新型冠状病毒中和抗体类药物中和能力的检测方法与流程

1.本发明属于生物技术领域，具体涉及新型冠状病毒中和抗体类药物中和能力快速检测方法。


背景技术：

2.根据中国国家药品监督管理局药品审评中心(cde)发布的《新型冠状病毒中和抗体类药物技术资料要求(药学)(征求意见稿)》
1.，目前对于新型冠状病毒中和抗体类药物体外生物学活性的检测方法包括：与新型冠状病毒相关蛋白的特异性结合活性，ace2竞争结合活性，新型冠状病毒/假病毒中和或阻断生物学活性等。《要求》特别指出，“评价中和抗体中和新型冠状病毒的能力及特异性非常重要，应在分子筛选阶段确认抗体对新型冠状病毒的中和能力”，而显然与新型冠状病毒相关蛋白(如s蛋白受体结合域，以下简称rbd)的特异性结合活性检测实验并不能有效反映生理状态下中和抗体中和新型冠状病毒的能力。新型冠状病毒中和活性检测无可避免地需要使用活体新型冠状病毒，必须在经国家卫健委备案的p3(protection 3)实验室中进行实验操作，且必须对实验人员进行严格的安全操作培训，因此只有少数实验室能获得相应资质，无法大范围推广。即使是假病毒中和抗体检测方法
2.，也要求在p2(protection 2)实验室中进行实验操作，实验通常要持续大于一周的时间，且由于制备的病毒活性难以保持一致，必然导致方法稳定性受限，难以作为药物生产和质量控制(简称cmc)阶段的质量放行方法。
3.根据我们的文献调研，目前只有血管紧张素转化酶2(ace2)竞争结合活性检测实验可以满足作为新型冠状病毒中和抗体类药物中和活性的质量放行方法的要求，且实验周期短，无需专门的p2实验室，具有较广的应用范围。但是却没有相应的方法可以准确、稳定地定量衡量中和抗体的中和活性，因此需要开发稳定的ace2竞争结合活性检测实验方法，以用于抗体药物cmc阶段的质量放行检测。
4.综上所述，目前尚未找到相关中和活性检测方法的报道，满足实验易操作性、高通量和快速检测的同时，还能兼顾生理条件的重现性和方法的稳定性。


技术实现要素：

5.为解决上述问题，我们通过基于过表达ace2的hela细胞和细胞为基础的elisa实验，建立了一种用于评价新型冠状病毒中和抗体类药物中和能力的快速检测方法。
6.一方面，本发明提供了一种检测样品中和新型冠状病毒能力的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
7.(1)将标记物连接的新型冠状病毒刺突蛋白(s)胞外结构域(ecd)、样品与ace2过表达的细胞系接触孵育；
8.(2)获得步骤(1)孵育后的细胞，并将所述细胞与检测物质接触孵育，所述检测物质能与所述标记物反应产生检测信号；
9.(3)通过检测步骤(2)产生的信号强弱确定所述样品中和新型冠状病毒的能力。
10.在一些实施方案中，所述新型冠状病毒s蛋白ecd包括与seq id no：1或4所示氨基酸序列至少80％一致性的序列。在另一些实施方案中，所述新型冠状病毒s蛋白ecd包括与seq id no：1或4所示氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或者100％一致性的序列。在另一些实施方案中，所述新型冠状病毒s蛋白ecd包括与seq id no：1或4所示氨基酸序列至少90％一致性的序列。在一些实施方案中，所述新型冠状病毒s蛋白ecd包括与seq id no：1或4所示氨基酸序列至少95％一致性的序列。在另一些实施方案中，所述新型冠状病毒s蛋白ecd包括与seq id no：1或4所示氨基酸序列至少96％一致性的序列。在一些实施方案中，所述新型冠状病毒s蛋白ecd包括与seq id no：1或4所示氨基酸序列至少97％一致性的序列。在另一些实施方案中，所述新型冠状病毒s蛋白ecd包括与seq id no：1或4所示氨基酸序列至少98％一致性的序列。在一些实施方案中，所述新型冠状病毒s蛋白ecd包括与seq id no：1或4所示氨基酸序列至少99％一致性的序列。在一些实施方案中，所述新型冠状病毒s蛋白ecd包括seq id no：1或4所示的氨基酸序列。在一个具体实施方案中，所述新型冠状病毒s蛋白ecd的氨基酸序列如seq id no:1或4所示。
11.在一些实施方案中，所述步骤(1)中加入的标记物连接的新型冠状病毒s蛋白ecd浓度为0.8-3.2μg/ml，优选为1.2-2.0μg/ml。在另一些实施方案中，所述新型冠状病毒s蛋白ecd浓度为0.8μg/ml、0.9μg/ml、1.0μg/ml、1.1μg/ml、1.2μg/ml、1.3μg/ml、1.4μg/ml、1.5μg/ml、1.6μg/ml、1.7μg/ml、1.8μg/ml、1.9μg/ml、2.0μg/ml、2.1μg/ml、2.2μg/ml、2.3μg/ml、2.4μg/ml、2.5μg/ml、2.6μg/ml、2.7μg/ml、2.8μg/ml、2.9μg/ml、3.0μg/ml、3.1μg/ml或3.2μg/ml。在一些优选实施方案中，所述新型冠状病毒s蛋白ecd浓度为1.2μg/ml、1.3μg/ml、1.4μg/ml、1.5μg/ml、1.6μg/ml、1.7μg/ml、1.8μg/ml、1.9μg/ml或2.0μg/ml。在一个具体实施方案中，所述步骤(1)中加入的新型冠状病毒s蛋白ecd浓度为1.6μg/ml。
12.在一些实施方案中，所述步骤(1)中的标记物选自his标签、flag标签、c-myc标签、ha标签、v5标签、hsv标签和生物素中的一种或多种，优选为his标签。在一些具体的实施方案中，所述步骤(1)中的标记物为his标签和flag标签。
13.在一些实施方案中，所述步骤(1)中ace2过表达的细胞系选自hek293、hela、vero e6或cho，优选为ace2过表达的hela细胞系。在一些具体的实施方案中，所述步骤(1)中ace2过表达的细胞系为ace2过表达的hela细胞系。
14.在一些实施方案中，加入的所述ace2过表达的细胞系的细胞浓度为4
ⅹ
10
5-1
ⅹ
106个细胞/ml，优选为5
ⅹ
105个细胞/ml。在另一些实施方案中，加入的所述ace2过表达的细胞系的细胞浓度为4
ⅹ
105、5
ⅹ
105、6
ⅹ
105、7
ⅹ
105、8
ⅹ
105、9
ⅹ
105或1
ⅹ
106个细胞/ml。在一个具体的实施方案中，加入的所述ace2过表达的细胞系的细胞浓度为5
ⅹ
105个细胞/ml。
15.在一些实施方案中，所述步骤(1)中接触孵育包括在18℃-37℃下孵育0.5-3小时，优选为室温下孵育1-2小时。在一些具体的实施方案中，所述步骤(1)中接触孵育包括在室温下孵育1-2小时。
16.在一些实施方案中，所述步骤(2)中获得步骤(1)孵育后的细胞包括移除孵育后细胞上清和洗涤细胞步骤。所述孵育后细胞上清和洗涤细胞步骤包括移除步骤(1)接触孵育后的细胞上清液，加入实验室缓冲液洗涤，移除实验室缓冲液。其中，所述实验室缓冲液为含1％fbs的pbs溶液。
17.在一些实施方案中，所述步骤(2)中检测物质选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或吖啶化合物连接的抗标记物抗体。在另一些实施方案中，所述步骤(2)中检测物质选自辣根过氧化物酶连接的链霉亲和素(识别生物素)。本发明中抗标记物抗体选自抗标签蛋白抗体，如抗his标签抗体、抗flag标签抗体、抗c-myc标签抗体、抗ha标签抗体、抗v5标签抗体或抗hsv标签抗体。
18.在一些实施方案中，所述标记物包含his标签，所述检测物质包含辣根过氧化物酶连接的抗his标签抗体。
19.在一些实施方案中，所述步骤(2)中接触孵育包括在18℃-37℃下孵育0.5-1.5小时，优选为室温下孵育1小时。在一些具体实施方案中，所述步骤(2)中接触孵育包括在室温下孵育1小时。
20.在一些实施方案中，所述步骤(3)检测信号步骤包括移除步骤(2)孵育后细胞的上清，洗涤细胞，加入显色工作液孵育，再加入显色终止液，读取信号值。
21.在一些实施方案中，所述显色工作液包括tmb过氧化物酶底物和过氧化物酶底物溶液b，所述显色终止液包括磷酸溶液。
22.在一些实施方案中，所述样品为抗新型冠状病毒抗体类药物。在一些具体实施方案中，所述样品为抗新型冠状病毒的融合蛋白或抗新型冠状病毒的抗体。在一个具体实施方案中，所述样品为ace2-fc融合蛋白。在另一个具体实施方案中，所述样品为抗新型冠状病毒单克隆抗体、抗体片段或双特异性抗体。参考国家药品监督管理局药品审评中心发布的《新型冠状病毒中和抗体类药物技术资料要求(药学)(征求意见稿)》，本发明所述新冠抗体类药物包括但不限单克隆抗体、抗体片段、fc融合蛋白、双特异性抗体等，如ace2-fc融合蛋白。本发明的样品可以来源于生物学方法制备的抗新型冠状病毒的抗体或融合蛋白，也可以是新型冠状病毒免疫的受试者、动物(如小鼠、兔等)获得的血清、血浆或全血。
23.本发明的一些具体实施方案中，所述步骤(1)包括将0.8-3.2μg/ml含有标记物的新型冠状病毒s蛋白ecd、样品与浓度为4
ⅹ
10
5-1
ⅹ
106个细胞/ml的ace2过表达的细胞，在18℃-37℃下接触培养0.5-3小时。
24.在本发明的一些具体实施方案中，所述步骤(2)包括移除步骤(1)中的细胞孵育物上清液，洗涤细胞，并将所述细胞与偶联了辣根过氧化物酶的抗标记物抗体在18℃-37℃下孵育0.5-1.5小时。
25.在本发明的一些具体实施方案中，所述步骤(3)包括移除步骤(2)孵育后细胞的上清，洗涤细胞，加入tmb过氧化物酶底物和过氧化物酶底物溶液b孵育后，再加入磷酸溶液，读取信号值。
26.本发明中所述步骤(1)中可以先将标记物连接的新型冠状病毒s蛋白ecd和样品混合物与ace2过表达的细胞进行孵育，或者先加入样品与ace2过表达的细胞孵育，再加入标记物连接的新型冠状病毒s蛋白ecd进行孵育。
27.在本发明的一些具体实施方案中，所述方法包括：步骤(1):将0.8-3.2μg/ml含有标记物的新型冠状病毒s蛋白ecd、样品与浓度为4
ⅹ
10
5-1
ⅹ
106个细胞/ml的ace2过表达的细胞，在18℃-37℃下接触培养0.5-3小时；步骤(2):移除步骤(1)中的细胞孵育物上清液，洗涤细胞，并将所述细胞与偶联了辣根过氧化物酶的抗标记物抗体在18℃-37℃下孵育0.5-1.5小时；和步骤(3):移除步骤(2)孵育后细胞的上清，洗涤细胞，加入显色物质，读取
信号值。
28.在本发明的另一些具体实施方案中，所述方法包括：步骤(1):将1.2-2.0μg/ml含有his标签的新型冠状病毒s蛋白ecd、样品与浓度为4
ⅹ
10
5-1
ⅹ
106个细胞/ml的ace2过表达的hela细胞，在18℃-37℃下接触培养0.5-3小时；步骤(2):移除步骤(1)中的细胞孵育物上清液，洗涤细胞，并将所述细胞与偶联了辣根过氧化物酶的抗his标记物抗体在18℃-37℃下孵育0.5-1.5小时；和步骤(3):移除步骤(2)孵育后细胞的上清，洗涤细胞，加入tmb过氧化物酶底物和过氧化物酶底物溶液b孵育后，在18℃-37℃下孵育10-30分钟，再加入磷酸溶液，读取信号值。
29.在本发明的一个具体实施方案中，所述方法包括：步骤(1):将1.6μg/ml含有his标签的新型冠状病毒s蛋白ecd和样品混合物与浓度为5
ⅹ
105个细胞/ml的ace2过表达的hela细胞，在室温下接触培养1-2小时；步骤(2):去除步骤(1)中的细胞培养物上清液，洗涤细胞，并将所述细胞与偶联了辣根过氧化物酶的抗his标记物抗体在室温下孵育1小时；和步骤(3):移除步骤(2)孵育后细胞的上清，洗涤细胞，加入tmb过氧化物酶底物和过氧化物酶底物溶液b孵育后，室温孵育10-30分钟，再加入磷酸溶液，读取信号值。
30.另一方面，本发明还提供了一种检测样品中和新型冠状病毒能力的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括标记物连接的新型冠状病毒s蛋白ecd、ace2过表达的细胞系以及能与所述标记物反应产生信号的检测物质，其中，所述ace2过表达的细胞系为贴壁细胞。
31.在一些实施方案中，所述新型冠状病毒s蛋白ecd包括与seq id no：1或4所示氨基酸序列至少80％的序列。在另一些实施方案中，所述新型冠状病毒s蛋白ecd包括与seq id no：1或4所示氨基酸序列至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或者100％一致性的序列。在另一些实施方案中，所述新型冠状病毒s蛋白ecd包括与seq id no：1或4所示氨基酸序列至少90％一致性的序列。在一些实施方案中，所述新型冠状病毒s蛋白ecd包括与seq id no：1或4所示氨基酸序列至少95％一致性的序列。在另一些实施方案中，所述新型冠状病毒s蛋白ecd包括与seq id no：1或4所示氨基酸序列至少96％一致性的序列。在一些实施方案中，所述新型冠状病毒s蛋白ecd包括与seq id no：1或4所示氨基酸序列至少97％一致性的序列。在另一些实施方案中，所述新型冠状病毒s蛋白ecd包括与seq id no：1或4所示氨基酸序列至少98％一致性的序列。在一些实施方案中，所述新型冠状病毒s蛋白ecd包括与seq id no：1或4所示氨基酸序列至少99％一致性的序列。在另一些实施方案中，所述新型冠状病毒s蛋白ecd包括seq id no：1或4所示的氨基酸序列。在一个具体实施方案中，所述新型冠状病毒s蛋白ecd的氨基酸序列如seq id no:1或4所示。
32.在一些实施方案中，所述标记物包含his标签，所述检测物质包含辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或吖啶化合物连接的抗his标签抗体。
33.在一些实施方案中，所述ace2过表达的细胞系的细胞浓度为4
ⅹ
10
5-1
ⅹ
106个细胞/ml，优选为5
ⅹ
105个细胞/ml。
34.在一些实施方案中，所述ace2过表达的细胞系选自hek293、hela、vero e6或cho，优选为ace2过表达的hela细胞。
35.在一些实施方案中，所述固相支持物为微孔板、微孔管、磁颗粒、微珠或塑料珠。在一个具体实施方案中，所述固相支持物为微孔板。固相载体原料一般有聚苯乙烯、尼龙、硝
基纤维素、聚乙烯醇等。
36.本发明检测新型冠状病毒抗体的原理在于，将过表达ace2的细胞系铺板，加入标记物连接的新型冠状病毒s蛋白ecd和样品混合物进行孵育，或者先加入样品与细胞孵育，再加入标记物连接的新型冠状病毒s蛋白ecd孵育。在此过程中，过表达ace2的细胞中过表达的ace2蛋白会与标记物连接的新型冠状病毒s蛋白ecd结合，随后加入与所述标记物反应的检测抗体进行孵育，前述每一步孵育后均通过洗涤除去游离的反应物，最后加入可以使检测物质显色的工作液，当过表达ace2的细胞与标记物连接的新型冠状病毒s蛋白ecd的结合时，会发生显色反应；当样品(中和抗体类药物，如ace2-fc融合蛋白)与标记物连接的新型冠状病毒s蛋白ecd结合时，该结合物会被洗涤去除，显色反应会被抑制或不会发生显色反应。通过测定显色物质的信号强弱即可反映样品抑制标记物连接的新型冠状病毒s蛋白ecd与过表达ace2的细胞的结合情况。本发明中所述信号强弱具体是指光密度的高低，通过测量光密度的高低可以定性和定量所述样品中和新型冠状病毒的能力。定性判断的具体方法为：当测得的光密度高时，说明样品与标记物连接的新型冠状病毒s蛋白ecd的结合能力差，即样品中和新型冠状病毒的能力弱；当测得的光密度低时，说明样品与新型冠状病毒s蛋白ecd的结合能力强，即样品中和新型冠状病毒的能力强；定量判断的具体方法为：使用分析软件，基于信号值和浓度的对数值，拟合量效曲线，拟合参数为四参数拟合(4p-fit)，得到每条曲线的半数有效浓度(ec50)，下渐近线(bottom)，上渐近线(top)，斜率(hillslope)，窗口(span)，logec50等参数；
37.y＝bottom (top-bottom)/(1 10^((logec50-x)
×
hillslope))
38.根据对照品和样品的拟合曲线记录各参数值，计算样品的相对活性：
39.相对活性(％)＝(对照品ec
50
值/样品ec
50
值)
×
100％
40.其他计算公式分别如下：
41.相对活性均值计算公式：
[0042][0043]
标准偏差(sd)计算方法：
[0044][0045]
变异系数(cv)或相对标准偏差(rsd)的计算方法：
[0046]
cv(％)＝(标准偏差/平均值)
×
100％
[0047]
本发明提供的一种检测样品中和新型冠状病毒能力的方法，特别地，该方法使用新冠病毒s蛋白的膜外区域(ecd)取代新冠病毒/假病毒/rbd，最大限度地还原生理条件下新冠病毒与宿主细胞膜表面受体的结合，同时避免了病毒的使用，大大增加了实验的安全性，减少实验复杂度和周期；其次，该方法使用过表达人ace2的hela细胞系代替人ace2蛋白包板进行cell-based elisa实验，对生理条件下ace2受体的构象还原度更高，因此检测得到的中和抗体相对活性更能准确反映抗体中和新冠病毒结合受体的生物学活性；除此之外，本发明的检测方法可以通过cell-based elisa实验严格控制检测方法实施过程中的各种变量，包括相关蛋白的浓度和活性，hela/ace2细胞系的铺板密度等，对结果进行定量分
析，保证了抗体中和能力评估结果的稳定性。
[0048]
本发明提供的检测样品中和新型冠状病毒能力的方法，具有如下所述的有益技术效果：
[0049]
1.使用新型冠状病毒s蛋白的膜外全长(新型冠状病毒s蛋白ecd)来代替受体结合域rbd，与使用rbd的技术相比更接近病毒侵染细胞的真实生理状态，更能准确反映药物阻断病毒与宿主细胞受体结合的生理过程。
[0050]
2.使用新型冠状病毒s蛋白的膜外全长(新型冠状病毒s蛋白ecd)代替新型冠状病毒/假病毒，与现有的病毒/假病毒中和实验相比实验周期短，操作简单，且在普通实验室中即可进行，无需p2/p3实验室。
[0051]
3.使用稳定过表达ace2受体的hela细胞系，受体表达量高，且比现有技术使用ace2蛋白铺板更能反映受体的天然构象，因此对药物阻断病毒与受体结合的生理过程的模拟更
[0052]
4.基于稳定的cell-based elisa方法，实验重复性强，能够准确反映中和抗体类药物的生物学活性，能够用于药物生产过程中的放行检测。
[0053]
名词解释：
[0054]
术语“新型冠状病毒”(sars-cov-2)，亦称为2019-ncov，是指2019年12月最先报告的引起不明原因肺炎的致病微生物，其属于β属冠状病毒，有包膜，病毒颗粒呈圆形或椭圆形，直径为60-140nm。其基因组与非典(sars-cov-1)的基因组相似度仅为80％，而与从中菊头蝠(rhinolophus affinis)分离得到的冠状病毒(bat coronavirus ratg13)基因序列相似度高达96％。
[0055]
术语“新型冠状病毒s蛋白ecd”是指新型冠状病毒颗粒表面的刺突蛋白(spike protein)的膜外结构域(ectodomain,ecd)。本发明中所述新型冠状病毒s蛋白ecd包括新型冠状病毒的受体结合区域(receptor binding domain,rbd)，rbd结构域是与人ace2(血管紧张素转化酶2)受体的相互作用位点，在病毒的侵染过程中发挥着重要作用。在一些具体实施方案中，所述新型冠状病毒s蛋白ecd包含seq id no:4所示的氨基酸序列。
[0056]
本发明中“ace2”或“ace2蛋白”可以体现为重组ace2蛋白，可以体现为可溶性ace2蛋白，可以体现为fc标签ace2蛋白。本发明中ace2过表达的细胞系是指通过本领域常规的重组表达的方法生产进行细胞表面的ace2蛋白的表达。在一些实施方案中，所述ace2包含seq id no:2或3所示的氨基酸序列。
[0057]
术语“中和”是指样品与sars-cov-2病毒的s蛋白结合阻止其与细胞膜黏附，融合和进入细胞的过程。本文所用的术语“中和抗体”指通过与病毒分子结合防止细胞被某种抗原或感染源侵害的抗体，其原理是通过抑制乃至中和它们的某种生化作用。
[0058]
关于“百分比(％)一致性”定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分，候选序列中与特定肽或多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。可以本领域技术范围内的多种方式进行序列对比以测定百分比氨基酸序列同一性，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如blast、blast-2、align或megalign(dnastar)软件。本领域技术人员可决定测量对比的适宜参数，包括对所比较的序列全长获得最大对比所需的任何算法。
[0059]
术语“ec50”亦称为半最大效应浓度，是指能引起50％最大效应的浓度。
[0060]
术语“ic50”亦称为半最大抑制浓度，是指能引起50％最大抑制效果的浓度。
附图说明
[0061]
图1为新型冠状病毒中和抗体类药物中和活性elisa检测原理示意图。(a)his-ecd蛋白与hela/ace2细胞结合活性示意图。(b)加入ace2-fc融合蛋白(指代中和抗体类药物)后，中和效果elisa检测原理示意图；
[0062]
图2为rbd/ecd与hela/ace2细胞结合的量效曲线；
[0063]
图3为ace2-fc融合蛋白中和ecd与hela/ace2细胞结合量效曲线，图3a为第一次实验，图3b为第二次实验；图3c为第三次实验。
具体实施方式
[0064]
elisa是以免疫学反应为基础，将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的试验技术。由于抗原、抗体的反应在一种固相载体
──
聚苯乙烯微量滴定板的孔中进行，每加入一种试剂孵育后，可通过洗涤除去多余的游离反应物，从而保证试验结果的特异性与稳定性。在本项目中，通过接种过表达ace2的hela细胞，加入梯度稀释的中和抗体类药物(如ace2-fc融合蛋白)与固定浓度的新型冠状病毒ecd蛋白混合溶液，最后通过检测试剂来评价上述药物(如ace2-fc融合蛋白)中和新型冠状病毒ecd蛋白与靶细胞的结合能力。
[0065]
根据前期预实验结果初步确定的实验参数调整新型冠状病毒ecd蛋白的浓度，进行实验参数优化。根据初步确定的实验参数，由不同实验人员进行重复实验，初步确认实验参数，以建立新型冠状病毒抗体类药物中和活性的评价方法。实验原理如图1所示，将过表达ace2的hela细胞系铺板，依次加入his-ecd蛋白和样品混合物、偶联辣根过氧化物酶(hrp)的anti-his检测抗体以及反应底物，每一步孵育后均通过洗涤除去游离的反应物，则最终通过催化产生有色底物所测得的光密度值即可反映ecd蛋白与ace2受体的结合情况。若控制ecd蛋白的浓度，即可准确测定中和抗体类药物(ace2-fc融合蛋白)中和ecd蛋白与ace2受体相互作用的活性，达到定量衡量中和抗体中和活性的目的。
[0066]
实施例1.ace2单过表达hela细胞系构建
[0067]
人ace2蛋白的dna序列进行基因合成后，同时利用相同限制性内切酶酶切质粒载体plvx-puro(clontech，cat.no.632164)，酶切后获得的ace2-flag蛋白orf dna片段(编码的氨基酸序列如seq id no:2所示)和带有粘性末端的质粒载体片段，使用genscript的cloneez
tm
pcr克隆试剂盒进行连接，转化大肠杆菌感受态细胞，获得质粒plvx-puro-ace2。
[0068]
慢病毒生产：将hek293t细胞用胰酶消化，重悬后加入10％fbs的dmem中，铺6-10
×
106hek293t/培养皿(10cm)。每个培养皿按照7-10μgpspax2,5-8μg pmd2.g-vsv-g和9-13μg plvx-puro-ace2转染，将lipofectamine 3000(thermo fisher,cat.no.l3000001)与三种质粒混合加入培养皿中。转染后6-8小时换新鲜培养液。转染后48-56小时收集病毒上清，收集后以0.45μm滤器过滤，超速离心。将病毒沉淀用500μl新鲜培养基重悬，置于-80℃保存。
[0069]
感染靶细胞：将hela细胞铺至12孔板，细胞数以第二天达到50％为宜，培养过夜。准备完全培养基和polybrene(sigma,cat.no.h9268-10g)混合物，polybrene终浓度为3-6μg/ml。移去培养基并添加0.5ml polybrene/培养基混合物于每孔中。感染前，从冰箱取出并
融化病毒，吸去细胞原有培养基，加入1/2体积新鲜培养基，再将病毒原液加入hela细胞中混匀。感染后第二天(约24小时)，吸去含病毒的培养液，换上新鲜的完全培养液，继续37℃培养。
[0070]
嘌呤霉素(puromycin)抗性筛选：细胞培养基中加入1-3μg/ml puromycin，2-3天换含puromycin的完全培养液一次，至不感染筛选对照组细胞被puromycin杀光。连续筛选至获得稳定细胞株。
[0071]
facs检测ace2-flag表达：取一部分获得的稳定细胞至facs管中，离心去掉上清。加入4％多聚甲醛室温固定20分钟。20分钟后去上清，加入bd fixation/permeabilization(bd biosciences,cat.no.554714)4℃孵育20分钟。20分钟后洗掉上清，加入pe anti-dykddddk tag antibody(biolegend,cat.no.637310)孵育30分钟。30分钟后洗去上清，重悬在facs缓冲液，上机检测ace2表达水平，筛选到ace2高表达的细胞。再对高表达ace2的细胞进行单克隆挑选(具体步骤如下)，筛选出单克隆细胞株。高表达ace2的单克隆扩大培养直至建立稳定的细胞株。
[0072]
单克隆挑选：将细胞池极限稀释至96孔板中，7天后显微镜下观察96孔板，并标记出有单克隆的孔。单克隆细胞转移至24孔板中，随后扩大至6孔板。
[0073]
实施例2.ecd与hela/ace2结合实验
[0074]
2.1试剂配制：
[0075]
样品工作液：his-rbd样品(cat.no.z03479-1)和his-ecd样品(cat.no.z03481-1)均由genscript合成。在实验开始前，使用实验缓冲液(含有1％fbs的pbs溶液，下同)将his-rbd样品和his-ecd样品分别梯度稀释至表1所示浓度以配制样品工作液，并置于4℃备用。
[0076]
表1.his-rbd样品工作液和his-ecd样品工作液分别进行梯度稀释的浓度
[0077][0078][0079]
检测抗体工作液：检测抗体使用the
tm his tag antibody[hrp],mab,mouse(genscript,cat.no.a00612)，储液浓度为0.5mg/ml，用实验缓冲液稀释500倍，以配制检测抗体工作液。
[0080]
显色工作液：将tmb过氧化物酶底物和过氧化物酶底物溶液b(kpl,cat.no.50-76-00)取出并恢复室温，按1：1的配比混合均匀以配制显色工作液。
[0081]
2.2实验步骤
[0082]
使用2ml stempro accutase(gibco,cat.no.a1105-01)消化收集实施例1制备的ace2高表达hela细胞系，重悬细胞并计算细胞数量及活率，用完全培养基稀释细胞悬液至
细胞密度为500,000cells/ml。转移100μl细胞悬液至96孔细胞培养板的相应孔中，将酶标板转移至细胞培养箱中孵育过夜贴壁(37℃，通入5％co2，培养时间12～18小时)。从细胞培养箱中取出酶标板，除尽剩余上清液。转移300μl实验缓冲液至相应孔中，混匀孔内液体后，移除洗板缓冲液，重复2～3次。转移50～100μl样品工作液至相应孔中，室温孵育1～2小时。
[0083]
取出酶标板，移除上清液并除尽剩余液体。用300μl实验缓冲液洗板3次。转移100μl检测抗体工作液至相应孔中，室温孵育约1小时。取出酶标板，移除上清液并除尽剩余液体。用300μl实验缓冲液洗板3次。转移100μl显色工作液至相应孔中，室温孵育10～30分钟。完成孵育后，转移100μl显色终止液(2m磷酸溶液，下同)至相应孔中以终止显色。
[0084]
使用酶标仪读取光密度信号值。检测波长和参比波长分别选择450nm和630nm，实验原始数据为检测波长读取信号值和参比波长信号值的差值。分析实验数据，拟合量效曲线。
[0085]
2.3实验结果
[0086]
根据上述实验步骤进行ecd与hela/ace2的结合实验，测得的病毒rbd蛋白和ecd蛋白分别与hela/ace2细胞结合的量效曲线如图2所示。结果显示，病毒rbd蛋白和ecd蛋白同hela/ace2细胞结合能力有较大差异，并同时分别得到了rbd和ecd与细胞结合的ec50，分别为0.0813μg/ml和1.632μg/ml。考虑到ecd比rbd能够更好地模拟生理状态下的新型冠状病毒s蛋白结构，因此我们选取ecd的ec50浓度用于中和实验ecd的蛋白浓度。
[0087]
实施例3.新型冠状病毒中和抗体类药物中和ecd与hela/ace2结合实验
[0088]
3.1试剂配置：
[0089]
中和样品工作液：使用实验缓冲液将his-ecd储液稀释至3.2μg/ml(1:1稀释后即实施例2中获得的ec50浓度)以配制his-ecd工作液，将ace2-fc融合蛋白(genscript,cat.no.z03484-1)样品梯度稀释至表2所示浓度以配制样品工作液，his-ecd工作液和对应浓度的ace2-fc融合蛋白样品工作液按1:1体积比混合以配制中和样品工作液。
[0090]
表2.中和样品工作液中的his-ecd的浓度和对应的ace2-fc融合蛋白的浓度梯度
[0091][0092]
检测抗体工作液：同实施例2.1的试剂配置方法；
[0093]
显色工作液：同实施例2.1的试剂配置方法。
[0094]
3.2实验步骤
[0095]
使用2ml stempro accutase(gibco,cat.no.a1105-01)消化收集实施例1制备的ace2高表达hela细胞系，重悬细胞并计算细胞数量及活率，用完全培养基稀释细胞悬液至
细胞密度为500,000cells/ml。转移100μl细胞悬液至96孔细胞培养板的相应孔中，将酶标板转移至细胞培养箱中孵育过夜贴壁(37℃，通入5％co2，培养时间12～18小时)。从细胞培养箱中取出酶标板，除尽上清液。转移300μl实验缓冲液至相应孔中，混匀孔内液体后，移除洗板缓冲液并除尽剩余液体，重复2～3次。转移100μl中和样品工作液至相应孔中，室温孵育1～2小时。
[0096]
取出酶标板，移除上清液以除尽剩余液体。用300μl实验缓冲液洗板3次。转移100μl检测中和抗体样品工作液至相应孔中，室温孵育约1小时。取出酶标板，移除上清液并除尽剩余液体。用300μl实验缓冲液洗板3次。转移100μl显色工作液至相应孔中，室温孵育10～30分钟。完成孵育后，转移100μl显色终止液至相应孔中以终止显色。
[0097]
使用酶标仪读取光密度信号值。检测波长和参比波长分别选择450nm和630nm，实验原始数据为检测波长读取信号值和参比波长信号值的差值。分析实验数据，拟合量效曲线。
[0098]
3.3实验结果
[0099]
分别由不同实验人员a和b，以ace2-fc融合蛋白为供试品，按照实施例3的操作步骤,于不同实验日期进行三次独立重复，每次重复均设置参比品(rs)和质控品(qc)，进行方法初步确认，结果如图3所示。rs和qc样品均为按照实施例3的操作步骤独立配制的ace2-fc融合蛋白，通过比较qc样品与rs样品的检测结果差异，即可衡量实验方法的准确性和稳定性。其中图3a为第一次实验，设置了人igg1蛋白作为中和实验阴性对照，第二次和第三次实验的量效曲线图见图3b和图3c，三次独立重复实验数据总结见表3，从实验结果可以看出，三次独立实验qc的相对活性都在80％～120％范围内波动，三次实验的qc样品相对活性取平均值为96％，表现出良好的系统适用性，说明该检测方法得到的检测方法准确度高；相对活性的变异系数(cv)为13.6％，小于15％，提示该方法较为稳定、应用本发明方法得到的检测结果波动较小，即实验结果的精密度高。非相关抗体人igg1未表现出中和能力，说明该方法特异性良好，能够特异性地检测抗体中和ecd与ace2结合的能力。
[0100]
表3.ace2-fc融合蛋白中和ecd与hela/ace2细胞结合量实验数据比较
[0101][0102]
seq id no:1新型冠状病毒s蛋白ecd(含标签蛋白)
[0103]
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[0104]
seq id no:2 ace2-flag序列：
[0105]
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[0106]
seq id no:3 ace2序列
[0107]
msssswlllslvavtaaqstieeqaktfldkfnheaedlfyqsslaswnyntniteenvqnmnnagdkwsaflkeqstlaqmyplqeiqnltvklqlqalqqngssvlsedkskrlntilntmstiystgkvcnpdnpqeclllepglneimansldynerlwaweswrsevgkqlrplyeeyvvlknemaranhyedygdywrgdyevngvdgydysrgqliedvehtfeeikplyehlhayvraklmnaypsyispigclpahllgdmwgrfwtnlysltvpfgqkpnidvtdamvdqawdaqrifkeaekffvsvglpnmtqgfwensmltdpgnvqkavchptawdlgkgdfrilmctkvtmddfltahhemghiqydmayaaqpfllrnganegfheavgeimslsaatpkhlksigllspdfqedneteinfllkqaltivgtlpftymlekwrwmvfkgeipkdqwmkkwwemkreivgvvepvphdetycdpaslfhvsndysfiryytrtlyqfqfqealcqaakhegplhkcdisnsteagqklfnmlrlgksepwtlalenvvgaknmnvrpllnyfeplftwlkdqnknsfvgwstdwspyadqsikvrislksalgdkayewndnemylfrssvayamrqyflkvknqmilfgeedvrvanlkprisfnffvtapknvsdiiprtevekairmsrsrindafrlndnsleflgiqptlgppnqppvsiwlivfgvvmgvivvgivilif
tgirdrkkknkarsgenpyasidiskgennpgfqntddvqtsf
[0108]
seq id no:4新型冠状病毒s蛋白ecd
[0109]
mfvflvllplvssqcvnlttrtqlppaytnsftrgvyypdkvfrssvlhstqdlflpffsnvtwfhaihvsgtngtkrfdnpvlpfndgvyfasteksniirgwifgttldsktqsllivnnatnvvikvcefqfcndpflgvyyhknnkswmesefrvyssannctfeyvsqpflmdlegkqgnfknlrefvfknidgyfkiyskhtpinlvrdlpqgfsaleplvdlpiginitrfqtllalhrsyltpgdsssgwtagaaayyvgylqprtfllkynengtitdavdcaldplsetkctlksftvekgiyqtsnfrvqptesivrfpnitnlcpfgevfnatrfasvyawnrkrisncvadysvlynsasfstfkcygvsptklndlcftnvyadsfvirgdevrqiapgqtgkiadynyklpddftgcviawnsnnldskvggnynylyrlfrksnlkpferdisteiyqagstpcngvegfncyfplqsygfqptngvgyqpyrvvvlsfellhapatvcgpkkstnlvknkcvnfnfngltgtgvltesnkkflpfqqfgrdiadttdavrdpqtleilditpcsfggvsvitpgtntsnqvavlyqdvnctevpvaihadqltptwrvystgsnvfqtragcligaehvnnsyecdipigagicasyqtqtnsprraasvasqsiiaytmslgaensvaysnnsiaiptnftisvtteilpvsmtktsvdctmyicgdstecsnlllqygsfctqlnraltgiaveqdkntqevfaqvkqiyktppikdfggfnfsqilpdpskpskrsfiedllfnkvtladagfikqygdclgdiaardlicaqkfngltvlpplltdemiaqytsallagtitsgwtfgagaalqipfamqmayrfngigvtqnvlyenqklianqfnsaigkiqdslsstasalgklqdvvnqnaqalntlvkqlssnfgaissvlndilsrldkveaevqidrlitgrlqslqtyvtqqliraaeirasanlaatkmsecvlgqskrvdfcgkgyhlmsfpqsaphgvvflhvtyvpaqeknfttapaichdgkahfpregvfvsngthwfvtqrnfyepqiittdntfvsgncdvvigivnntvydplqpeldsfkeeldkyfknhtspdvdlgdisginasvvniqkeidrlnevaknlneslidlqelgkyeqyikwp
[0110]
参考文献：
[0111]
[1]国家药品监督管理局药品审评中心，《新型冠状病毒中和抗体类药物技术资料要求(药学)(征求意见稿)》，2020年5月。
[0112]
[2]nie,jianhui,et al."establishment and validation of a pseudovirus neutralization assay for sars-cov-2."emerging microbes&infections 9.1(2020):680-686.