一种百合品质的可视化识别方法与流程

1.本发明属于化学分析检测技术领域，具体涉及一种百合的品质可视化识别新方法。


背景技术：

2.百合作为一种传统药食同源产品，富含多糖、甾体皂苷和酚酸等多种成分，具有滋阴润肺、止咳消炎、清心安神等保健作用，还具有抗癌、抗抑郁、抗衰老和增强机体免疫等药效。百合的保健作用和药效与其品质密切相关，百合优良的品质与其适宜的地理环境和气候条件、成熟的生产加工工艺有关。不同产地的百合品质具有较大差异，例如“药用百合”的道地产区为湖南隆回、龙山、新邵等，而“食用百合”道地产区为甘肃兰州。不同产地的百合仅从形貌上肉眼难以区分，特别是通过加工后的百合。
3.由于不同产地水土气候等条件的不同，百合在品质上出现优劣之分，具体表现为其含有的活性化合物种类和含量存在较大差异，导致药效千差万别。目前常见的百合或其他中药材的品质研究一般通过色谱法、近红外光谱法和等方法实现，这些大型仪器方法成本高、操作复杂、耗时长，只能局限于实验室中，无法被广大人民群众接受，难以普及开来。
4.因此，进一步建立一种灵敏度高、特异性好、成本低廉并可快速便捷识别百合品质的方法，具有极大实际意义的。


技术实现要素：

5.本发明的主要目的在于针对现有技术存在的问题和不足，提供一种百合品质的可视化识别新方法，利用金银纳米簇(ag-auncs)与百合中的儿茶素等成分结合发生聚集诱导荧光增强作用(aie)，并通过比较反应前后产生的明显丰富的荧光色变，实现对百合品质的可视化识别；该方法工艺简单、绿色环保、成本低廉、容易普及、可投入工业化生产，适合推广应用。
6.为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
7.一种百合品质的可视化识别方法，包括以下步骤：将待测百合样品的提取液与金银纳米簇混混合均匀，静置反应，根据反应后所得检测体系的颜色或荧光强度信息以及不同品质的百合样品的颜色或荧光强度响应差异，实现对百合品质的快速可视化识别。
8.上述方案中，所述静置反应时间为1-5min。
9.上述方案中，所得检测体系中金银纳米簇的浓度为0.67-1.67
×
10-6
mol/l；所述检测体系中百合成分的含量以提取液制备过程中引入的百合生药计为3-7mg生药/ml。
10.上述方案中，所述百合品质的可视化识别方法中，采用肉眼观察或拍摄设备的手段获取颜色信息，比对得到依据百合产地和年份划分优质产区(或道地产区)的可视化识别图谱库。
11.优选的，所述拍摄手段进一步在紫外灯照射条件下拍摄。
12.上述方案中，采用荧光分光光度计检测荧光荧光强度；测定条件包括：发射波长
360-700nm，激发波长为330-350nm，狭缝宽度为5-20nm。
13.上述方案中，所述百合品质的可视化识别方法具体包括以下步骤：
14.1)获取不同产地和/或年份的待测百合样品的提取液；
15.2)将发红色荧光的金银纳米簇溶液与待测百合提取液混合，静置反应，采集所得检测体系基于金银纳米簇传感荧光增强作用的可视化荧光图像；
16.3)根据可视化荧光图像与百合产地和/或年份之间的联系，建立基于百合产地和/或年份的可视化识别模型库，实现对优质产区或优质年份百合产品的识别。
17.上述方案中，所述可视化识别模型库的建立方法包括：根据不同产地和/或年份百合样品所得可视化荧光图像，提取其rgb值，构建不同产地或年份百合样品对应的比色卡。
18.上述方案中，所述比色卡中对应的百合样品的产地品质由高到低依次呈粉色-紫色-蓝色的规律变化
19.上述方案中，所述优质产区(或道地产区)为湖南龙牙、湖南龙山、湖南新邵或甘肃兰州(响应结果接近粉色)；优质年份为2～3年份。
20.上述方案中，所述金银纳米簇的制备方法包括如下步骤：将牛血清白蛋白溶液加入水中，然后依次加入氯金酸溶液和柠檬酸盐溶液，并调节ph值至4～6，避光水浴加热后加入银盐溶液继续充分反应，再经离心、过滤，得发红色荧光的金银纳米团簇溶液。
21.上述方案中，所述牛血清白蛋白(bsa)、氯金酸、银盐的摩尔比为1:(0.22～0.67):(0.22～0.67)。
22.上述方案中，所述银盐可选用硝酸银、氯化银或乙酸银等。
23.上述方案中，所得金银纳米团簇溶液的浓度为2-5
×
10-4
mol/l。
24.上述方案中，所述避光水浴加热温度为70-85℃，时间为3.5-4.5h。
25.上述方案中，所述离心速率为7000-10000rpm，时间为5-15min；所得上清液用0.22μm的微孔滤膜过滤。
26.上述方案中，所述提取采用超声醇提工艺，采用的提取溶剂为50-100vol％的乙醇水溶液。
27.上述方案中，所述超声醇提工艺条件包括：百合经粉碎研磨过50-200目筛得百合粉末，按照1g:5-10ml的料液比将百合粉末和50-100vol％的乙醇水溶液混合，35-40℃超声提取1.1-1.5小时，得粗提液，再将所得粗提液在7000-10000rpm条件下离心5-15min，取上清液过0.22μm的微孔滤膜，即得百合提取液。
28.上述方案中，所述待测百合的品质包括其产地或年份，其中产地包括湖南百合、兰州、福建、江西、云南、江苏等；年份包括1年～8年。
29.上述方案中，利用96孔板用于检测百合品质，具体如下：用移液枪分别精准量取不同产地品质不同的百合提取液和水，加入96孔板中孵育1分钟，在相同浓度条件下，用移液枪分别精准量取不同产地品质不同的百合提取液、水和金银纳米簇溶液，加入96孔板中孵育1分钟；后在紫外暗箱365nm的激发光下，使用智能手机(型号为iphone xr)拍摄百合反应前后产生荧光色变的照片，与此同时可通过肉眼判断百合品质差异。
30.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
31.1)本发明利用金银纳米簇与百合中儿茶素等有效成分结合产生aie效应进而导致荧光增强的特性，并结合不同产地或不同年份的百合中儿茶素等有效成分的含量差异(品
质差异)，利用不同品质百合产品产生的荧光色差(颜色或荧光强度差异)，实现对百合品质的快速可视化识别。
32.2)本发明所述识别方法与传统基于色谱的检测方法相比，具有稳定性更高、响应更快速、操作更简便、装置更便携等优势，可满足普通群众的使用需求，具有广阔的应用前景，可投入工业化生产。
附图说明
33.图1为本发明所述百合品质识别方法的流程示意图；
34.图2为本发明实施例1中不同产地百合和纳米金银簇反应前后反应可视化荧光结果图；其中(a)为反应前百合的自身荧光可视化图，(b)为反应后百合的荧光可视化图；
35.图3为本发明实施例2中不同生长年份百合和金银纳米簇反应前后反应可视化荧光结果图；
36.图4为实施例1中不同浓度百合有效成分儿茶素标准品和纳米金银簇反应后的可视化荧光图；
37.图5为本发明所述方法机理探究中儿茶素与金银纳米簇反应前后的荧光光谱强度图。
38.图6为本发明所述方法机理探究中不同浓度儿茶素标样和纳米金银簇反应后的(a)荧光强度，(b)线性图；
具体实施方式
39.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
40.以下实施例中，所述纳米金银簇溶液的制备方法包括如下步骤：将0.04ml浓度为50mmol/l的牛血清白蛋白溶液加入1.56ml水中，然后依次加入0.1ml浓度为5mmol/l的氯金酸溶液和0.2ml浓度为0.5mmol/l的柠檬酸盐溶液，混合均匀并调节ph值至6，避光水浴加热(80℃，4h)后加入0.1ml浓度为5mmol/l的硝酸银溶液继续充分反应(25℃，3h)，即得发红色荧光的金银纳米簇溶液产物(浓度为2
×
10-4
mol/l)；具体使用过程中再加水稀释100倍体积，得到浓度为2
×
10-6
mol/l的金银纳米簇溶液。
41.以下实施例中，采用的儿茶素标样由上海源叶生物有限公司提供。
42.以下实施例中，所述百合样品的提取步骤包括如下：分别将1g百合样品进行粉碎研磨过50目筛得百合粉末，按照1g:6ml的料液比将百合粉末和乙醇水溶液(75vol％)混合，40℃超声提取1.5h得粗提液，将所得粗提液在8000rpm条件下离心15min，取上清液过0.22μm的微孔滤膜，即得到百合提取液(5.5ml)。
43.实施例1
44.一种百合品质(百合产地)的可视化识别方法，包括如下步骤：
45.1)分别将九种不同已知产地(湖南百合序号1、湖南隆回龙牙百合序号2、湖南龙山百合序号3、甘肃兰州百合序号4、福建莆田序号5、8年生兰州百合序号6、江西抚州序号7、滇百合干序号8、江苏百合序号9、江西大别山序号10；其中湖南百合1在购买时没有标注更具
体的产地)的百合样品进行提取，得百合提取液；
46.2)将所得百合提取液分别与金银纳米簇溶液混合，静置反应3min，观察反应前后百合提取液的荧光色变；具体步骤包括：
47.a)在1.5ml比色皿中分别加入900μltris-hcl缓冲溶液(ph＝7.0)和100μl步骤1)制备的百合提取液10倍稀释液(加水稀释)，反应3min，检测其荧光性能；所得荧光照片和利用软件提取rgb值后绘制的荧光图片见图2a；
48.b)取体积为400μl的96微孔板，用移液枪分别精准量取100μl不同产地百合样品提取液的10倍稀释液、100μltris-hcl缓冲溶液和100μl浓度为2
×
10-6
mol/l的金银纳米簇溶液混合，静置反应3min；在紫外暗箱365nm的激发光下，使用智能手机(型号为iphone xr)拍摄百合反应后产生荧光色变的照片，然后进一步用软件提取对应照片的rgb值并绘制荧光图片；具体结果见图2b；图中，空白组(blank)的检测方法包括：用移液枪分别精准量取200μltris-hcl缓冲溶液和100μl浓度为2
×
10-6
mol/l的金银纳米簇溶液混合，静置反应3min；儿茶素组(epicatechin和catechins)的检测方法包括：用移液枪分别精准量取100μl儿茶素标样、100μltris-hcl缓冲溶液和100μl浓度为2
×
10-6
mol/l的金银纳米簇溶液混合，静置反应3min。
49.检测结果表明：不同产地百合提取液自身的荧光强度较弱(图2a)，荧光强度差异较小，肉眼不易识别；但加入金银纳米簇后，金银纳米簇与不同产地百合中的儿茶素响应后会促进荧光强度产生明显差异(图2b)，分别对应肉眼可见的不同程度的粉色、紫色和蓝色；其中湖南龙牙百合和甘肃兰州百合均呈粉色(与儿茶素标样的响应效果相近)，对应道地产区；说明采用本发明上述方法，可通过肉眼很好地可视化识别湖南龙牙百合(序号2)、湖南龙山百合序号3和甘肃兰州百合(序号4)这三种优质产区。
50.实施例2
51.一种百合品质(百合生长年份)的可视化识别方法，包括如下步骤：
52.1)将四批不同年份(1年兰州七里河、2年兰州七里河、3年兰州七里河、8年兰州百合的百合样品分别进行提取；
53.2)将100μl所得百合提取液的10倍稀释液(加水稀释)分别与100μltris-hcl缓冲溶液、100μl浓度为2
×
10-6
mol/l的金银纳米簇溶液在孔径为400μl的96微孔板中反应2min，在紫外暗箱365nm的激发光下观察反应前后待测百合提取液的荧光色变；使用智能手机(型号为iphone xr)拍摄百合反应前后产生荧光色变的照片，结果见图3a；然后进一步用软件提取对应照片的rgb值并绘制荧光图片，见图3b。
54.可以看出，不同年份百合提取液本身的荧光强度较弱，荧光强度差异较小，肉眼不易识别；但在与纳米金银簇反应后，产生了肉眼可见的荧光色变，且不同年份品质各异的百合具有丰富明显的荧光颜色差异，通过肉眼能够很好地可视化识别兰州地区四个不同年份的百合。
55.原理研究
56.由于儿茶素为百合的重要功效成分之一，其含量影响百合品质优劣，同时不同产地百合中儿茶素的含量有较大差异，为探究产地对百合品质可视化的影响，分别取不同浓度的儿茶素标准样品和不同产地的百合样品进行可视化识别，具体包括如下步骤：
57.分别将100μl浓度分别为0-2
×
10-3
mol/l(具体为1
×
10-5
、2
×
10-5
、3
×
10-5
、1
×
10
‑4、2
×
10-4
、3
×
10-4
、5
×
10-4
、1
×
10-3
、1.5
×
10-3
、2
×
10-3
mol/l)的儿茶素标准样品溶液与100μl tris-hcl缓冲液和100μl浓度为2
×
10-6
mol/l的纳米金银簇溶液混合均匀，分别静置反应3min，观察反应后不同浓度儿茶素标样的荧光色变，结果见图4；图4中，1～6号样本对应的原始(混合前)儿茶素标准样品溶液的浓度依次为2
×
10-3
、1
×
10-3
、3
×
10-4
、1
×
10-4
、3
×
10-5
、1
×
10-5
mol/l；空白组所得检测溶液由100μl浓度为2
×
10-6
mol/l的纳米金银簇溶液与200μltris-hcl缓冲液混合而成。
58.由图4可知，随着儿茶素浓度的增加，将其与金银纳米簇溶液结合后，发生了明显的色变反应，颜色从肉眼可见的紫色变为粉色。
59.图5为儿茶素标样与金银纳米簇反应前后的荧光光谱强度图，可以看出，金银纳米簇与百合中的儿茶素响应后的荧光强度有明显差异(明显增强)，吸收峰蓝移。
60.图6为不同浓度儿茶素标样与纳米金银簇反应后的荧光强度及线性图，可以看出，金银纳米簇的荧光强度随儿茶素浓度的增加逐渐增强，且在一定浓度范围内(0.00-2
×
10-3
mol/l)呈现良好的线性关系；由此推测，本发明采用的金银纳米簇可与百合中的有效成分儿茶素结合，产生aie效应，导致荧光增强，然后结合不同产地或不同年份的百合所含儿茶素之间的差异，促进实现对百合品质(不同产品或年份)的有效识别。
61.上述实施例仅是为了清楚地说明所做的实例，而并非对实施方式的限制。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或者变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举，因此所引申的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。