一种检测稻瘟灵的试纸条及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及稻瘟灵的检测，具体涉及一种用于检测稻瘟灵的胶体金试纸条，其特别适用于烟叶中稻瘟灵残留的检测。


背景技术：

2.稻瘟灵(isoprothiolane)又名异丙硫环、富士一号，化学名称1,3-二硫戊环-2-亚基丙二酸二异丙酯，是一种高效内吸性杀菌剂，其杀菌谱较窄，是防治稻瘟病的特效药，特别是对穗颈瘟具有优良效果，能通过植物的根、茎、叶各个部位内吸传导，并能达到心叶。其对稻苗瘟和小球菌核病也均有效，大面积使用还可兼治稻飞虱、叶蝉，并对植物生长有调节作用。
3.但随着稻瘟灵的大量施用，有可能会污染周围的环境，还可能使其残留于农产品中，对人类造成潜在的健康威胁，所以其在水果、蔬菜、烟草生产中的残留问题受到越来越多的关注。我国针对不同作物，制定了稻瘟灵最大残留限量标准，其中西瓜的最大残留限量为0.1mg/kg，大米的最大残留限量为1mg/kg，烟草的最大残留限量为2mg/kg。
4.目前，文献只见对谷物、水果、蔬菜中这类杀菌剂残留量的检测报道，而没有见到有关烟叶中残留量的测定方法的报道。国内外对稻瘟灵残留的检测方法主要有气相色谱-质谱联用(gc-ms)、高效液相色谱-质谱联用(hplc-ms)、气相色谱法(gc)等。仪器方法具备检测灵敏度高、特异性强等优势，但是检测样本前处理繁琐、耗时，样品还需提取和净化处理，同时仪器检测方法需要昂贵的大型仪器和设备，配备专业的检测技术人员进行操作和管理，无法进行现场大规模检测，时效性差，难以推广。因此，开发一种不受检测设备限制并且能够实现对大批量样品进行快速检测的产品和方法成为迫切需要解决的问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服现有的检测稻瘟灵的方法存在的对设备依赖性高，并且不能够实现对大批量样品的快速检测的特点，提供一种操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低、不受检测设备限制的试纸条及其制备方法和应用，以实现对大批量的稻瘟灵样品进行快速检测和现场监控。
6.为了实现本发明的目的，本发明提供了一种检测稻瘟灵的试纸条，该试纸条包括样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫和底板；所述反应膜上具有包被有稻瘟灵半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线；所述结合物释放垫上喷涂有稻瘟灵单克隆抗体-胶体金标记物。
7.所述稻瘟灵单克隆抗体是以稻瘟灵半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得。
8.所述稻瘟灵半抗原-载体蛋白偶联物由稻瘟灵半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白或人血清白蛋白，所述稻瘟灵半抗原是以丙二酸二异丙酯为原料，与二硫化碳和3,4-二氯丁酸在强碱中进行缩合反应得
到的，其分子结构式为：
[0009][0010]
所述样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫依次粘贴在底板上，所述结合物释放垫1/3～1/2被覆盖于样品吸收垫下。
[0011]
所述底板可为pvc底板或其他硬质不吸水的材料；所述样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸；所述结合物释放垫可为玻璃棉或聚酯材料；所述吸水垫为吸水纸；所述反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。
[0012]
本发明还提供了一种制备上述试纸条的方法，其包括以下步骤：
[0013]
1)制备喷涂有稻瘟灵单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；
[0014]
2)制备具有包被有稻瘟灵半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；
[0015]
3)将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸条。
[0016]
具体地说，步骤包括：
[0017]
1)以丙二酸二异丙酯为原料，与二硫化碳和3,4-二氯丁酸在强碱中进行缩合反应，制备稻瘟灵半抗原；
[0018]
2)将稻瘟灵半抗原与载体蛋白偶联，制备稻瘟灵半抗原-载体蛋白偶联物；
[0019]
3)用稻瘟灵半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌稻瘟灵单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
[0020]
4)提取小鼠igg免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；
[0021]
5)分别将稻瘟灵半抗原-载体蛋白偶联物和羊抗鼠抗抗体包被于反应膜的检测线(t)和质控线(c)上；
[0022]
6)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；
[0023]
7)将制备的稻瘟灵单克隆抗体加入到制备的胶体金中，得到稻瘟灵单克隆抗体-胶体金标记物；
[0024]
8)将稻瘟灵单克隆抗体-胶体金标记物喷涂在结合物释放垫上，37℃烘干2h后取出，置于干燥环境中保存备用；
[0025]
9)将样品吸收垫用含1％牛血清白蛋白、ph为7.2的0.02mol/l磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃烘干2h备用；
[0026]
10)在底板上按顺序粘贴上样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜、吸水垫，结合物释放垫从起始端有1/3区域被样品吸收垫覆盖。最后切成3.95mm宽的小条，装在特制的塑料制卡壳中，以铝箔袋密封，4～30℃条件下保存12个月。结合物释放垫的1/3被样品吸收垫覆盖
可以延长检测结果观察时间，使样品吸收垫将检测液体充分吸收并与金标抗体充分反应，从而减少误差。
[0027]
本发明还提供了一种应用上述试纸条检测样品中稻瘟灵残留的方法，它包括以下步骤：
[0028]
(1)样品前处理；
[0029]
(2)用试纸条进行检测；
[0030]
(3)分析检测结果。
[0031]
本发明的稻瘟灵快速检测试纸条采用高度特异性的抗体抗原反应及免疫层析分析技术，将稻瘟灵单克隆抗体-胶体金标记物固定于结合物释放垫上，样品中的稻瘟灵在流动过程中与结合物释放垫上的稻瘟灵单克隆抗体-胶体金标记物结合，形成稻瘟灵-抗体-胶体金标记物。样本中的稻瘟灵与反应膜检测线上的稻瘟灵半抗原-载体蛋白偶联物竞争结合稻瘟灵单克隆抗体-胶体金标记物，根据检测线红色条带深浅来判断待测样品液中是否含有稻瘟灵残留。
[0032]
检测时，样品经处理后滴入样品吸收垫，当稻瘟灵在样品中的浓度低于检测限或为零时，单克隆抗体-胶体金标记物在层析过程中会与固定在反应膜上的稻瘟灵半抗原-载体蛋白偶联物结合，在检测线(t)和质控线(c)上各出现一条红色条带，且t线显色比c线显色深或与c线显色一致；如果稻瘟灵在样品中的浓度等于或高于检测限，单克隆抗体-胶体金标记物会与稻瘟灵全部结合，从而在t线处因为竞争反应不会与稻瘟灵半抗原-载体蛋白偶联物结合而不出现红色条带或比c线显色浅。如图2所示。
[0033]
阴性：当质控线(c)显示出红色条带，检测线(t)同时也显示出红色条带，且(t)线颜色接近或深于(c)线时，判为阴性。
[0034]
阳性：当质控线(c)显示出红色条带，而检测线(t)不显色或(t)线颜色浅于(c)线时，判为阳性。
[0035]
无效：当质控线(c)不显示出红色条带，则无论检测线(t)显示出红色条带与否，该试纸条均判为无效。
[0036]
本发明的试纸条具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、不受检测设备限制、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。用本发明试纸条检测稻瘟灵残留的方法，简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。
附图说明
[0037]
图1为试纸条剖面结构示意图，图中：1、样品吸收垫；2、结合物释放垫；3、反应膜；4、吸水垫；5、检测线；6、质控线；7、底板；
[0038]
图2为试纸条检测结果判定图；
[0039]
图3为稻瘟灵半抗原合成图。
具体实施方式
[0040]
下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内可能会对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰同样应落入发明的保护范围。
[0041]
实施例1检测稻瘟灵的试纸条的制备
[0042]
该试纸条的制备方法主要包括以下步骤：
[0043]
1)制备喷涂有稻瘟灵单克隆抗体-胶体金标记物的结合物释放垫；
[0044]
2)制备具有包被有稻瘟灵半抗原-载体蛋白偶联物的检测线和包被有羊抗鼠抗抗体的质控线的反应膜；
[0045]
3)将1)和2)制备好的结合物释放垫、反应膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸条。
[0046]
下面分步详细叙述：
[0047]
1、稻瘟灵半抗原的合成(合成路线见附图3)
[0048]
取1.88g丙二酸二异丙酯，加二硫化碳20ml，室温搅拌，充分混匀，加2mol/l koh溶液13ml，室温搅拌1h，再加入3,4-二氯丁酸1.56g，补加2mol/l koh溶液5ml，四丁基溴化铵3.8g，乙腈80ml，加热回流反应4h，停止反应，旋蒸，除去乙腈和二硫化碳，加水80ml，加6mol/l hcl调节ph值到6，加乙酸乙酯100ml
×
3萃取三次，合并有机相，水洗，无水硫酸钠干燥蒸干，得到黄色油状物，上硅胶柱，用体积比为3:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶液洗脱分离纯化，得到乙酸-稻瘟灵0.76g，即为稻瘟灵半抗原。
[0049]
2、免疫原的制备
[0050]
取稻瘟灵半抗原12.9mg，加1ml四氢呋喃溶解澄清，加n-羟基丁二酰亚胺(nhs)8.5mg、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)14.8mg，充分溶解混匀，室温反应2h，得到半抗原活化液a液；取牛血清白蛋白(bsa)50mg，加0.1mol/l cb9.1 8ml溶解，得到b液；将a液逐滴滴加到b液中，室温反应4h，停止反应，用0.02mol/l pbs缓冲液透析纯化3天，每天换液3次，离心分装，得到稻瘟灵-bsa偶联物，即为免疫原。
[0051]
3、包被原的制备
[0052]
取稻瘟灵半抗原7.7mg，加1ml二甲基亚砜(dmso)溶解澄清，加nhs 5.1mg、edc 9.7mg，充分溶解混匀，室温反应2h，得到半抗原活化液a液；取卵清蛋白(ova)50mg，加0.1mol/l cb9.1 7ml溶解，得到b液；将a液逐滴滴加到b液中，室温反应4h，停止反应，用0.02mol/l pbs缓冲液透析纯化3天，每天换液3次，离心分装，得到稻瘟灵-ova偶联物，即为包被原。
[0053]
4、稻瘟灵单克隆抗体的制备
[0054]
(1)动物免疫
[0055]
将步骤2得到的免疫原注入balb/c小鼠体内，免疫剂量为150μg/只，使其产生抗血清。
[0056]
(2)细胞融合和克隆化
[0057]
取免疫balb/c小鼠脾细胞，按8:1(数量配比)比例与sp2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争elisa测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用有限稀释法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
[0058]
(3)细胞冻存和复苏
[0059]
将杂交瘤细胞用冻存液制成1
×
106个/ml的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。
[0060]
(4)单克隆抗体的制备与纯化
[0061]
增量培养法：将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。
[0062]
所述细胞培养基为向rpmi1640培养基中添加小牛血清和碳酸氢钠，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20％(质量分数)，使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2％(质量分数)；所述细胞培养基的ph为7.4。
[0063]
5、羊抗鼠抗抗体的制备
[0064]
以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。
[0065]
6、稻瘟灵单克隆抗体-胶体金标记物的制备
[0066]
(1)胶体金的制备
[0067]
用双蒸去离子水将1％氯金酸稀释成0.01％(质量分数)，取100ml置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入1.5ml 1％柠檬酸三钠，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红色时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4℃保存。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物，在日光下观察颜色为酒红色。
[0068]
(2)稻瘟灵单克隆抗体-胶体金标记物的制备
[0069]
在磁力搅拌下，用0.2mol/l碳酸钾溶液调胶体金的ph值至7.2，按每毫升胶体金溶液中加入5～50μg抗体的标准向胶体金溶液中加入上述稻瘟灵单克隆抗体，继续搅拌混匀30min；静置10min后加入10％bsa，使其在胶体金溶液中的终浓度为1％，静置10min。12000r/min、4℃离心40min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4℃备用。
[0070]
复溶缓冲液：含bsa的质量分数为0.1％～0.5％、蔗糖的质量分数为2％～4％、ph 7.2的0.02mol/l磷酸盐缓冲液。
[0071]
7、结合物释放垫的制备
[0072]
将结合物释放垫浸泡于含0.5％bsa、5％蔗糖、ph 7.4的0.02mol/l磷酸盐缓冲液中，均匀浸湿2h，37℃烘干备用。用bio dot划膜仪将制备好的稻瘟灵单克隆抗体-胶体金标记物均匀喷涂在结合物释放垫上，每1cm结合物释放垫喷涂0.01ml稻瘟灵单克隆抗体-胶体金标记物后，置于37℃环境(湿度＜20％)中2h后取出，置于干燥环境(湿度＜20％)中保存备用。
[0073]
8、样品吸收垫的制备
[0074]
将样品吸收垫用含1％bsa、ph为7.2的0.02mol/l磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃烘干2h备用。
[0075]
9、反应膜的制备
[0076]
将稻瘟灵半抗原-ova偶联物包被到反应膜上构成检测线，将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控线。
[0077]
包被过程：用0.01mol/l、ph 7.2的磷酸缓冲液将稻瘟灵半抗原-ova偶联物稀释到1mg/ml，用bio dot划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线(t线)，包被量为1.0μl/cm；用0.01mol/l、ph 7.2的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠抗抗体稀释到200μg/ml，用bio dot划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线(c线)，包被量为1.0μl/cm。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥16h，备用。
[0078]
10、试纸条的组装
[0079]
根据附图1所示试纸条剖面结构，将样品吸收垫(1)、结合物释放垫(2)、反应膜(3)、吸水垫(4)依次按顺序粘贴在pvc底板(7)上；结合物释放垫从起始端有1/3区域被样品吸收垫覆盖，结合物释放垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与pvc底板的始端对齐，吸水垫的末端与pvc底板的末端对齐；所述反应膜上有检测线(5)和质控线(6)，检测线(t线)和质控线(c线)均为与所述试纸条的长相垂直的条状带；检测线位于靠近结合物释放垫的末端的一侧；质控线位于远离结合物释放垫的末端的一侧；将试纸条用机器切成3.95mm宽的小条，装在特制的塑料制卡壳中，以铝箔袋密封，4～30℃的环境中贮存，有效期12个月。
[0080]
实施例2样品中稻瘟灵的检测
[0081]
1、样品前处理
[0082]
将样品粉碎或剪碎成小于1cm的碎片；称取1.00g
±
0.05g粉碎的样品至聚苯乙烯离心管中；加入5ml甲醇，涡旋振荡1min；取100μl上清液加入900μl 0.02mol/l磷酸盐缓冲液，混匀，待测。
[0083]
2、用试纸条检测
[0084]
用微量移液器吸取待测样本液100μl垂直滴于加样孔中；液体流动开始计时，反应10min，判定结果。
[0085]
3、分析检测结果
[0086]
阴性(－)：t线显色比c线显色深或与c线显色一致，表示样品中稻瘟灵浓度低于检测限，如图2a、2b。
[0087]
阳性( )：t线显色比c线显色浅或t线不显色，表示样品中稻瘟灵浓度等于或高于检测限，如图2c、2d。
[0088]
无效：未出现c线，表明不正确的操作过程或试纸条已变质失效，如图2e、2f。
[0089]
实施例3样品检测实例
[0090]
1、检测限试验
[0091]
取空白采后待烤烟叶、初烤烟叶样本，在其中分别添加稻瘟灵至终浓度为1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg，取试纸条进行检测，每个样本重复测定三次。
[0092]
用试纸条检测采后待烤烟叶、初烤烟叶样本时，当其中无稻瘟灵和其添加浓度为1mg/kg时，试纸条上显示出t线显色比c线显色深或与c线显色一致，呈阴性；当其中稻瘟灵添加浓度为2mg/kg、4mg/kg时，试纸条上显示出t线显色比c线显色浅或t线不显色，呈阳性，表明本试纸条对烟叶中稻瘟灵的检测限为2mg/kg，可以满足最大残留限量的要求。
[0093]
2、假阳性率、假阴性率试验
[0094]
取空白采后待烤烟叶、初烤烟叶样本及添加稻瘟灵至终浓度为2mg/kg的阳性采后待烤烟叶、初烤烟叶样本各20份，用3个批次生产的试纸条分别进行检测，计算其阴阳性率。
[0095]
结果表明：用3个批次生产的试纸条检测阳性样本时，结果全为阳性，可知阳性符合率为100％，假阴性率为0；检测阴性样本时，结果全为阴性，可知阴性符合率为100％，假阳性率为0。说明本发明的检测稻瘟灵的试纸条可以对烟叶样本中稻瘟灵残留进行快速检测。
[0096]
3、特异性试验
[0097]
将百菌清、多菌灵、噁霜灵、甲基硫菌灵、甲霜灵、腈菌唑、三唑酮、三唑醇、霜霉威、戊唑醇、异菌脲等烟叶中常用的杀菌剂用ph7.2、0.2mol/l的磷酸盐缓冲液稀释至500mg/l，用稻瘟灵试纸条进行检测。结果显示，用该试纸条检测500mg/l百菌清、多菌灵、噁霜灵、甲基硫菌灵、甲霜灵、腈菌唑、三唑酮、三唑醇、霜霉威、戊唑醇、异菌脲时，试纸条t线显色比c线显色深或与c线显色一致，呈阴性。说明本试纸条对百菌清、多菌灵、噁霜灵、甲基硫菌灵、甲霜灵、腈菌唑、三唑酮、三唑醇、霜霉威、戊唑醇、异菌脲等烟叶中常用的杀菌剂无交叉反应。
[0098]
4、与仪器方法比对试验
[0099]
取采后待烤烟叶、初烤烟叶样本各20份，编号1-20号，使用本试纸条与仪器检测方法进行对比检测，仪器方法参照：“gb/t 20769-2008水果和蔬菜中450种农药及相关化学品残留量的测定液相色谱-串联质谱法”(稻瘟灵检出限为0.46mg/kg)，本试纸条采后待烤烟叶、初烤烟叶样本中稻瘟灵含量低于2mg/kg，视为未检出，用“－”表示，高于2mg/kg的样品仪器方法用实际结果表示，试纸条检测结果用“ ”表示，结果见下表。
[0100]
表1采后待烤烟叶样本试纸条与仪器方法检测结果比较(mg/kg)
[0101][0102]
表2初烤烟叶样本试纸条与仪器方法检测结果比较(mg/kg)
[0103][0104]
由上表可知，试纸条检测结果与仪器检测结果相吻合。
[0105]
尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。