黄芩苷在治疗冠状病毒感染性疾病中的应用的制作方法

1.本发明涉及药物治疗领域，具体涉及黄芩苷在治疗冠状病毒感染性疾病 中的应用。


背景技术：

2.冠状病毒是具有外套膜的正链单股rna病毒。病毒包膜上存在棘突， 不同的冠状病毒的棘突差异明显，看似冠状，所以命名为“冠状病毒”。病 毒粒子外包着脂肪膜，膜表面有三种糖蛋白：刺突糖蛋白(s，spikeprotein， 是受体结合位点、溶细胞作用和主要抗原位点)；小包膜糖蛋白(e， envelopeprotein，较小，与包膜结合的蛋白)；膜糖蛋白(m，membraneprotein， 负责营养物质的跨膜运输、新生病毒出芽释放与病毒外包膜的形成)。少数种 类还有血凝素糖蛋白(he蛋白，haemaglutinin-esterase)。冠状病毒的核酸为 非节段单链( )rna，长27-31kd，是rna病毒中最长的rna核酸链，具有 正链rna特有的重要结构特征：即rna链5’端有甲基化“帽子”，3’端 有polya“尾巴”结构。这一结构与真核mrna非常相似，也是其基因组 rna自身可以发挥翻译模板作用的重要结构基础，而省去了rna-dna-rna 的转录过程。冠状病毒的rna和rna之间重组率非常高，病毒极易出现变 异，抗原性发生变化的结果是导致原有疫苗失效。
3.冠状病毒共有七种，其中四种会引起普通的感冒症状，分别为229e、 nl63、oc43、hku1，剩下的两种则是令人闻之丧胆的sars(非典型肺炎) 以及mers-cov(中东呼吸综合征冠状病毒)，这两种病毒曾入选为人类历史 上最可怕的病毒之一。2020年1月12日被世界卫生组织正式命名为“2019 新型冠状病毒”(2019-ncov)，是人类历史上确定的第7种可感染人的冠状病 毒(human coronavirus,hcov)。
4.此外，冠状病毒基因组序列还具有同源性，可分为4个属，α，β，γ 和δ。γ和δ冠状病毒属只感染动物，α冠状病毒属包括人冠状病毒229e 和nl63，β冠状病毒属包括4个家系，hku1和oc43属于a家系；b家 系包括sars，与重症肺炎有关；mers则属于β冠状病毒c家系。
5.人冠状病毒hcov-229e属α群正链rna病毒冠状病毒，是引起人类上 呼吸道感染的病原，常引起人的普通感冒。在临床上除引起呼吸道感染外还 会引起胃肠道疾病及神经系统症状，如肺炎等，研究表明，当hcov-229e 感染肺部时，会释放促炎细胞因子，包括il-2、il-10、tnf-α、ifn-β，引 起肺炎。
6.因此迫切需要一种预防和治疗人冠状病毒药物的出现。


技术实现要素：

7.黄芩苷是从双子叶唇形科植物黄芩(scutellaria baicalensis georgi)的干燥 根中提取分离出来的一种黄酮类化合物，为黄色针状结晶。通常在稀酸条件 下比较稳定，如在2％硫酸水溶液中不会发生水解，但酸的浓度加大，温度 升高至110℃时则可水解生成葡萄糖醛酸及黄芩苷元，即黄芩素。
8.临床研究发现，黄芩苷具有显著的生物活性，具有抑菌、利尿、抗炎、 抗变态及解
痉作用，并且具有较强的抗癌反应等生理效能，黄芩苷还能吸收 紫外线，清除氧自由基，且能抑制黑色素的生成。但目前还没有报道论述关 于黄芩苷可治疗人类冠状病毒hcov-229e。
9.为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
10.根据本发明的一个方面，提供黄芩苷在治疗冠状病毒感染性疾病中的应 用，所述冠状病毒为人冠状病毒hcov-229e，所述冠状病毒感染性疾病为人 冠状病毒hcov-229e感染引起的疾病。
11.可选地，所述人冠状病毒hcov-229e感染引起的疾病包括肺炎、肾炎和 肝炎。
12.可选地，所述人冠状病毒hcov-229e感染引起的疾病的给药方式选用雾 化吸入给药。
13.可选地，所述雾化吸入给药的单次剂量为13.6mg/60kg-54.4mg/60kg。 该给药剂量是以实施例2高、中、低三个剂量雾化吸入给药2ml，并按照小 鼠系数11和人体重60kg计算而得。
14.可选地，在所述雾化吸入给药的制剂形式为吸入溶液，其中黄芩苷的浓 度为1.25mg/ml-5mg/ml。
15.可选地，所述人冠状病毒hcov-229e感染引起的疾病通过hcov-229e 病毒感染体外培养的人胚肺成纤维细胞mrc-5或感染balb/c类小鼠模型构 建。
16.在进行黄芩苷在人冠状病毒hcov-229e感染体外培养的人胚肺成纤维 细胞mrc-5上的应用过程中，首先进行黄芩苷对体外培养mrc-5细胞的毒 性试验，确定黄芩苷的最大无毒浓度，在最大无毒浓度范围内，将黄芩苷原 药液做2倍倍比稀释成8个浓度进行试验，其中，8个浓度按从大到小的顺 序排列分别为2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.625mg/ml、0.31mg/ml、0.16mg/ml、 0.08mg/ml、0.04mg/ml、0.02mg/ml。验证黄芩苷在体外培养细胞mrc-5上 对人类冠状病毒hcov-229e的抑制作用。
17.可选地，所述黄芩苷在人冠状病毒hcov-229e感染balb/c类小鼠模型 中的应用。
18.在黄芩苷在人冠状病毒hcov-229e感染balb/c类小鼠模型中的应用的 试验中，将黄芩苷原药液做2倍倍比稀释共3个浓度进行试验，其中，高浓 度为5mg/ml，中浓度为2.5mg/ml，低浓度为1.25mg/ml。采用雾化方式给 小鼠给药，采用人冠状病毒hcov-229e感染小鼠肺炎模型，检测药物黄芩 苷在小鼠肺指数及抑制率、肺组织病毒载量、肺组织炎性因子含量、外周血 淋巴细胞百分比评价受试药物的有效性。
19.本发明技术方案通过在感染人冠状病毒hcov-229e的体外细胞试验， 感染人冠状病毒hcov-229e的小鼠试验中验证黄芩苷的新用途，该技术方 案具有新颖性，并进行了黄芩苷在治疗由hcov-229e病毒感染引起的肺炎 的疗效试验，试验结果显示，黄芩苷在体外对人冠状病毒hcov-229e感染 细胞有一定的抑制作用；能抑制病毒hcov-229e诱导产生的tnfα、il 6 等细胞因子的表达，对感染hcov-229e病毒的肺炎小鼠肺指数及抑制率中 表现出了良好的药效，能降低感染hcov-229e病毒的肺炎小鼠肺组织的病 毒载量，升高小鼠外周血淋巴细胞比例，降低小鼠肺组织il-2、il-10、tnf
-ꢀ
α、ifn-β的含量。
附图说明
20.图1为黄芩苷治疗感染hcov-229e病毒的肺炎小鼠的肺指数及抑制率 的结果柱状
图；
21.图2为黄芩苷治疗感染hcov-229e病毒的肺炎小鼠的肺组织病毒载量 的结果柱状图；
22.图3为黄芩苷治疗感染hcov-229e病毒的肺炎小鼠的外周血cd
4
t淋 巴细胞百分比的结果柱状图；
23.图4为黄芩苷治疗感染hcov-229e病毒的肺炎小鼠的外周血cd
8
t淋 巴细胞百分比的结果柱状图；
24.图5为黄芩苷治疗感染hcov-229e病毒的肺炎小鼠的外周血b淋巴细 胞百分比的结果柱状图；
25.图6为黄芩苷治疗感染hcov-229e病毒的肺炎小鼠肺组织炎性因子il-2 的结果柱状图；
26.图7为黄芩苷治疗感染hcov-229e病毒的肺炎小鼠肺组织炎性因子 il-10的结果柱状图；
27.图8为黄芩苷治疗感染hcov-229e病毒的肺炎小鼠肺组织炎性因子 tnf-α的结果柱状图；
28.图9为黄芩苷治疗感染hcov-229e病毒的肺炎小鼠肺组织炎性因子 ifn-β的结果柱状图。
具体实施方式
29.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发 明实施方式作进一步地详细描述。
30.实施例1
31.采用人冠状病毒hcov-229e感染体外培养mrc-5细胞模型，通过观察 药物的tc0、tc50、ic50、ti，评价药物黄芩苷在体外对人冠状病毒 hcov-229e的抑制作用。
32.一、试验材料
33.1.1、细胞株为人胚肺成纤维细胞mrc-5，购自北京北纳创联生物技术研究 院，本室传代，液氮保存备用。
34.1.2、病毒株为人冠状病毒hcov-229e，由中国医学科学院医药生物技术研究 所提供，本实验室传代，-80℃冰箱保存备用。
35.1.3、受试药物为黄芩苷，浓度为5mg/ml，分子量为446，溶剂为磷酸缓冲盐 溶液(pbs)。
36.1.4、实验试剂见表1。其中，dmem是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基。
37.表1：
38.试剂名称生产厂家批号dmem培养基康宁公司14019014pbs溶液康宁公司14819005胰酶康宁公司110519010胎牛血清康宁公司35081006双抗gibco公司1796440
39.1.5、试验仪器见表2。
40.表2：
41.仪器名称生产厂家型号电子分析天平ohaus corp.brock.nj.usaar1140co2培养箱thermothermo-371生物安全柜thermothermomsc1.2洁净工作台airtechsw-cj-2fd离心机eppendorfcentrifuge 5430全自动细胞计数仪countstaric 1000倒置显微镜olympusckx41
42.二、试验方法
43.2.1、原药液的制备
44.称取黄芩苷500mg，置于50ml容量瓶中，用ph为7的磷酸盐缓冲溶液 定容至刻度，摇匀，即得10mg/ml。为使溶解度更佳，配置好的溶液进行2 倍稀释，即原药液为5mg/ml，提供药理学实验。
45.将浓度为5mg/ml的黄芩苷原药液做2倍倍比稀释，分别为2.5mg/ml、 1.25mg/ml、0.625mg/ml、0.31mg/ml、0.16mg/ml、0.08mg/ml、0.04mg/ml、 0.02mg/ml，共做8个浓度加入。
46.2.2、黄芩苷对体外培养mrc-5细胞的毒性试验
47.将配制后的8个稀释度药物，加到已长成单层的mrc-5细胞培养板中， 100μl/孔，每个稀释度做4个复孔，同时设正常细胞对照。将培养板置37℃， 5％co2培养箱中培养，每日倒置显微镜下观察细胞病变情况，连续48h，确 定细胞不出现明显病变的最低稀释倍数(最大无毒浓度tc0)，并按 reed-muench法计算50％细胞毒性浓度(tc
50
)，见表3和表4。
48.表3:
[0049][0050]
表4：
[0051][0052]
由表3、4可知，黄芩苷的最大无毒浓度tc0为0.078mg/ml，下述试验 所用浓度均在tc0浓度以下进行。
[0053]
2.3、黄芩苷在体外培养细胞mrc-5上对人冠状病毒hcov-229e的抑制作用。
[0054]
取已长成单层细胞的培养板，倒掉培养液，接种hcov-229e病毒液， 100tcid
50
，100μl/孔，置37℃，5％的co2培养箱中吸附1h后，弃去病毒 液，用细胞维持液冲洗细胞面3遍
后，依次加入无毒浓度以下6个稀释度的 各药液，100μl/孔，每个稀释度做3个复孔，同时设正常细胞对照和病毒对 照，置37℃，5％co2培养箱中培养，每日倒置显微镜下观察细胞病变情况， 48-72小时后病毒对照组细胞病变为 ～～ 时记录试验结果。
[0055]
其中，细胞病变按6级标准判断：
[0056]
－：细胞生长正常，无病变出现；
[0057]
±
：细胞病变少于整个单层的10％；
[0058]
：细胞病变约占整个单层细胞的25％以下；
[0059]
：细胞病变约占整个单层细胞的50％以下；
[0060]
：细胞病变约占整个单层细胞的75％以下；
[0061]
：细胞病变约占整个单层细胞的75％以上。
[0062]
按reed-muench计算50％抑制浓度(ic
50
)和治疗指数(ti)，ti＝tc
50
/ic
50
， 结果见表5、表6。
[0063]
表5：
[0064][0065]
表6：
[0066][0067]
表5、6结果显示：黄芩苷对人冠状病毒hcov-229e致体外培养mrc-5 细胞病变有一定程度的抑制作用，能抑制病毒hcov-229e诱导产生的tnf α、il 6等细胞因子的表达，其作用强度大小与黄芩苷浓度相关，黄芩苷浓 度越大，抑制作用越强，ic
50
为56ug/ml。
[0068]
三、实验结论
[0069]
在无毒浓度下黄芩苷在体外对hcov-229e感染引起mrc-5细胞病变有 一定程度的抑制作用，其作用强度的大小与黄芩苷浓度相关，黄芩苷浓度越 大，抑制作用越强，治疗指数ti＝2。
[0070]
实施例2
[0071]
采用人冠状病毒hcov-229e感染小鼠肺炎模型，从肺指数及抑制率，肺 组织中病毒核酸表达量，肺组织中炎性因子含量，外周血中免疫细胞百分比 4个方面评价黄芩苷对人冠状病毒hcov-229e小鼠肺炎模型的治疗作用。
[0072]
一、实验材料
[0073]
1.1、阳性药物为磷酸氯喹片，购自四川升和药业股份有限公司，批号为 2002114，规格为0.25g/片，口服，0.5g/60kg/天。
[0074]
1.2、受试药物为黄芩苷，浓度为5mg/ml，透明澄清液体，以雾化吸入方式 给药。
[0075]
1.3、实验动物为balb/c小鼠，分别选自雌雄各51只，级别为spf级，体 重为11
±
1g，合格证号分别为no.1100112011015252(雄)， no.1100112011015253(雌)，许可证号为scxk(京)2016-0006，购自北京 维通利华实验动物技术有限公司。
[0076]
1.4、病毒毒株为人冠状病毒hcov-229e，由中国医学科学院医药生物技术 研究所提供，本实验室传代，-80℃冰箱保存备用。
[0077]
1.5、实验试剂见表7
[0078]
表7：
[0079][0080]
1.6、实验仪器见表8
[0081]
表8：
[0082][0083]
二、实验方法
[0084]
2.1、药物配制
[0085]
磷酸氯喹片的配制，见表9：
[0086][0087]
受试药物的配制，见表10：
[0088][0089]
2.2、病毒传代
[0090]
取已长成单层mrc-5细胞的25cm2培养瓶，弃掉培养液，用细胞维持 液冲洗细胞面3遍后，加入细胞维持液5ml，再加入hcov-229e病毒液200μl， 置37℃5％co2培养箱中培养72～96h，每日倒置显微镜下观察细胞病变情 况，直至80％细胞出现明显病变(cpe)后，将细胞培养瓶置于-80℃低温冰 箱冻存，病毒液反复冻融3次后，用于病毒滴度测定。
[0091]
取已长成单层mrc5细胞的96孔板，弃掉培养液，用细胞维持液冲洗 细胞3遍后，按
10倍倍比(10-1
～10-8
)稀释接种不同滴度的hcov-229e病 毒液，共8个稀释度，100μl/孔，每个稀释度做4个复孔，同时设正常细胞 对照。96孔板置37℃、5％co2培养箱中培养72～96h，每日倒置显微镜下 观察细胞病变情况，并记录各孔的细胞病变情况。按reed-muench法计算50％ 细胞病变浓度(tcid
50
)。
[0092]
2.3、小鼠模型的构建及给药
[0093]
balb/c小鼠102只，按体重随机分为正常对照组，模型对照组，氯喹 对照组，黄芩苷高、中、低剂量组。其中，高、中、低剂量分别为原药液、 1/2倍原药液、1/4倍原药液。正常对照组、模型对照组、氯喹对照组每组10 只，雌雄各半；黄芩苷高、中、低剂量组每组8只，雌雄各半。分组结束后， 除正常对照组外，其他各组小鼠乙醚轻度麻醉后，用100tcid50 hcov-229e 滴鼻感染，50μl/只，隔日1次，共感染2次。初次感染当天，氯喹对照组 以0.09g/kg/d灌胃给黄芩苷，各剂量组小鼠每组20min雾化吸入2ml药液， 正常对照组、模型对照组同等条件下给予蒸馏水灌胃，每天1次，连续4天。 末次给药后一天称量体重后，眼眶采血(抗凝)，解剖取肺并称量肺重，-80℃ 保存。
[0094]
2.4、小鼠肺指数及抑制率计算
[0095]
小鼠称量体重后取血，解剖取肺组织并称量肺重，计算小鼠肺指数及抑 制率，具体计算公式如下：
[0096]
肺指数＝肺湿重(g)
×
100/体重(g)
[0097][0098]
2.5、小鼠肺组织中核酸检测(实时荧光定量rt-pcr法)
[0099]
2.5.1、核酸裂解处理
[0100]
将保存于-80℃的小鼠肺组织置于洁净的研钵中，倒入少量液氮，将肺组 织研磨成粉末，粉末置于1.5ml离心管中，加入1ml trizol试剂，轻弹管底， 将肺组织粉末重悬；室温水平放置离心管，孵育20min；4℃，12000rpm，离 心10min；移取上清液至新的1.5ml离心管中，加入0.2ml氯仿，用力震摇 15s，室温孵育3min至液体分层；4℃，12000rpm，离心15min；移取上清液 至新的1.5ml离心管中，加入0.5ml异丙醇，混匀，室温孵育30min；4℃， 12000rpm，离心10min；弃上清，用75％乙醇1ml洗涤沉淀；4℃，7500rpm， 离心5min；吸尽上清液，短暂干燥rna沉淀5～10min；用20μl depc水 溶解沉淀，-80℃低温冰箱保存。
[0101]
2.5.2、核酸测定
[0102]
对照品核酸处理：depc-h2o作为阴性对照。阳性对照品进行10、100、 1000倍梯度稀释。试剂配制：取n
×
18μl hcov-229e核酸荧光pcr检测混 合液，n
×
1μl内部对照品，与n
×
1μl rt-pcr酶(n为反应管数)，振荡混 匀数秒，3000rpm离心数秒。加样：取上述混合液20μl置于pcr管中，然 后将样品核酸提取液、depc-h2o、阳性对照品各5μl分别加入pcr管中， 改进管盖，离心数秒使所有液体置于底部，立即进行pcr扩增反应。pcr 扩增：反应管仿制在定量荧光pcr仪上，循环参数设置为：45℃
×
10min； 95℃
×
15min；再按95℃
×
15sec
→
60℃
×
60sec，循环40次；单点荧光检测 在60℃，反应体系为25μl。
[0103]
2.5.3、核酸检测计算方法，见表11。
[0104]
表11：
[0105]
ct值结果判断undet或40阴性≦38阳性38～40复检一次，如仍为38～40，则为阴性
[0106]
2.6、小鼠肺组织中炎性因子检测(elisa法)
[0107]
2.6.1、样品收集及储存
[0108]
组织匀浆液样本：称量50mg肺组织加入500μl生理盐水后，使用超声 细胞破碎仪匀浆组织，使用低温高速离心机4℃、10000rpm离心10分钟。 吸取上清液之后分装，保存于-80℃冰箱贮存备用，避免反复冻融。
[0109]
2.6.2、样本检测
[0110]
样本准备工作：样本用稀释剂2倍稀释后进行检测。检测：从已平衡至 室温的密封袋中取出微孔板，分别将不同浓度标准品，实验样本或者质控品 加入相应孔中，每孔100μl。用封板胶纸封住反应孔，室温孵育2小时。用 洗液洗板，重复操作4次。最后一次洗板结束，将板倒置，在吸水纸拍干所 有残留液体；在每个微孔内加入100μl酶标检测抗体。用封板胶纸封住反应 孔，室温孵育2小时。重复第4步洗板操作，在每个微孔内加入100μl显色 底物，室温孵育30分钟。注意避光。在每个微孔内加入100μl终止液后30 分钟内，使用酶标仪测量450nm的吸光度值，计算结果。
[0111]
2.7、小鼠外周血淋巴细胞比例检测(流式细胞术)
[0112]
离心机4℃预冷后，小鼠摘眼球取血，向装有10ml 1
×
pbs的15ml离 心管中加入3滴血(约150μl)，1600rpm，5min，室温离心；用移液管小 心弃去上清，每管加入1ml红细胞裂解液重悬细胞沉淀，室温裂解约5-10min 至液体从浑浊变澄清，加入10ml pbs终止裂解，2000rpm，5min，4℃离心， 弃上清(如果还有较多红细胞可重复进行步骤4)。细胞沉淀用10ml pbs重 悬，2000rpm，5min，4℃离心，弃上清，用200μl封闭液(含5％fbs的 pbs)重悬，并将细胞悬液转移至1.5ml ep管中，4℃封闭30min。避光于 封闭液中配制流式抗体如下：fitc标记抗小鼠cd3e、pe标记抗小鼠cd19， percp-cy5.5标记抗小鼠cd4、apc标记抗小鼠cd8a，每一管细胞的配制体 积为：抗体各0.3μl，封闭液50μl。
[0113]
细胞悬液2000rpm，5min，4℃离心，弃上清。加入流式抗体，每管50 μl，4℃避光染色30min，加入1ml pbs，2000rpm，5min，4℃离心，弃上 清。用200μl含2％fbs的pbs重悬细胞，转移至流式管中，上机检测(如 不能及时上机检测，可用pbs将4％多聚甲醛固定液稀释为2％，重悬细胞， 每管体积为200μl，4℃避光保存过夜)。
[0114]
2.8、统计分析
[0115]
数据采用(mean
±
sd)表示，组间差异采用t检验，p《0.05为差异具 有统计学意义。
[0116]
三、试验结果
[0117]
3.1、药物黄芩苷对感染hcov-229e病毒的肺炎小鼠肺指数及抑制率的影响
[0118]
表12：
[0119][0120]
注：与正常对照组比较p《0.01；与模型对照组比较p《0.01
[0121]
由表12及图1可知：与正常对照组比较，模型对照组小鼠肺指数显著增 加(p《0.01)；与模型对照组比较，黄芩苷高、中、低剂量组小鼠肺指数显 著降低(p《0.01)，黄芩苷高、中、低剂量组抑制率分别为73.61％、44.32％、 56.17％。可见，黄芩苷高、中、低剂量均表现出了良好的药效。
[0122]
3.2、黄芩苷对感染hcov-229e病毒的肺炎小鼠肺组织病毒载量的影响
[0123]
表13：
[0124][0125]
注：与正常对照组比较p《0.01；与模型组比较p《0.01
[0126]
由表13、图2结果可知：与正常对照组比较，模型对照组小鼠肺组织病 毒载量显著增加(p《0.01)；与模型对照组比较，黄芩苷高、中剂量组小鼠 肺组织病毒载量显著降低(p《0.01)。
[0127]
3.3、黄芩苷对感染hcov-229e病毒的肺炎小鼠外周血淋巴细胞比例的影响
[0128]
表14：
[0129][0130]
注：与正常对照组比较p《0.01；与模型对照组比较p《0.05
[0131]
由表14、图3、图4、图5结果可知：与正常对照组比较，模型对照组 小鼠外周血cd
4
t淋巴细胞、cd
8
t淋巴细胞百分比显著降低(p《0.01)； 与模型对照组比较，黄芩苷高剂量组小鼠外周血cd
4
t淋巴细胞、cd
8
t淋 巴细胞百分比显著升高(p《0.05)。
[0132]
3.4、黄芩苷对感染hcov-229e病毒的肺炎小鼠肺组织炎性因子的影响
[0133]
表15：
[0134][0135]
注：与正常对照组比较p《0.05，p《0.01；与模型对照组比较p《0.05，p《0.01
[0136]
由表15、图6、图7、图8、图9结果可知：与正常对照组比较，模型对 照组小鼠肺组织il-2、il-10、tnf-α、ifn-β含量显著升高(p《0.05，p《0.01)； 与模型对照组比较，黄芩苷高、中、低剂量组小鼠肺组织il-2、il-10、tnf
-ꢀ
α含量显著降低(p《0.05，p《0.01)，黄芩苷中剂量组小鼠肺组织ifn-β含 量显著降低(p《0.01)。