一种多功能化石墨烯载网在冷冻电镜三维重构中的应用的制作方法

1.本发明涉及一种多功能化石墨烯载网在冷冻电镜三维重构中的应用，属于生物冷冻电镜技术领域。


背景技术：

2.由于冷冻电镜技术相关硬件和软件的持续发展，冷冻电子显微镜(cryo-em)现在已成为解决生物大分子原子分辨率结构的常规方法，这极大地扩展了在分子水平上对生物学机制的理解。然而，该方法仍然面临一些关键的技术挑战，特别是对于冷冻样品制备而言。在实践中，将少量含有生物分子的溶液滴加到由支撑膜(例如多孔碳膜)覆盖的新鲜辉光放电的载网上，然后在液态乙烷中骤冷。理想地，预期生物分子将被定向富集地嵌入由无噪音膜支撑的薄玻璃化冰层中，但实际上并不是这种情况，并且生物分子的嵌入方向不可控。在大多数情况下，生物分子颗粒被吸收到空气-水界面中，这会导致生物分子的变性和优势取向问题，从而使后续的三维重构无法实现或结果不可靠。
3.面对这些问题，在冷冻样品制备中探索了无定形碳薄层作为支撑膜。然而，碳膜具有许多缺点，例如电子传导性差和背景噪声强，这导致在冷冻电镜数据收集过程中出现样品充电和目标信号浸没的问题。由于石墨烯及其衍生物具有超高的热/电导率，强大的机械强度和近乎无背景噪音的优异性能，因此也被用作冷冻电镜中的支撑膜。实际上，这些薄膜只能部分解决空气-水界面问题，而几乎不能控制冷冻样品中的颗粒分布。一些亲和力载网(例如功能化的石墨烯、脂质单层或碳膜和链霉亲和素二维晶体膜能够将目标分子锚定在膜的表面，从而使目标颗粒远离空气-水界面并处于更健康的状态。但是，这些亲和力载网无法特定地调节目标颗粒分子的方向，并可能引发更严重的优势取向的问题。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种多功能化石墨烯载网(mfg载网)在冷冻电镜三维重构中的应用，mfg载网能够特异性地将目标生物分子锚定在其表面上，从而避免了空气与水的界面问题，而且还能够控制颗粒取向分布，通过把相关的蛋白纯化标签构建到每个生物大分子的不同方向上，提供了丰富的欧拉角，并且让生物大分子的结构解析更加的可靠以及更加的高效，因此，mfg载网将促进在结构生物学分析中应用冷冻电镜的通用性和可重复性。
5.本发明涉及的多功能化石墨烯载网，可按照下述方法制备：
6.1)刻蚀采用cvd生长的石墨烯薄膜覆盖的铜箔作为电镜载网，即得到石墨烯载网(即电镜载网以及覆盖的石墨烯薄膜)；
7.所述电镜载网上设有孔阵列；
8.2)将所述石墨烯载网进行氧等离子体处理；
9.3)采用2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)缓冲液处理所述石墨烯载网；
10.所述2-(n-吗啉代)乙磺酸缓冲液中含有1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐和n-羟基-磺基琥珀酰亚胺；
nta的成功修饰(图1(f))。通过stem进行的高角度环形暗场(haadf)成像确定了单分散的高对比度斑点(图1(g)上图)，该斑点被分配给了ni，并通过相应的eels光谱进行了验证(图1g下图)。能量损失峰值为与ni l
2,3
.的理论值一致。haadf成像中不存在生物素信号，可能是因为它由轻元素(例如碳、氢和硫)组成，并且容易受到stem中使用的超高电子剂量的照射。为了评估修饰效率，基于haadf图像(图1(g))计算了石墨烯膜上的镍原子密度(图1(g))，发现在石墨烯表面每两平方纳米有一个以上的ni-nta修饰位点。这样的修饰密度不仅适合于目标大分子的结合，其直径通常在几纳米到几十纳米之间，而且对石墨烯的危害也很小。本发明进一步使用tem对多功能化的石墨烯膜进行成像，发现该膜无污染，并且石墨烯晶格得到了很好的保存，这是由其选定区域的电子衍射(saed)模式所表明的(图1(h)中的插图)。
30.本发明涉及的mfg载网是亲水性的，并且对电子束辐射具有抵抗力。本发明通过水接触角(wca)测试检查亲水性。本发明测量了石墨烯载网和多功能石墨烯载网的wca，发现功能化后该角度从97.4
°
减小到39.1
°
(图2(a))，适用于后续的生物电镜标本制备。石墨烯的优越性能，例如超高的导热性和导电性以及强大的机械强度，主要归因于由sp2杂化的碳原子形成的完美二维六角形晶格。拉曼光谱显示，改性前石墨烯膜中不存在d峰(1350cm-1
)，表明石墨烯几乎没有缺陷(图2(b)，上方的蓝色曲线)。经过多重功能化后，出现了一个弱的d峰，其强度比g峰(1580cm-1
)的强度比约为0.2(图2(b)，下方的红色曲线)，远低于氧化石墨烯。此外，石墨烯的2d(2690cm-1
)和g峰得到了很好的保留，这表明经过本发明的多官能化处理后，石墨烯的固有晶格得到了很好的保留。为了测量mfg的机械性能，本发明对悬浮的mfg进行了afm纳米压痕实验。如图3(c)所示，mfg的弹性系数仅比原始石墨烯有很小的降低(左侧)，表明石墨烯晶格中保持了σ键，并与带有弱d峰的mfg的拉曼结果相对应(图2(b))。进一步地，本发明使用透射率约为100e-/a2/s的tem表征了石墨烯和多功能石墨烯膜上的辐射损伤(图2(d))，连续记录三阶(i3rd)和一阶(imax)布拉格衍射峰的积分强度，并绘制相对强度(i3rd/imax)与累积剂量的关系(图2(d))，发现，在高达的辐射下，多功能石墨烯的相对强度仅发生了轻微的衰减，这非常适合在tem下成像。
31.本发明涉及的mfg载网具有与靶标生物分子的结合特异性。本发明通过荧光显微镜验证了多功能石墨烯膜的结合特异性。在生化分析中，ni-nta可以与组氨酸标签的(his-tag)蛋白特异性结合，而生物素可以高亲和力捕获链霉亲和素。具体地，本发明首先用ni-nta和生物素配体对在铜箔上生长的石墨烯膜进行多重功能化，然后用mfg孵育约500μl含有his标记的红色荧光蛋白(rfp)和链霉亲和素-fitc的蛋白溶液。如果激发，fitc将产生绿色荧光。之后，使用各种缓冲液彻底清洗了mfg载网表面(图3)。当在荧光显微镜下用双波长激发成像时，用普通样品缓冲液洗涤后，在功能化石墨烯区域上可见高密度的红色和绿色斑点(图3(a))，表明his标记的rfp和链霉亲和素-fitc结合到石墨烯表面。相比之下，未功能化区域几乎没有红色或绿色信号。咪唑可以竞争性地螯合镍离子。在存在咪唑的情况下，红色信号几乎完全被洗掉，而绿色信号得以保留(图3(b))。同时，高浓度的生物素溶液洗掉了大多数绿色信号，但对红色信号影响很小(图3(c))。当同时使用咪唑和高浓度生物素溶液清洗mfg表面时，红色和绿色信号均消失(图3(d))。此外，本发明还使用ni-nta或生物素通过荧光显微镜对单个配体官能化的石墨烯进行了结合实验，并获得了相同的结
果。上述结果表明，通过ni-nta和生物素配体实现的多功能石墨烯能够以高特异性结合靶蛋白。
32.本发明涉及的mfg载网能够很好地解决空气-水界面吸附问题以及优势取向的问题。为了证明mfg载网能够避免生物分子吸附在空气-水界面上的能力，本发明使用冷冻电子断层扫描(et)方法重建冷冻标本并定位单个20s蛋白酶体颗粒，其β亚基被组氨酸标签标记以及α亚基被sbp标签标记。这两个不同的标签构建在20s蛋白酶体的不同侧面，his标签在侧面，sbp在顶部，它们特异性结合在mfg载网上修饰的各种配体上。作为对照，对常规的多孔碳和石墨烯膜进行了表征。在多孔碳载网中，蛋白质颗粒主要分布在标本的空气-水界面上，通过测量两个颗粒分布层的距离估算出冰厚度约为80nm(图4(a)。而且，存在20s蛋白酶体的严重的优势取向问题，其主要取向是侧视图，即矩形视图(图4(a)，右)。在未功能化的石墨烯载网中，发现许多颗粒被吸收到空气-水界面上，尽管许多颗粒躺在石墨烯表面(图4(b)左和中)。侧视图再次是石墨烯表面和空气-水界面的首选取向(图4(b)，右)。相比之下，mfg载网支持冷冻样品中的几乎所有蛋白质颗粒都位于mfg表面的同一层上，并且在俯视图(环形)和侧视图(矩形)下它们的取向都相对丰富(图4(c)，右)。总的来说，这些结果表明mfg载网可以将目标蛋白质颗粒锚定在其表面上，从而解决了空气-水界面吸附问题。
33.为了进一步测试mfg载网是否可以使方向可控，本发明将单配体官能化石墨烯膜的欧拉角分布与mfg进行了比较。在基于单配体官能化石墨烯膜上收集的20s蛋白酶体颗粒的3d重建中，发现首选方向分别是ni-nta官能化石墨烯的侧视图(图5(a))和生物素官能化石墨烯的俯视图(图5(b))。这些数据与先前的陈述相吻合，先前的陈述是ni-nta结合在20s蛋白酶体侧面构建的his标签上，而生物素-链霉亲和素在20s蛋白酶体的上表面上结合sbp标签。如预期的那样，将20s蛋白酶体应用于多功能石墨烯载网时，欧拉角分布变得更加平衡(图5(c))，最终确定了20s蛋白酶体的冷冻电镜结构，其中mfg载网支撑了12,451个颗粒(图5(d))。不同亲和力配体修饰引起的改变的欧拉角分布证明，mfg载网具有设计目标生物分子取向分布的巨大潜力，并使冷冻电镜结构重建更可靠。
34.气-水界面一直是生物冷冻电镜样品制备中存在的一个大问题，并且生物分子的分散性和与冰的定向分布难以控制，这大大限制了冷冻电镜的结构求解效率。基于此，本发明提供了一种多功能化石墨烯载网，经实验确认，多功能石墨烯载网能够特异性地将目标生物分子锚定在其表面上，从而避免了空气与水的界面问题。此外，与单配体修饰相比，多功能石墨烯使能够人为地设计颗粒取向分布。因此可以预期，由多个亲和配体修饰的mfg载网将促进在结构生物学分析中应用冷冻电镜的通用性和可重复性。
附图说明
35.图1为ni-nta和生物素功能化的石墨烯载网(mfg载网)的表征；其中，图1(a)为通过直接蚀刻铜箔制成的石墨烯载网的光学显微镜图像。图1(b)为石墨烯载网的低倍tem图像显示直径约30μm的排列孔，图1(c)为高分辨率stem图像显示了双层悬浮石墨烯的莫尔图案，图1(d)为xps检查关于修饰效率与氧等离子体处理时间的关系，图1(e)为mfg的典型afm图像，上面带有明显的突起，图1(f)为s和ni在mfg上的edx元素映射，图1(g)为mfg的haadf stem图像和相应的eels数据，图1(h)为mfg的tem显微照片，插图为saed模式。
36.图2为石墨烯和mfg载网的吸能测试；其中，图2(a)为通过wca测量的石墨烯(上方)
和mfg载网(下方)的亲水性；图2(b)为石墨烯(上方)和mfg载网(下方)的拉曼光谱比较，显示了2d(2690cm-1
)、d(1350cm-1
)和g(1580cm-1
)峰；图2(c)为通过afm纳米压痕实验表征的石墨烯(右侧曲线)和mfg载网(左侧曲线)的弹性系数；图2(d)为三阶衍射点强度(i3rd)与一阶(imax)点强度之比与剂量累积(上方曲线表示石墨烯，下方曲线表示mfg载网)。
37.图3为通过荧光显微镜表征mfg载网的结合特异性结果；其中，图3(a)为与his标记的rfp和链霉亲和素-fitc孵育后，在mfg上可以检测到红色和绿色信号；图3(b)为用咪唑溶液洗涤时，mfg上只有绿色斑点；图3(c)为用高浓度生物素溶液洗涤后，大多数绿色斑点被洗掉，而红色斑点被保留；图3(d)为用咪唑和高浓度生物素溶液洗涤时，红色和绿色斑点均消失。
38.图4为通过使用不同的支撑膜制备的低温样品中的颗粒位置；其中，图4(a)为蛋白质颗粒在多孔碳膜上的分布；图4(b)表示蛋白质颗粒在石墨烯膜上的分布；图4(c)为蛋白质颗粒在mfg上的蛋白质颗粒分布；左图表示蛋白质颗粒在空气-水界面上的吸收图，中图表示颗粒位置，每个斑点表示一个单独的颗粒，右图表示使用冷冻电子断层扫描技术所重建的冰层里20s蛋白酶体的分布截面。
39.图5为单功能或多功能石墨烯膜上20s蛋白酶体的欧拉角分布；其中，图5(a)为在ni-nta官能化的石墨烯膜上的欧拉角分布和相应的优势取向被列出，图5(b)为生物素官能化石墨烯上的欧拉角分布，图5(c)为多个亲和配体官能化的石墨烯膜(mfg)上的欧拉角分布，图5(d)为基于mfg载网支持的20s蛋白酶体颗粒的3d重建。
具体实施方式
40.下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
41.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
42.下述实施例中石墨烯载网的表征：
43.通过光学显微镜(om)(nikon，ds-ri2)、sem(加速电压1-2kv，hitachi s-4800)、afm(scansyst模式，bruker尺寸图标，提示：snl-a)、拉曼光谱仪(532nm，labram hr-800，horiba)、xps(kratos analytical ltd.)和高分辨率像差校正的stem(60kv，nion u-herms 200)表征石墨烯载网的结构。
44.下述实施例中石墨烯载网的afm纳米压痕测试：
45.使用带有商业提示的商业afm系统(icon)对原始和多功能悬浮石墨烯膜进行纳米压痕测试。在每次压痕之前，用tapping模式扫描悬浮的石墨烯膜，以发现并确保孔上完整的悬浮石墨烯。随后，将afm尖端居中于圆形孔的中心。在进行机械测试时，使用了力-位移模式。弹性系数可以使用力-位移曲线和先前报道的理论模型来定量。
46.下述实施例中蛋白样品准备：
47.从大肠杆菌中纯化n末端带有his标签的rfp蛋白，而链霉亲和素-fitc蛋白则从thermo fisher公司(目录sa1001)购买。6x his和sbp9标签的20s蛋白酶体的构建和纯化如下：1)通过pcr分别在β亚基的n末端引入6个组氨酸，在α亚基的c末端添加sbp。2)将这些工程化的β和α亚基质粒共转化到大肠杆菌感受态细胞中；3)在体内表达和组装β和α亚单位为完全的20s蛋白酶体；4)通过超声破碎大肠杆菌细胞，并将含有20s蛋白酶体的细胞裂解物离心并施加到镍柱上。孵育后，用300mm咪唑缓冲液竞争性洗脱结合镍柱的20s蛋白酶体，并
使用无咪唑缓冲液(50mm tris-hcl，100mm nacl)通过分子筛系统进一步纯化。
48.下述实施例中冷冻电镜实验以及结构分析：
49.首先将0.02mg/ml的链霉亲和素溶液与多功能石墨烯载网一起孵育约20分钟，然后使用缓冲液(50mm tris-hcl，100mm nacl)洗涤载网3～5次。将约5μl 20s蛋白酶体溶液吸移到新鲜处理的mfg载网上，并在高湿度的室内孵育约20min。然后，将载网用蛋白缓冲液(50mm tris-hcl，150mm nacl)轻轻洗涤3次，然后转移到湿度为100％，温度为12℃的vitrobot(thermo fisher scientific)中。滤纸夹吸水的时间设为3s，滤纸夹吸力设为-2。吸干后，将载网快速浸入液态乙烷中，然后保存在液氮中以进行进一步的冷冻电镜成像。
50.将冷冻样品转移到在液氮环境下300kev的加速电压的titan krios显微镜(thermo fisher scientific)中。然后使用k2直接电子探测器摄像机(gatan公司)以-1.5μm至-2.5μm的欠焦范围，以22500x的放大倍率和的像素大小收集数据。单张照片的总累积电子曝光剂量为每张照片分为32帧，并通过motioncor2程序应用于后续移动校正。在重建过程中，所有这些经过移动校正的显微照片的ctf和欠焦值首先由ctffind4软件包估算。然后，自动选取颗粒，并通过relion3.1对其进行几轮二维分类。剔除分类形状类别错误的颗粒，并将剩余的颗粒用于进一步的三维分类和细化重构。在最后的细化步骤中，应用d7对称性，并绘制每个颗粒的欧拉角进行取向分布分析。
51.下述实施例中冷冻电镜层析成像分析：
52.cryo-et数据集是使用serialem软件在配备了k2直接电子探测器(gatan公司)的titan krios显微镜(thermo fisher scientific，300kev)上收集的。对于每个倾斜系列，以 3
°
的步长从 51
°
采集到-51
°
，欠焦值为-5.0μm。电子剂量约为总剂量约为所有照片的放大的物理像素大小为倾斜系列的照片经过对中后，将其用imod程序进行重构，所有照片是被进行了bin4压缩的。cryo-et重构过程中20s蛋白酶体颗粒的坐标是通过手动挑取定位的。
53.实施例1、mfg载网的制备与结构表征
54.1)制备石墨烯载网
55.首先采用cvd法在铜箔上生长石墨烯薄膜，然后将铜箔直接选择性刻蚀成电镜载网微栅，得到超洁净，坚固的石墨烯载网，该载网包含阵列排布的孔(图1(a)和图1(b))。
56.在低温样品制备过程中，石墨烯的覆盖度和在载网上的完整性取决于孔直径和石墨烯层数，当双层或多层石墨烯的孔直径约为30μm时，可以很好地保持石墨烯的覆盖度和在载网上的完整性。本实施例以铺有1至4层石墨烯的载网作为起始材料。悬浮的石墨烯是超净的，当通过高分辨率stem成像时，可以很好地识别出蚀刻的铜孔上的碳原子以及双层石墨烯的莫尔图案(图1(c)，stem图像经过了高斯模糊处理，以减少噪声)。还使用原子-力显微镜(afm)来表征悬浮的石墨烯，该石墨烯的表面非常平坦且没有污染。因此，这种无聚合物和无转移的石墨烯载网的制造方法极大地保持了石墨烯膜的完整性和清洁性。
57.2)石墨烯载网的功能化
58.首先在反应离子刻蚀机(pico sls，diener)的5sccm的氧气环境中将石墨烯载网阵列辉光放电12s，然后立即吸取5微升100mm，ph 5.0的mes缓冲液(含有5.0mm1-乙基-3-(3-二甲基-氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(edc，sigma-aldrich company，cas25952-53-8)和
5.0mm n-羟基-磺基琥珀酰亚胺(sulfo-nhs，sigma-aldrich company，cas 106627-54-7))放到刚辉光放电的石墨烯载网上。在室温下孵育50分钟后，用50mm tbe缓冲液(ph 8.5)洗涤石墨烯载网，并用溶解有11.3mm nta-nh2和30mm biotion-peg-nh2(o-(2-氨基乙基)-o
′-
[2-(生物素基氨基)乙基]八聚乙二醇)的tbe缓冲液，活化石墨烯载网1.5h，然后与11.3mm niso4溶液孵育1h。最后，用蒸馏水或缓冲液洗涤载网。
[0059]
为了避免在苛刻的化学条件下铜箔被氧化，本发明使用了低损伤的氧等离子体充电方法来激活石墨烯膜，并优化了氧等离子体的处理时间以获得合适的x射线光电子能谱(xps)表征的功能化结果。相比之下，未经氧等离子体处理的石墨烯膜基本上是疏水性的，并且ni-nta和生物素无法在其表面改性(图1(d))。当石墨烯用氧等离子体处理6s或12s时，可以通过xps清楚地识别s 2p3/2(168.7ev)，ni 2p3/2(856.4ev)，ni 2p1/2(874.1ev)信号，并且这些元素的相对丰度与充电时间大致呈正相关。s信号分别来自生物素和ni-nta的ni。然而，在18s和24s的处理时间并没有增加s和ni的含量，这表明氧等离子体的12s处理可能足以饱和石墨烯表面的修饰(图1(d))。
[0060]
首先在多个亲和配体功能化的石墨烯(mfg)的表面上进行了afm表征，与未功能化的石墨烯膜相比，该石墨烯变得非常粗糙并具有结构特征(图1(e))。这些凸起特征的高度大多在1～2nm的范围内。mfg载网的edx元素图谱显示s和ni均均匀且分散地分布在石墨烯表面，这证明了生物素和ni-nta的成功修饰(图1(f))。通过stem进行的高角度环形暗场(haadf)成像确定了单分散的高对比度斑点(图1(g)上图)，该斑点被分配给了ni，并通过相应的eels光谱进行了验证(图1(g)下图)。能量损失峰值为与ni l
2,3
.的理论值一致。haadf成像中不存在生物素信号，可能是因为它由轻元素(例如碳、氢和硫)组成，并且容易受到stem中使用的超高电子剂量的照射。为了评估修饰效率，基于haadf图像(图1(g))计算了石墨烯膜上的镍原子密度(图1(g))，发现在石墨烯表面每两平方纳米有一个以上的ni-nta修饰位点。这样的修饰密度不仅适合于目标大分子的结合，其直径通常在几纳米到几十纳米之间，而且对石墨烯的危害也很小。进一步使用tem对多功能化的石墨烯膜进行成像，发现该膜无污染，并且石墨烯晶格得到了很好的保存，这是由其选定区域的电子衍射(saed)模式所表明的(图1(h)中的插图)。
[0061]
实施例2、mfg载网的生物应用性能研究
[0062]
1、mfg载网是亲水性的，并且对电子束辐射具有抵抗力
[0063]
本发明通过水接触角(wca)测试检查亲水性。本发明测量了石墨烯载网和多功能石墨烯载网的wca，发现功能化后该角度从97.4
°
减小到39.1
°
(图2(a))，适用于后续的生物电镜标本制备。石墨烯的优越性能，例如超高的导热性和导电性以及强大的机械强度，主要归因于由sp2杂化的碳原子形成的完美二维六角形晶格。拉曼光谱显示，改性前石墨烯膜中不存在d峰(1350cm-1
)，表明石墨烯几乎没有缺陷(图2(b)，上方的蓝色曲线)。经过多重功能化后，出现了一个弱的d峰，其强度比g峰(1580cm-1
)的强度比约为0.2(图2(b)，下方的红色曲线)，远低于氧化石墨烯。此外，石墨烯的2d(2690cm-1
)和g峰得到了很好的保留，这表明经过本发明的多官能化处理后，石墨烯的固有晶格得到了很好的保留。为了测量mfg的机械性能，本发明对悬浮的mfg进行了afm纳米压痕实验。如图2(c)所示，mfg的弹性系数仅比原始石墨烯有很小的降低(左侧曲线)，表明石墨烯晶格中保持了σ键，并与带有弱d峰的mfg的拉曼结果相对应(图2(b))。接下来，使用透射率约为100e-/a2/s的tem表征了石墨烯和多功能
石墨烯膜上的辐射损伤(图2(d))。连续记录三阶(i3rd)和一阶(imax)布拉格衍射峰的积分强度，并绘制相对强度(i3rd/imax)与累积剂量的关系(图2d)。发现，在高达的辐射下，多功能石墨烯的相对强度仅发生了轻微的衰减，这非常适合在tem下成像。
[0064]
2、mfg载网具有与靶标生物分子的结合特异性
[0065]
本发明通过荧光显微镜验证了多功能石墨烯膜的结合特异性。在生化分析中，ni-nta可以与组氨酸标签的(his-tag)蛋白特异性结合，而生物素可以高亲和力捕获链霉亲和素。首先用ni-nta和生物素配体对在铜箔上生长的石墨烯膜进行多重功能化，然后用mfg孵育约500μl含有his标记的红色荧光蛋白(rfp)和链霉亲和素-fitc的蛋白溶液。如果激发，fitc将产生绿色荧光。之后，使用各种缓冲液彻底清洗了mfg表面(图3)。当在荧光显微镜下用双波长激发成像时，用普通样品缓冲液洗涤后，在功能化石墨烯区域上可见高密度的红色和绿色斑点(图3(a))，表明his标记的rfp和链霉亲和素-fitc结合到石墨烯表面。相比之下，未功能化区域几乎没有红色或绿色信号。咪唑可以竞争性地螯合镍离子。在存在咪唑的情况下，红色信号几乎完全被洗掉，而绿色信号得以保留(图3(b))。同时，高浓度的生物素溶液洗掉了大多数绿色信号，但对红色信号影响很小(图3(c))。当同时使用咪唑和高浓度生物素溶液清洗mfg表面时，红色和绿色信号均消失(图3(d))。此外，本发明还使用ni-nta或生物素通过荧光显微镜对单个配体官能化的石墨烯进行了结合实验，并获得了相同的结果。上述结果表明，通过ni-nta和生物素配体实现的多功能石墨烯能够以高特异性结合靶蛋白。
[0066]
3、mfg很好地解决了空气-水界面吸附问题以及优势取向的问题
[0067]
为了证明mfg有避免生物分子吸附在空气-水界面上的能力，本发明使用冷冻电子断层扫描(et)方法来重建冷冻标本并定位单个20s蛋白酶体颗粒，其β亚基被组氨酸标签标记以及α亚基被sbp标签标记。这两个不同的标签构建在20s蛋白酶体的不同侧面，his标签在侧面，sbp在顶部，它们特异性结合在mfg载网上修饰的各种配体上。作为对照，对常规的多孔碳和石墨烯膜进行了表征。在多孔碳载网中，蛋白质颗粒主要分布在标本的空气-水界面上，通过测量两个颗粒分布层的距离估算出冰厚度约为80nm(图4(a))，而且，存在20s蛋白酶体的严重的优势取向问题，其主要取向是侧视图，即矩形视图(图4(a)，右图)。在未功能化的石墨烯载网中，发现许多颗粒被吸收到空气-水界面上，尽管许多颗粒躺在石墨烯表面(图4(b)，左图和中图)。侧视图再次是石墨烯表面和空气-水界面的首选取向(图4(b)，右图)。相比之下，mfg支持冷冻样品中的几乎所有蛋白质颗粒都位于mfg表面的同一层上，并且在俯视图(环形)和侧视图(矩形)下它们的取向都相对丰富(图4(c)，右图)。综上结果表明mfg膜可以将目标蛋白质颗粒锚定在其表面上，从而解决了空气-水界面吸附问题。
[0068]
为了进一步测试mfg载网是否可以使方向可控，本发明将单配体官能化石墨烯膜的欧拉角分布与mfg进行了比较。在基于单配体官能化石墨烯膜上收集的20s蛋白酶体颗粒的3d重建中，发现首选方向分别是ni-nta官能化石墨烯的侧视图(图5(a))和生物素官能化石墨烯的俯视图(图5(b))。这些数据与上述相吻合，即ni-nta结合在20s蛋白酶体侧面构建的his标签上，而生物素-链霉亲和素在20s蛋白酶体的上表面上结合sbp标签。如预期的那样，将20s蛋白酶体应用于多功能石墨烯载网时，欧拉角分布变得更加平衡(图5(c))，最终确定了20s蛋白酶体的冷冻电镜结构，其中mfg载网支撑了12,451个颗粒(图5(d))。不同亲
和力配体修饰引起的改变的欧拉角分布证明，mfg载网具有设计目标生物分子取向分布的巨大潜力，并使冷冻电镜结构重建更可靠。
[0069]
虽然，近年来利用单颗粒电子显微镜技术解析的大分子的高分辨率结构的数量持续增加，然而，这项技术的普遍性以及可靠性都被制备样品的气-液界面问题以及颗粒的优势取向问题严重的挑战着，这在实际的样品制作中要花大量的精力去克服。本发明提供了多功能化的石墨烯(mfg)作为冷冻样品的支撑膜，通过用多亲和性配体共价修饰在石墨烯膜上，这些多亲和性配体展现了与生物大分子纯化标签的结合的准确性，并且阻止了这些生物大分子在冷冻样品制备过程中的气-液界面问题的出现。然后，依据多亲和性配体石墨烯(mfg)拥有不同的亲和性配体的特性，可以设计颗粒方向的分布，通过把相关的蛋白纯化标签构建到每个生物大分子的不同方向上，这样就提供了丰富的欧拉角，并且让生物大分子的结构解析更加的可靠以及更加的高效。