一种天然多糖海绵及其制备方法与应用与流程

1.本发明涉及生物医用高分子材料领域，具体涉及一种天然多糖海绵及其制备方法与应用。


背景技术：

2.无法控制的出血对人们的生命安全造成非常大的威胁。临床上常用的止血纱布、止血绷带、止血纤维等材料存在不被组织吸收、止血速度慢、易与伤口发生粘连造成二次损伤等问题，尤其对于不可按压的部位难以发挥作用。开发新型快速有效的止血材料可以减轻病患痛苦，挽救伤者生命，是生物医用材料领域的重点研究方向之一。
3.近年来，具有多孔结构的止血海绵引起了越来越广泛的关注，海绵具有良好的吸收液体能力，能够快速吸收伤口表面的血液和渗出物，有效激活血小板，实现快速止血；但目前仍然缺乏兼具可降解、安全无毒并且止血性能优良的海绵，还需要开展进一步的研究和开发。


技术实现要素：

4.针对现有技术的不足，本技术提供了一种天然多糖海绵及其制备方法与应用，所述天然多糖海绵具有良好的止血效果，质轻、吸液性强，且具有较低的溶血率，其溶血率小于5％符合国标中对于生物材料的生物安全性要求。
5.根据本技术的一个方面，提供了一种天然多糖海绵，天然多糖海绵的组成成分包括具有氨基的多糖i、具有醛基的多糖ii和无机化合物。
6.所述天然多糖海绵的凝血指数(bci)为6％～15％；溶血率为1.6％～4.5％；孔隙率为52.9％～76.3％，孔径尺寸在20μm～80μm。
7.可选地，天然多糖海绵按重量份计包括具有氨基的多糖i15～80份、具有醛基的多糖ii 11～74份、无机化合物3～53份。
8.可选地，具有氨基的多糖ⅰ为羧甲基壳聚糖，具有醛基的多糖ⅱ为醛基化天然多糖；无机化合物为高岭土。
9.可选地，醛基化天然多糖选自醛基化透明质酸、醛基化硫酸软骨素、醛基化葡聚糖中的至少一种。
10.具体地，羧甲基壳聚糖的含量可独立选自15份、18份、20份、23份、25份、28份、30份、35份、38份、40份、43份、45份、48份、50份、53份、55份、58份、60份、63份、65份、68份、70份、73份、75份、78份、80份，或上述两点之间的任意数值。
11.具体地，醛基化天然多糖的含量可独立选自，11份、13份、15份、18份、20份、23份、25份、28份、30份、33份、35份、38份、40份、43份、45份、48份、50份、53份、55份、58份、60份、63份、65份、68份、70份、73份、74份，或上述两点之间的任意数值。
12.具体地，高岭土的含量可独立选自3份、5份、8份、10份、13份、15份、18份、20份、23份、25份、28份、30份、33份、35份、38份、40份、43份、45份、48份、50份、53份，或上述两点之间
的任意数值。
13.根据本技术的又一个方面，提供了一种天然多糖海绵的制备方法，该方法包括以下步骤：
14.(1)配制含有具有氨基的多糖ⅰ和无机化合物的溶液a；
15.(2)配制含有具有醛基的多糖ⅱ的溶液b；
16.(3)将溶液a与溶液b混合，交联反应，得到水凝胶；
17.(4)将水凝胶在-80～196℃中冷冻12～72h，再进行冷冻干燥处理，获得天然多糖海绵。
18.可选地，溶液a与溶液b中包括水溶性溶剂，所述水溶性溶剂选自磷酸缓冲盐溶液或生理盐水中的一种；磷酸缓冲盐溶液的ph为7.2～7.4。
19.可选地，具有氨基的多糖ⅰ为羧甲基壳聚糖，具有醛基的多糖ⅱ为醛基化天然多糖；无机化合物为高岭土。
20.醛基化天然多糖选自醛基化透明质酸、醛基化硫酸软骨素和醛基化葡聚糖中的至少一种。
21.本技术所述醛基化透明质酸、醛基化硫酸软骨素和醛基化葡聚糖可以通过现有技术制备得到。
22.可选地，溶液a中，具有氨基的多糖ⅰ的浓度为2wt.％～8wt.％，无机化合物的浓度为0.5wt.％～4wt.％；溶液b中，具有醛基的多糖ⅱ的浓度为1.5wt.％～7wt.％。
23.可选地，溶液a和溶液b的体积比例为1～9:9～1。
24.可选地，交联反应的时间为5s～50min，交联反应的温度为20～25℃。
25.具体地，羧甲基壳聚糖的含量可独立选自2wt.％、2.5wt.％、3wt.％、3.5wt.％、4wt.％、4.5wt.％、5wt.％、5.5wt.％、6wt.％、6.5wt.％、7wt.％、7.5wt.％、8wt.％，或上述两点之间的任意数值。
26.具体地，醛基化天然多糖的含量可独立选自1.5wt.％、2wt.％、2.5wt.％、3wt.％、3.5wt.％、4wt.％、4.5wt.％、5wt.％、5.5wt.％、6wt.％、6.5wt.％、7wt.％，或上述两点之间的任意数值。
27.具体地，高岭土的含量可独立选自0.5wt.％、1wt.％、1.5wt.％、2wt.％、2.5wt.％、3wt.％、3.5wt.％、4wt.％，或上述两点之间的任意数值。
28.具体地，溶液a与溶液b的体积比可独立选自1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1，或上述比值之间的任意比值。
29.本技术交联反应过程也称为水凝胶的凝胶化，交联时间即为可水凝胶的凝胶化时间。
30.具体地，交联反应的时间为5s～5min、6min～10min、11min～15min、16min～20min、21min～25min、26min～30min、31min～35min、36min～40min、41min～45min或46min～50min。
31.具体地，交联反应的时间为5s、7s、10s、12s、15s、20s、25s、30s、35s、40s、45s、50s、55s、1min、65s、70s、75s、80s、85s、90s、95s、100s、105s、110s、115s、2min、130s、150s、3min、200s、4min、4.5min、5min、5.5min、6min，7.5min、8min、8.5min、9min、9.5min、10min、10.5min、11min、11.5min、12min，12.5min、13min、13.5min、14min、14.5min、15min、
15.5min、16min、16.5min、17min，17.5min、18min、18.5min、19min、19.5min、20min、20.5min、21min、21.5min、22min，22.5min、23min、23.5min、24min、24.5min、25min、25.5min、26min、26.5min、27min，27.5min、28min、28.5min、29min、29.5min、30min、30.5min、31min、31.5min、32min、32.5min、33min、33.5min、34min、34.5min、35min，35.5min、36min、36.5min、37min、37.5min、38min、38.5min、39min、40min、41min，42min、43min、44min、45min、46min、47min、48min、49min、50min，或上述两点之间的任意数值。
32.可选地，所述水凝胶具有双重的交联网络结构，
33.第一重交联结构通过具有氨基的多糖i和具有醛基的多糖ii经动态共价交联形成多糖网络；
34.第二重交联结构通过无机化合物与多糖网络经物理交联形成。
35.根据本技术的又一方面，本发明还提供了上述天然多糖海绵在止血材料方面的应用，并对其体外凝血指数进行评估。
36.可选地，所述天然多糖海绵的凝血指数(bci)为6％～15％；溶血率为1.6％～4.5％；孔隙率为52.9％～76.3％，孔径尺寸在20μm～80μm。
37.具体地，所述天然多糖的凝血指数为6％、6.79％、7％、8％、9.09％、9.83％、10％、10.82％、11％、11.87％、12％、12.85％、13.69％、14％、15％，或上述两点之间的任意数值。
38.所述天然多糖的溶血率为1.6％、2.0％、2.2％、2.5％、2.8％、3.2％、3.5％、3.8％、4.0％、4.3％、4.5％，或上述两点之间的任意数值。
39.所述天然多糖的孔隙率为52.9％、55.6％、58.6％、60％、63.5％、65％、67.4％、69.3％、71.3％、74％、76.3％，或上述两点之间的任意数值。
40.所述天然多糖的孔径尺寸在20～45μm、25～45μm、25～50μm、30～65μm、40～80μm、50～80μm、55～70μm或60～80μm范围内。
41.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
42.(1)本发明采用的羧甲基壳聚糖、醛基化天然多糖和高岭土都具有安全无毒、生物相容性优良、可生物降解等特点。醛基化天然多糖作为天然交联剂，与羧甲基壳聚糖上的氨基经席夫碱动态共价键形成水凝胶网络，进一步冷冻干燥制备获得海绵，避免了常用戊二醛交联剂带来的毒性较大问题，同时也避免了京尼平交联剂导致材料变色影响海绵止血过程可视化的问题。
43.(2)本发明采用-80℃～-196℃下快速冷却，解决了无机颗粒沉降到底部的问题，有利于无机颗粒的均匀分散。
44.(3)本发明所提供的天然多糖海绵质轻、吸液性强和较低的溶血率，其溶血率小于5％符合国标中对于生物材料的生物安全性要求。同时本发明提供的天然多糖海绵具有多重止血作用，具有良好的止血效果，一是天然多糖海绵的多孔结构和无机颗粒高岭土能够快速吸收血液中的水分，浓缩血液中的血小板与凝血酶，使凝血因子与血小板集聚和沉积，达到止血的目的；二是壳聚糖带有一定量的正电荷，其直接将创面上的血小板激活引发凝血反应，促使血液凝固，从而达到止血效果；三是高岭土与血液接触，可直接激发凝血因子xii，启动内源性凝血途径，继而激活凝血因子xi，使纤维蛋白形成纤维蛋白单体，纤维蛋白单体结合成纤维蛋白的聚体，形成不溶于水的血凝块。
45.另外在凝血因子的缺乏时，高岭土可直接启动凝血因子xi，达到止血的目的。天然
多糖海绵为无机颗粒提供了载体，避免无机颗粒单独使用时难以取出、对伤口造成二次伤害的问题。
附图说明
46.图1(a)为本发明实施例1天然多糖海绵的实物图；
47.图1(b)为本发明实施例1天然多糖海绵在2000倍率下的扫描电镜图；
48.图2为本发明实施例1～8天然多糖海绵溶血率数据图。
49.图3为本发明实施例1～8天然多糖海绵与纱布凝血指数数据图。
具体实施方式
50.下面结合实施例对本发明作进一步描述，需要指出的是，以下所述实施例旨在对本发明的理解，而对其不起任何限定作用。
51.(1)醛基化天然多糖的制备：称取1～5g的硫酸软骨素、透明质酸钠或葡聚糖，倒入去离子水中，室温搅拌直至完全溶解，得到浓度为1％(wt/v)的多糖水溶液；随后，加入高碘酸钠，按照天然多糖与高碘酸钠质量比为1～10:1的比例进行添加，避光反应1～3h；然后，加入过量乙二醇，终止反应，继续搅拌1～2h；最后，将上述溶液装入透析袋中，在超纯水中透析3～6天，在-65℃条件下进行冷冻干燥，得到醛基化天然多糖固体粉末，-18℃冷藏待用。
52.(2)溶血率测试：取兔子动脉血，将20ml pbs缓冲液(ph 7.4)加入10ml兔子全血中，轻轻混合后将混合物以3000rpm离心6分钟。然后从离心的离心管底部收集红细胞(rbc)，再以rbc与pbs缓冲液(ph7.4)体积比为1:2的比例重复上述相同的方案提取5次。接下来，通过在新鲜的pbs缓冲液(ph 7.4)中稀释来制备浓度为5％v/v的红细胞，得rbc悬浮液。将本技术天然多糖海绵以400μg/ml分散在pbs缓冲液(ph7.4)中，然后将所得悬浮液与rbc悬浮液以1:1v/v的比例轻轻混合，以达到最终浓度200μg/ml。在室温下孵育130分钟后，将样品在3000rpm下离心7分钟。将上清液(量取150μl)转移到96孔板中，并使用酶标仪在545nm处记录样品的吸光度。使用以下方法计算每个样品的溶血率：
53.溶血率(％)＝((a
s-ab)/(a
p-ab))*100％
54.as为样品吸光度，ab为阴性对照的吸光度，ap为阳性对照的吸光度；阴性对照为不添加天然多糖海绵组，pbs缓冲溶液与rbc悬浮液1:1v/v的比例混合；阳性对照为不添加天然多糖海绵，去离子水与rbc悬浮液1:1v/v的比例混合。
55.(3)凝血指数测试：将预称重的50mg本技术天然多糖海绵和预称重的50mg纱布(对照组)分别放入离心管中，并在37℃下预热5分钟。接着，在样品表面轻轻滴加抗凝兔子血(100μl)，然后加入12.5μl cacl2(0.2mol/l)。在37℃下孵育120秒后，将10ml去离子水非常温和地加入离心管内，然后以1000rpm离心5分钟。然后，酶标仪在545nm处获得上清液的吸光度。使用以下方法计算凝血指数：
56.bci(％)＝(as/ar)
×
100％
57.其中as是天然多糖海绵或纱布处理过的样品中上清液的吸光度，ar是空白组中上清液的吸光度；空白组为不加海绵、纱布和cacl2处理组。
58.在这个实验中，较低的bci表明更好的凝血能力。
59.(4)孔隙率测试：将15mg的海绵浸入无水乙醇中，并保持在乙醇中完全饱和。样品浸没后，孔隙率的百分比计算如下：
60.孔隙率(％)＝(w
s-wd)/(vs
×
ρ)
61.ws为浸没在无水乙醇中的样品重量，wd为冷冻干燥样品的重量，vs为冷冻干燥后样品的体积，ρ为乙醇的密度。
62.实施例1
63.天然多糖海绵的制备：
64.(1)将羧甲基壳聚糖和高岭土溶解于生理盐水中，得到含有2wt.％的cmcs和0.5wt.％的ka的溶液a；
65.(2)制备醛基化透明质酸，其中透明质酸钠与高碘酸钠的质量比为1:1，避光反应时间是2h，透析袋截留分子量为3500，将醛基化透明质酸溶解于生理盐水中，得到含有5wt.％醛基化透明质酸的溶液b；
66.(3)将溶液a和溶液b以3:7的体积比混合，室温凝胶化12s，得到水凝胶；
67.(4)将水凝胶在-80℃下冷冻48h，随后进行冷冻干燥处理，获得天然多糖海绵。
68.所述天然多糖海绵中，按重量份计含有羧甲基壳聚糖14份，高岭土3.5份，醛基化透明质酸83份。所得天然多糖海绵的实物图和扫描电镜图如图1所示，从图1中可以看到海绵具有多孔的结构，孔径在25～50μm范围内。
69.随后对天然多糖海绵的溶血率和凝血指数进行测试，该海绵的溶血率为2.5％，凝血指数为11.87％，其中纱布作为对照，其凝血指数为86.9％。国标中指出溶血率低于5％为安全的生物材料，由此可看出该海绵安全无毒，且具有优异的止血能力，具体见图2和3。最后对海绵的孔隙率进行测试，经计算，海绵的孔隙率为63.5％。
70.实施例2
71.天然多糖海绵的制备：
72.(1)将羧甲基壳聚糖和高岭土溶解于生理盐水中，得到含有4wt.％的cmcs和2wt.％的ka的溶液a；
73.(2)制备醛基化硫酸软骨素，其中硫酸软骨素与高碘酸钠的质量比为3:1，避光反应时间是1h，透析袋截留分子量为8000～14000，将醛基化硫酸软骨素溶解于生理盐水中，得到含有4wt.％醛基化硫酸软骨素的溶液b；
74.(3)将溶液a和溶液b以5:5的体积比混合，室温凝胶化125s，得到水凝胶；
75.(4)将水凝胶在-80℃下冷冻72h，随后进行冷冻干燥处理，获得天然多糖海绵。
76.所述天然多糖海绵中，按重量份计含有羧甲基壳聚糖40份，高岭土20份，醛基化硫酸软骨素40份。该海绵的溶血率为1.6％，凝血指数为9.09％，具体见图2和3；海绵的孔隙率为52.9％，孔径尺寸在20～45μm。
77.实施例3
78.天然多糖海绵的制备：
79.(1)将羧甲基壳聚糖和高岭土溶解于ph为7.2的pbs溶液中，得到含有8wt.％的cmcs和4wt.％的ka的溶液a；
80.(2)制备醛基化葡聚糖，其中葡聚糖与高碘酸钠的质量比为10:1，避光反应时间是3h，透析袋截留分子量为3500，将醛基化葡聚糖溶解于ph为7.2的pbs溶液中，得到含有
6wt.％醛基化葡聚糖的溶液b；
81.(3)将溶液a和溶液b以8:2的体积比混合，室温凝胶化36min，得到水凝胶；
82.(4)将水凝胶在-80℃下冷冻12h，随后进行冷冻干燥处理，获得天然多糖海绵。
83.所述天然多糖海绵中，按重量份计含有羧甲基壳聚糖59份，高岭土29.5份，醛基化葡聚糖11.5份。该海绵的溶血率为3.2％，凝血指数为6.79％，具体见图2和3；海绵的孔隙率为71.3％，孔径尺寸在40～80μm。
84.实施例4
85.天然多糖海绵的制备：
86.(1)将羧甲基壳聚糖和高岭土溶解于ph为7.2的pbs溶液中，得到含有7wt.％的cmcs和1wt.％的ka的溶液a；
87.(2)制备醛基化透明质酸，其中透明质酸钠与高碘酸钠的质量比为5:1，避光反应时间是3h，透析袋截留分子量为3500，将醛基化透明质酸溶解于ph为7.2的pbs溶液中，得到含有3wt.％醛基化透明质酸的溶液b；
88.(3)将溶液a和溶液b以1:9的体积比混合，室温凝胶化150s，得到水凝胶；
89.(4)将水凝胶在-196℃下冷冻12h，随后进行冷冻干燥处理，获得天然多糖海绵。
90.所述天然多糖海绵中，按重量份计含有羧甲基壳聚糖38.5份，高岭土12.5份，醛基化透明质酸49份。该海绵的溶血率为3.8％，凝血指数为13.69％，具体见图2和3；海绵的孔隙率为58.6％，孔径尺寸在30～65μm。
91.实施例5
92.天然多糖海绵的制备：
93.(1)将羧甲基壳聚糖和高岭土溶解于ph为7.4的pbs溶液中，得到含有3wt.％的cmcs和1.5wt.％的ka的溶液a；
94.(2)制备醛基化葡聚糖，其中葡聚糖与高碘酸钠的质量比为10:1，避光反应时间是3h，透析袋截留分子量为3500，将醛基化葡聚糖溶解于ph为7.4的pbs溶液中，得到含有5wt.％醛基化葡聚糖的溶液b；
95.(3)将溶液a和溶液b以2:8的体积比混合，室温凝胶化7s，得到水凝胶；
96.(4)将水凝胶在-80℃下冷冻12h，随后进行冷冻干燥处理，获得天然多糖海绵。
97.所述天然多糖海绵中，按重量份计含有羧甲基壳聚糖12份，高岭土6份，醛基化葡聚糖82份。该海绵的溶血率为4.0％，凝血指数为15％，具体见图2和3；海绵的孔隙率为76.3％，孔径尺寸在60～80μm。
98.实施例6
99.天然多糖海绵的制备：
100.(1)将羧甲基壳聚糖和高岭土溶解于生理盐水中，得到含有5wt.％的cmcs和3wt.％的ka的溶液a；
101.(2)制备醛基化硫酸软骨素，其中硫酸软骨素与高碘酸钠的质量比为8:1，避光反应时间是3h，透析袋截留分子量为8000～14000，将醛基化硫酸软骨素溶解于生理盐水中，得到含有6wt.％醛基化硫酸软骨素的溶液b；
102.(3)将溶液a和溶液b以4:6的体积比混合，室温凝胶化130s，得到水凝胶；
103.(4)将水凝胶在-80℃下冷冻12h，随后进行冷冻干燥处理，获得天然多糖海绵。
104.所述天然多糖海绵中，按重量份计含有羧甲基壳聚糖29.5份，高岭土17.5份，醛基化硫酸软骨素53份。该海绵的溶血率为4.3％，凝血指数为12.85％，具体见图2和3；海绵的孔隙率为67.4％，孔径尺寸在50～80μm。
105.实施例7
106.天然多糖海绵的制备：
107.(1)将羧甲基壳聚糖和高岭土溶解于生理盐水中，得到含有6wt.％的cmcs和2.5wt.％的ka的溶液a；
108.(2)制备醛基化透明质酸，其中透明质酸钠与高碘酸钠的质量比为3:1，避光反应时间是3h，透析袋截留分子量为3500，将醛基化透明质酸溶解于ph为7.2的pbs溶液中，得到含有6wt.％醛基化透明质酸的溶液b；
109.(3)将溶液a和溶液b以6:4的体积比混合，室温凝胶化8.5min，得到水凝胶；
110.(4)将水凝胶在-196℃下冷冻24h，随后进行冷冻干燥处理，获得天然多糖海绵。
111.所述天然多糖海绵中，按重量份计含有羧甲基壳聚糖48份，高岭土20份，醛基化透明质酸32份。该海绵的溶血率为4.5％，凝血指数为9.83％，具体见图2和3；海绵的孔隙率为55.6％，孔径尺寸在25～45μm。
112.实施例8
113.天然多糖海绵的制备：
114.(1)将羧甲基壳聚糖和高岭土溶解于ph为7.2的pbs溶液中，得到含有2.5wt.％的cmcs和3.5wt.％的ka的溶液a；
115.(2)制备醛基化葡聚糖，其中葡聚糖与高碘酸钠的质量比为10:1，避光反应时间是3h，透析袋截留分子量为3500，将醛基化葡聚糖溶解于ph为7.2的pbs溶液中，得到含有6.5wt.％醛基化葡聚糖的溶液b；
116.(3)将溶液a和溶液b以9:1的体积比混合，室温凝胶化28min，得到水凝胶；
117.(4)将水凝胶在-80℃超低温冰箱中冷冻48h，随后进行冷冻干燥处理，获得天然多糖海绵。
118.所述天然多糖海绵中，按重量份计含有羧甲基壳聚糖37份，高岭土52份，醛基化葡聚糖11份。该海绵的溶血率为2.2％，凝血指数为10.82％，具体见图2和3；海绵的孔隙率为69.3％，孔径尺寸在55～70μm。
119.由实施例1～8可以看出，随着天然多糖海绵多糖组分中醛基化天然多糖比例的增加，交联反应时间逐渐缩短。
120.由图2可以看出，相对于阳性对照组的100％溶血率，由实施例1～8制备的天然多糖海绵的溶血率都在5％以内，符合国标中对于生物材料的生物安全性要求。
121.由图3可以看出，相对于纱布凝血指数86.9％，由实施例1～8制备获得的天然多糖海绵凝血指数大大降低，展示出了良好的凝血能力。
122.对比例1
123.具体制备步骤同实施例1，不同的地方在于步骤(1)中不添加ka。将获得的天然多糖海绵进行测试，其溶血率4.8％，凝血指数35.8％。由此可见，虽然该海绵符合国标中对于生物材料的生物安全性要求，但其凝血能力明显低于本技术天然多糖海绵。
124.以上所述，仅是本技术的几个实施例，并非对本技术做任何形式的限制，虽然本申
请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本技术，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本技术技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。