去乙酰化酶抑制剂在制备糖代谢异常治疗药物中的应用的制作方法

1.本发明涉及糖代谢异常冶疗领域，特别是涉及去乙酰化酶抑制剂在制备糖代谢异常冶疗药物中的应用。


背景技术：

2.糖代谢是生物体中最重要的基础代谢之一，糖代谢的中间产物，是很多代谢途径的重要原料，同时对众多的生物功能有调节作用，糖代谢最重要的功能是产生能量，而能量代谢是生物一切生命活动的动力，代谢产生的能量，支持生物的代谢、调节、繁殖等所有的生物学功能，能量代谢和糖代谢有着密不可分的关系。
3.糖代谢是大脑能量的主要来源，糖代谢的异常会导致大脑的能量代谢降低，导致大脑和海马组织等不能正常的行使功能。
4.氟是自然界中广泛存在的元素，氟中毒会对牙齿、肾脏系统、神经系统等造成伤害，进而危害生长发育期儿童的智力功能，氟中毒影响大鼠学习记忆的海马组织的机制研究目前还不是很完善，有待深入的研究和探讨。
5.氟化钠可对emp途径中的丙酮酸激酶以及烯醇化酶产生较强的抑制效果，丙酮酸激酶控制着糖酵解中最后一步转化丙酮酸的关键性反应，因此也是糖酵解中重要的酶类之一。在丙酮酸激酶的催化作用下磷酸烯醇式丙酮酸的磷酰基团转移至adp生成atp，同时，磷酸烯醇式丙酮酸转化为丙酮酸，这一步转化反应是不可逆的，因此，也是整个糖酵解速率的限速酶。
6.已有研究发现氟中毒大鼠海马星形胶质细胞水肿甚至坏死，胞内线粒体出现变形、肿胀、空泡样变。星型胶质细胞作为脑内糖酵解代谢的主要场所，可通过星形胶质细胞-神经元乳酸穿梭(anls)将糖酵解代谢产物乳酸转运至神经元内，成为神经元氧化磷酸化代谢正常进行的必须能量底物之一，对记忆的形成以及长期记忆的维持至关重要，正常人脑的衰老往往伴随着脑糖酵解的丧失，增强有氧糖酵解可暂时性缓解脑能量危机，促进神经元的存活和轴突的修复。


技术实现要素：

7.本发明的目的是提供去乙酰化酶抑制剂在制备糖代谢异常冶疗药物中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，去乙酰化酶抑制剂能够调节因糖代谢异常产生的差异蛋白的表达，从而治疗糖代谢异常。
8.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
9.本发明提供去乙酰化酶抑制剂在制备糖代谢异常冶疗药物中的应用。
10.进一步地，所述去乙酰化酶抑制剂为丁酸钠或曲古抑菌素a。
11.进一步地，所述糖代谢异常为氟中毒导致的糖代谢异常。
12.进一步地，所述糖代谢异常为海马体组织的糖代谢异常。
13.本发明公开了以下技术效果：
14.氟中毒会对大鼠海马体组织的糖代谢和能量代谢产生较大的影响，从差异蛋白角度来看acat1、pdhb、dlat、mdh2、aldoa蛋白的表达会升高，pfkp、pkm、ldha、mdh1、 ldhb蛋白的表达会降低；加入去乙酰化酶抑制剂后这种代谢异常可以得到缓解。本发明提供了去乙酰化酶抑制剂的一种新的应用途径，为糖代谢异常疾病的治疗，尤其是氟中毒导致的海马体组织的糖代谢异常，提供一种新的药物选择。
附图说明
15.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
16.图1为各实验组的差异蛋白情况；
17.图2为各实验组的gene ontology分析结果；
18.图3为各实验组的kyoto encyclopedia of genes and genomes分析结果；
19.图4为通过string数据库进行蛋白质相互作用网络分析结果。
具体实施方式
20.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
21.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
22.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
23.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
24.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
25.实施例1
26.一、实验方法
27.1.1动物模型
28.将氟中毒大鼠分为四组：
29.空白处理组(c)：正常饮食，不饲喂氟、丁酸钠和tsa。
30.氟中毒组(f)：与c组区别在于，大鼠自由饮用100mg/l的含氟单质的溶液。
31.丁酸钠治疗组(f s)：与f组区别在于，在染氟三月后，每只大鼠每日灌胃1.0g/kg 丁酸钠，连续灌胃2个月。
32.曲古抑菌素a(tsa)治疗组(f t)：与f组区别在于，在染氟三月后，每只大鼠每日腹腔注射1mg/kg tsa，连续注射7天。
33.丁酸钠治疗组灌胃2个月，曲古抑菌素a(tsa)治疗组连续腹腔注射7天，之后杀大鼠取海马组织，-80℃保存以备后续实验。每组大鼠取材3只作为生物学重复，共取12只大鼠的海马组织进行ldha、dlat、pdhb、pkm、mdh1、pfkp、acat1、mdh2、aldoa、 ldhb蛋白的含量检测。
34.1.2蛋白质提取
35.海马组织利用丙酮沉淀法进行蛋白质提取。样本加入配制好的裂解液后，磨碎后 20000g离心30min去除沉淀。再加入4倍体积的预冷tca-丙酮进行蛋白沉淀，20000g离心去除上清液后，将沉淀物用预冷纯丙酮清洗三次，每次在-20℃的条件下沉淀30min，然后20000g离心去除上清液。为保证蛋白不被降解，以上离心步骤均在4℃的条件下完成。将最终的沉淀加入蛋白裂解液，超声助溶后离心去除沉淀部分，保留蛋白溶液。之后对提取好的蛋白溶液进行还原烷基化，溶液中加入dtt至终浓度10mm，56℃水浴1h，取出后迅速加入iam至终浓度55mm，暗室静置1h。用bradford法对还原烷基化之后的蛋白溶液进行定量。
36.1.3fasp(filter-aided sample preparation)酶解
37.每组样本取100ug蛋白加入到10kd超滤管中，离心去除废液后加入200μl50％teab，14000g，4℃离心40min去除废液，重复上述步骤两次以置换溶液buffer。之后加入3.3ug的胰蛋白酶，37度水浴24h进行蛋白质的酶解。酶解结束后，冻干溶液并用25μl、100mm teab溶液复溶肽段。
38.1.4tmt标记
39.根据tmt试剂盒说明书，对每组样本酶解复溶后的肽段溶液进行tmt标记。(方法：首先将标记试剂平衡至室温，再在每管标记试剂中加入41μl乙腈，将混合好的标记试剂分别加入复溶后的肽段溶液中，室温静置1h。然后分别加入8μl 5％羟胺，室温15min以终止反应。混合后真空抽干。)其中f(正常喂食)组标记为tmt-126； k(氟中毒)组标记为tmt-127n；i(喂食拮抗剂丁酸钠)组标记为tmt-127c；l(喂食拮抗剂tsa)组标记tmt-128n；标记后混合备用。
40.1.5scx(强阳离子交换)预分离
41.混合后的肽段用solvent a(25％acn，10mm kh2po4，ph＝3)进行稀释，磷酸调整 ph至3.0，利用高效液相色谱(hplc)(rigol l-3000)进行预分离。将稀释后样本加入scx(250
×
4.60mm，phenomenex luna)柱子中，用solvent b(25％acn， 2m kcl，10mm kh2po4，ph＝3)进行洗脱，流速为1ml/min。利用hplc将混合肽段溶液分成了16个组分。
42.1.6肽段纯化
43.使用strata-x c18除盐柱(phenomenex，usa)对预分离后的16个组分分别进行除盐。将最终含有肽段的溶液进行低温抽干，用0.1％甲酸溶液进行复溶。
44.1.7lc ms/ms分析
45.肽段溶液首先用dionex ultimate 3000nano lc system进行分离。a液为0.1％的
甲酸与2％的乙腈，b液为0.1％甲酸与98％乙腈。将样本装入反向trap柱(thermoscientificacclaimpepmap100，150μm
×
2cm，anoviperc18)，并用分析柱(agelatechnologies，75μm
×
10cm，5μm，)进行分离，流速为0.4μl/min。然后样本经过q-exactive质谱仪(thermoscientific，nj)进行分析。质谱仪的检测方法为正离子模式，母离子扫描范围350-2000m/z，二级质谱的分辨率为35000，归一化碰撞能量为30ev，二级质谱碎裂模式为：highercollisionenergydissociation(hcd)。母离子质量范围350-6000da，二级质谱图中最小峰数为10，信噪比s/n阈值1.5。
46.1.8蛋白质鉴定与定量
47.利用proteomediscoverer1.4软件对液相质谱产出的谱图数据进行数据库检索，检索数据库为uniprot(uniprot_rattus_10116，共37686条序列)。在定性分析时，设定一级质量偏差为15ppm，二级质量偏差为20mmu。thedatabasepatternforcalculatingfalsediscoveryrate(fdr)wassettodecoy。肽段的fdr设定为≤0.01。在定量分析时，蛋白质定量取值类型被设定为uniquepeptides的中位值；通过全部可定量蛋白的中位值来做归一化以纠正实验偏差。我们选择了筛选阈值，只有比值≥1.2且p值≤0.05的蛋白质被设置为上调，而比值≤0.83且p值≤0.05的蛋白质被设置为下调。
48.1.9mrm分析
49.通过mrm-ms分析量化12种选定蛋白质的表达水平，从而确认使用tmt分析获得的蛋白质表达水平。根据tmt数据确定目标蛋白的特征肽，并且仅选择独特的肽序列进行mrm分析。按照tmt分析方案，制备、还原、烷基化蛋白质并用胰蛋白酶消化。获得的肽混合物通过c18柱(0.10
×
20mm；3μm)引入质谱仪，然后通过c18柱(0.15
×
120mm；1.9μm)引入质谱仪。
50.质谱测量使用质谱仪(6500；abscience)进行。然后使用skyline2.6对获得的原始数据进行分析。蛋白质和肽的fdr设置为0.01。skyline2.6软件用于定量数据处理和蛋白质组学分析。在mrm-ms分析中，每个品种包括四个生物重复。
51.1.10数据库检索、蛋白鉴定和定量
52.将质谱产生的数据通过pd1.4软件和uniprot下载的大鼠数据库进行比对，对实验各组的蛋白质进行鉴定，选取肽段的fdr《0.01，对蛋白质进行相对定量。利用r软件对比对得到的三组平行实验的定量结果进行显著性分析，用三组平行实验的均值作为实验组的相对定量结果。通过筛选foldchange≥1.2倍，p值小于0.05的条件筛选差异蛋白。
53.通过david在线分析软件对差异蛋白进行geneontology功能富集分析和keggpathway富集分析，通过string数据库，对差异蛋白进行蛋白质互作网络分析，使用cytoscape的cluego插件进行网络图绘制。使用pathview工具，绘制代谢通路图。
54.1.11ppi网络建设
55.stringv11.0(http://string-db.org/)用于分析当前研究中确定的dep的ppi，并构建ppi网络。蛋白质相互作用信息是从氟/对照组的糖代谢或能量代谢中提取的。
56.1.12统计分析
57.采用r软件进行统计分析。
58.二、实验结果
59.2.1蛋白质鉴定和定量
60.通过3组4标平行lc-ms/ms质谱分析，分别产生68026张、71517张、73374张谱图，分别匹配到14240条、14497条、14670条肽段，分别鉴定到fdr≤0.01的蛋白数为2572、2580、2613。大部分蛋白质的相对分子质量分布在10-60kda。同时，鉴定的蛋白质具有较高的肽段覆盖度，其中50％的鉴定蛋白有超过10％的肽段覆盖度，有 29.6％的蛋白的肽段覆盖度高于20％。大约57.6％的蛋白质鉴定到3条或3条以上的肽段。通过方差分析检验的方法，我们获得不同实验组的差异蛋白情况如下(图1、表 1-表2)：氟中毒组(f)和空白处理组(c)比较，共鉴定到578个差异蛋白，其中 353个上调蛋白，225个下调蛋白。丁酸钠治疗组(f s)与氟中毒组(f)比较，共鉴定到533个差异蛋白，其中179个上调蛋白，354个下调蛋白。tsa治疗组(f t)与氟中毒组(f)比较，共鉴定到270个差异蛋白，其中69个上调蛋白，201个下调蛋白。
61.表1氟中毒组/对照组的葡萄糖代谢或能量代谢差异蛋白
[0062][0063][0064]
表2氟 丁酸钠/氟中葡萄糖代谢或能量代谢的差异蛋白
[0065][0066]
表3糖酵解/糖异生代谢通路中的差异蛋白
[0067][0068]
根据gene ontology数据库，分别对f/c组、(f s)/f组和(f t)/f组进行功能富集注释分析(图2)。选取每组分析结果中，biological process分类中的p值最小的前10个功能注释结果进行分析，三组数据分析的富集注释的结果中，差异蛋白均富集在atp代谢过程。f/c组和(f s)/f组的差异蛋白，同时还富集在糖酵解过程和三羧酸循环中。
[0069]
kyoto encyclopedia of genes and genomes(kegg)数据库进行代谢通路功能富集分析(见图3)：
[0070]
f/s，对578个差异蛋白依据kyoto encyclopedia of genes and genomes(kegg) 数据库进行代谢通路功能富集分析。富集分析中p＜0.05的共有28个代谢通路，其中 8条代谢通路：氧化磷酸化、碳代谢、糖酵解/糖异生、丙酮酸代谢、柠檬酸循环(tca 循环)、乙醛酸和二羧酸代谢、戊糖磷酸途径、果糖和甘露糖代谢与糖代谢或能量代谢相关的。
[0071]
(f s)/f,对533个差异蛋白依据kyoto encyclopedia of genes and genomes(kegg) 数据库进行代谢通路功能富集分析。富集分析中p＜0.05的共有23个代谢通路，其中 7条代谢通路：碳代谢、氧化磷酸化、糖酵解/糖异生、柠檬酸循环(tca循环)、丙酮酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、戊糖磷酸途径与糖代谢或能量代谢相关的。
[0072]
(f t)/f,对270个差异蛋白依据kyoto encyclopedia of genes and genomes
(kegg) 数据库进行代谢通路功能富集分析。富集分析中p＜0.05的共有13个代谢通路，其中 4条代谢通路：氧化磷酸化、碳代谢、糖酵解/糖异生、果糖和甘露糖代谢与糖代谢或能量代谢相关的。
[0073]
我们通过mrm技术验证氟处理组、氟 丁酸钠处理组和氟 tsa处理组的84个差异蛋白，通过mrm和tmt关联分析的热图发现，mrm验证的大部分差异蛋白和tmt的表达方向是一致的。其中，10个和糖代谢和能量代谢相关的差异蛋白，8个通过mrm得到验证，其中6个关键的差异蛋白是和tmt的表达是一致的。
[0074]
根据差异蛋白的结果，发现在氟处理/空白处理组和氟 丁酸钠/氟处理组的结果中有很多与糖代谢或者能量代谢相关的差异蛋白(表1-表2)。表现出，氟处理的大鼠海马组织，较大程度地影响了大鼠的正常糖代谢和能量代谢，而丁酸钠的加入有效的恢复了海马组织的糖代谢和能量代谢，从糖代谢的重要的中间代谢通路-糖酵解/糖异生代谢通路中的差异蛋白(表3)，蛋白质的相对定量差异较大，说明加入氟或者丁酸钠的加入，影响大鼠海马组织的正常的糖代谢生理功能，氟处理组/空白处理组与氟 丁酸钠/氟处理组的差异蛋白的上下调方向完全相反，说明丁酸钠加入后，对氟的影响产生了抑制。
[0075]
本发明通过蛋白质组学的实验方法，从蛋白质层面解释氟中毒对大鼠海马组织的影响，与加入去乙酰化酶抑制剂处理后大鼠海马组织的比较，进一步研究了氟中毒的机制和缓解方法。我们前期通过高通量蛋白组学结合tmt体外标记技术证实了氟中毒后大鼠脑代谢通量发生改变，脑内糖酵解代谢被抑制。通过功能富集分析，发现go功能富集分析中的biological process的分类中，差异蛋白主要富集在与糖代谢和能量代谢相关的生物学功能中。kegg的pathway富集分析中，我们发现碳代谢、糖酵解/ 糖异生、柠檬酸循环(tca循环)、丙酮酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、戊糖磷酸途径与糖代谢和能量代谢相关的代谢通路，差异蛋白的富集比较显著。我们将这7个代谢通路的差异蛋白通过cytoscape的cluego进行分析，发现丙酮酸代谢和糖酵解/糖异生代谢位于所有代谢的中间位置，ldha、dlat、pdhb、pkm、mdh1、pfkp、acat1、mdh2、 aldoa、ldhb是比较重要的中间差异蛋白。
[0076]
对这十个蛋白进行深入分析，整理各实验组的差异倍数等信息，我们通过string 数据库进行蛋白质互作网络分析(图4)，观察到aldoa和pdhb位于互作网络图中较重要的位置，可能会对我们关注的丙酮酸代谢和糖酵解/糖异生代谢两条通路产生较重要的影响。进行这两图代谢通路的代谢通路图的绘制，并将相关信息标注在代谢通路上，从通路整体观察差异蛋白的变化情况，通过通路图发现，aldoa蛋白在糖酵解/糖异生代谢通路中差异变化最大，在丙酮酸代谢中pdhb和dlat在代谢通路中的位置比较重要，同时在互作网络图中，pdhb、dlat和aldoa之间也存在着紧密结合的相互作用。这三个蛋白主要是丙酮酸脱氢酶和果糖二磷酸醛缩酶，两种酶的上调表达，促进丙酮酸的生成，进而产生更多的乙酰coa，影响神经系统，同时代谢产生更多的能量，影响下游代谢通路和生理反应。
[0077]
在探讨氟中毒导致中枢神经系统损伤的机制时，我们发现氟中毒可引起细胞内ca
2
超载，而过量的ca
2
可以通过与钙调蛋白(calmodululin，cam)结合磷酸化激活ca
2
/钙调蛋白依赖性蛋白激酶ii(calcium/calmodululin-dependent protein kinase ii， camkii)，激活的camkii可以通过多种途径调节细胞内ca
2
平衡，具有广泛的生物学活性，且与神经炎症，突触损伤，糖酵解，学习记忆等功能密切相关。在此后的mrm验证实验中我们观察到氟中毒后大鼠海马组织有氧糖酵解相关限速酶：pkm、pfkp、ldhb 表达水平下降，提示
氟中毒大鼠的warburg效应被抑制，oxphos产生的atp无法及时补充氟中毒大脑损伤后对能量的快速需求，影响神经元受损后重塑以及神经系统的稳定性。然而，我们同样观察到pdhb、mdh2、dlat等蛋白表达水平却呈上升趋势，我们推测葡萄糖代谢产物丙酮酸无法通过warburg效应经乳酸脱氢酶催化生成乳酸，大量的丙酮酸通过线粒体内膜进入三羧酸循环，故pdhb、mdh2、dlat、acat1等三羧酸循环相关酶表达升高。
[0078]
四个实验组中大鼠海马体组织中ldha、dlat、pdhb、pkm、mdh1、pfkp、acat1、 mdh2、aldoa、ldhb蛋白的检测结果见表4。氟中毒会对大鼠海马体组织的糖代谢和能量代谢产生较大的影响，从差异蛋白角度来看acat1、pdhb、dlat、mdh2、aldoa蛋白的表达会升高，pfkp、pkm、ldha、mdh1、ldhb蛋白的表达会降低，加入去乙酰化酶抑制剂后这种代谢异常可以得到缓解，由此可以表明去乙酰化酶抑制剂可以用来治疗糖代谢异常，尤其是氟中毒导致的海马体组织的糖代谢异常。
[0079]
表4糖酵解/糖异生代谢通路中的差异蛋白
[0080][0081]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。