一种间充质干细胞复合补片及其制备方法与应用与流程

1.本发明属于妇产科学领域，涉及一种间充质干细胞复合补片及其制备方法与应用。


背景技术：

2.子宫内膜损伤严重危害女性健康，甚至影响生育。严重损伤时，自身修复功能难以促进自愈，导致功能性修复障碍，结缔组织代偿性的增生，形成纤维化及疤痕组织，进一步导致宫腔粘连危机患者生理健康，甚至导致宫性不育。目前，临床上对于子宫内膜损伤尚无非常有效的药物或手术治疗方法。
3.近年来的研究发现，间充质干细胞(mscs)对于子宫内膜损伤具有良好的修复潜能。在刮宫术后，通过在子宫腔内均匀注射mscs，能有效促进子宫内膜的修复，表现为子宫内膜厚度的增加。然而，游离的mscs注射存在明显局限性，一方面移植的细胞很容易流失，另一方面注射的细胞在损伤位点缺乏有利的生存微环境，容易死亡，这些局限共同限制了mscs的治疗效果。有研究提出将mscs接种到支架材料中，通过片状支架复合mscs移植显著提高了mscs在移植位点的滞留，改善了治疗效果。然而，尽管支架材料为mscs提供了临时生长空间，但往往缺乏对mscs的积极调控作用，在促进mscs修复功能方面效果有限。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种间充质干细胞复合补片及其制备方法与应用。该补片除作为mscs的生长支架外，还具有局部缓释细胞因子碱性成纤维生长因子bfgf的功能，形成有利于mscs生长与治疗功能发挥的局部微环境，明显改善其促进子宫内膜损伤修复的治疗效果。
5.本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
6.本发明提供了一种间充质干细胞复合补片，由间充质干细胞、ph敏感性胶原溶液、碱性成纤维生长因子bfgf缓释微球复合而成。
7.进一步地，所述复合补片通过将所述间充质干细胞、碱性成纤维生长因子bfgf缓释微球与ph敏感性胶原溶液均匀混合后，调整ph至中性并培养获得。
8.优选地，所述碱性成纤维生长因子bfgf缓释微球为装载碱性成纤维生长因子bfgf的plga微球，粒径大小在10-15μm。
9.优选地，混合溶液中的细胞终浓度为1-2.5
×
106/ml(本实施例中按照2
×
106/ml)，碱性成纤维生长因子bfgf的含量为30-80ng/ml(本实施例中按照50ng/ml)，ph敏感性胶原溶液的浓度2-4mg/ml。
10.本发明还提供了一种间充质干细胞复合补片的制备方法，包括以下步骤：
11.1)将mscs悬液、碱性成纤维生长因子bfgf缓释微球与ph敏感性胶原溶液均匀混合，调整ph至中性；
12.2)将mscs-碱性成纤维生长因子bfgf缓释微球-胶原复合物置于细胞培养箱中培
养，形成补片。
13.优选地，步骤1)中，所述碱性成纤维生长因子bfgf缓释微球为装载碱性成纤维生长因子bfgf的plga微球，粒径大小在10-15μm左右。
14.优选地，步骤1)中，通过双乳化-溶剂挥发法制备碱性成纤维生长因子bfgf缓释微球。
15.优选地，步骤1)中，混合溶液中的细胞终浓度为1-2.5
×
106/ml，更优选2
×
106/ml；碱性成纤维生长因子bfgf的含量为30-80ng/ml,更优选50ng/ml。
16.优选地，步骤1)中，调整ph使用0.1m的naoh；ph水平通过观察培养基指示剂颜色来确定。
17.优选地，步骤1)中，所述ph敏感性胶原溶液通过将sd大鼠鼠尾胶原纤维束抽出，溶解于0.2％的醋酸溶液制作而成，ph敏感性胶原溶液在混合溶液中的优选浓度2-4mg/ml。
18.优选地，步骤2)包括：将mscs-碱性成纤维生长因子bfgf缓释微球-胶原复合物加入到24孔培养板中，每孔0.5-1ml(本实施例中按照0.5ml)；将培养板放入到37℃，5％co2培养箱中孵育1-2小时(本实施例中按照1小时)，使其凝胶化，每孔加入0.5-1ml(本实施例中按照0.5ml)mscs培养液培养24-48h。
19.本发明还提供了上述间充质干细胞补片在子宫内膜损伤模型中移植及修复子宫内膜损伤的应用。
20.进一步地，所述子宫内膜损伤包括不同因素造成的严重损伤，自身无法修复，子宫壁发生纤维化，形成瘢痕。
21.本发明的有益效果如下：
22.该补片通过ph敏感性胶原溶液与间充质干细胞均匀混合，调整ph使胶原溶液发生交联作用形成凝胶状，进一步在培养过程中细胞与凝胶相互作用形成固态补片；同时，通过嵌入缓释功能的碱性成纤维生长因子bfgf微载体，实现碱性成纤维生长因子bfgf在补片中控制释放，形成有利于间充质干细胞的局部微环境，从而促进间充质干细胞的生长及治疗功能的发挥。
23.本发明制备补片的方法操作简单方便，补片柔软、易于与不同类型的伤口形状贴合移植；所制备的mscs补片不仅能够作为抑制细胞的支架，提高mscs在移植位点的停留于存活，还能通过碱性成纤维生长因子bfgf的不断缓释形成有利于mscs生长及发挥治疗功能的微环境，显著改善mscs修复子宫内膜损伤的效果，增加子宫壁厚度。
附图说明
24.图1为本发明实施例中制备的碱性成纤维生长因子bfgf缓释微球的扫描电镜观察图片。
25.图2为本发明实施例中游离plga微球释放碱性成纤维生长因子bfgf的曲线及嵌入到胶原凝胶中后的释放曲线。
26.图3为本发明实施例中制备的mscs复合补片；a，msc/碱性成纤维生长因子bfgf缓释微球/胶原复合溶液在ph调整为中性后在24孔培养板中形成的凝胶化复合物；b，凝胶复合物培养24小时后收缩并从培养板脱离形成的补片。
27.图4为本发明实施例中mscs复合补片在大鼠子宫损伤模型中的移植；箭头所指为
移植贴敷在子宫损伤位点的补片。
28.图5为本发明实施例中msc/碱性成纤维生长因子bfgf缓释微球/胶原复合补片对子宫损伤的修复效果检测。a,正常对照组子宫组织h&e染色；b,子宫损伤后，不给予任何治疗组，4w后子宫组织h&e染色；c,子宫损伤后，给予msc/胶原补片治疗组，4w后子宫组织h&e染色；d,子宫损伤后，给予msc/碱性成纤维生长因子bfgf缓释微球/胶原复合补片治疗组，4w后子宫组织h&e染色；e，不同治疗组4w后子宫内膜厚度比较。
具体实施方式
29.为了更清楚地说明本发明的技术方案，通过以下实施例对本发明作进一步的描述，以便本领域的技术人员进一步本发明，但以下实施例不对本发明构成任何形式限制。
30.实施例
31.一、碱性成纤维生长因子bfgf缓释微球的制备与表征
32.1、制备
33.1)称取聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)固体0.2g，溶解于2ml二氯甲烷，制备10％的plga溶液，作为油相；
34.2)将商业化购买的碱性成纤维生长因子bfgf蛋白100μg溶解于1ml纯净水中，配制100μg/ml的水溶液，作为水相；
35.3)称取1g聚乙烯醇(pva)固体，在加热条件下溶解于100ml水溶液中，制备1％pva溶液；
36.4)300μl碱性成纤维生长因子bfgf水溶液(100μg/ml)加入到1ml plga溶液(10％)中，通过探头式超声仪(scientz-iid)在2％功率下超声乳化1分钟，形成初乳液；
37.5)将1ml初乳液加入到10ml pva溶液(1％)中，使用高速匀浆机在10000rpm速度下搅拌5分钟，形成复乳液；
38.6)复乳液转移到烧杯中，通过磁力搅拌器进行缓慢搅动4小时以上，使有机溶剂充分挥发；
39.7)5000rpm离心力条件下离心10min收集微球，同时通过elisa法检测上清中的碱性成纤维生长因子bfgf浓度，根据初始加入的碱性成纤维生长因子bfgf总量，计算碱性成纤维生长因子bfgf的包封率，为31.6％；
40.8)碱性成纤维生长因子bfgf缓释微球经纯净水洗涤三次后，冻干，通过分析天平称量上述每毫升plga溶液体系制备获得碱性成纤维生长因子bfgf缓释微球的重量，为86.5mg。
41.图1所示为制备的碱性成纤维生长因子bfgf缓释微球的扫描电镜观察图片。可见微球表面光滑，为单分散性良好的规则球形结构。
42.2、表征
43.1)取5mg碱性成纤维生长因子bfgf缓释微球重悬于1ml pbs中，置于37℃细胞培养箱进行缓释，在不同时间点离心收集上清液后，重新加入1ml新鲜pbs，测定碱性成纤维生长因子bfgf的缓释曲线；如图2所示，大多数碱性成纤维生长因子bfgf在3天内缓释，存在明显的突释现象。
44.2)取5mg微球重悬于0.5ml 2
×
dmem培养基中，与0.5ml 2mg/ml的胶原凝胶混合，
使用0.1m naoh调整ph，根据培养基颜色判断ph为中性时停止调整，将上述混合液加入到12孔培养板中，置于37摄氏度细胞培养箱，使其凝胶化形成补片状，添加1mlpbs继续培养，在不同时间点收集上清，并补充1ml新鲜pbs，测定碱性成纤维生长因子bfgf的缓释曲线，如图2所示，较游离的碱性成纤维生长因子bfgf缓释微球相比，碱性成纤维生长因子bfgf缓释时间明显延长，缓释达7天以上，且突释现象明显减弱，表明凝胶化的胶原补片对微球中释放的碱性成纤维生长因子bfgf具有进一步的阻滞作用，使其在补片中存在一定时间停留，形成富含碱性成纤维生长因子bfgf的微环境。
45.二、间充质干细胞复合补片的制备
46.1、mscs分离自人脂肪组织，其中脂肪组织来源为临床抽脂手术的废弃物，已经相关流程批准使用；
47.2、脂肪组织充分剪碎后，加0.1％i型胶原酶 0.05％胰酶消化30-60分钟，随后1000g离心力离心10min；
48.3、去除上清，pbs重悬细胞，洗涤三次；
49.4、α-mem 10％血清培养液重悬细胞，计数，并以5
×
106的细胞剂量接种于直径10cm的培养皿中；
50.5、37℃，5％co2培养箱中进行培养，隔天换液一次，细胞生长至会合后以0.05％的胰酶进行消化，以1：3进行传代；
51.6、培养至3代以上的mscs，胰酶消化进行收集，以5
×
α-mem培养液重悬，配制成2
×
106/ml浓度的细胞悬液，添加碱性成纤维生长因子bfgf微球，使碱性成纤维生长因子bfgf的含量达到50ng/ml，随后将细胞/碱性成纤维生长因子bfgf微球悬液与2mg/ml的胶原溶液混合均匀，naoh调整ph至中性；
52.7、将上述胶原/细胞/碱性成纤维生长因子bfgf微球溶液加入到24孔培养板中，每孔0.5ml；
53.8、将培养板放入到37℃，5％co2培养箱中孵育1小时，使其凝胶化，每孔加入0.5ml mscs培养液进行培养；
54.9、培养24-48h，凝胶从培养孔底部脱落，形成漂浮在培养液中的片层。如图3所示。
55.三、间充质干细胞复合补片在子宫内膜损伤修复中的应用
56.1、成年雌性sd大鼠(本实施例中采用6-8周龄，180-270g重的雌性sd大鼠)，腹腔注射戊巴比妥钠进行麻醉；
57.2、由腹部正中位进行纵切开腹腔，将子宫壁切除长约1.5cm、宽约0.5cm，制备严重子宫损伤动物模型；
58.3、分别将单纯的细胞/胶原片层、细胞/碱性成纤维生长因子bfgf微球/胶原片层移植到子宫损伤部位，如图4所示；
59.4、移植结束后，缝合腹腔；
60.5、术后30天，对大鼠子宫急性取材，4％多聚甲醛固定后，制备石蜡标本并进行切片；
61.6、对石蜡切片进行h&e染色，对子宫损伤修复情况进行评估。
62.如图5所示，msc/碱性成纤维生长因子bfgf缓释微球/胶原复合补片治疗组子功内膜修复效果明显优于未治疗组以及单纯msc/胶原补片治疗组。