检测替格瑞洛及其有关物质的方法与流程

1.本发明属于化学中的分析检测领域，具体地，涉及检测替格瑞洛及其有关物质的方法。


背景技术：

2.替格瑞洛(ticagrelor，商品名：brilinta)，是由阿斯利康制药有限公司(astrazeneca ab)开发的一种选择性的二磷酸腺苷(adp)受体拮抗剂，其通过激活p2y12受体，可以可逆性地阻滞adp介导的血小板活化和聚集。
3.fda于2011年7月20日批准替格瑞洛片上市，用于急性冠脉综合征(不稳定性心绞痛、非st段抬高心肌梗死或st段抬高心肌梗死)患者，包括接受药物治疗和经皮冠状动脉介入(pci)治疗的患者，降低血栓性心血管疾病的发生率。替格瑞洛片的抗血小板作用具有可逆性，直接作用于adp受体，不经肝代谢，不受体内代谢影响，起效时间为30分钟。替格瑞洛在抢救acs患者时有着突出的优势，其具有非血小板介导的作用，能够提高血液腺苷浓度，改善心肌血供，降低心梗面积。同时，相较于氯吡格雷，替格瑞洛抗血小板作用更强、更持久，维持期血小板抑制作用更强，更适合急性冠状动脉综合征患者长期使用。因此，替格瑞洛作为血小板抑制剂，安全性和有效性都更优，具有替代氯吡格雷的潜力，所以市场潜力巨大，应用前景广阔。
4.有关物质主要是在生产过程中带入的起始原料、中间体、聚合体、副反应产物、储藏过程中的降解产物等。有关物质的研究是药品质量研究中关键性的项目之一，其含量不仅反映药品纯度的直接指标，而且有重要的安全意义。
5.目前，针对替格瑞洛中有关物质的检测方法存在平衡时间较长，灵敏度较差，检测峰形较差等缺点，尤其是无法分离检测出下面三种有关物质。因此，开发一种灵敏度高、检测限低、分离度高、稳定性好的替格瑞洛检测方法显得很有必要。
6.

技术实现要素：

7.本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，
本发明提出了检测替格瑞洛及其有关物质的方法和分离检测化学品的方法，该检测替格瑞洛的方法可以有效地分离检测出替格瑞洛样品及其有关物质，具有准确性强、分离度好、检测限低、稳定性强、操作简便、快捷、效率高等优点，适于广泛应用。
8.在本发明的第一方面，本发明提出了一种检测替格瑞洛的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将替格瑞洛样品进行高效液相色谱检测，其中，所述高效液相色谱检测使用的流动相包括甲基叔丁基醚、正己烷、四氢呋喃和三氟乙酸。
9.发明人采用高效液相色谱法检测替格瑞洛时发现，流动相的组成会显著影响替格瑞洛的分离效果，若流动相选择不当，会导致替格瑞洛与其他物质，尤其是无法使下述三种杂质彼此之间明显分离，从而无法实现准确分离检测目的，进一步更难以确定具体含量。进而，发明人经过深入研究分析及优化筛选发现，以甲基叔丁基醚、正己烷、四氢呋喃和三氟乙酸作为流动相可以有效地分离检测替格瑞洛及其相关物质，分离度高，进一步地，可避免出现因峰形不好导致无法计算峰面积、分离度低或者出峰重叠在一起而导致无法有效分离等问题。进一步地，根据所得到的液相色谱图可以计算不同杂质的含量。由此，根据本发明实施例的方法检测结果准确性强、灵敏度高、稳定性强，并且，操作简便、快捷，效率高，适于规模化应用。
[0010][0011]
式(i)物质以下也称杂质一，式(ii)物质以下也称杂质二，式(iii)物质以下也称杂质三。
[0012]
根据本发明的实施例，所述方法还可以具有如下附加的技术特征至少之一：
[0013]
根据本发明的实施例，所述方法包括分离检测替格瑞洛样品中的有关物质，所述有关物质包括具有如下结构式的物质：
[0014][0015]
根据本发明的实施例，所述方法还包括用自身对照法测定式(i)、式(ii)、式(iii)的含量。
[0016]
根据本发明的实施例，所述甲基叔丁基醚、正己烷、四氢呋喃和三氟乙酸的体积比为(50～80):(10～35):(5～30):(0.05～0.3)，优选为(50～80):(15～35):(5～15):(0.05～0.3)。
[0017]
根据本发明的实施例，所述高效液相色谱检测中采用的色谱柱为多糖衍生物手性柱，优选为多糖衍生物耐溶剂型手性柱，更优选为chiralpak ic。
[0018]
根据本发明的实施例，所述色谱柱的尺寸为250mm
×
4.6mm，5μm。
[0019]
根据本发明的实施例，所述高效液相色谱检测中采用的检测波长为260nm～296nm，优选为275nm～296nm。
[0020]
根据本发明的实施例，所述高效液相色谱检测中采用的柱温为20℃～40℃。
[0021]
根据本发明的实施例，所述高效液相色谱检测中采用的流动相流速为0.8ml/min～1.2ml/min。
[0022]
根据本发明的实施例，进行所述高效液相色谱检测之前，对所述替格瑞洛样品进行稀释处理，稀释处理采用的稀释剂包括正己烷和乙醇。
[0023]
根据本发明的实施例，所述正己烷和乙醇的体积比为(70～85):(15～30)，优选为(75～85):(15～25)。
[0024]
根据本发明的实施例，所述高效液相色谱检测所得色谱图中，替格瑞洛、式(i)物质、式(ii)物质、式(iii)物质对应的色谱峰相邻峰之间的分离度均大于2。
[0025]
在本发明的第二方面，本发明提出了一种多糖衍生物耐溶剂型手性柱在替格瑞洛和/或有关物质的检测中的用途。利用该手性柱可以有效地分离上述替格瑞洛及三种杂质，避免出现因峰形不好导致无法计算峰面积、分离度低或者出峰重叠在一起而导致无法有效分离等问题，提高了检测结果的准确性、灵敏度和稳定性。
[0026]
根据本发明的实施例，所述有关物质包括具有如下结构式的物质：
[0027][0028]
根据本发明的实施例，所述多糖衍生物耐溶剂型手性柱为chiralpak ic。
[0029]
根据本发明的实施例，采用高效液相色谱进行所述检测，高效液相色谱检测使用的流动相包括甲基叔丁基醚、正己烷、四氢呋喃和三氟乙酸。
[0030]
根据本发明的实施例，所述流动相中甲基叔丁基醚、正己烷、四氢呋喃和三氟乙酸的体积比为(50～80):(10～35):(5～30):(0.05～0.3)，优选为(50～80):(15～35):(5～15):(0.05～0.3)
[0031]
根据本发明的实施例，所述高效液相色谱检测中采用的检测波长为260nm～296nm，优选为275nm～296nm。
[0032]
根据本发明的实施例，所述高效液相色谱检测中采用的柱温为20℃～40℃。
[0033]
根据本发明的实施例，所述高效液相色谱检测中采用的流动相流速为0.8ml/min～1.2ml/min。
[0034]
根据本发明的实施例，进行所述高效液相色谱检测之前，对所述替格瑞洛样品进行稀释处理，所述稀释处理采用的稀释剂包括正己烷和乙醇，所述正己烷和乙醇的体积比为(70～85):(15～30)，优选为(75～85):(15～25)。
[0035]
根据本发明的实施例，所述高效液相色谱检测所得色谱图中，所述替格瑞洛、式(i)物质、式(ii)物质、式(iii)物质对应的色谱峰相邻峰之间的分离度均大于2。
[0036]
在本发明的第三方面，本发明提出了一种分离检测化学品的方法。根据本发明的实施例，所述化学品包括具有如下结构：与与
与
[0037]
所述方法包括：将含有所述化学品的样品进行高效液相色谱检测，其中，所述高效液相色谱检测使用的流动相包括甲基叔丁基醚、正己烷、四氢呋喃和三氟乙酸。由此，根据本发明实施例的方法可以有效地分离检测出样品中的化学品，具有准确性强、分离度好、检测限低、稳定性强、操作简便、快捷、效率高等优点，适于广泛应用。
[0038]
根据本发明的实施例，所述甲基叔丁基醚、正己烷、四氢呋喃和三氟乙酸的体积比为(50～80):(10～35):(5～30):(0.05～0.3)，优选为(50～80):(15～35):(5～15):(0.05～0.3)。
[0039]
根据本发明的实施例，所述高效液相色谱检测中采用的色谱柱为多糖衍生物手性柱，优选为多糖衍生物耐溶剂型手性柱，更优选为chiralpak ic。
[0040]
根据本发明的实施例，所述高效液相色谱检测中采用的检测波长为260nm～296nm，优选为275nm～296nm。
[0041]
根据本发明的实施例，所述高效液相色谱检测中采用的柱温为20℃～40℃。
[0042]
根据本发明的实施例，所述高效液相色谱检测中采用的流动相流速为0.8ml/min～1.2ml/min。
[0043]
根据本发明的实施例，进行所述高效液相色谱检测之前，对所述替格瑞洛样品进行稀释处理，所述稀释处理采用的稀释剂包括正己烷和乙醇，所述正己烷和乙醇的体积比为(70～85):(15～30)，优选为(75～85):(15～25)。
[0044]
根据本发明的实施例，所述高效液相色谱检测所得色谱图中，式(i)物质、式(ii)物质、式(iii)物质对应的色谱峰相邻峰之间的分离度均大于2。
[0045]
在本发明的第四方面，本发明提出了一种替格瑞洛质量控制方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将替格瑞洛样品进行高效液相色谱检测，确定替格瑞洛以及具有如下结构的有关物质含量：
[0046][0047]
当所述替格瑞洛不小于替格瑞洛含量阈值且所述有关物质不大于有关物质含量阈值时，则判定所述替格瑞洛样品符合要求。由此，采用根据本发明实施例的方法可以准确判断出替格瑞洛样品是否符合要求，从而有效地把控质量。
[0048]
根据本发明的实施例，所述高效液相色谱检测使用的流动相包括甲基叔丁基醚、正己烷、四氢呋喃和三氟乙酸。
[0049]
根据本发明的实施例，，所述流动相中甲基叔丁基醚、正己烷、四氢呋喃和三氟乙酸的体积比为(50～80):(10～35):(5～30):(0.05～0.3)，优选为(50～80):(15～35):(5～15):(0.05～0.3)。
[0050]
根据本发明的实施例，，所述高效液相色谱检测中采用的色谱柱为多糖衍生物手性柱，优选为多糖衍生物耐溶剂型手性柱，更优选为chiralpak ic。
[0051]
根据本发明的实施例，，所述高效液相色谱检测中采用的检测波长为260nm～296nm，优选为275nm～296nm。
[0052]
根据本发明的实施例，，所述高效液相色谱检测中采用的柱温为20℃～40℃。
[0053]
根据本发明的实施例，，所述高效液相色谱检测中采用的流动相流速为
[0054]
0.8ml/min～1.2ml/min。
[0055]
根据本发明的实施例，进行所述高效液相色谱检测之前，对所述替格瑞洛样品进行稀释处理，所述稀释处理采用的稀释剂包括正己烷和乙醇，优选地，所述正己烷和乙醇的体积比为(70～85):(15～30)，更优选为(75～85):(15～25)。
[0056]
根据本发明的实施例，所述高效液相色谱检测所得色谱图中，所述替格瑞洛、式(i)物质、式(ii)物质、式(iii)物质对应的色谱峰相邻峰之间的分离度均大于2。
[0057]
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
[0058]
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
[0059]
图1为根据本发明实施例的实施例1中试验溶液的高效液相色谱图；
[0060]
图2为根据本发明实施例的实施例2中试验溶液的高效液相色谱图；
[0061]
图3为根据本发明实施例的实施例3中试验溶液的高效液相色谱图；
[0062]
图4为根据本发明实施例的对比例1中试验溶液的高效液相色谱图；
[0063]
图5为根据本发明实施例的对比例2中试验溶液的高效液相色谱图。
具体实施方式
[0064]
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0065]
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
[0066]
检测替格瑞洛的方法
[0067]
在本发明的第一方面，本发明提出了一种检测替格瑞洛的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将替格瑞洛样品进行高效液相色谱检测，其中，所述高效液相色谱检测使用的流动相包括甲基叔丁基醚、正己烷、四氢呋喃和三氟乙酸。
[0068]
发明人经过深入研究分析及优化筛选发现，以甲基叔丁基醚、正己烷、四氢呋喃和三氟乙酸作为流动相可以有效地分离检测替格瑞洛，分离度高，可避免出现因峰形不好导致无法计算峰面积、分离度低或者出峰重叠在一起而导致无法有效分离等问题。进一步地，根据所得到的液相色谱图及标准品的色谱图可以计算不同杂质的含量。由此，根据本发明实施例的方法检测结果准确性强、灵敏度高、稳定性强，并且，操作简便、快捷，效率高，适于规模化应用。
[0069]
根据本发明的实施例，该方法包括分离检测替格瑞洛样品中的有关物质，有关物质包括具有如下结构式的物质：
[0070][0071]
发明人发现以甲基叔丁基醚、正己烷、四氢呋喃和三氟乙酸作为流动相可以实现上述三种杂质及替格瑞洛之间各自分离，分离度高，可避免出现因峰形不好导致无法计算峰面积、分离度低或者出峰重叠在一起而导致无法有效分离等问题。进一步地，根据所得到的液相色谱图及标准品的色谱图可以计算不同杂质的含量。
[0072]
需要说明的是，替格瑞洛样品中可能存在上述三种结构的有关物质，也可能不存在上述三种结构的有关物质，当替格瑞洛样品中存在上述三种结构的有关物质时，使用本发明方法可以对替格瑞洛及该三种有关物质进行分离及含量测定，当替格瑞洛样品中不存
在上述三种结构的有关物质时，使用本发明方法可以对替格瑞洛样品的这三种有关物质同时进行监测。
[0073]
根据本发明的实施例，流动相中所述甲基叔丁基醚、正己烷、四氢呋喃和三氟乙酸的体积比为(50～80):(10～35):(5～30):(0.05～0.3)，优选为(50～80):(15～35):(5～15):(0.05～0.3)。根据本发明实施例的方法，流动相配比合理，可以显著提高对特定杂质的分离度，且各组分分离完全，峰形好，测定各组分响应值均在适当的范围，溶剂没有危害。
[0074]
根据本发明的实施例，高效液相色谱检测中采用的色谱柱为多糖衍生物手性柱，优选为多糖衍生物耐溶剂型手性柱，更优选为chiralpak ic。由此，可以有效地分离上述替格瑞洛及三种杂质，避免出现因峰形不好导致无法计算峰面积、分离度低或者出峰重叠在一起而导致无法有效分离等问题，提高了检测结果的准确性、灵敏度和稳定性。根据本发明的优选实施例，色谱柱的尺寸为250mm
×
4.6mm，5μm。
[0075]
根据本发明的实施例，高效液相色谱检测中采用的检测波长为260nm～296nm。由此，采用所述波长可以有效降低上述杂质的检测限，提高检测灵敏度。
[0076]
根据本发明的实施例，高效液相色谱检测中采用的检测波长为275nm～296nm。
[0077]
根据本发明的实施例，高效液相色谱检测中采用的柱温为20℃～40℃。由此，可以提高各组分的分离度。
[0078]
根据本发明的实施例，高效液相色谱检测中采用的流动相流速为0.8ml/min～1.2ml/min。由此，可以实现同时检测替格瑞洛及上述三种杂质，并且分离度高，色谱图峰形好。
[0079]
根据本发明的实施例，进行高效液相色谱检测之前，对替格瑞洛样品进行稀释处理，所述稀释处理采用的稀释剂包括正己烷和乙醇。发明人发现，稀释剂的组成会影响替格瑞洛及上述三种杂质的分离效果，进而，发明人经过深入研究发现，以正己烷和乙醇作为稀释剂，在色谱检测时可以有效地改善峰形，实现替格瑞洛及上述三种杂质的分离检测。
[0080]
根据本发明的实施例，正己烷和乙醇的体积比为(70～85):(15～30)，优选为(75～85):(15～25)。由此，可以进一步有效地分离替格瑞洛及上述三种杂质，避免出现因峰形不好导致无法计算峰面积、分离度低或者出峰重叠在一起而导致无法有效分离等问题，提高检测结果的准确性、灵敏度和稳定性。
[0081]
根据本发明的实施例，高效液相色谱检测所得色谱图中，替格瑞洛、式(i)物质、式(ii)物质、式(iii)物质对应的色谱峰相邻峰之间的分离度均大于2
[0082]
用途
[0083]
在本发明的第二方面，本发明提出了一种多糖衍生物耐溶剂型手性柱在替格瑞洛和/或有关物质的检测中的用途。利用该手性柱可以有效地分离上述替格瑞洛及三种杂质，避免出现因峰形不好导致无法计算峰面积、分离度低或者出峰重叠在一起而导致无法有效分离等问题，提高了检测结果的准确性、灵敏度和稳定性。
[0084]
根据本发明的实施例，多糖衍生物耐溶剂型手性柱为chiralpak ic。由此，以便进一步有效地分离上述替格瑞洛及三种杂质，提高检测效果。
[0085]
根据本发明的实施例，采用高效液相色谱进行所述检测，高效液相色谱检测使用的流动相包括甲基叔丁基醚、正己烷、四氢呋喃和三氟乙酸。发明人经过深入研究分析及优化筛选发现，以甲基叔丁基醚、正己烷、四氢呋喃和三氟乙酸作为流动相可以有效地分离检
测替格瑞洛，分离度高，可避免出现因峰形不好导致无法计算峰面积、分离度低或者出峰重叠在一起而导致无法有效分离等问题。
[0086]
需要说明的是，前面针对检测替格瑞洛的方法中所描述的流动相组成、检测波长、柱温、流动相流速、稀释剂所描述的特征和优点，同样适用于该多糖衍生物耐溶剂型手性柱在替格瑞洛和/或有关物质的检测中的用途，在此不再赘述。
[0087]
分离检测化学品的方法
[0088]
在本发明的第三方面，本发明提出了一种分离检测化学品的方法。根据本发明的实施例，所述化学品包括具有如下结构：与与与与
[0089]
所述方法包括：将含有所述化学品的样品进行高效液相色谱检测，其中，所述高效液相色谱检测使用的流动相包括甲基叔丁基醚、正己烷、四氢呋喃和三氟乙酸。由此，根据本发明实施例的方法可以有效地分离检测出样品中的化学品，具有准确性强、分离度好、检测限低、稳定性强、操作简便、快捷、效率高等优点，适于广泛应用。
[0090]
需要说明的是，前面针对检测替格瑞洛的方法中所描述的流动相组成、检测波长、柱温、流动相流速、稀释剂所描述的特征和优点，同样适用于该分离检测化学品的方法，在此不再赘述。
[0091]
替格瑞洛质量控制方法
[0092]
在本发明的第四方面，本发明提出了一种替格瑞洛质量控制方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：
[0093]
将替格瑞洛样品进行高效液相色谱检测，确定替格瑞洛以及具有如下结构的有关
物质含量：
[0094][0095]
当所述替格瑞洛不小于替格瑞洛含量阈值且所述有关物质不大于有关物质含量阈值时，则判定所述替格瑞洛样品符合要求。由此，采用根据本发明实施例的方法可以准确判断出替格瑞洛样品是否符合要求，从而有效地把控质量。
[0096]
需要说明的是，本发明对于替格瑞洛含量阈值和有关物质含量阈值的具体值不做严格限定，可以根据实际需要灵活选择。例如，替格瑞洛含量阈值为90％、95％、99％、99.99％等，各有关物质含量阈值为5％、1％、0.1％、0.01％等。
[0097]
还需要说明的是，前面针对检测替格瑞洛的方法中所描述的流动相组成、检测波长、柱温、流动相流速、稀释剂所描述的特征和优点，同样适用于该一种替格瑞洛质量控制方法，在此不再赘述。
[0098]
下面参考具体实施例，对本发明进行描述，需要说明的是，这些实施例仅仅是描述性的，而不以任何方式限制本发明。其中，色谱柱chiralpak ad-h为大赛璐多糖衍生物正相手性柱(涂敷型)；色谱柱chiralpak ic为大赛璐多糖衍生物耐溶剂型手性色谱柱(键合型)。
[0099]
实施例1
[0100]
色谱条件：
[0101]
色谱柱：chiralpak ic(250mm
×
4.6mm，5μm)
[0102]
检测器：uv检测器
[0103]
检测波长：282nm
[0104]
流动相：甲基叔丁基醚-正己烷-四氢呋喃-三氟乙酸按体积比为65:25:10:0.2混合
[0105]
柱温：35℃
[0106]
流速：1.0ml/min
[0107]
进样量：50μl
[0108]
空白溶液：由正己烷、乙醇按体积比约为80:20组成的混合溶剂，即稀释溶剂。
[0109]
杂质一对照品溶液储备液：称取杂质一10mg到50ml量瓶，用乙醇溶解稀释制成含杂质一0.2mg/ml的溶液储备液。
[0110]
杂质二对照品溶液储备液：称取杂质二10mg到50ml量瓶，用乙醇溶解稀释制成含杂质二0.2mg/ml的溶液储备液。
[0111]
杂质三对照品溶液储备液：称取杂质三10mg到50ml量瓶，用乙醇溶解稀释制成含杂质三0.2mg/ml的溶液储备液。
[0112]
试验溶液：称取替格瑞洛原料20mg至20ml量瓶，加入4ml乙醇使之溶解，然后加入杂质一对照品溶液储备液0.1ml、杂质二对照品溶液储备液0.1ml、杂质三对照品溶液储备液0.1ml，再用正己烷定容，得到试验溶液。
[0113]
替格瑞洛样品溶液：称取替格瑞洛样品20mg到20ml量瓶，用4ml乙醇溶解，用正己烷稀释至刻度，制成含替格瑞洛样品1mg/ml的溶液。
[0114]
分别取杂质一对照品溶液储备液、杂质二对照品溶液储备液、杂质三对照品溶液储备液、试验溶液、替格瑞洛样品溶液各50μl，依次注入液相色谱仪。
[0115]
试验结论：试验溶液的高效液相色谱图如图1所示，试验溶液中杂质一的出峰时间约为20.83min，杂质二的出峰时间约为13.47min，杂质三的出峰时间约为15.46min，替格瑞洛的出峰时间约为23.69min，杂质二、杂质三、杂质一与替格瑞洛相邻之间的分离度均大于2。
[0116]
实施例2
[0117]
色谱条件：
[0118]
色谱柱：chiralpak ic(250mm
×
4.6mm，5μm)
[0119]
检测器：uv检测器
[0120]
检测波长：296nm
[0121]
流动相：甲基叔丁基醚-正己烷-四氢呋喃-三氟乙酸按体积比为50:35:15:0.05混合
[0122]
柱温：40℃
[0123]
流速：0.8ml/min
[0124]
进样量：50μl
[0125]
空白溶液：由正己烷、乙醇按体积比约为75:25组成的混合溶剂，即稀释溶液。
[0126]
杂质一对照品溶液储备液：称取杂质一10mg到50ml量瓶，用乙醇溶解稀释制成含杂质一0.2mg/ml的溶液储备液。
[0127]
杂质二对照品溶液储备液：称取杂质二10mg到50ml量瓶，用乙醇溶解稀释制成含杂质二0.2mg/ml的溶液储备液。
[0128]
杂质三对照品溶液储备液：称取杂质三10mg到50ml量瓶，用乙醇溶解稀释制成含杂质三0.2mg/ml的溶液储备液。
[0129]
试验溶液：称取替格瑞洛原料20mg至20ml量瓶，加入5ml乙醇使之溶解，然后加入杂质一对照品溶液储备液0.1ml、杂质二对照品溶液储备液0.1ml、杂质三对照品溶液储备液0.1ml，再用正己烷定容，得到试验溶液。
[0130]
替格瑞洛样品溶液：称取替格瑞洛样品20mg到20ml量瓶，用5ml乙醇溶解，用正己烷稀释至刻度制成含替格瑞洛样品1mg/ml的溶液。
[0131]
分别取杂质一对照品溶液储备液、杂质二对照品溶液储备液、杂质三对照品溶液储备液、试验溶液、替格瑞洛样品溶液各50μl，依次注入液相色谱仪。
[0132]
试验结论：试验溶液的高效液相色谱图如图2所示，试验溶液中杂质一的出峰时间约为21.06min，杂质二的出峰时间约为13.89min，杂质三的出峰时间约为15.73min，替格瑞
洛的出峰时间约为23.71min，杂质二、杂质三、杂质一与替格瑞洛相邻之间的分离度均大于2。
[0133]
实施例3
[0134]
色谱条件：
[0135]
色谱柱：chiralpak ic(250mm
×
4.6mm，5μm)
[0136]
检测器：uv检测器
[0137]
检测波长：275nm
[0138]
流动相：甲基叔丁基醚-正己烷-四氢呋喃-三氟乙酸按体积比为80:15:5:0.3混合
[0139]
柱温：20℃
[0140]
流速：1.2ml/min
[0141]
进样量：50μl
[0142]
空白溶液：由正己烷、乙醇按体积比约为85:15组成的混合溶剂，即稀释溶液。
[0143]
杂质一对照品溶液储备液：称取替格瑞洛异构体杂质一10mg到50ml量瓶，用乙醇溶解稀释制成含杂质一0.2mg/ml的溶液储备液。
[0144]
杂质二对照品溶液储备液：称取杂质二10mg到50ml量瓶，用乙醇溶解稀释制成含杂质二0.2mg/ml的溶液储备液。
[0145]
杂质三对照品溶液储备液：称取杂质三10mg到50ml量瓶，用乙醇溶解稀释制成含杂质三0.2mg/ml的溶液储备液。
[0146]
试验溶液：称取替格瑞洛原料20mg至20ml量瓶，加入3ml乙醇使之溶解，然后加入杂质一对照品溶液储备液0.1ml、杂质二对照品溶液储备液0.1ml、杂质三对照品溶液储备液0.1ml，再用正己烷定容，得到试验溶液。
[0147]
替格瑞洛样品溶液：称取替格瑞洛样品20mg，加入3ml乙醇使之溶解，用正己烷稀释至刻度，制成含替格瑞洛样品1mg/ml的溶液。
[0148]
分别取杂质一对照品溶液储备液、杂质二对照品溶液储备液、杂质三对照品溶液储备液、试验溶液、替格瑞洛样品溶液各50μl，依次注入液相色谱仪。
[0149]
试验结论：试验溶液的高效液相色谱图如图3所示，试验溶液中杂质一的出峰时间约为20.85min，杂质二的出峰时间约为13.14min，杂质三的出峰时间约为15.31min，替格瑞洛的出峰时间约为23.82min，杂质二、杂质三、杂质一与替格瑞洛相邻之间的分离度均大于2。
[0150]
实施例4：调整流动相配比
[0151]
色谱条件：
[0152]
色谱柱：chiralpak ic(250mm
×
4.6mm，5μm)
[0153]
检测器：uv检测器
[0154]
检测波长：282nm
[0155]
流动相：甲基叔丁基醚-正己烷-四氢呋喃-三氟乙酸按体积比为60:10:30:0.2混合
[0156]
柱温：35℃
[0157]
流速：1.0ml/min
[0158]
进样量：50μl
[0159]
空白溶液：由正己烷、乙醇按体积比约为80:20组成的混合溶剂，即稀释溶剂。
[0160]
杂质一对照品溶液储备液：称取杂质一10mg到50ml量瓶，用乙醇溶解稀释制成含杂质一0.2mg/ml的溶液储备液。
[0161]
杂质二对照品溶液储备液：称取杂质二10mg到50ml量瓶，用乙醇溶解稀释制成含杂质二0.2mg/ml的溶液储备液。
[0162]
杂质三对照品溶液储备液：称取杂质三10mg到50ml量瓶，用乙醇溶解稀释制成含杂质三0.2mg/ml的溶液储备液。
[0163]
试验溶液：称取替格瑞洛原料20mg至20ml量瓶，加入4ml乙醇使之溶解，然后加入杂质一对照品溶液储备液0.1ml、杂质二对照品溶液储备液0.1ml、杂质三对照品溶液储备液0.1ml，再用正己烷定容，得到试验溶液。
[0164]
替格瑞洛样品溶液：称取替格瑞洛样品20mg到20ml量瓶，用4ml乙醇溶解，再用正己烷稀释至刻度制成含替格瑞洛样品1mg/ml的溶液。
[0165]
分别取杂质一对照品溶液储备液、杂质二对照品溶液储备液、杂质三对照品溶液储备液、试验溶液、替格瑞洛样品溶液各50μl，依次注入液相色谱仪。
[0166]
结果：替格瑞洛、杂质一、杂质二、杂质三能有效分离，然而，杂质三与杂质二分离度小于1.5。
[0167]
实施例5：调整稀释剂配比
[0168]
与实施例1相比，区别在于稀释溶剂比例变化，正己烷-乙醇的体积比为70:30
[0169]
结果：替格瑞洛、杂质一、杂质二、杂质三能有效分离，然而，杂质二与杂质三的峰形不好，无法准确计算其含量。
[0170]
实施例1～5解决了现有技术杂质一、杂质二、杂质三无法分离的问题，作为优选地，实施例1～3中，杂质二、杂质三、杂质一与替格瑞洛相邻之间的分离度均大于2。
[0171]
实施例6：调整检测波长
[0172]
溶液配制如实施例1，用正己烷、乙醇按体积比约为80:20组成的混合溶剂稀释1000倍的替格瑞洛样品溶液50μl，在255nm、275nm、296nm三个波长下进行检测，其他检测条件如实施例1。连续进样6针，记录色谱图，测定峰面积，并记录信噪比，结果见下表1，表2及表3。
[0173]
表1：255nm检测波长下进行检测的峰面积及信噪比结果
[0174]
[0175][0176]
表2：275nm检测波长下进行检测的峰面积及信噪比结果
[0177][0178]
表3：296nm检测波长下进行检测的峰面积及信噪比结果
[0179][0180]
结果显示，稀释1000倍的替格瑞洛样品溶液，信噪比进行比较，检测波长为275nm和296nm时的信噪比约是255nm检测波长的信噪比的4倍，因此，在本发明方法的检测波长范围内，信噪比高，检测效果好；通过6针峰面积rsd比较，255nm时为3.35％，275nm时为1.89％，296nm时为1.40％，因此在本发明方法的检测波长范围内的峰面积rsd小，检测精确度高。
[0181]
实施例7
[0182]
为进一步验证本发明所提供的检测方法的各方面效果，进行了如下实验：
[0183]
1、系统精密度
[0184]
取实施例1中用由正己烷、乙醇按体积比约为80:20组成的混合溶剂稀释1000倍的替格瑞洛样品溶液50μl，连续进样6针，记录色谱图，测定峰面积，结果见下表4。
[0185]
表4：出峰时间和出峰面积
[0186]
no123456均值rsd％rtmin24.36624.39324.38624.37324.41924.42624.3940.10峰面积1.6011.6161.6091.6301.6011.6011.6100.72
[0187]
计算得到替格瑞洛保留时间的rsd为0.10％，峰面积的rsd为0.72％，说明本发明检测方法系统精密度良好。
[0188]
2、线性
[0189]
称取杂质一10mg到50ml量瓶，用乙醇溶解稀释制成含杂质一0.2mg/ml的溶液。称取杂质二10mg到50ml量瓶，用乙醇溶解稀释制成含杂质二0.2mg/ml的溶液。称取杂质三10mg到50ml量瓶，用乙醇溶解稀释制成含杂质三0.2mg/ml的溶液。称取替格瑞洛对照品10mg到50ml量瓶，用乙醇溶解稀释制成含替格瑞洛对照品0.2mg/ml的溶液。取上述三种溶液各2.5ml，至25ml量瓶，用稀释剂(正己烷-乙醇(80:20))定容。得到线性储备液。
[0190]
精密量取线性储备液0.1ml、0.1ml、0.5ml、1ml、1ml、3ml、5ml分别置20ml、10ml、20ml、20ml、10ml、20ml、20ml量瓶中，用稀释剂定容至刻度，得到不同水平浓度的线性溶液。将上述线性溶液l1-l7溶液各精密量取50μl，分别注入液相色谱仪，记录各物质色谱图，以供试液的浓度对峰面积作线性曲线。结果如表5：
[0191]
表5：线性曲线结果
[0192]
成分线性范围(μg/ml)回归方程r校正因子杂质一0.0999～4.9976y＝1.4933x-0.04831.0001.0杂质二0.1005～5.0238y＝1.4402x-0.03100.99991.0替格瑞洛0.1071～5.5360y＝1.4806x-0.06210.9999/杂质三0.1062～5.3108y＝1.3655x-0.00060.99991.0
[0193]
实验结果表明，杂质一、杂质二和杂质三相对于替格瑞洛的校正因子均为1.0，校正因子在0.9～1.1范围内，因此，使用本方法检测上述三种杂质可以采用不加校正因子的主成分自身对照法进行计算。
[0194]
3、定量限
[0195]
色谱条件同实施例1
[0196]
实验步骤
[0197]
称取杂质一10mg到50ml量瓶，用乙醇溶解稀释制成含杂质一0.2mg/ml的溶液。称取杂质二10mg到50ml量瓶，用乙醇溶解稀释制成含杂质二0.2mg/ml的溶液。称取杂质三10mg到50ml量瓶，用乙醇溶解稀释制成含杂质三0.2mg/ml的溶液。称取替格瑞洛对照品10mg到50ml量瓶，用乙醇溶解稀释制成含替格瑞洛对照品0.2mg/ml的溶液。逐级降低上述溶液的浓度，注入液相色谱仪，记录色谱图，当主成分的峰高约为基线噪音峰高的10倍、3倍时，该样品的进样量为定量限和检测限。定量限及检测限结果如表6：
[0198]
表6：替格瑞洛及其杂质的定量限及检测限结果
[0199][0200]
实验结果表明，杂质一、杂质二和杂质三在本发明方法的检测下的定量限约为限度(0.1％)的十分之一，方法的灵敏度较好。
[0201]
专利文件“高效液相色谱法检测替格瑞洛中手性异构体含量的方法”(申请号：201510812061.2)的说明书【0030】段公开的线性范围均不小于0.7μg/ml，而本发明的方法的定量限均显著低于该专利中线性范围的下限。
[0202]
4、回收率
[0203]
色谱条件同实施例1
[0204]
实验步骤
[0205]
称取杂质一10mg到50ml量瓶，用乙醇溶解稀释制成含杂质一0.2mg/ml的溶液。称取杂质二10mg到50ml量瓶，用乙醇溶解稀释制成含杂质二0.2mg/ml的溶液。称取杂质三10mg到50ml量瓶，用乙醇溶解稀释制成含杂质三0.2mg/ml的溶液。取上述三种溶液各10ml，至20ml量瓶，摇匀，得回收率储备液。称取20mg替格瑞洛原料药至9个20ml量瓶，加入4ml乙醇使之溶解，再分别移取回收率储备液0.48ml、0.6ml、0.72ml置20ml量瓶，再用正己烷定容，摇匀，每个水平配制3份回收率溶液。移取0.6ml回收率储备液，至20ml量瓶，用正己烷、乙醇按体积比约为80:20组成的混合溶剂定容，摇匀，得到对照品溶液。称取替格瑞洛原料20mg至20ml量瓶，加入4ml乙醇使之溶解，再用正己烷定容，得本底溶液。精密量取本底溶液、对照品溶液、各回收率溶液50μl，依次注入液相色谱仪，记录色谱图，结果用外标法计算。结果如表7、表8及表9：
[0206]
表7：杂质一回收率试验结果
[0207][0208]
表8：杂质二回收率试验结果
[0209][0210]
表9：杂质三回收率试验结果
[0211][0212]
结果表明：杂质一的回收率在98.66％～104.58％之间，杂质二的回收率在99.86％～105.26％之间，杂质三的回收率在92.26％～102.24％之间，表明该方法的准确度良好。对比例1：调整色谱柱、检测波长、流动相试剂、稀释溶剂(申请号：201510812061.2中检测条件)
[0213]
色谱条件：
[0214]
色谱柱：chiralpak ad-h
[0215]
检测器：uv检测器
[0216]
检测波长：255nm
[0217]
流动相：正己烷-乙醇-三氟乙酸按体积比为83:17:0.7混合
[0218]
柱温：40℃
[0219]
流速：1.0ml/min
[0220]
进样量：50μl
[0221]
稀释溶剂：乙醇
[0222]
空白溶液：即稀释溶剂。
[0223]
杂质一对照品溶液储备液：称取杂质一10mg到50ml量瓶，用乙醇溶解稀释制成含杂质一0.2mg/ml的溶液储备液。
[0224]
杂质二对照品溶液储备液：称取杂质二10mg到50ml量瓶，用乙醇溶解稀释制成含杂质二0.2mg/ml的溶液储备液。
[0225]
杂质三对照品溶液储备液：称取杂质三10mg到50ml量瓶，用乙醇溶解稀释制成含杂质三0.2mg/ml的溶液储备液。
[0226]
试验溶液：称取替格瑞洛原料20mg至20ml量瓶，加入4ml乙醇使之溶解，然后加入杂质一对照品溶液储备液0.1ml、杂质二对照品溶液储备液0.1ml、杂质三对照品溶液储备液0.1ml，再用乙醇定容，得到试验溶液。
[0227]
替格瑞洛样品溶液：称取替格瑞洛样品20mg到20ml量瓶，用4ml乙醇溶解，再用乙醇稀释至刻度制成含替格瑞洛样品1mg/ml的溶液。
[0228]
分别取杂质一对照品溶液储备液、杂质二对照品溶液储备液、杂质三对照品溶液储备液、试验溶液、替格瑞洛样品溶液各20μl，依次注入液相色谱仪。
[0229]
试验结论：试验溶液的高效液相色谱图如图4所示，调整色谱柱、检测波长、流动相、稀释溶剂后，杂质二的出峰时间约为23.59min，杂质三的出峰时间约为24.44min，杂质一的出峰时间约为26.09min，杂质三与杂质二无法有效分离。
[0230]
对比例2：调整色谱柱、流动相试剂
[0231]
色谱条件：
[0232]
色谱柱：chiralpak ad-h
[0233]
检测器：uv检测器
[0234]
检测波长：282nm
[0235]
流动相：正己烷-四氢呋喃-三氟乙酸按体积比为90:10:0.2混合
[0236]
柱温：35℃
[0237]
流速：1.0ml/min
[0238]
进样量：50μl
[0239]
空白溶液：由正己烷、乙醇按体积比约为80:20组成的混合溶剂，即稀释溶剂。
[0240]
杂质一对照品溶液储备液：称取杂质一10mg到50ml量瓶，用乙醇溶解稀释制成含杂质一0.2mg/ml的溶液储备液。
[0241]
杂质二对照品溶液储备液：称取杂质二10mg到50ml量瓶，用乙醇溶解稀释制成含杂质二0.2mg/ml的溶液储备液。
[0242]
杂质三对照品溶液储备液：称取杂质三10mg到50ml量瓶，用乙醇溶解稀释制成含杂质三0.2mg/ml的溶液储备液。
[0243]
试验溶液：称取替格瑞洛原料20mg至20ml量瓶，加入4ml乙醇使之溶解，然后加入杂质一对照品溶液储备液0.1ml杂质二对照品溶液储备液0.1ml、杂质三对照品溶液储备液0.1ml，再用正己烷定容，得到试验溶液。
[0244]
替格瑞洛样品溶液：称取替格瑞洛样品20mg到20ml量瓶，用4ml乙醇溶解，再用正己烷稀释至刻度制成含替格瑞洛样品1mg/ml的溶液。
[0245]
分别取杂质一对照品溶液储备液、杂质二对照品溶液储备液、杂质三对照品溶液储备液、试验溶液、替格瑞洛样品溶液各50μl，依次注入液相色谱仪。
[0246]
试验溶液的高效液相色谱图如图5所示，调整色谱柱及流动相试剂后，杂质二的出峰时间约为23.63min、杂质三的出峰时间约为24.183min、杂质一的出峰时间约为24.87min，三种杂质彼此无法有效分离。
[0247]
对比例1～2选取了现有技术替格瑞洛检测方法中对杂质一、杂质二、杂质三分离较好的方法，但是杂质一、杂质二、杂质三仍无法分离，由此可以说明，现有技术中，替格瑞洛相关的检测方法并不能实现杂质一、杂质二、杂质三的有效分离。本发明检测方法能实现杂质一、杂质二、杂质三的有效分离，优选地，其相邻峰之间分离度大于2。
[0248]
综上所述，本发明可以实现杂质一、杂质二、杂质三的有效分离，并且具有准确性强、分离度好、检测限低、稳定性强、操作简便、快捷、效率高等优点，适于广泛应用。
[0249]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特
点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
[0250]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。