的测定，利用免疫蛋白印迹法和免疫组化检测Cdc37的表达。

本发明的实施例另外还提供一种Cdc37基因在制备类风湿关节炎靶向治疗制剂中的应用，其特征在于，类风湿关节炎靶向治疗制剂通过制备Cdc37特异性干扰序列获得，Cdc37特异性干扰序列用于敲低Cdc37在细胞中表达。

本发明的上述技术方案的有益效果如下：本发明提供了Cdc37在RA预防/治疗药物中的应用。本发明的实施例研究证实：Cdc37在RA滑膜组织中表达明显上升，本发明的Cdc37特异性干扰序列显著降低FLS中Cdc37的表达，同时明显抑制FLS的增殖、炎症反应、迁移能力。本发明首次验证了Cdc37在RA中的表达及生物学功能，此发现将一步完善RA发病机制的研究。本发明为研发治疗RA药物提供了新的理论依据，以Cdc37作为药物靶点，筛选出Cdc37特异性抑制剂作为RA预防/治疗的候选药物，为临床上提高RA治疗效果奠定基础。

附图说明

图1为本发明的实施例1中建立胶原诱导的关节炎模型(Collagen-Induced Arthritis；CIA)，在加强免疫后第2天对大鼠进行关节炎评分情况图。

图2为本发明的实施例2中提取原代CIA-FLS进行培养，Cdc37表达情况统计图。

图3为本发明的实施例2中使用Cdc37-siRNA抑制Cdc37的表达后，EdU染色和流式细胞术检测CIA-FLS增殖情况图。

图4为本发明的实施例3中采用qPCR方法检测TNF-α处理后CIA-FLS中MMP-3和MMP-9表达的变化图。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。

实施例1：检测胶原诱导的关节炎模型中的Cdc37表达水平

一、建立胶原诱导的关节炎模型：

1-1、将动物随机分为两组(对照组和实验组)。对照组(n＝10)未进行任何实验操作，同时实验组(n＝10)用不完全弗氏佐剂和牛II型胶原蛋白以1：1的比例乳化。最后，通过皮内注射，将200ul的混合物注入大鼠尾根部。

1-2、7天后，以相同的方式在相同部位注射100ul的免疫增强剂。28天后，在南通大学实验动物中心大鼠手术室腹腔注射300mg/kg水合氯醛麻醉。腹腔注射10％水合氯醛后，均未出现腹膜炎、疼痛或不适的迹象。

二、采用关节炎指数(AI)进行评估：无肿胀0分，指指间关节受累1分，关节和脚趾轻度肿胀2分，脚趾和踝关节肿胀3分，全足部严重关节炎4分。每条肢体最多有4分，共有16分。如果总分超过6分，则建模成功。

三、采用建模成功后的大鼠膝关节滑膜提取原代滑膜细胞、组织学、免疫组化观察和免疫印迹分析。取大鼠踝关节进行石蜡切片。用过量的水合氯醛钠处死大鼠。

3-1、蛋白免疫印迹分析：蛋白被装载在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上，然后转移到PVDF膜上。膜在4℃下用特异性抗体孵育过夜，然后与二抗孵育。ECL化学发光试剂盒检测蛋白条带。

3-2、免疫组化：组织在二甲苯中脱蜡，然后用内源性过氧化物酶阻滞剂浸泡20分钟，然后用PBS冲洗。特异性抗体于4℃过夜。二氨基联苯胺作为显色底物。然后观察切片的免疫染色。

结果如图1所示，与对照组相比，CIA大鼠的外观、H&E染色、番红O染色显示关节肿胀、软骨侵蚀、血管翳形成、滑膜增生。通过免疫蛋白印迹法检测了CIA大鼠模型滑膜组织中Cdc37蛋白的表达，较对照组显著增加；可见，Cdc37在胶原诱导的关节炎模型滑膜组织中的表达明显上升。免疫组化分析与免疫印迹法的结果一致。

实施例2：体外敲低Cdc37抑制FLS增殖

一、FLS的分离与培养：将新鲜滑膜组织离心洗涤2次(2500r/min，离心6min)，吸弃上清液，吸取胶原酶Ⅱ至离心管中，轻轻吹打使组织块重新悬浮，放入CO2培养箱消化，观察组织成絮状后，加入1mL体积分数20％FBS终止消化，离心(2500r/min，离心6min)，弃上清液，放入培养瓶中，用少量体积分数20％的FBS人工贴壁，再加入3mL体积分数20％的FBS在CO2培养箱中培养，本实验采用第3-8代的细胞。

二、Cdc37-siRNA转染FLS：将细胞按40％密度接种于6孔板，使用Lip2000将NC-siRNA和Cdc37-siRNA分别转染到FLS中，6小时后用含20％胎牛血清的DMEM-F12取代培养基。将细胞进一步培养48小时，并用于后续实验。

Cdc37-siRNA的序列包括：

Cdc37-siRNA#1：5'-GGACUACAGCGUUUGGGAUTT-3'，5'-AUCCCAAACGCUGUAGUCCTT-3'；

Cdc37-siRNA#2：5'-CGAAUAGAGAAGGCCAUGATT-3'，5'-UCAUGGCCUUCUCUAUUCGTT-3'，

Cdc37-siRNA#3：5'-CUUCGAGAAAGACAUCAGUTT-3'，5'-ACUGAUGUCUUUCUCGAAGTT-3'；

NC-siRNA：5'-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3'，5'-ACG UGA CAC GUU CGG AGAATT-3'。

EdU染色：Cdc37-siRNA转染后的FLS以5×10⁴/100μl的密度接种于96孔板中过夜。然后按照说明使用EDU DNA细胞增殖试剂盒进行分析。

细胞周期分析：Cdc37-siRNA转染后，用PBS洗涤细胞，在-20℃下用70％乙醇固定过夜。细胞与RNaseA(1mg/ml)在37℃下孵育30分钟，然后用碘化丙啶(50μg/ml)染色20分钟。最后，用FACSCalibur(BD)对细胞进行分析。

结果如图2和图3所示，如图2所示，Cdc37在CIA-FLS中高表达。使用TNF-α刺激CIA-FLS后，Cdc37的表达呈时间依赖性增加，在48h左右达到峰值并且CyclinD1和PCNA的表达也存在时间依赖性增加。如图3所示，在TNF-α刺激后，Cdc37-siRNA组中FLS的增殖率明显低于对照组。同时CyclinD1和PCNA的表达下降。由此可见，转染Cdc37-siRNA后，敲低了Cdc37，在敲低Cdc37后，FLS的增殖能力明显下降，同时增殖相关标志物CyclinD1和PCNA的表达下降。

通过图2和图3可见，在3组Cdc37-siRNA中，Cdc37-siRNA#2能够明显敲低Cdc37，FLS的增殖能力明显下降，增殖相关标志物CyclinD1和PCNA的表达下降最明显，可作为Cdc37-siRNA抑制剂优选。

实施例3：敲低Cdc37表达抑制FLS的炎症反应和迁移侵袭能力。

一、RNA分离与定量聚合酶链反应：使用UNlQ-10柱Trizol总RNA分离试剂盒提取总RNA，然后测定浓度。利用HiScriptIIQRTSuperMorqPCR( )逆转录成cDNA后，通过Q-PCR扩增分析mRNA的表达。采用相对定量算法2-ΔΔCt法(Livak法)对实验组靶基因(MMP)与对照组管家基因(GAPDH)进行比值分析和比较。所用的引物如下：

细胞划痕：将FLS置于6孔板中，转染48小时后，用无血清DMEM-F12孵育12小时。用10μl无菌尖端划伤细胞单层。刮取后，立即切换到新鲜培养基，培养细胞24小时后显微镜下拍照。

Transwell实验：用Cdc37-siRNA转染FLS后，用无血清DMEM-F12培养基将其重新悬浮，最终浓度为2×104/mL。将200微升细胞悬液放入Transwell的上腔室，下腔室为600μL的含10％胎牛血清的DMEM-F12培养基。12小时后用4％多聚甲醛固定粘附在膜底部的细胞，用结晶紫染色，最后用显微镜观察。

结果如图4所示，，Cdc37-siRNA显著抑制了TNF-α介导的CIA-FLS中的MMP-3和MMP-9的释放。细胞划痕试验结果显示Cdc37的敲低显著降低了细胞迁移。此外，Transwell实验表明沉默Cdc37可显著抑制TNF-α处理后CIA-FLS的侵袭能力。由此可见，Cdc37-siRNA(Cdc37-siRNA#2)转染后，敲低Cdc37，FLS中MMP-3和MMP-9的表达明显下降，同时其迁移、侵袭能力也受到抑制。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南通大学附属医院

<120> Cdc37在类风湿关节炎预防或治疗方面的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Cdc37-siRNA#1正义链序列(Cdc37-siRNA#1-F )

<400> 1

ggacuacagc guuugggaut t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Cdc37-siRNA#1反义链序列 (Cdc37-siRNA#1-R)

<400> 2

aucccaaacg cuguagucct t 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Cdc37-siRNA#2正义链序列 (Cdc37-siRNA#2-F )

<400> 3

cgaauagaga aggccaugat t 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Cdc37-siRNA#2反义链序列 (Cdc37-siRNA#2-R)

<400> 4

ucauggccuu cucuauucgt t 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Cdc37-siRNA#3正义链序列(Cdc37-siRNA#3-F )

<400> 5

cuucgagaaa gacaucagut t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> Cdc37-siRNA#3反义链序列(Cdc37-siRNA#3-R )

<400> 6

acugaugucu uucucgaagt t 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> NC-siRNA 正义链序列(NC-siRNA -F)

<400> 7

uucuccgaac gugucacgut t 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> NC-siRNA 反义链序列 (NC-siRNA -R)

<400> 8

acgugacacg uucggagaat t 21