杂环化合物及其用途的制作方法

杂环化合物及其用途
相关申请的交叉引用
1.本技术要求2019年4月9日提交的美国临时申请号62/831,665的优先权，将其内容通过引用以其整体并入本文。
技术领域
2.本公开文本总体上涉及参与抑制dna损伤检查点激酶wee1的治疗剂，所述治疗剂通过消除细胞周期停滞和适当的dna修复来增强基因毒性化学疗法。本发明还提供了包含本发明化合物的药学上可接受的组合物和使用所述组合物治疗与此通路相关的疾病的方法。


背景技术：

3.wee1是一种酪氨酸激酶，其磷酸化并且使cdc2失活并且参与g检查点信号传导。更具体地，wee1参与g
2-m检查点信号传导。因为p53是g检查点中的关键调节因子，p53缺陷型肿瘤在dna损伤后仅依赖于g检查点。更具体地，因为p53是g
1-s检查点中的关键调节因子，p53缺陷型肿瘤在dna损伤后仅依赖于g
2-m检查点。因此，此类肿瘤通过wee1抑制对dna损伤剂选择性地敏感。
4.wee1属于参与与细胞周期蛋白依赖性激酶1结合的细胞周期蛋白b的末端磷酸化和失活(导致响应于dna损伤而使g细胞周期停滞)的蛋白激酶家族。wee1首先是在裂殖酵母中被鉴定的，其中wee1缺乏导致过早有丝分裂进入和较小尺寸的酵母的复制。它是负责酪氨酸的抑制性磷酸化的主要激酶。
5.在细胞经历有丝分裂之前，它们通过严密控制的g
1-s、内-s和g
2-m检查点级联进展。wee1激酶已经作为关键的g
2-m检查点调节因子出现。此酪氨酸激酶通过催化在酪氨酸-15(y15)上)对cdc2(细胞周期蛋白依赖性激酶1(cdk1)的人同系物的抑制性磷酸化而负调节向有丝分裂的进入。这导致cdc2/细胞周期蛋白b复合物的失活，这使细胞在g
2-m停滞，从而允许dna修复。这种抑制还通过以下发生：chk1介导的cdc25磷酸酶的抑制，这会去除对cdc2的抑制性磷酸化。因此，进入有丝分裂依赖于wee1与chk1/cdc25的相反活动之间的平衡。因此，预期wee1抑制消除g
2-m停滞并且推进细胞进入过早有丝分裂，通过研究证实的假设记载了通过小分子抑制剂或小的干扰rna抑制wee1导致过早进入有丝分裂并且细胞随后通过有丝分裂灾变或细胞凋亡而死亡。(s.muller,j.clinical.oncology,2015)。
6.最近，已经公开了一些类别的wee1抑制剂。其中是选择性抑制剂，azd-1775(1,2-烯丙基-1-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-((4-(4甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3(2h)-酮)。azd-1775在各种临床前研究中作为单一疗法或在增强化学疗法和放射疗法中展现出抗肿瘤活性，并且当前处于i/ii期临床试验。
[0007]
wee1在若干种癌症类型中高度表达，所述癌症类型包括肝细胞癌、乳腺癌、宫颈癌、肺癌、鳞状细胞癌、弥漫性内在脑桥胶质瘤(dipg)、胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤、白血病、黑素瘤和卵巢癌。(p.reigan等人,trends in pharmacol.sci.,2016)。
[0008]
处于临床开发中的wee1抑制剂很少。改善wee1抑制剂选择性以及所述抑制剂允许靶向特定癌症类型的特性仍有余地。


技术实现要素：

[0009]
在一方面，提供了一种式(i)的化合物：或其盐，其中y、r1、r2、r3、r4、m和n是如本文详述的。
[0010]
在一些实施方案中，式(i)的化合物或其盐具有式(ii)或(iii)或是其盐，如本文详述的。
[0011]
在另一方面，提供了一种治疗有需要的个体的癌症的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的如本文详述的化合物(诸如式(i)、(ii)或(iii)的化合物)或其药学上可接受的盐。还提供了一种抑制细胞中wee1的方法，所述方法包括向所述细胞施用本文详述的化合物或其盐。
[0012]
在另一方面，提供了包含本文详述的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。还提供了包含本文详述的化合物或其盐的试剂盒。还提供了如本文详述的化合物或其盐，其用于制造用于治疗癌症的药剂。
具体实施方式
定义
[0013]“烷基”是指并且包括具有指定的碳原子数(即，c
1-c
10
意指一至十个碳)的饱和的直链和支链的单价烃结构及其组合。具体的烷基是具有1至20个碳原子的那些(“c
1-c
20
烷基”)。更具体的烷基是具有1至8个碳原子(“c
1-c8烷基”)、3至8个碳原子(“c
3-c8烷基”)、1至6个碳原子(“c
1-c6烷基”)、1至5个碳原子(“c
1-c5烷基”)、或1至4个碳原子(“c
1-c4烷基”)的那些。烷基的例子包括但不限于诸如以下的基团：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基，例如正戊基、正己基、正庚基、正辛基的同系物和异构体等。
[0014]
如本文所用，“烯基”是指具有至少一个烯属不饱和位点(即，具有至少一个式c＝c的部分)并且具有指定的碳原子数(即，c
2-c
10
意指二至十个碳原子)的不饱和的直链或支链的单价烃链或其组合。烯基可以呈“顺式”或“反式”构型，或可替代地呈“e”或“z”构型。具体的烯基是具有2至20个碳原子(“c
2-c
20
烯基”)、具有2至8个碳原子(“c
2-c8烯基”)、具有2至6个碳原子(“c
2-c6烯基”)、或具有2至4个碳原子(“c
2-c4烯基”)的那些。烯基的例子包括但不限于诸如以下的基团：乙烯基(ethenyl)(或乙烯基(vinyl))、丙-1-烯基、丙-2-烯基(或烯丙基)、2-甲基丙-1-烯基、丁-1-烯基、丁-2-烯基、丁-3-烯基、丁-1,3-二烯基、2-甲基丁-1,3-二烯基、其同系物和异构体等。
[0015]
如本文所用，“亚烷基”是指与烷基相同但是具有二价的残基。具体的亚烷基是具有1至6个碳原子(“c
1-c6亚烷基”)、1至5个碳原子(“c
1-c5亚烷基”)、1至4个碳原子(“c
1-c4亚
烷基”)或1至3个碳原子(“c
1-c3亚烷基”)的那些。亚烷基的例子包括但不限于诸如以下的基团：亚甲基(-ch
2-)、亚乙基(-ch2ch
2-)、亚丙基(-ch2ch2ch
2-)、亚丁基(-ch2ch2ch2ch
2-)等。
[0016]
如本文所用，“炔基”是指具有至少一个炔属不饱和位点(即，具有至少一个式c≡c的部分)并且具有指定的碳原子数(即，c
2-c
10
意指2至10个碳原子)的不饱和的直链或支链的单价烃链或其组合。具体的炔基是具有2至20个碳原子(“c
2-c
20
炔基”)、具有2至8个碳原子(“c
2-c8炔基”)、具有2至6个碳原子(“c
2-c6炔基”)、或具有2至4个碳原子(“c
2-c4炔基”)的那些。炔基的例子包括但不限于诸如以下的基团：乙炔基(ethynyl)(或乙炔基(acetylenyl))、丙-1-炔基、丙-2-炔基(或炔丙基)、丁-1-炔基、丁-2-炔基、丁-3-炔基、其同系物或异构体等。
[0017]“芳基”是指并且包括多不饱和的芳族烃基团。芳基可以含有另外的稠环(例如1至3个环)，包括另外稠合的芳基、杂芳基、环烷基、和/或杂环基环。在一种变型中，芳基含有6至14个环形碳原子。芳基的例子包括但不限于苯基、萘基、联苯基等。
[0018]“羰基”是指基团c＝o。
[0019]“环烷基”是指并且包括环状单价烃结构，所述结构可以是完全饱和的、单不饱和的或多不饱和的，但是非芳族的，具有指定的碳原子数(例如，c
1-c
10
意指一至十个碳)。环烷基可以由一个环(诸如环己基)或多个环(诸如金刚烷基)组成，但是不包括芳基。包含多于一个环的环烷基可以是稠合的、螺或桥接的、或其组合。优选的环烷基是具有3至13个环状碳原子的环状烃。更优选的环烷基是具有3至8个环状碳原子的环状烃(“c
3-c8环烷基”)。环烷基的例子包括但不限于：环丙基、环丁基、环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基、降冰片基等。
[0020]“卤基”或“卤素”是指具有9至85的原子序数的17族系列元素。优选的卤代基团包括氟、氯、溴和碘。在残基被多于一个卤素取代的情况下，它可以通过使用对应于所附接的卤素部分的数量的前缀来提及，例如，二卤代芳基、二卤代烷基、三卤代芳基等是指被两个(“二”)或三个(“三”)卤代基团(可能是但不必须是相同的卤基)取代的芳基和烷基；因此，4-氯-3-氟苯基在二卤代芳基的范围内。其中每个氢被卤代基团替代的烷基称为“全卤代烷基”。优选的全卤代烷基是三氟烷基(-cf3)。类似地，“全卤代烷氧基”是指在构成烷氧基的烷基部分的烃中卤素替代每个h的烷氧基。全卤代烷氧基的例子是三氟甲氧基(-ocf3)。
[0021]“杂芳基”是指并且包括具有1至10个环碳原子和至少一个环杂原子(包括但不限于诸如氮、氧和硫的杂原子)的不饱和芳族环基团，其中所述氮和硫原子任选地被氧化，并且一个或多个氮原子任选地被季铵化。杂芳基可以在环碳处或在环杂原子处与分子的其余部分附接。杂芳基可以含有另外的稠环(例如，1至3个环)，包括另外稠合的芳基、杂芳基、环烷基、和/或杂环基环。杂芳基的例子包括但不限于吡啶基、嘧啶基、噻吩基、呋喃基、噻唑基等。
[0022]“杂环”或“杂环基”是指具有1至10个环碳原子和1至4个环杂原子(诸如氮、硫或氧等)的饱和或不饱和非芳族基团，其中所述氮和硫原子任选地被氧化，并且一个或多个氮原子任选地被季铵化。杂环基可以具有单环或多个缩合环，但是不包括杂芳基。包含多于一个环的杂环可以是稠合的、螺或桥接的、或其任何组合。在稠环体系中，一个或多个稠环可以是芳基或杂芳基。杂环基的例子包括但不限于四氢吡喃基、二氢吡喃基、哌啶基、哌嗪基、吡咯烷基、噻唑啉基、噻唑烷基、四氢呋喃基、四氢噻吩基、2,3-二氢苯并[b]噻吩-2-基、4-氨
基-2-氧代嘧啶-1(2h)-基等。
[0023]“氧代基”是指部分＝o。
[0024]
除非另有规定，否则“任选经取代的”意指基团可以是未经取代的或被一个或多个(例如，1、2、3、4、或5个)针对所述基团列出的取代基取代，其中所述取代基可以相同或不同。在一个实施方案中，任选地被取代的基团具有一个取代基。在另一个实施方案中，任选经取代的基团具有两个取代基。在另一个实施方案中，任选经取代的基团具有三个取代基。在另一个实施方案中，任选经取代的基团具有四个取代基。在一些实施方案中，任选经取代的基团具有1至2个、2至5个、3至5个、2至3个、2至4个、3至4个、1至3个、1至4个或1至5个取代基。
[0025]“药学上可接受的载体”是指药物配制品中除了活性成分以外的对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
[0026]
如本文所用，“治疗”(“treatment”或“treating”)是用于获得有益或希望的结果(包括临床结果)的方法。例如，有益或希望的结果包括但不限于以下一种或多种：减少由疾病引起的症状、提高患有疾病的患者的生活质量、减少治疗疾病所需的其他药物的剂量、延迟疾病的进展和/或延长个体的生存。关于癌症或其他不需要的细胞增殖，有益或希望的结果包括缩小肿瘤(减小肿瘤大小)；降低肿瘤的生长速率(诸如抑制肿瘤生长)；减少癌细胞的数量；在一定程度上抑制、减缓或减慢并且优选停止癌细胞向外周器官的浸润；抑制(在一定程度上减慢并且优选停止)肿瘤转移；抑制肿瘤生长；防止或延迟肿瘤的发生和/或复发；和/或在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状。在一些实施方案中，有益或希望的结果包括预防或延迟发生和/或复发，诸如不需要的细胞增殖的发生和/或复发。
[0027]
如本文所用，“延迟疾病的发展”意指推迟、阻碍、减慢、延缓、稳定和/或延期疾病(诸如癌症)的发展。此延迟可以具有不同的时间长度，这取决于病史和/或所治疗的个体。如对于本领域技术人员清楚的是，足够或显著的延迟实际上可以涵盖预防，因为个体不会患上疾病。例如，可以延迟晚期癌症，诸如转移的发展。
[0028]
如本文所用，化合物或其盐或药物组合物的“有效剂量”或“有效量”是足以实现有益或希望的结果的量。对于预防性使用，有益或希望的结果包括诸如以下的结果：消除或降低风险、减轻严重程度或延迟所述疾病的发作，所述疾病包括所述疾病的生化、组织学和/或行为症状、其并发症和在所述疾病发展期间呈现出的中间病理表型。对于治疗性用途，有益或希望的结果包括以下的结果：改善、缓解、减轻、延迟或减少由疾病引起的一种或多种症状；提高患有所述疾病的那些的生活质量；减少治疗所述疾病所需的其他药物的剂量；诸如经由靶向、延迟疾病的进展和/或延长生存来增强另一种药物的作用。关于癌症或其他不需要的细胞增殖，有效量包含这样的量，其足以引起肿瘤缩小和/或降低肿瘤的生长速率(诸如抑制肿瘤生长)，或者预防或延迟其他不需要的细胞增殖。在一些实施方案中，有效量是足以延迟发展的量。在一些实施方案中，有效量是足以预防或延迟发生和/或复发的量。可以在一次或多次施用中施用有效量，在癌症的情况下，药物或组合物的有效量可以：(i)减少癌细胞的数量；(ii)减小肿瘤大小；(iii)在一定程度上抑制、延缓、减慢并且优选阻止癌细胞向外周器官的浸润；(iv)抑制(即，在一定程度上减慢并且优选停止)肿瘤转移；(v)抑制肿瘤生长；(vi)防止或延迟肿瘤的发生和/或复发；和/或(vii)在一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状。可以在一次或多次施用中施用有效剂量。出于本公开文本的目
的，化合物或其盐或药物组合物的有效剂量是足以直接或间接地完成预防性或治疗性治疗的量。预期并且理解的是，有效剂量的化合物或其盐或药物组合物可以实现或不实现与另一种药物、化合物或药物组合物的结合。因此，可以在施用一种或多种治疗剂的上下文中考虑“有效剂量”，并且如果与一种或多种其他药剂结合可以实现或实现所希望的结果，则可以考虑以有效量给予单一药剂。
[0029]
如本文所用，术语“个体”是哺乳动物，包括人。个体包括但不限于人、牛、马、猫、犬、啮齿动物或灵长类动物。在一些实施方案中，所述个体是人。所述个体(诸如人)可能患有晚期疾病或较小程度的疾病，诸如低肿瘤负荷。在一些实施方案中，所述个体处于增殖性疾病(诸如癌症)的早期阶段。在一些实施方案中，所述个体处于增殖性疾病(诸如晚期癌症)的晚期阶段。
[0030]
本文对“约”某一值或参数的提及包括(并且描述)针对所述值或参数本身的实施方案。例如，提及“约x”的描述包括“x”的描述。
[0031]
应理解，本文所述的方面和变型还包括“由方面和变型组成”和/或“基本上由方面和变型组成”。化合物
[0032]
在一方面，提供了一种式(i)的化合物：或其盐，其中：y是氢或r4；m是0、1、2、或3；n是0、1、2、3、或4；r1独立地是f、cl、或甲基；r2是c
1-c6烷基、c
3-c6环烷基或-(c
1-c3亚烷基)cf3；r3是其中：指示芳族环；m1是ch、cr
3b
或n；m2是ch、cr
3b
、n、或不存在；m3是ch、cr
3b
、n、o、或s；m4是ch、cr
3b
、n、o、或s，条件是：(1)当m4是o或s并且m2不存在时，则m3是ch、cr
3b
或n，以及
(2)当m3是o或s并且m2不存在时，则m4是ch、cr
3b
或n；r
3a
是任选地被c
1-c6卤代烷基或-cn取代的c
3-c6环烷基、或任选地被卤素、-oh或-cn取代的c
1-c6烷基，条件是当r
3a
是任选地被卤素、-oh或-cn取代的c
1-c6烷基时，则m1、m2、m3和m4中的至少一个是cr
3b
；r
3b
是卤素或-cn；每个r4独立地是氧代基、c
1-c6烷基、c
2-c6烯基、c
2-c6炔基、卤素、-c(o)r
17
、-c(o)or
17
、-c(o)nr
17r18
、-cn、-si(c
1-c6烷基)3、-or
17
、-nr
17r18
、-oc(o)nr
17r18
、-nr
17
c(o)r
18
、-s(o)2r
17
、-nr
17
s(o)2r
18
、-s(o)2nr
17r18
、c
3-c6环烷基、3至6元杂环基、-(c
1-c3亚烷基)cn、-(c
1-c3亚烷基)or
17
、-(c
1-c3亚烷基)nr
17r18
、-(c
1-c3亚烷基)cf3、-(c
1-c3亚烷基)c(o)r
17
、-(c
1-c3亚烷基)c(o)nr
17r18
、-(c
1-c3亚烷基)nr
17
c(o)r
18
、-(c
1-c3亚烷基)s(o)2r
17
、-(c
1-c3亚烷基)nr
17
s(o)2r
18
、-(c
1-c3亚烷基)s(o)2nr
17r18
、-(c
1-c3亚烷基)(c
3-c6环烷基)或-(c
1-c3亚烷基)(3至6元杂环基)，其中每个r4独立任选地被卤素、氧代基、-or
19
、-nr
19r20
、或-c(o)r
19
取代，或两个r4当与相同的碳结合时与它们附接的碳一起形成c
3-c6环烷基或3至6元杂环基，各自任选地被r
19
取代的；每个r
17
、r
18
、r
19
和r
20
独立地是氢、c
3-c6环烷基、3-6元杂环基或c
1-c6烷基，其中的每一个任选地被卤素、氧代基或-oh取代，或r
17
和r
18
与它们附接的原子一起形成任选地被卤素、氧代基或-oh取代的3-6元杂环基。
[0033]
在式(i)的化合物或其盐的一些实施方案中，所述化合物不是表1x中的化合物或其盐。在式(i)的化合物或其盐的一些实施方案中，所述化合物不是表1x中的化合物号1x-39x或其盐。表1x
[0034]
在式(i)的化合物的一些实施方案中，所述化合物具有式(ii)：
[0035]
在式(i)的化合物的一些实施方案中，所述化合物具有式(iii)：
[0036]
在式(i)的化合物的一些实施方案中，r2是c
1-c6烷基，诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、或仲丁基。在一些实施方案中，r2是异丙基或乙基。在一些实施方案中，r2是异丙基。在一些实施方案中，r2是乙基。在一些实施方案中，r2是c
3-6
环烷基，
诸如环丙基、环丁基、环戊基、或环己基。在一些实施方案中，r2是环丙基。在一些实施方案中，r2是-(c
1-c3亚烷基)cf3。在一些实施方案中，r2是-ch2cf3。在一些实施方案中，r2选自异丙基、乙基、环丙基和-ch2cf3。
[0037]
在式(i)的化合物的一些实施方案中，m1是ch。在一些实施方案中，m1是cr
3b
。在一些实施方案中，m1是n。
[0038]
在式(i)的化合物的一些实施方案中，m2是ch。在一些实施方案中，m2是cr
3b
。在一些实施方案中，m2是n。在一些实施方案中，m2不存在。
[0039]
在式(i)的化合物的一些实施方案中，m3是ch。在一些实施方案中，m3是cr
3b
。在一些实施方案中，m3是n。在一些实施方案中，m3是s。在一些实施方案中，m3是o。
[0040]
在式(i)的化合物的一些实施方案中，m4是ch。在一些实施方案中，m4是cr
3b
。在一些实施方案中，m4是n。在一些实施方案中，m4是s。在一些实施方案中，m4是o。在一些实施方案中，当m4是o或s并且m2不存在时，则m3是ch、cr
3b
或n。在一些实施方案中，当m3是o或s并且m2不存在时，则m4是ch、cr
3b
或n。
[0041]
在式(i)的化合物的一些实施方案中，r3选自：选自：在一些实施方案中，r3是在一些实施方案中，r3是在一些实施方案中，r3是在一些实施方案中，r3是在一些实施方案中，r3是在一些实施方案中，r3是在一些实施方案中，r3是在一些实施方案中，r3是在一些实施方案中，r3是在一些实施方案中，r3是在一些实施方案中，r3是
在一些实施方案中，r3是在一些实施方案中，r3是在一些实施方案中，r3是
[0042]
在式(i)的化合物的一些实施方案中，r
3a
是任选地被c
1-c6卤代烷基或-cn取代的c
3-c6环烷基，诸如环丙基、环丁基、环戊基、或环己基，其中的每一个任选地被c
1-c6卤代烷基或-cn取代。在一些实施方案中，r
3a
是未经取代的c
3-6
环烷基，诸如环丙基、环丁基、环戊基、或环己基，其中的每一个是未经取代的。在一些实施方案中，r
3a
是任选地被c
1-c6卤代烷基取代的c
3-c6环烷基，诸如环丙基、环丁基、环戊基、或环己基，其中的每一个任选地被c
1-c6卤代烷基取代。在一些实施方案中，r
3a
是任选地被-cn取代的c
3-c6环烷基，诸如环丙基、环丁基、环戊基、或环己基，其中的每一个任选地被-cn取代。在一些实施方案中，r
3a
是是在一些实施方案中，r
3a
是在一些实施方案中，r
3a
是在一些实施方案中，r
3a
是在一些实施方案中，r
3a
是在一些实施方案中，r
3a
是任选地被卤素、-oh或-cn取代的c
1-c6烷基，诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、或仲丁基，其中的每一个任选地被卤素、-oh或-cn取代。在一些实施方案中，r
3a
是未经取代的c
1-c6烷基，诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、或仲丁基，其中的每一个是未经取代的。在一些实施方案中，r
3a
是任选地被卤素取代的c
1-c6烷基，诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、或仲丁基，其中的每一个任选地被卤素取代。在一些实施方案中，r
3a
是任选地被-oh取代的c
1-c6烷基，诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、或仲丁基，其中的每一个任选地被-oh取代。在一些实施方案中，r
3a
是任选地被-oh取代的c
1-c6烷基，诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、或仲丁基，其中的每一个任选地被-cn取代。在一些实施方案中，r
3a
是是在一些实施方案中，r
3a
是在一些实施方案中，r
3a
是在一些实施方案中，r
3a
是在一些实施方案中，r
3a
是在一些实施方案中，r
3a
是在一些实施方案中，r
3a
是在一些实施方案中，r
3a
是
[0043]
在式(i)的化合物的一些实施方案中，r
3b
是-cn。在一些实施方案中，r
3b
是卤素，诸如氟、氯、溴、或碘。在一些实施方案中，r
3b
是氟。在一些实施方案中，r
3b
是氯。在一些实施方案中，r
3b
是溴。
[0044]
在式(i)的化合物的一些实施方案中，r3选自：
[0045]
在式(i)的化合物的一些实施方案中，m是0。在一些实施方案中，m是1。在一些实施方案中，m是2。在一些实施方案中，m是3。在一些实施方案中，m是0、1、或2。在一些实施方案中，m是0或1。
[0046]
在式(i)的化合物的一些实施方案中，r1是f。在一些实施方案中，r1是cl。在一些实施方案中，r1是甲基。
[0047]
在式(i)的化合物的一些实施方案中，n是0。在一些实施方案中，n是1。在一些实施
方案中，n是2。在一些实施方案中，n是3。在一些实施方案中，n是4。在一些实施方案中，n是0、1、2、或3。在一些实施方案中，n是0、1、或2。在一些实施方案中，n是0或1。
[0048]
在式(i)的化合物的一些实施方案中，每个r4独立地是c
1-c6烷基，或两个r4当与相同的碳结合时与它们附接的碳一起形成c
3-c6环烷基。在一些实施方案中，每个r4独立地是c
1-c6烷基，诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、或仲丁基。在一些实施方案中，n是1并且r4是c
1-c6烷基。在一些实施方案中，n是2并且每个r4独立地是c
1-c6烷基。在一些实施方案中，n是2并且每个r4是甲基。在一些实施方案中，n是2并且两个r4当与相同的碳结合时与它们附接的碳一起形成c
3-c6环烷基。
[0049]
在式(i)的化合物的一些实施方案中，y是氢。在一些实施方案中，y是r4。在一些实施方案中，y是c
1-c6烷基、c
2-c6烯基、c
2-c6炔基、c
3-c6环烷基、或3至6元杂环基。在一些实施方案中，y是c
1-c6烷基，诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、或仲丁基。
[0050]
在式(i)的化合物的一些实施方案中，环a、环b、y、r1和r4一起形成选自以下的部分：
在一些实施方案中，环a、环b、y、r1和r4一起形成选自以下的部分：以下的部分：在一些实施方案中，环a、环b、y、r1和r4一起形成在一些实施方案中，环a、环b、y、r1和r4一起形成
在一些实施方案中，环a、环b、y、r1和r4一起形成在一些实施方案中，环a、环b、y、r1和r4一起形成在一些实施方案中，环a、环b、y、r1和r4一起形成在一些实施方案中，环a、环b、y、r1和r4一起形成
[0051]
在式(i)的化合物的一些实施方案中，所述化合物具有一个或多个以下的特征：(i)r2是(1)c
1-c6烷基，诸如异丙基或乙基、(2)c
3-c6环烷基，诸如环丙基，或(3)-(c
1-c3亚烷基)cf3，诸如-ch2cf3；(ii)r3是(4)(4)(4)其中r
3a
是任选地被c
1-c6卤代烷基或-cn取代的c
3-c6环烷基、或任选地被卤素、-oh或-cn取代的c
1-c6烷基，条件是当r
3a
是任选地被卤素、-oh或-cn取代的c
1-c6烷基时，则m1、m2、m3和m4中的至少一个是cr
3b
，并且r
3b
是卤素或-cn，或(5)
(iii)环a、环b、r1和r4一起形成选自以下的部分：在一些实施方案中，(1)适用。在一些实施方案中，(2)适用。在一些实施方案中，(3)适用。在一些实施方案中，(4)适用。在一些实施方案中，(5)适用。在一些实施方案中，(iii)适用。在一些实施方案中，(i)和(4)适用。在一些实施方案中，(i)和(5)适用。在一些实施方案中，(1)和(4)适用。在一些实施方案中，(1)和(5)适用。在一些实施方案中，(2)和(4)适用。在一些实施方案中，(2)和(5)适用。在一些实施方案中，(3)和(4)适用。在一些实施方案中，(3)和(5)适用。在一些实施方案中，(i)和(iii)适用。在一些实施方案中，(1)和(iii)适用。在一些实施方案中，(2)和(iii)适用。在一些实施方案中，(3)和(iii)适用。在一些实施方案中，(4)和(iii)适用。在一些实施方案中，(5)和(iii)适用。在一些实施方案中，(i)、(4)和(iii)适用。在一些实施方案中，(i)、(5)和(iii)适用。在一些实施方案中，(1)、(4)和(iii)适用。在一些实施方案中，(1)、(5)和(iii)适用。在一些实施方案中，(2)、(4)和(iii)适用。在一些实施方案中，(2)、(5)和(iii)适用。在一些实施方案中，(3)、(4)和(iii)适用。在一些实施方案中，(3)、(5)和(iii)适用。
[0052]
在本文的描述中，应理解，某一部分的每个描述、变型、实施方案或方面可以与其他部分的每个描述、变型、实施方案或方面组合，就如同具体地且个别地列出每个描述组合一般。例如，本文提供的关于式(i)的r1的每种描述、变型、实施方案或方面可以与r2、r3、r4、m、n和y的每种描述、变型、实施方案或方面组合，就好像每一种组合被具体且单独地列出一样。还应理解，在适用的情况下，式(i)的所有描述、变型、实施方案或方面同样适用于本文详述的其他式，并且被同等描述，就好像每一个描述、变型、实施方案或方面是对于所有式单独且独立地列出的。例如，在适用的情况下，式(i)的所有描述、变型、实施方案或方面同等地适用于如本文详述的任何式(诸如式(ii)和式(iii))，并且同等地描述，就好像每种描述、变型、实施方案或方面针对所有式被分开且单独地列出一样。
[0053]
还提供了本文所提及的化合物的盐，诸如药学上可接受的盐。本发明还包括所描述的化合物的任何或所有立体化学形式，包括任何对映异构体或非对映异构体形式以及任何互变异构体或其他形式。
[0054]
在一方面，如本文详述的化合物可以呈纯化形式，并且本文详述了包含呈纯化形式的化合物的组合物。提供了包含如本文详述的化合物或其盐的组合物，诸如基本上纯的化合物的组合物。在一些实施方案中，含有如本文详述的化合物或其盐的组合物呈基本上纯的形式。除非另外规定，否则“基本上纯的”意图指组合物含有不超过35％的杂质，其中杂质表示除构成大部分所述组合物的化合物或其盐外的化合物。在一些实施方案中，提供了一种基本上纯的化合物或其盐的组合物，其中所述组合物含有不超过25％、20％、15％、10％或5％的杂质。在一些实施方案中，提供了一种基本上纯的化合物或其盐的组合物，其中所述组合物含有或不超过3％、2％、1％或0.5％的杂质。
[0055]
代表性化合物在表1中列出。表1
[0056]
在一些实施方案中，本文提供了表1中所述的化合物、或其互变异构体、或前述任一种的盐，以及其用途。在一些实施方案中，本文提供了表1中所述的化合物或其药学上可接受的盐。
[0057]
在适用的情况下，本文所描述的实施方案和变型适用于本文详述的任何式的化合物。
[0058]
本文描绘了本文详述的化合物的代表性例子，包括根据本公开文本的中间体和最终化合物。应理解，在一方面，所述化合物中的任一种可以用于本文详述的方法中，包括(在适用的情况下)可以分离并且向个体施用的中间体化合物。
[0059]
即使未描绘盐，本文所描绘的化合物也可以作为盐存在，并且应理解，本公开文本包括此处描绘的化合物的所有盐和溶剂化物以及所述化合物的非盐和非溶剂化物形式，正
如熟练技术人员充分理解的。在一些实施方案中，本文所提供的化合物的盐是药学上可接受的盐。在一个或多个叔胺部分存在于所述化合物中的情况下，还提供并且描述了n-氧化物。
[0060]
在本文所述的任一种化合物可能存在互变异构形式的情况下，即使仅可以明确地描绘一种或一些互变异构形式，也预期了每一种互变异构形式。具体描绘的互变异构形式在溶液中或当根据本文所述的方法使用时可以是或可以不是主要形式。
[0061]
本公开文本还包括所描述的化合物(诸如表1的化合物)的任一种或所有立体化学形式，包括其任何对映异构或非对映异构形式。结构或名称旨在包括所描绘的化合物的所有可能的立体异构体，并且每个独特的立体异构体具有带有后缀“a”、“b”等的化合物编号。本发明还包括所述化合物的所有形式，诸如所述化合物的结晶形式或非结晶形式。还预期了包含本发明化合物的组合物，如基本上纯的化合物(包括其特定立体化学形式)的组合物，或包含任何比率的本发明化合物(包括两种或更多种立体化学形式)的混合物(诸如外消旋或非外消旋混合物)的组合物。
[0062]
本发明还预期了本文所述的化合物的同位素标记和/或同位素富集的形式。本文的化合物可以在构成此类化合物的一个或多个原子处含有非天然比例的原子同位素。在一些实施方案中，所述化合物是同位素标记的，诸如本文所述的式(i)的同位素标记的化合物或其变体，其中一个或多个原子的部分被相同元素的同位素替代。可以掺入本发明化合物中的示例性同位素包括氢、碳、氮、氧、磷、硫、氯的同位素，诸如2h、3h、
11
c、
13
c、
14
c、
13
n、
15
o、
17
o、
32
p、
35
s、
18
f、
36
cl。某些同位素标记的化合物(例如3h和
14
c)可用于化合物或底物组织分布研究。较重的同位素(诸如氘(2h))的掺入可以赋予由更大的代谢稳定性引起的某些治疗优势(例如，增加的体内半衰期或降低的剂量需求)，并且因此在一些情况下可能是优选的。
[0063]
本发明的同位素标记的化合物总体上可以通过本领域技术人员已知的标准方法和技术或通过与所附实施例中所述的那些类似的程序，使用适当的同位素标记的试剂代替相应的未标记的试剂来制备。
[0064]
本发明还包括所描述的任一种化合物的任何或所有代谢物。代谢物可以包括通过所描述的任一种化合物的生物转化产生的任何化学物质，诸如所述化合物的中间体和代谢产物，诸如将在向人施用后在体内产生。
[0065]
提供了在合适的容器中包含本文所述的化合物或其盐或溶剂化物的制品。容器可以是小瓶、罐、安瓿、预装注射器、静脉注射袋等。
[0066]
优选地，本文详述的化合物是口服可生物利用的。然而，所述化合物也可以被配制用于肠胃外(例如，静脉内)施用。
[0067]
本文所述的一种或几种化合物可以通过将作为活性成分的一种或多种化合物与本领域已知的药理学上可接受的载体组合而用于药剂的制备。基于药物的治疗形式，载体可以是各种形式的。在一种变型中，药剂的制造用于本文公开的任一种方法中，例如用于治疗癌症。通用合成方法
[0068]
本发明的化合物可以通过如以下总体描述的并且在下文实施例(诸如在以下实施例中提供的方案)中更具体地描述的多种方法来制备。在以下的方法描述中，当在所描绘的式中使用时，符号应被理解为代表以上关于本文的式的以上所述的那些基团。
[0069]
在希望获得化合物的特定对映异构体的情况下，这可以从相应的对映异构体的混合物中使用用于分离或拆分对映异构体的任何合适的常规程序来实现。因此，例如，非对映异构体衍生物可以通过对映异构体的混合物(例如，外消旋体)与适当的手性化合物的反应来产生。然后可以通过任何便利的手段(例如，通过结晶)分离非对映异构体并且回收所希望的对映异构体。在另一种拆分方法中，可以使用手性高效液相色谱法分离外消旋体。可替代地，如果希望，可以通过在所述方法之一中使用适当的手性中间体来获得特定的对映异构体。
[0070]
色谱法、重结晶和其他常规分离程序也可以与中间体或最终产物一起使用，其中希望获得化合物的特定异构体或以其他方式纯化反应产物。
[0071]
还考虑了本文提供的化合物或其盐的溶剂化物和/或多晶型物。溶剂化物含有化学计量量或非化学计量量的溶剂，并且通常是在结晶过程期间形成的。当溶剂是水时形成水合物，或当溶剂是醇时形成醇化物。多晶型物包括化合物的相同的元素组成的不同晶体堆积排列。多晶型物通常具有不同的x射线衍射图、红外光谱、熔点、密度、硬度、晶体形状，光学和电特性、稳定性和/或溶解性。各种因素(诸如重结晶溶剂、结晶速率、和储存温度)均可能导致单晶形式占主导地位。
[0072]
在一些实施方案中，式(i)、(ii)或(iii)的化合物是根据方案1至方案5合成的。方案1方案2方案3
方案4方案5其中m、n、y、r1、r2、r3和r4是如本文针对式(i)所定义的。在以下实施例部分中提供了具体的例子。药物组合物和配制品
[0073]
本公开文本包括本文详述的任一种化合物的药物组合物。因此，本公开文本包括包含如本文详述的化合物或其盐和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。在一方面，所述药学上可接受的盐是酸加成盐，诸如与无机酸或有机酸形成的盐。药物组合物可以采用适合口服、颊、肠胃外、鼻、局部或直肠施用的形式或适合通过吸入施用的形式。
[0074]
在一方面，如本文详述的化合物可以呈纯化的形式，并且在本文中详述了包含呈纯化的形式的化合物的组合物。提供了包含如本文详述的化合物或其盐的组合物，诸如基本上纯的化合物的组合物。在一些实施方案中，含有如本文详述的化合物或其盐的组合物呈基本上纯的形式。
[0075]
在一个变型中，本文的化合物是制备用于向个体施用的合成化合物。在另一个变型中，提供了含有呈基本上纯的形式的化合物的组合物。在另一个变型中，本公开文本包括含有本文详述的化合物和药学上可接受的载体的药物组合物。在另一个变型中，提供了施用化合物的方法。纯化的形式、药物组合物和施用所述化合物的方法适用于本文详述的任何化合物或其形式。
[0076]
本文详述的化合物或其盐可以被配制用于任何可用的递送途径，包括口腔、粘膜(例如，鼻、舌下、阴道、颊或直肠)、肠胃外(例如，肌内、皮下或静脉内)、局部或透皮递送形式。可以将化合物或其盐与合适的载体一起配制以提供递送形式，所述递送形式包括但不限于片剂、囊片、胶囊(诸如硬明胶胶囊或软弹性明胶胶囊)、扁囊剂、糖锭、锭剂、胶姆剂、分散体、栓剂、软膏剂、泥罨剂(膏状)、糊剂、粉末、敷料、乳膏、溶液、贴剂、气雾剂(例如，鼻喷雾剂或吸入剂)、凝胶、悬浮液(例如，水性液体悬浮液或非水性液体悬浮液、水包油乳液或油包水液体乳液)、溶液和酏剂。
[0077]
本文所述的一种或几种化合物或其盐可以用于通过将作为活性成分的一种或多种化合物或其盐与药学上可接受的载体(诸如以上提到的那些)组合制备配制品，诸如药物配制品。取决于系统的治疗形式(例如，透皮贴剂与口服片剂)，载体可以是各种形式的。此外，药物配制品可以含有防腐剂、增溶剂、稳定剂、再润湿剂、乳化剂、甜味剂、染料、调节剂和用于调节渗透压的盐、缓冲剂、包衣剂或抗氧化剂。包含所述化合物的配制品还可以含有具有有价值的治疗特性的其他物质。药物配制品可以通过已知的药学方法制备。合适的配制品可以例如在remington’s pharmaceutical sciences,mack publishing company,宾夕法尼亚州费城,第20版.(2000)中找到，将其通过引用并入本文。
[0078]
如本文所述的化合物可以以通常接受的口服组合物的形式(诸如片剂、包衣片剂和在硬壳或软壳中的凝胶胶囊、乳液或悬浮液)向个体施用。可用于制备此类组合物的载体的例子是乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、硬脂酸酯或其盐等。对于具有软壳的凝胶胶囊可接受的载体是，例如，植物油、蜡、脂肪、半固体和液体多元醇等。此外，药物配制品可以含有防腐剂、增溶剂、稳定剂、再润湿剂、乳化剂、甜味剂、染料、调节剂和用于调节渗透压的盐、缓冲剂、包衣剂或抗氧化剂。
[0079]
可以将本文所述的任何化合物配制成呈所描述的任何剂型的片剂，例如，如本文所述的化合物或其盐可以配制成10mg片剂。
[0080]
还描述了包含本文提供的化合物的组合物。在一个变型中，所述组合物包含化合物或其盐和药学上可接受的载体或赋形剂。在另一个变型中，提供了基本上纯的化合物的组合物。使用方法
[0081]
本文详述的化合物和组合物(诸如含有本文提供的任何式的化合物或其盐和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物)可以用于如本文提供的施用和治疗方法。所述化合物和组合物也可以用于体外方法(诸如将化合物或组合物施用至细胞用于筛选目的和/
或用于进行质量控制测定的体外方法)中。
[0082]
本文提供了一种治疗个体的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其任何实施方案、变型或方面(统称为，式(i)、(ii)或(iii)的化合物或本发明化合物或本文详述或描述的化合物)或其药学上可接受的盐。本文进一步提供了一种疗个体的增殖性疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其药学上可接受的盐。本文还提供了一种治疗个体的癌症的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，根据本文所述的施用剂量和/或方法向个体施用所述化合物。
[0083]
在一些实施方案中，个体的癌症具有一个或多个tp53基因突变或表达突变型p53。在一些实施方案中，具有一个或多个tp53基因突变或表达突变型p53的个体中的癌症是胶质母细胞瘤。tp53是编码p53的人基因。在一些实施方案中，本文提供了一种治疗个体的癌症的方法，所述方法包括(a)基于以下选择用于治疗的个体：(i)癌症中tp53基因的一个或多个突变的存在，或(ii)癌症中突变型p53的表达，以及向所述个体施用有效量的式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，测定癌症的突变型p53的表达。在一些实施方案中，对癌症的tp53基因进行测序以检测一种或多种突变。在一些实施方案中，通过对癌症进行活检并且对来自活检癌症的tp53基因进行测序来对tp53基因进行测序。在一些实施方案中，通过对来自个体的循环肿瘤dna(ctdna)进行测序来对tp53基因进行测序。
[0084]
在一些实施方案中，本文提供一种使用式(i)、(ii)或(iii)的化合物或任何实施方案在制造用于治疗疾病的药剂中的方法。在一些实施方案中，本文提供了一种使用式(i)、(ii)或(iii)的化合物或任何实施方案在制造用于治疗癌症的药剂中的方法。
[0085]
在一些实施方案中，式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其盐用于治疗具有增殖性疾病(诸如本文所述的癌症)的个体。在一些实施方案中，所述个体有风险患上增殖性疾病，诸如癌症。在这些实施方案中的一些中，基于一个或多个风险因素确定个体有风险患上癌症。在这些实施方案中的一些中，所述风险因素是与癌症相关的家族史和/或基因。
[0086]
本发明化合物或其盐被认为对于治疗多种疾病和障碍是有效的。例如，在一些实施方案中，本发明组合物可以用于治疗增殖性疾病，诸如癌症。在一些实施方案中，所述癌症是实体瘤。在一些实施方案中，所述癌症是以下中的任一种：成人肿瘤学和儿科肿瘤学、粘液样细胞癌和圆形细胞癌、局部晚期肿瘤、转移性癌症、人软组织肉瘤(包括尤因氏肉瘤)、癌症转移(包括淋巴转移)、鳞状细胞癌(特别是头颈鳞状细胞癌)、食管鳞状细胞癌、口腔癌、血细胞恶性肿瘤(包括多发性骨髓瘤)、白血病(包括急性淋巴细胞白血病、急性非淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞白血病、和毛细胞白血病)、积液性淋巴瘤(基于体腔的淋巴瘤)、胸腺淋巴瘤、皮肤t细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、肾上腺皮质癌、产生acth的肿瘤、肺癌(包括小细胞癌和非小细胞癌)、乳腺癌(包括小细胞癌和导管癌)、胃肠癌(包括胃癌、结肠癌、结直肠癌、与结直肠肿瘤相关的息肉)、胰腺癌、肝癌、泌尿癌(包括膀胱癌，包括原发性浅表性膀胱肿瘤、膀胱侵袭性移行细胞癌和肌肉浸润性膀胱癌)、前列腺癌、女性生殖道恶性肿瘤(包括卵巢癌、原发性腹膜上皮性肿瘤、宫颈癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、子宫癌和卵巢滤泡实体瘤)、男性生殖道恶性肿瘤(包括睾丸癌和阴茎癌)、肾癌(包括肾细胞癌)、脑癌(包括内源性脑肿瘤、神经母细胞瘤、星形细胞脑
肿瘤、神经胶质瘤、中枢神经系统中的转移性肿瘤细胞侵入)、骨癌(包括骨瘤和骨肉瘤)、皮肤癌(包括黑素瘤、人皮肤角质形成细胞的肿瘤进展、鳞状细胞癌)、甲状腺癌、视网膜母细胞瘤、神经母细胞瘤、腹腔积液、恶性胸腔积液、间皮瘤、威尔姆氏肿瘤、胆囊癌、滋养层细胞肿瘤、血管外皮细胞瘤和卡波西肉瘤。
[0087]
在一些实施方案中，本文所述的化合物和组合物抑制细胞(诸如癌细胞)中的g
2-m检查点。在一些实施方案中，癌细胞是来自本文所述的任何癌症类型的癌细胞。g
2-m dna损伤检查点的抑制导致细胞过早有丝分裂，并且因此导致细胞凋亡。在一些实施方案中，本文提供了一种抑制细胞中g
2-m dna损伤检查点的方法，所述方法包括向所述细胞施用有效量的式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，在细胞群体中约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约70％或更多、约80％或更多、约85％或更多，约90％或更多、约95％或更多、约96％或更多、约97％或更多、约98％或更多、或约99％或更多的细胞中抑制g
2-m dna损伤检查点。在一些实施方案中，在细胞群体中高达约99％、高达约98％、高达约97％、高达约96％、高达约95％、高达约90％、高达约85％、或高达约80％的细胞中抑制g
2-m dna损伤检查点。
[0088]
在一些实施方案中，本文提供了一种在细胞中诱导过早有丝分裂的方法，所述方法包括向所述细胞施用有效量的式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，在细胞群体中约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约70％或更多、约80％或更多、约85％或更多，约90％或更多、约95％或更多、约96％或更多、约97％或更多、约98％或更多、或约99％或更多的细胞中诱导过早有丝分裂。在一些实施例中，在细胞群体中高达约99％、高达约98％、高达约97％、高达约96％、高达约95％、高达约90％、高达约85％、或高达约80％的细胞中诱导过早有丝分裂。
[0089]
在一些实施方案中，本文提供了一种在细胞中诱导细胞凋亡的方法，所述方法包括向所述细胞施用有效量的式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，在细胞群体中约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约70％或更多、约80％或更多、约85％或更多，约90％或更多、约95％或更多、约96％或更多、约97％或更多、约98％或更多、或约99％或更多的细胞中诱导细胞凋亡。在一些实施方案中，在细胞群体中高达约99％、高达约98％、高达约97％、高达约96％、高达约95％、高达约90％、高达约85％、或高达约80％的细胞中诱导细胞凋亡。
[0090]
在一些实施方案中，本文提供了一种在细胞中抑制wee1的方法，所述方法包括向所述细胞施用有效量的式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，wee1被抑制约10％或更多、约20％或更多、约30％或更多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多，约70％或更多、约75％或更多、约80％或更多、约90％或更多、约95％或更多、约96％或更多、约97％或更多、约98％或更多、或约99％或更多。在一些实施方案中，wee1被抑制高达约99％、高达约98％、高达约97％、高达约96％、高达约95％、高达约90％、高达约85％、高达约80％、高达约70％、或高达约60％。在一些实施方案中，根据激酶测定测量wee1的活性。
[0091]
在一些实施方案中，本文提供了一种抑制wee1的方法，所述方法包括使wee1与有效量的式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其药学上可接受的盐接触。在一些实施方案中，式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其药学上可接受的盐以以下的ic
50
与wee1结合：小于1μm、小于
900nm、小于800nm、小于700nm、小于600nm、小于500nm、小于400nm、小于300nm、小于200nm、小于100nm、小于50nm、小于10nm、小于5nm、小于1nm、或小于0.5nm。在一些实施方案中，式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其药学上可接受的盐以以下的ic
50
与wee1结合：在0.1nm与1nm之间、1nm与5nm之间、在5nm与10nm之间、在10nm与50nm之间、在50nm与100nm之间、在100nm与200nm之间、在200nm与300nm之间、在300nm与400nm之间、在400nm与500nm之间、在500nm与600nm之间、在600nm与700nm之间、在700nm与800nm之间、在800nm与900nm、或在900nm与1μm之间。在一些实施方案中，根据激酶测定测量ic
50
。在一些实施方案中，根据细胞细胞毒性测定测量ic
50
。
[0092]
在一些实施方案中，本文提供了一种抑制细胞增殖的方法，所述方法包括使所述细胞与有效量的式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其药学上可接受的盐接触。在一些实施方案中，式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其药学上可接受的盐以以下的ic
50
有效抑制细胞增殖：小于5μm、小于2μm、小于1μm、小于900nm、小于800nm、小于700nm、小于600nm、小于500nm、小于400nm、小于300nm、小于200nm、小于100nm、或小于50nm。在一些实施方案中，式(i)、(ii)或(iii)的化合物或药学上可接受的盐以以下的ic
50
有效抑制细胞增殖：在10nm与20nm之间、在20nm与50nm之间、在50nm与100nm之间、在100nm与500nm之间、在500nm与1μm之间、在1μm与2μm、或在2μm与5μm之间。在一些实施方案中，根据细胞增殖测定测量ic
50
。组合疗法
[0093]
如本文所提供的，当前公开的化合物或其盐可以激活免疫系统，例如通过诱导细胞凋亡或抑制癌细胞的有丝分裂。因此，本发明的化合物或其盐可以与其他抗癌剂组合使用以增强肿瘤免疫疗法。在一些实施方案中，本文提供了一种治疗个体的疾病的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其任何实施方案、变型或方面(统称为，式(i)、(ii)或(iii)的化合物或本发明化合物或本文详述或描述的化合物)或其药学上可接受的盐、和另外的治疗剂。在一些实施方案中，所述疾病是增殖性疾病，诸如癌症。
[0094]
在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是癌症免疫疗法药剂。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是化学治疗剂。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是免疫刺激剂。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂靶向检查点蛋白(例如，免疫检查点抑制剂)。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂有效刺激、增强或改善针对肿瘤的免疫反应。在一些实施方案中，所述另外的化学治疗剂是dna烷基化剂、基于铂的化学治疗剂、激酶抑制剂或dna损伤修复(ddr)通路抑制剂。在一些实施方案中，所述另外的化学治疗剂是dna烷基化剂。在一些实施方案中，所述另外的化学治疗剂是基于铂的化学治疗剂。在一些实施方案中，所述另外的化学治疗剂是激酶抑制剂。在一些实施方案中，所述另外的化学治疗剂是dna损伤修复(ddr)通路抑制剂。
[0095]
在另一方面，本文提供了一种用于治疗疾病(诸如癌症)的组合疗法。在一些实施方案中，本文提供了一种治疗个体的疾病的方法，所述方法包括与放射疗法组合，施用有效量的式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其任何实施方案、变型或方面(统称为，式(i)、(ii)或(iii)的化合物或本发明化合物或本文详述或描述的化合物)或其药学上可接受的盐。
[0096]
在一些实施方案中，本文提供一种治疗个体的疾病的方法，所述方法包括(a)施用有效量的式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其任何实施方案、变型或方面(统称为，式(i)、
(ii)或(iii))或其药学上可接受的盐，以及(b)施用有效量的另外的化学治疗剂。在一些实施方案中，所述化学治疗剂是激酶抑制剂或抑制一种或多种dna损伤修复(ddr)通路的药剂。在一些实施方案中，在共施用另外的化学治疗剂之前、之后或同时施用式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，在另外的化学治疗剂之前或之后1或多个小时(诸如2或更多个小时、4或更多个小时、8或更多个小时、12或更多个小时、24或更多个小时、或48或更多个小时)施用式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其药学上可接受的盐。
[0097]
可以与式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其药学上可接受的盐组合使用的化学治疗剂的例子包括dna靶向剂、dna烷基化剂(诸如环磷酰胺、氮芥、苯丁酸氮芥、美法仑、达卡巴嗪、替莫唑胺或亚硝基脲)、拓扑异构酶抑制剂(诸如拓扑异构酶i抑制剂(例如，伊立替康或拓扑替康)或拓扑异构酶ii抑制剂(例如，依托泊苷或替尼泊苷))、蒽环类药物(诸如道诺霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、或戊柔比星)、组蛋白脱乙酰化酶抑制剂(诸如伏立诺他或罗米地辛)、布罗莫结构域抑制剂、其他表观遗传抑制剂、紫杉烷(诸如紫杉醇或多西紫杉醇)、激酶抑制剂(诸如硼替佐米、埃罗替尼、吉非替尼、伊马替尼、维莫非尼、或维莫德吉)、抗血管生成抑制剂、核苷酸类似物或前体类似物(诸如阿扎胞苷、硫唑嘌呤、卡培他滨、阿糖胞苷、去氧氟尿苷、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、巯嘌呤、甲氨蝶呤、或硫鸟嘌呤)、或基于铂的化学治疗剂(诸如顺铂、卡铂、或奥沙利铂)、培美曲塞、或其组合。在一些实施方案中，本文提供了一种治疗个体的疾病的方法，所述方法包括(a)施用有效量的式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其任何实施方案、变型或方面(统称为式(i)、(ii)或(iii))或其药学上可接受的盐，以及(b)施用有效量的激酶抑制剂(诸如硼替佐米、埃罗替尼、吉非替尼、伊马替尼、维莫非尼、或维莫德吉)。在一些实施方案中，在共施用激酶抑制剂之前、之后或同时施用式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，在激酶抑制剂之前或之后1或多个小时(诸如2或更多个小时、4或更多个小时、8或更多个小时、12或更多个小时、24或更多个小时、或48或更多个小时)施用式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其药学上可接受的盐。
[0098]
在一些实施方案中，本文提供一种治疗个体的疾病的方法，所述方法包括(a)施用有效量的式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其任何实施方案、变型或方面(统称为，式(i)、(ii)或(iii))或其药学上可接受的盐，以及(b)施用有效量的dna损伤剂。在一些实施方案中，在共施用dna损伤剂之前、之后或同时施用式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，在dna损伤剂之前或之后1或多个小时(诸如2或更多个小时、4或更多个小时、8或更多个小时、12或更多个小时、24或更多个小时、或48或更多个小时)施用式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其药学上可接受的盐。
[0099]
在一些实施方案中，本文提供了一种治疗个体的疾病的方法，所述方法包括(a)施用有效量的式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其任何实施方案、变型或方面(统称为式(i)、(ii)或(iii))或其药学上可接受的盐，以及(b)施用有效量的dna烷基化剂(诸如环磷酰胺、氮芥、苯丁酸氮芥、美法仑、达卡巴嗪、替莫唑胺或亚硝基脲)。在一些实施方案中，在共施用dna烷基化剂之前、之后或同时施用式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，在dna烷基化剂之前或之后1或多个小时(诸如2或更多个小时、4或更多个小时、8或更多个小时、12或更多个小时、24或更多个小时、或48或更多个小时)施用式
(i)、(ii)或(iii)的化合物或其药学上可接受的盐。
[0100]
在一些实施方案中，本文提供了一种治疗个体的疾病的方法，所述方法包括(a)施用有效量的式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其任何实施方案、变型或方面(统称为式(i)、(ii)或(iii))或其药学上可接受的盐，以及(b)施用有效量的拓扑异构酶抑制剂(诸如拓扑异构酶i抑制剂(例如，伊立替康或拓扑替康)或拓扑异构酶ii抑制剂(例如，依托泊苷或替尼泊苷))。在一些实施方案中，在共施用拓扑异构酶抑制剂之前、之后或同时施用式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，在拓扑异构酶抑制剂之前或之后1或多个小时(诸如2或更多个小时、4或更多个小时、8或更多个小时、12或更多个小时、24或更多个小时、或48或更多个小时)施用式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其药学上可接受的盐。
[0101]
在一些实施方案中，本文提供了一种治疗个体的疾病的方法，所述方法包括(a)施用有效量的式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其任何实施方案、变型或方面(统称为式(i)、(ii)或(iii))或其药学上可接受的盐，以及(b)施用有效量的蒽环类药物(诸如道诺霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、或戊柔比星)。在一些实施方案中，在共施用蒽环类药物之前、之后或同时施用式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，在蒽环类药物之前或之后1或多个小时(诸如2或更多个小时、4或更多个小时、8或更多个小时、12或更多个小时、24或更多个小时、或48或更多个小时)施用式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其药学上可接受的盐。
[0102]
在一些实施方案中，本文提供一种治疗个体的疾病的方法，所述方法包括(a)施用有效量的式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其任何实施方案、变型或方面(统称为，式(i)、(ii)或(iii))或其药学上可接受的盐，以及(b)施用有效量的组蛋白脱乙酰化酶抑制剂(诸如伏立诺他或罗米地辛)。在一些实施方案中，在共施用组蛋白脱乙酰化酶抑制剂之前、之后或同时施用式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，在组蛋白脱乙酰化酶抑制剂之前或之后1或多个小时(诸如2或更多个小时、4或更多个小时、8或更多个小时、12或更多个小时、24或更多个小时、或48或更多个小时)施用式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其药学上可接受的盐。
[0103]
在一些实施方案中，本文提供一种治疗个体的疾病的方法，所述方法包括(a)施用有效量的式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其任何实施方案、变型或方面(统称为，式(i)、(ii)或(iii))或其药学上可接受的盐，以及(b)施用有效量的紫杉烷(诸如紫杉醇或多西紫杉醇)。在一些实施方案中，在共施用紫杉烷之前、之后或同时施用式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，在紫杉烷之前或之后1或多个小时(诸如2或更多个小时、4或更多个小时、8或更多个小时、12或更多个小时、24或更多个小时、或48或更多个小时)施用式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其药学上可接受的盐。
[0104]
在一些实施方案中，本文提供了一种治疗个体的疾病的方法，所述方法包括(a)施用有效量的式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其任何实施方案、变型或方面(统称为式(i)、(ii)或(iii))或其药学上可接受的盐，以及(b)施用有效量的核苷酸类似物或前体类似物(诸如阿扎胞苷、硫唑嘌呤、卡培他滨、阿糖胞苷、去氧氟尿苷、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、巯嘌呤、甲氨蝶呤、或硫鸟嘌呤)。在一些实施方案中，在共施用核苷酸类似物或前体类似物之前、之后或同时施用式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其药学上可接受的盐。在一些实
施方案中，在核苷酸类似物或前体类似物之前或之后1或多个小时(诸如2或更多个小时、4或更多个小时、8或更多个小时、12或更多个小时、24或更多个小时、或48或更多个小时)施用式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其药学上可接受的盐。
[0105]
在一些实施方案中，本文提供一种治疗个体的疾病的方法，所述方法包括(a)施用有效量的式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其任何实施方案、变型或方面(统称为，式(i)、(ii)或(iii))或其药学上可接受的盐，以及(b)施用有效量的基于铂的化学治疗剂(诸如顺铂、卡铂、或奥沙利铂)。在一些实施方案中，在共施用基于铂的化学治疗剂之前、之后或同时施用式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，在基于铂的化学治疗剂之前或之后1或多个小时(诸如2或更多个小时、4或更多个小时、8或更多个小时、12或更多个小时、24或更多个小时、或48或更多个小时)施用式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其药学上可接受的盐。
[0106]
在一些实施方案中，本文提供一种治疗个体的疾病的方法，所述方法包括(a)施用有效量的式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其任何实施方案、变型或方面(统称为，式(i)、(ii)或(iii))或其药学上可接受的盐，以及(b)施用有效量的培美曲塞。在一些实施方案中，在共施用培美曲塞之前、之后或同时施用式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，在培美曲塞之前或之后1或多个小时(诸如2或更多个小时、4或更多个小时、8或更多个小时、12或更多个小时、24或更多个小时、或48或更多个小时)施用式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其药学上可接受的盐。
[0107]
在一些实施方案中，本文提供一种治疗个体的疾病的方法，所述方法包括(a)施用有效量的式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其任何实施方案、变型或方面(统称为，式(i)、(ii)或(iii))或其药学上可接受的盐，以及(b)施用有效量的ddr通路抑制剂。在一些实施方案中，在共施用ddr通路抑制剂之前、之后或同时施用式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，在ddr通路抑制剂之前或之后1或多个小时(诸如2或更多个小时、4或更多个小时、8或更多个小时、12或更多个小时、24或更多个小时、或48或更多个小时)施用式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其药学上可接受的盐。所述ddr通路抑制剂的例子包括聚(adp-核糖)聚合酶(parp)抑制剂(诸如奥拉帕尼、卢卡帕尼、尼拉帕尼、或他拉佐帕尼(talazoparib))、共济失调毛细血管扩张突变(atm)蛋白抑制剂、共济失调毛细血管扩张和rad3相关(atr)蛋白抑制剂、检查点激酶1(chk1)抑制剂、或其组合。
[0108]
在一些实施方案中，本文提供一种治疗个体的疾病的方法，所述方法包括(a)施用有效量的式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其任何实施方案、变型或方面(统称为，式(i)、(ii)或(iii))或其药学上可接受的盐，以及(b)施用有效量的parp抑制剂(诸如奥拉帕尼、卢卡帕尼、尼拉帕尼、或他拉佐帕尼)。在一些实施方案中，在共施用parp抑制剂之前、之后或同时施用式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，在parp抑制剂之前或之后1或多个小时(诸如2或更多个小时、4或更多个小时、8或更多个小时、12或更多个小时、24或更多个小时、或48或更多个小时)施用式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其药学上可接受的盐。
[0109]
在一些实施方案中，本文提供一种治疗个体的疾病的方法，所述方法包括(a)施用有效量的式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其任何实施方案、变型或方面(统称为，式(i)、(ii)或(iii))或其药学上可接受的盐，以及(b)施用有效量的atm蛋白抑制剂。在一些实施
方案中，在共施用atm蛋白抑制剂之前、之后或同时施用式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，在atm蛋白抑制剂之前或之后1或多个小时(诸如2或更多个小时、4或更多个小时、8或更多个小时、12或更多个小时、24或更多个小时、或48或更多个小时)施用式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其药学上可接受的盐。
[0110]
在一些实施方案中，本文提供一种治疗个体的疾病的方法，所述方法包括(a)施用有效量的式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其任何实施方案、变型或方面(统称为，式(i)、(ii)或(iii))或其药学上可接受的盐，以及(b)施用有效量的atr蛋白抑制剂。在一些实施方案中，在共施用atr蛋白抑制剂之前、之后或同时施用式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，在atr蛋白抑制剂之前或之后1或多个小时(诸如2或更多个小时、4或更多个小时、8或更多个小时、12或更多个小时、24或更多个小时、或48或更多个小时)施用式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其药学上可接受的盐。
[0111]
在一些实施方案中，本文提供一种治疗个体的疾病的方法，所述方法包括(a)施用有效量的式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其任何实施方案、变型或方面(统称为，式(i)、(ii)或(iii))或其药学上可接受的盐，以及(b)施用有效量的chk1抑制剂。在一些实施方案中，在共施用chk1抑制剂之前、之后或同时施用式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其药学上可接受的盐。在一些实施方案中，在chk1抑制剂之前或之后1或多个小时(诸如2或更多个小时、4或更多个小时、8或更多个小时、12或更多个小时、24或更多个小时、或48或更多个小时)施用式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其药学上可接受的盐。
[0112]
在另一方面，本文提供了一种组合疗法，其中将式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其盐与有效地刺激免疫反应的一种或多种另外的药剂共施用(可以单独地或同时地)，从而进一步增强、刺激或上调受试者的免疫反应。例如，提供了一种用于刺激受试者的免疫反应的方法，所述方法包括向所述受试者施用式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其盐和一种或多种免疫刺激抗体(诸如抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体和/或抗ctla-4抗体)，使得在受试者中刺激免疫反应，例如以抑制肿瘤生长。在一个实施方案中，向所述受试者施用式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其盐和抗pd-1抗体。在另一个实施方案中，向所述受试者施用式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其盐和抗pd-l1抗体。在又另一个实施方案中，向施用所述受试者式(i)的化合物或其盐和抗ctla-4抗体。在另一个实施方案中，所述免疫刺激性抗体(例如，抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体和/或抗ctla-4抗体)是人抗体。可替代地，所述免疫刺激性抗体可以是例如，嵌合抗体或人源化抗体(例如，从小鼠抗pd-1抗体、抗pd-l1抗体和/或抗ctla-4抗体制备的)。
[0113]
在一个实施方案中，本公开文本提供了一种用于治疗增殖性疾病(例如，癌症)的方法，所述方法包括向受试者施用式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其盐和抗pd-1抗体。在进一步的实施方案中，式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其盐以亚治疗剂量施用，所述抗pd-1抗体以亚治疗剂量施用，或者二者均以亚治疗剂量施用。在另一个实施方案中，本公开文本提供了一种用于改变与用免疫刺激剂治疗过度增殖性疾病相关的不良事件的方法，所述方法包括向受试者施用式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其盐和亚治疗剂量的抗pd-1抗体。在某些实施方案中，所述受试者是人。在某些实施方案中，所述抗pd-1抗体是人序列单克隆抗体。
[0114]
在一个实施方案中，本发明提供了一种用于治疗过度增殖性疾病(例如，癌症)的
方法，所述方法包括向受试者施用式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其盐和抗pd-l1抗体。在进一步的实施方案中，式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其盐以亚治疗剂量施用，所述抗pd-l1抗体以亚治疗剂量施用，或者二者均以亚治疗剂量施用。在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于改变与用免疫刺激剂治疗过度增殖性疾病相关的不良事件的方法，所述方法包括向受试者施用式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其盐和亚治疗剂量的抗pd-l1抗体。在某些实施方案中，所述受试者是人。在某些实施方案中，所述抗pd-l1抗体是人序列单克隆抗体。
[0115]
在某些实施方案中，可以将本文所讨论的治疗剂的组合在药学上可接受的载体中作为单一组合物同时施用，或作为单独的组合物同时施用，其中每一种组合物均在药学上可接受的载体中。在另一个实施方案中，可以顺序施用所述治疗剂的组合。例如，可以顺序施用抗ctla-4抗体和式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其盐，诸如首先施用抗ctla-4抗体，并且其次施用式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其盐；或首先施用式式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其盐，并且其次施用抗ctla-4抗体。另外地或可替代地，可以顺序施用抗pd-1抗体和式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其盐，诸如首先施用抗pd-1抗体，并且其次施用式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其盐；或首先施用式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其盐，并且其次施用抗pd-1抗体。另外或可替代地，可以顺序施用抗pd-l1抗体和式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其盐，诸如首先施用抗pd-l1抗体，并且其次施用式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其盐；或首先施用式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其盐，并且其次施用抗pd-l1抗体。
[0116]
此外，如果顺序施用组合疗法的多于一个剂量，则顺序施用的顺序可以在每个施用时间点相反或保持相同的顺序，顺序施用可以与同时施用组合，或其任何组合。
[0117]
任选地，式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其盐的组合可以进一步与免疫原性剂(诸如癌细胞、纯化的肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和碳水化合物分子)、细胞和用编码免疫刺激细胞因子的基因转染的细胞)组合。
[0118]
式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其盐还可以进一步与标准的癌症治疗组合。例如，式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其盐可以有效地与化学治疗方案组合。在这些情况下，可以减少与本公开文本的组合一起施用的其他化学治疗剂的剂量(mokyr等人(1998)cancer research 58:5301-5304)。具有式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其盐的其他组合疗法包括辐射、手术、或激素剥夺(deprivation)。血管生成抑制剂也可以与式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其盐组合。抑制血管生成导致肿瘤细胞死亡，其可以将肿瘤抗原的来源供给宿主抗原呈递通路。
[0119]
在其他例子中，式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其盐可以用于与抗瘤抗体结合。举例来说并且不希望受理论束缚，用抗癌抗体或与毒素缀合的抗癌抗体治疗可以导致癌细胞死亡(例如，肿瘤细胞)，这将增强由ctla-4、pd-1、pd-l1、或式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其盐介导的免疫反应。在一个示例性实施方案中，过度增殖性疾病(例如，癌症肿瘤)的治疗可以包括同时或顺序或其任何组合的抗癌抗体与式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其盐以及抗ctla-4和/或抗pd-1和/或抗pd-l1抗体的组合，这可以增强宿主的抗肿瘤免疫反应。可以用于激活宿主免疫反应性的其他抗体可以进一步与式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其盐组合使用。
[0120]
在一些实施方案中，式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其盐可以与抗cd73疗法(诸如
抗cd73抗体)组合。
[0121]
在又进一步的实施方案中，将式(i)、(ii)或(iii)的化合物或其盐与另一种wee1抑制剂组合施用。给药和施用方法
[0122]
向个体(诸如人)施用的化合物的剂量可以随具体的化合物或其盐、施用方法和正在治疗的具体的疾病(诸如癌症的类型和阶段)而变化。在一些实施方案中，所述化合物或其盐的量是治疗有效量。
[0123]
在一方面，所述化合物的有效量可以是在约0.01与约100mg/kg之间的剂量。考虑到常规因素，例如施用或药物递送的模式或途径；药剂的药代动力学；待治疗的疾病的严重程度和病程；受试者的健康状态、病症和体重，可以通过常规方法(诸如建模、剂量递增、或临床试验)确定本发明化合物的有效量或剂量。示例性剂量是约0.7mg/天至7g/天、或约7mg/天至350mg/天、或约350mg/天至1.75g/天、或约1.75至7g/天的范围。
[0124]
在一方面，本文提供的任何方法可以包括向个体施用药物组合物，所述药物组合物含有有效量的本文提供的化合物或其盐和药学上可接受的赋形剂。
[0125]
可以根据有效给药方案向个体施用本发明的化合物或组合物，持续所希望的时间段或持续时间，诸如至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约6个月、或至少约12个月或更长时间，这在一些变型中可能持续个体的生命的持续时间。在一个变型中，所述化合物以每天或间歇时间表施用。所述化合物可以在一段时间内连续(例如，每天至少一次)向个体施用。给药频率也可以少于每天一次，例如，约每周一次给药。给药频率可以多于每天一次，例如每天两次或三次。给药频率也可以是间歇性的，包括“禁药期”(例如，每天一次给药持续7天，然后不给药持续7天，重复任何14天的时间段，诸如约2个月、约4个月、约6个月或更长时间)。任何给药频率可以采用本文所述的任何化合物以及本文所述的任何剂量。
[0126]
本文提供的化合物或其盐可以经由各种途径向个体施用，所述途径包括例如静脉内、肌内、皮下、口服和透皮。本文提供的化合物可以以低剂量频繁地施用，称为
‘
节律性疗法’，或作为使用单独的或与一种或多种另外的药物组合的化合物的维持疗法的一部分施用。节律性疗法或维持疗法可以包括循环施用本文提供的化合物。节律性疗法或维持疗法可以包括肿瘤内施用本文提供的化合物。
[0127]
在一方面，本发明提供了一种治疗个体的癌症的方法，所述方法通过向个体(例如，人)肠胃外施用有效量的化合物或其盐。在一些实施方案中，施用途径是静脉内、动脉内、肌内、或皮下。在一些实施方案中，施用途径是口服。在仍其他实施方案中，施用途径是透皮。
[0128]
本发明还提供了如本文所述用于治疗、预防和/或延迟癌症的开始和/或发展的组合物(包括药物组合物)和本文所述的其他方法。在某些实施方案中，所述组合物包含以单位剂型存在的药物配制品。
[0129]
还提供了用于本文所述的方法的在合适包装中的包含本文所述的本公开文本的化合物或其盐、组合物和单位剂量的制品。合适的包装是本领域已知的，并且包括例如小瓶、器皿、安瓿、瓶子、罐子、软包装等。制品可以进一步被灭菌和/或密封。试剂盒
[0130]
本公开文本进一步提供了用于实施本发明方法的试剂盒，所述试剂盒包含本文所
述的一种或多种化合物或包含本文所述的化合物的组合物。所述试剂盒可以采用本文公开的任何化合物。在一个变型中，所述试剂盒使用本文所述的化合物或其盐。所述试剂盒可以用于本文所述的任何一种或多种用途，并且相应地可以含有用于治疗癌症的说明书。
[0131]
试剂盒通常包含合适的包装。试剂盒可以包含含有本文所述的任何化合物的一个或多个容器。每种组分(如果存在多于一种组分)可以被包装在单独的容器中，或一些组分可以在交叉反应性和保质期允许的情况下组合在一个容器中。
[0132]
所述试剂盒可以是单位剂型、大包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。例如，可以提供这样的试剂盒，其含有足够剂量的本文所公开的化合物和/或可用于本文所详述的疾病的另外的药物活性化合物，以向个体提供有效的治疗，持续较长的时间段，诸如一周、2周、3周、4周、6周、8周、3个月、4个月、5个月、7个月、8个月、9个月中或更长时间的任一个。试剂盒还可以包括多个单位剂量的化合物和使用说明书，并且以足以在药房(例如，医院药房和复合药房)中储存和使用的量包装。
[0133]
试剂盒可以任选地包括涉及本发明方法的一种或多种组分的使用的一组说明书，通常是书面说明书，尽管含有说明书的电子存储介质(例如，磁碟或光盘)也是可接受的。试剂盒中包括的说明书通常包括关于组分及其对个体的施用的信息。
[0134]
通过参考以下实施例可以进一步理解本发明，所述实施例是通过说明的方式提供的，而不意味着是限制性的。实施例实施例s-1：1-(5-氟-6-(2-氟丙-2-基)吡啶-2-基)-2-异丙基-6-((1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)氨基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(化合物号1.1)的合成
[0135]
步骤1：2-(6-溴-3-氟吡啶-2-基)丙-2-醇的合成：在氮气气氛下在-78℃下向2-溴-5-氟吡啶(2g，11.36mmol)在乙醚(30ml)中的溶液中缓慢添加正丁基锂(在己烷中2.5m，7.8ml，12.49mmol)。将所得的黄色反应混合物在-78℃下搅拌2小时并且经30分钟添加无水丙酮(1.0ml，13.63mmol)。在-78℃下继续搅拌1小时。添加hcl(2n，50ml)并且将反应混合物温热至0℃。将混合物的ph用2n hcl溶液调节至7。将反应混合物用乙酸乙酯稀释并且用盐水洗涤，经硫酸钠干燥以得到粗产物，将其通过快速色谱法[硅胶100-200目；在己烷中的0-50％etoac洗脱]纯化以得到呈黄色半固体的所希望的产物2-(6-溴-3-氟-吡啶-2-基)-丙-2-醇(1.5g，56.81％)。lcms：234.1[m 2]

。
[0136]
步骤2：6-溴-3-氟-2-(2-氟丙-2-基)吡啶的合成：在-78℃下向2-(6-溴-3-氟吡
啶-2-基)丙-2-醇(0.500g，2.14mmol，1.0当量)在dcm(10ml)中的搅拌溶液中添加dast(0.38ml，2.36mmol，1.1当量)。将反应混合物在室温下搅拌12h。反应完成后，将反应混合物用饱和碳酸氢钠溶液淬灭并且用etoac(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法[硅胶100-200目；在己烷中的0-10％etoac洗脱]纯化以得到呈无色液体的所希望的化合物(200mg，39.66％)。lcms：236.1[m 2]

。
[0137]
步骤3：1-(5-氟-6-(2-氟丙-2-基)吡啶-2-基)-2-异丙基-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮的合成：向2-异丙基-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(224mg，1.0mmol，1.0当量)和6-溴-3-氟-2-(2-氟丙-2-基)吡啶(236mg，1.0mmol，1.0当量)在二噁烷(10ml)中的搅拌溶液中添加碳酸钾(276mg，2.0mmol，2.0当量)并且将所得的混合物用氮气吹扫10min，然后添加碘化亚铜(38mg，0.2mmol，0.2当量)和n,n'-二甲基乙二胺(dmeda)(0.05ml，0.4mmol，0.4当量)并且用氮气再次吹扫10min，然后在90℃下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用水稀释并且用etoac(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法纯化以得到呈灰白色固体的所希望的化合物(200mg，52.6％)。lcms：380.2[m 1]

。
[0138]
步骤4：6-((1-(5-氟-6-(2-氟丙-2-基)吡啶-2-基)-2-异丙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯的合成：向1-(5-氟-6-(2-氟丙-2-基)吡啶-2-基)-2-异丙基-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(190mg，0.5mmol，1.0当量)在甲苯(2.0ml)中的搅拌溶液中添加m-cpba(245mg，1.0mmol，2.0当量)并且允许在室温下搅拌1h。添加6-氨基-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(149mg，0.6mmol，1.2当量)和dipea(0.44ml，2.5mmol，5.0当量)并且允许在室温下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用水稀释并且用etoac(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法[硅胶100-200目；在己烷中的0-50％etoac洗脱]纯化以得到呈灰白色固体的所希望的化合物(100mg，34.6％)。lcms：580.3[m 1]

。
[0139]
步骤5：1-(5-氟-6-(2-氟丙-2-基)吡啶-2-基)-2-异丙基-6-((1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)氨基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮的合成：将6-((1-(5-氟-6-(2-氟丙-2-基)吡啶-2-基)-2-异丙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(100mg，0.17mmol，1.0当量)溶解在二噁烷(1.0ml)中，然后逐滴添加4.0m-hcl(1.0ml)并且允许在室温下搅拌2h。反应完成后，将溶剂蒸发以得到粗产物，将其通过反相色谱法纯化以得到呈灰白色固体的所希望的化合物(45mg，55.5％)。lcms:457.3[m 1]

；1h nmr(400mhz,dmso-d
6,
甲酸盐):δ10.24(br s,1h)8.82(s,1h)8.69(br s,1h)8.39(d,j＝7.45hz,1h)8.28(br s,1h)8.10(t,j＝9.65hz,1h)7.96(d,j＝8.33hz,2h)7.55(br s,1h)7.35-7.49(m,2h)7.03(d,j＝8.33hz,1h)4.11-4.22(m,2h)3.96(br s,2h)3.08-3.17(m,2h)2.79(br s,2h)1.77(s,3h)1.71(s,3h)1.33(d,j＝6.58hz,6h)。实施例s-2：2-环丙基-1-(5-氟-6-(2-氟丙-2-基)吡啶-2-基)-6-((1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)氨基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(化合物号1.2)的合成
[0140]
步骤1：2-环丙基-1-(5-氟-6-(2-氟丙-2-基)吡啶-2-基)-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮的合成：向2-环丙基-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(230mg，1.03mmol，1.0当量)和6-溴-3-氟-2-(2-氟丙-2-基)吡啶(291mg，1.24mmol，1.2当量)在二噁烷(5ml)中的搅拌溶液中添加碳酸钾(285mg，2.06mmol，2.0当量)并且将所得的混合物用氮气吹扫10min，然后添加碘化亚铜(39.4mg，0.20mmol，0.2当量)和n,n'-二甲基乙二胺(dmeda)(0.04ml，0.41mmol，0.4当量)并且用氮气再次吹扫10min，然后在130℃下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用水稀释并且用etoac(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法[硅胶100-200目；在己烷中的0-50％etoac洗脱]纯化以得到呈黄色半固体的所希望的产物(180mg，48.74％)。lcms：378.11[m 1]

。
[0141]
步骤2：6-((2-环丙基-1-(5-氟-6-(2-氟丙-2-基)吡啶-2-基)-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯的合成：向2-环丙基-1-(5-氟-6-(2-氟丙-2-基)吡啶-2-基)-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(190mg，0.50mmol，1.0当量)在甲苯(3.0ml)中的搅拌溶液中添加m-cpba(174mg，1.00mmol，2.0当量)并且允许在室温下搅拌60分钟。添加6-氨基-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(150mg，0.60mmol，1.2当量)和dipea(0.4ml，0.55mmol，4.0当量)并且允许在室温下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用水稀释并且用etoac(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法[硅胶100-200目；在己烷中的0-50％etoac洗脱]纯化以得到呈浅黄色固体的所希望的化合物(130mg，44.77％)。lcms：578.3[m 1]

。
[0142]
步骤3：2-环丙基-1-(5-氟-6-(2-氟丙-2-基)吡啶-2-基)-6-((1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)氨基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮二盐酸盐的合成：将6-((2-环丙基-1-(5-氟-6-(2-氟丙-2-基)吡啶-2-基)-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(130mg，0.22mmol，1.0当量)溶解在二噁烷(2ml)中，然后逐滴添加在二噁烷(3ml)中的4.0m-hcl并且允许在室温下搅拌2h。反应完成后，将反应混合物过滤并且在减压下干燥；将获得的粗产物通过反相色谱法纯化以得到呈灰白色固体的所希望的化合物(2mg，20.48％)。lcms:478.3[m 1]

；1h nmr(400mhz,dmso-d
6,
hcl盐):δ10.17(br s,1h)8.79(s,1h)8.31(br s,1h)8.04
–
8.18(m,2h)7.96(dd,1h)7.56(br s,1h)7.40(d,j＝7.89hz,1h)7.02(d,1h)3.91(br s,2h)3.14(br s,2h)3.07(br s,2h)2.75(br s,2h)1.77(s,3h)1.72(s,3h)。实施例s-3：1-(5-氟-6-(2-氟丙-2-基)吡啶-2-基)-2-异丙基-6-((1,2,3,4-四氢异喹啉-7-基)氨基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(化合物号1.4)的合成
[0143]
步骤1：7-((1-(5-氟-6-(2-氟丙-2-基)吡啶-2-基)-2-异丙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯的合成：向1-(5-氟-6-(2-氟丙-2-基)吡啶-2-基)-2-异丙基-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(130mg，0.3mmol，1.0当量)在甲苯(2.0ml)中的搅拌溶液中添加m-cpba(148mg，0.6mmol，2.0当量)并且允许在室温下搅拌1h。添加7-氨基-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(149mg，0.6mmol，1.2当量)和dipea(0.27ml，1.5mmol，5.0当量)并且允许在室温下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用水稀释并且用etoac(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法[硅胶100-200目；在己烷中的0-50％etoac洗脱]纯化以得到呈灰白色固体的所希望的化合物(120mg，68.9％)。lcms：580.4[m 1]

。
[0144]
步骤2：1-(5-氟-6-(2-氟丙-2-基)吡啶-2-基)-2-异丙基-6-((1,2,3,4-四氢异喹啉-7-基)氨基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮的合成：将7-((1-(5-氟-6-(2-氟丙-2-基)吡啶-2-基)-2-异丙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(120mg，0.21mmol，1.0当量)溶解在二噁烷(2.0ml)中，然后逐滴添加在二噁烷(2.0ml)中的4.0m-hcl并且允许在室温下搅拌1h。反应完成后，将溶剂蒸发以得到粗产物，将其通过反相色谱法纯化以得到作为甲酸盐的呈灰白色固体的所希望的化合物(32mg，32.0％)。lcms:480.5[m 1]

；1h nmr(400mhz,dmso-d
6,
甲酸盐):δ10.25(br sbr s,1h)8.82(s,1h)8.28(br s,1h)8.05-8.13(m,1h)7.97(d,j＝6.58hz,1h)7.52(br sbr s,1h)7.38(d,j＝8.33hz,1h)7.06(d,j＝7.89hz,1h)4.12-4.19(m,2h)3.96(br sbr s,2h)3.07(br sbr s,2h)2.73(br sbr s,2h)1.77(s,3h)1.71(s,3h)1.34(d,j＝6.58hz,6h)。实施例s-4：1-(2-环丙基噻唑-4-基)-2-异丙基-6-((1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)氨基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(化合物号1.464)的合成
[0145]
步骤1：4-溴-2-环丙基噻唑的合成：向2,4-二溴噻唑(1.0g，4.11mmol，1.0当量)和环丙基硼酸(424mg，4.93mmol，1.2当量)在二噁烷(12ml)中的搅拌溶液中添加k3po4(1.11g，8.08mmol，2当量)并且将所得的混合物用氮气吹扫10min，然后添加xanthphos(119mg，0.20mmol，0.2当量)和pd(oac)2(46mg，0.20mmol，0.4当量)并且用氮气再次吹扫10min，在
90℃下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用水稀释并且用etoac(250ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(250ml)和盐水溶液(250ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法纯化以得到呈灰白色固体的所希望的化合物(600mg，71.42％)。lcms：204.1[m 1]

。
[0146]
步骤2：1-(2-环丙基噻唑-4-基)-2-异丙基-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮的合成：向2-异丙基-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(659mg，2.93mmol，1.0当量)和4-溴-2-环丙基噻唑(600mg，2.93mmol，1.0当量)在二噁烷(12ml)中的搅拌溶液中添加碳酸钾(810mg，5.86mmol，2.0当量)并且将所得的混合物用氮气吹扫10min，然后添加碘化亚铜(112mg，0.58mmol，0.2当量)和n,n'-二甲基乙二胺(dmeda)(0.13ml，1.17mmol，0.4当量)并且用氮气再次吹扫10min，然后在90℃下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用水稀释并且用etoac(250ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(250ml)和盐水溶液(250ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法纯化以得到呈灰白色固体的所希望的化合物(256mg，25.07％)。lcms：348.1[m 1]

。
[0147]
步骤1：6-((1-(2-环丙基噻唑-4-基)-2-异丙基-3-氧代-2,3-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯的合成：向1-(2-环丙基噻唑-4-基)-2-异丙基-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(128mg，0.36mmol，1当量)在甲苯(3.0ml)中的搅拌溶液中添加m-cpba(127mg，0.73mmol，2.0当量)并且允许在室温下搅拌1h。添加6-氨基-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(91mg，0.36mmol，1.0当量)和dipea(0.25ml，1.47mmol，4.0当量)并且允许在室温下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用水稀释并且用etoac(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法[硅胶100-200目；在己烷中的0-50％etoac洗脱]纯化以得到呈灰白色固体的所希望的化合物(86mg，42.62％)。lcms：548.3[m 1]

。
[0148]
步骤4：1-(2-环丙基噻唑-4-基)-2-异丙基-6-((1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)氨基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮盐酸盐的合成：将6-((1-(2-环丙基噻唑-4-基)-2-异丙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(86mg，0.15mmol，1.0当量)溶解在二噁烷(1ml)中，然后逐滴添加在二噁烷(1ml)中的4.0m-hcl并且允许在室温下搅拌1h。反应完成后，将反应混合物过滤并且在减压下干燥以得到呈灰白色固体的所希望的化合物(30mg，39.47％)。lcms:448.3[m 1]

；1h nmr(400mhz,dmso-d6,hcl盐):δ10.27(br sbr s,1h)9.20(br sbr s,2h)8.84(s,1h)7.90(s,1h)7.67(br sbr s,1h)7.48(d,j＝7.89hz,1h)7.11(d,j＝8.77hz,1h)4.28(dt,j＝13.59,6.80hz,1h)4.19(br sbr s,2h)3.35(br sbr s,2h)2.92(br sbr s,2h)1.17-1.27(m,6h)1.07-1.17(m,2h)0.88-0.97(m,2h)。实施例s-5：1-(2-环丙基噻唑-4-基)-2-异丙基-6-((1,2,3,4-四氢异喹啉-7-基)氨基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(化合物号1.465)的合成
[0149]
步骤1：7-((1-(2-环丙基噻唑-4-基)-2-异丙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯的合成：向1-(2-环丙基噻唑-4-基)-2-异丙基-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(128mg，0.36mmol，1当量)在甲苯(3.0ml)中的搅拌溶液中添加m-cpba(127mg，0.73mmol，2.0当量)并且允许在室温下搅拌1h。添加7-氨基-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(91mg，0.36mmol，1.0当量)和dipea(0.25ml，1.47mmol，4.0当量)并且允许在室温下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用水稀释并且用etoac(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法[硅胶100-200目；在己烷中的0-50％etoac洗脱]纯化以得到呈灰白色固体的所希望的化合物(86mg，51.54％)。lcms：548.3[m 1]

。
[0150]
步骤2：1-(2-环丙基噻唑-4-基)-2-异丙基-6-((1,2,3,4-四氢异喹啉-7-基)氨基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮盐酸盐的合成：将7-((1-(2-环丙基噻唑-4-基)-2-异丙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(104mg，0.18mmol，1.0当量)溶解在二噁烷(1.5ml)中，然后逐滴添加在二噁烷(1.5ml)中的4.0m-hcl并且允许在室温下搅拌1h。反应完成后，将反应混合物过滤并且在减压下干燥以得到呈灰白色固体的所希望的化合物(20mg，17.68％)。lcms:448.3[m 1]

；1h nmr(400mhz,dmso-d6,hcl盐):δ10.28(br s,1h)9.40(br s,2h)8.83(s,1h)7.90(s,1h)7.65(br.,1h)7.47(d,j＝7.89hz,1h)7.12(d,j＝8.77hz,1h)4.21-4.33(m,2h)4.17(br s,2h)3.33(br s,2h)2.94(br s,2h)1.22(d,j＝7.02hz,6h)1.16(dd,j＝8.11,2.41hz,2h)0.94(br s,2h)。实施例s-6：2-环丙基-6-((1,1-二甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)氨基)-1-(5-氟-6-(2-氟丙-2-基)吡啶-2-基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(化合物号1.5)的合成
[0151]
步骤1：2-环丙基-1-(5-氟-6-(2-氟丙-2-基)吡啶-2-基)-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮的合成：向(2-环丙基-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(230mg，1.03mmol，1.0当量)和6-溴-3-氟-2-(2-氟丙-2-基)吡啶(291mg，1.24mmol，1.2当量)在二噁烷(5ml)中的搅拌溶液中添加碳酸钾(285mg，2.06mmol，2.0当量)并且将所得的混合物用氮气吹扫10min，然后添加碘化亚铜(40mg，0.26mmol，0.2当量)和n,n'-二甲基乙二胺(dmeda)(0.04ml，0.413mmol，0.4当量)并且用氮气再次吹扫10min，在130℃下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用水稀释并且用etoac(50ml x 2)萃取。将
合并的有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法[硅胶100-200目；在己烷中的0-50％etoac洗脱]纯化以得到呈黄色半固体的所希望的产物(190mg，48.74％)。lcms：378.2[m 1]

。
[0152]
步骤2：6-((2-环丙基-1-(5-氟-6-(2-氟丙-2-基)吡啶-2-基)-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-1,1-二甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯的合成：向2-环丙基-1-(5-氟-6-(2-氟丙-2-基)吡啶-2-基)-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(190mg，0.5mmol，1.0当量)在甲苯(3.0ml)中的搅拌溶液中添加m-cpba(245mg，1.0mmol，2.0当量)并且允许在室温下搅拌60分钟。添加6-氨基-1,1-二甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(150mg，0.6mmol，1.2当量)和dipea(0.4ml，2.0mmol，4.0当量)并且允许在室温下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用水稀释并且用etoac(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法[硅胶100-200目；在己烷中的0-50％etoac洗脱]纯化以得到呈浅黄色固体的所希望的化合物(70mg，23.14％)。lcms：606.32[m 1]

。
[0153]
步骤3：2-环丙基-6-((1,1-二甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)氨基)-1-(5-氟-6-(2-氟丙-2-基)吡啶-2-基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮的合成：将6-((2-环丙基-1-(5-氟-6-(2-氟丙-2-基)吡啶-2-基)-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-1,1-二甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(70mg，0.11mmol，1.0当量)溶解在二噁烷(1.5ml)中，然后逐滴添加在二噁烷(4ml)中的4.0m-hcl并且允许在室温下搅拌2h。反应完成后，将反应混合物过滤并且在减压下干燥，得到粗品用于预纯化以得到呈浅黄色固体的所希望的化合物(2.5mg，3.9％)。lcms:506.4[m 1]

；1h nmr(400mhz,dmso-d
6,
游离碱):δ10.20(br sbr s,1h)8.81(s,1h)8.08-8.20(m,2h)7.98(d,j＝6.58hz,1h)7.58(br s,1h)7.45(d,j＝8.33hz,1h)7.30(d,j＝7.89hz,1h)3.25(br s,1h),3.14(br s,2h)2.86(br s,2h)1.78(s,3h)1.72(s,3h)1.51(s,6h)0.82(br s,4h)。实施例s-7：1-(5-氟-6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-2-异丙基-6-((1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)氨基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(化合物号1.249)的合成
[0154]
步骤1：1-(5-氟-6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-2-异丙基-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮的合成：向2-异丙基-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(287mg，1.28mmol，1.0当量)和2-(6-溴-3-氟吡啶-2-基)丙-2-醇(300mg，1.28mmol，1.0当量)在二噁烷(10ml)中的搅拌溶液中添加碳酸钾(354.09mg，2.56mmol，2.0当量)并且将所得的混合物用氮气吹扫10min，然后添加碘化亚铜(48.8mg，0.25mmol，0.2当量)和n,n'-二甲基乙二胺(dmeda)(0.05ml，0.51mmol，0.4当量)并且用氮气再次吹扫10min，然后在110℃下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用水稀释并且用etoac(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法纯化以得到所希望的化合物。
lcms：378.13[m 1]

。
[0155]
步骤2：6-((1-(5-氟-6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-2-异丙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯的合成：向1-(5-氟-6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-2-异丙基-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(275mg，0.73mmol，1.0当量)在甲苯(3.0ml)ml中的搅拌溶液中添加m-cpba(251mg，1.46mmol，2.0当量)并且允许在室温下搅拌1h。添加6-氨基-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(199mg，0.80mmol，1.2当量)和dipea(0.5ml，2.92mmol，4.0当量)并且允许在室温下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用水稀释并且用etoac(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法[硅胶100-200目；在己烷中的0-50％etoac洗脱]纯化以得到所希望的化合物。lcms：578.28[m 1]

。
[0156]
步骤3：1-(5-氟-6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-2-异丙基-6-((1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)氨基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮的合成：将6-((1-(5-氟-6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-2-异丙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(381mg，0.66mmol，1.0当量)溶解在二噁烷(4ml)中，然后逐滴添加4.0m-hcl(4ml)并且允许在室温下搅拌1h。反应完成后，将反应混合物过滤并且在减压下干燥以得到所希望的化合物。lcms:478.23[m 1]

；1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ10.20(br s,1h)8.81(s,1h)8.30(s,1h)7.93-8.03(m,1h)7.83(dd,j＝8.33,2.63hz,1h)7.56(br s,1h)7.40(d,j＝8.33hz,1h)7.02(d,j＝8.33hz,1h)4.17-4.21(m,1h)3.93(s,3h)3.09(t,j＝5.92hz,3h)2.76(t,j＝5.48hz,2h)1.52(s,6h)1.32(d,j＝6.58hz,6h)。实施例s-8：1-(6-(2-异丙基-3-氧代-6-((1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)氨基)-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶-2-基)环丙烷-1-甲腈(化合物号1.43)的合成
[0157]
步骤1：2-(6-溴吡啶-2-基)乙腈的合成：在-78℃下向mecn(1.4ml，27.4mmol，3.6当量)在thf(30ml)中的搅拌溶液中添加n-buli(在己烷中的2.5m，10ml，25.1mmol，3.3当量)并且在-78℃下搅拌30min。在-78℃下搅拌30min后，添加在thf(10ml)中的2,6-二溴吡啶(1.8g，7.6mmol，1.0当量)。将反应混合物在-78℃下搅拌45min。反应完成后，将反应混合物用水稀释并且用etoac(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法[combiflash，洗脱-在己烷中的0-30％etoac]纯化以得到所希望的化合物。lcms：197.04[m 1]

。
[0158]
步骤2：1-(6-溴吡啶-2-基)环丙烷-1-甲腈的合成：在氮气气氛下在-78℃下向2-(6-溴吡啶-2-基)乙腈(2.0g，10.15mmol，1.0当量)在thf(30ml)中的搅拌溶液中逐滴添加
lihmds(22.33ml，22.33mmol，2.2当量)。在-78℃下搅拌30min后，添加二溴乙烷(2.0g，11.16mmol，1.1当量)并且将反应混合物在室温下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用氯化铵(200ml)稀释并且用etoac(250ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(250ml)和盐水溶液(250ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法纯化以得到所希望的化合物。lcms：224.09[m 1]

。
[0159]
步骤3：1-(6-(2-异丙基-6-(甲硫基)-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶-2-基)环丙烷-1-甲腈的合成：向1-(6-溴吡啶-2-基)环丙烷-1-甲腈(600mg，2.67mmol，1.0当量)和(602mg，2.67mmol，1.0当量)在二噁烷(10ml)中的搅拌溶液中添加碳酸钾(800mg，5.34mmol，2.0当量)并且将所得的混合物用氮气吹扫10min，然后添加碘化亚铜(40mg，190.4mmol，0.2当量)和n,n'-二甲基乙二胺(dmeda)(0.1ml，1.06mmol，0.4当量)并且用氮气再次吹扫10min，然后在100℃下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用水稀释并且用etoac(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法纯化以得到所希望的化合物。lcms：367.2[m 1]

。
[0160]
步骤4：6-((1-(6-(1-氰基环丙基)吡啶-2-基)-2-异丙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯的合成：向1-(6-(2-异丙基-6-(甲硫基)-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶-2-基)环丙烷-1-甲腈(100mg，0.28mmol，1.0当量)在甲苯(2.0ml)中的搅拌溶液中添加m-cpba(98.17mg，0.56mmol，2.0当量)并且允许在室温下搅拌1h。添加6-氨基-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(84mg，0.34mmol，1.5当量)和dipea(0.2ml,1.42mmol，5.0当量)并且允许在室温下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用水稀释并且用etoac(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法[硅胶100-200目；在己烷中的0-70％etoac洗脱]纯化以得到所希望的化合物。lcms：567.3[m 1]

。
[0161]
步骤5：1-(6-(2-异丙基-3-氧代-6-((1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)氨基)-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶-2-基)环丙烷-1-甲腈的合成：将6-((1-(6-(1-氰基环丙基)吡啶-2-基)-2-异丙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(90mg，0.19mmol，1.0当量)溶解在二噁烷(1ml)中，然后逐滴添加4.0m-hcl(0.5ml)并且允许在室温下搅拌4h。反应完成后，将反应混合物过滤并且在减压下干燥并且通过反相hplc纯化以得到所希望的化合物。lcms:467.4[m 1]

；1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ10.29(br s,1h)8.82(s,1h)8.19(s,1h)8.09-8.16(m,1h)7.84(d,j＝8.33hz,1h)7.63(br s,1h)7.57(s,1h)7.42(d,j＝8.77hz,1h)7.06(s,1h)3.98-4.09(m,2h)3.17(br s,4h)2.85(br s,2h)1.82-1.90(m,2h)1.64-1.74(m,2h)1.35(d,j＝6.58hz,6h)。实施例s-9：1-(6-(6-(1,1-二甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基氨基)-2-异丙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶-2-基)环丙烷甲腈(化合物号1.45)的合成
[0162]
步骤1：6-(1-(6-(1-氰基环丙基)吡啶-2-基)-2-异丙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基氨基)-1,1-二甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯的合成：向1-(6-(2-异丙基-6-(甲硫基)-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶-2-基)环丙烷甲腈(100mg，0.28mmol，1.0当量)在甲苯(2.0ml)中的搅拌溶液中添加m-cpba(138mg，0.56mmol，2.0当量)并且允许在室温下搅拌1h。添加6-氨基-1,1-二甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(94mg，0.34mmol，1.1当量)和dipea(0.2ml，1.4mmol，5.0当量)并且允许在室温下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用水稀释并且用etoac(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法[硅胶100-200目；在己烷中的0-50％etoac洗脱]纯化以得到所希望的化合物。lcms：595.4[m 1]

。
[0163]
步骤2：1-(6-(6-(1,1-二甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基氨基)-2-异丙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶-2-基)环丙烷甲腈的合成：将6-(1-(6-(1-氰基环丙基)吡啶-2-基)-2-异丙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基氨基)-1,1-二甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(80mg，0.13mmol，1.0当量)溶解在二噁烷(0.8ml)中，然后逐滴添加4.0m-hcl(0.8ml)并且允许在室温下搅拌1h。反应完成后，将反应混合物过滤并且通过反相色谱法纯化以得到所希望的化合物。lcms:495.5[m 1]

；1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ10.18(br s,1h)8.80(s,1h)8.27(s,1h)8.10-8.13(m,1h)7.83(d,j＝8.33hz,1h)7.57(s,1h)7.51(br s,1h)7.37(br s,1h)7.20(d,j＝8.77hz,1h)4.09(d,j＝6.58hz,1h)3.02(br s,2h)2.68(d,j＝9.65hz,2h)1.85(d,j＝3.51hz,2h)1.71(d,j＝3.07hz,2h)1.29-1.44(m,12h)。实施例s-10：2 1-(4-(叔丁基)-5-氯噻唑-2-基)-2-异丙基-6-((1,2,3,4-四氢异喹啉-7-基)氨基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(化合物号1.349)的合成
[0164]
步骤1：2-溴-4-(叔丁基)-5-氯噻唑的合成：向2-溴-4-(叔丁基)噻唑(1.21g，5.49mmol，1.0当量)在acn(20ml)中的搅拌溶液中添加ncs(0.80，6.04mmol，1.1当量)。将反应混合物在室温下搅拌12h。反应完成后，将反应混合物用水(50ml)稀释并且用etoac(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法纯化以得到所希望的化合物。lcms：254.2[m 2]

。
[0165]
步骤2：1-(4-(叔丁基)-5-氯噻唑-2-基)-2-异丙基-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮的合成：向2-异丙基-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(865mg，3.85mmol，1.0当量)和2-溴-4-(叔丁基)-5-氯噻唑(982mg，3.85mmol，1.0当量)在二噁烷(12ml)中的搅拌溶液中添加碳酸钾(1.06g，7.71mmol，2.0当量)并且将所得的混合物用氮气吹扫10min，然后添加碘化亚铜(146mg，0.77mmol，0.2当量)和n,n'-二甲基乙二胺(dmeda)(0.16ml，1.54mmol，0.4当量)并且用氮气再次吹扫10min，然后在90℃下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用水稀释并且用etoac(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法纯化以得到所希望的产物。lcms：298.2[m 1]

。
[0166]
步骤3：7-((1-(4-(叔丁基)-5-氯噻唑-2-基)-2-异丙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯的合成：向1-(4-(叔丁基)-5-氯噻唑-2-基)-2-异丙基-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(32mg，0.08mmol，1.0当量)在甲苯(2.0ml)中的搅拌溶液中添加m-cpba(28mg，0.16mmol，2.0当量)并且允许在室温下搅拌1h。添加7-氨基-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(22mg，0.31mmol，1.1当量)和na2co3(34mg，0.32mmol，4.0当量)并且允许在室温下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用水稀释并且用etoac(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法纯化以得到所希望的化合物。lcms：598.3[m 1]

。
[0167]
步骤4：2 1-(4-(叔丁基)-5-氯噻唑-2-基)-2-异丙基-6-((1,2,3,4-四氢异喹啉-7-基)氨基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮的合成：将7-((1-(4-(叔丁基)-5-氯噻唑-2-基)-2-异丙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(25mg，0.04mmol，1.0当量)溶解在二噁烷(0.3ml)中，然后逐滴添加4.0m-hcl(0.3ml)并且允许在室温下搅拌1h。反应完成后，将反应混合物过滤并且在减压下干燥以得到所希望的化合物。lcms:498.4[m 1]

；1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ10.64(br s,1h)9.31(br s,1h)8.89(s,1h)7.72(br s,1h)7.58(d,j＝8.77hz,1h)7.23(d,j＝8.33hz,1h)4.54-4.67(m,1h)4.28(br s,2h)2.99(t,j＝5.92hz,2h)1.54(d,j＝6.58hz,2h)1.38-1.49(m,15h)。实施例s-11：1-(6-(2-乙基-3-氧代-6-((1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)氨基)-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶-2-基)环丙烷-1-甲腈(化合物号1.37)的合成
[0168]
步骤1：1-(6-(2-乙基-6-(甲硫基)-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶-2-基)环丙烷-1-甲腈的合成：向2-乙基-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(200mg，0.95mmol，1.0当量)和1-(6-溴吡啶-2-基)环丙烷-1-甲腈(212mg，0.95mmol，1.0当量)在二噁烷(10ml)中的搅拌溶液中添加碳酸钾(262.9mg，2mmol，2.0当量)并且将所得的混合物用氮气吹扫10min，然后添加碘化亚铜(36.23mg，0.19mmol，0.2当量)和n,n'-二甲基乙二胺(dmeda)(0.04ml，0.381mmol，0.4当量)并且用氮气再次吹扫10min，然后在130℃下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用水稀释并且用etoac(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法[硅胶100-200目；在己烷中的0-50％etoac洗脱]纯化以得到呈黄色半固体的所希望的产物(216mg，64.43％)。lcms：353.13(m 1)

。
[0169]
步骤2：6-((1-(6-(1-氰基环丙基)吡啶-2-基)-2-乙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯的合成：向1-(6-(2-乙基-6-(甲硫基)-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶-2-基)环丙烷-1-甲腈(108mg，0.31mmol，1.0当量)在甲苯(3.0ml)中的搅拌溶液中添加m-cpba(145.6mg，0.61mmol，2.0当量)并且允许在室温下搅拌60min。添加6-氨基-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(76.10mg，0.31mmol，1.0当量)和na2co3(129.7mg，1.22mmol，4.0当量)并且允许在室温下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用水稀释并且用etoac(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法[硅胶100-200目；在己烷中的0-50％etoac洗脱]纯化以得到呈浅黄色固体的所希望的化合物(121mg，71.44％)。lcms：553.26(m 1)

。
[0170]
步骤3：1-(6-(2-乙基-3-氧代-6-((1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)氨基)-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶-2-基)环丙烷-1-甲腈的合成：将6-((1-(6-(1-氰基环丙基)吡啶-2-基)-2-乙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(121mg，0.22mmol，1.0当量)溶解在二噁烷(1ml)中，然后逐滴添加在二噁烷(1.5ml)中的4.0m-hcl并且允许在室温下搅拌2h。反应完成后，将反应混合物过滤并且在减压下干燥；并且将粗品通过反相色谱法纯化以得到呈灰白色固体的所希望的化合物(10mg，10.00％)。lcms:453.21(m 1)

；1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ10.27(br s,1h)8.86(s,1h)8.24(s,1h)8.11(t,j＝7.89hz,1h)7.91(d,j＝8.33hz,1h)7.62(br s,1h)7.53(d,j＝7.45hz,1h)7.39(br s,1h)6.98-7.05(m,1h)3.83-4.05(m,4h)3.10(br s,2h)2.78(br s,2h)1.82-1.96(m,2h)1.61-1.74(m,2h)0.96(t,j＝7.02hz,3h)。实施例s-12：1-(6-(2-乙基-3-氧代-6-((1,2,3,4-四氢异喹啉-7-基)氨基)-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶-2-基)环丙烷-1-甲腈(化合物号1.38)的合成
[0171]
步骤1：7-((1-(6-(1-氰基环丙基)吡啶-2-基)-2-乙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡
1-甲腈(102mg，0.28mmol，1.0当量)在甲苯(3.0ml)中的搅拌溶液中添加m-cpba(132mg，0.56mmol，2.0当量)并且允许在室温下搅拌60分钟。添加6-氨基-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(75.9mg，0.31mmol，1.0当量)和na2co3(117.8mg，1.11mmol，4.0当量)并且允许在室温下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用水稀释并且用etoac(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法[硅胶100-200目；在己烷中的0-50％etoac洗脱]纯化以得到呈灰白色固体的所希望的化合物(90mg，57.0％)。lcms：567.28(m 1)

。
[0175]
步骤3：1-(6-(2-异丙基-3-氧代-6-((1,2,3,4-四氢异喹啉-7-基)氨基)-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶-2-基)环丙烷-1-甲腈的合成：将7-((1-(6-(1-氰基环丙基)吡啶-2-基)-2-异丙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(90mg，0.15mmol，1.0当量)溶解在二噁烷(1ml)中，然后逐滴添加在二噁烷(2ml)中的4.0m-hcl并且允许在室温下搅拌2h。反应完成后，将反应混合物过滤并且在减压下干燥，通过反相色谱法获得呈灰白色固体的纯化的产物(40mg，46.7％)。lcms:-467.22(m 1)

；1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ10.35(br s,1h)9.11(br s,2h)8.83(s,1h)8.08-8.20(m,1h)7.87(s,1h)7.65(br s,1h)7.51(d,j＝8.3hz,1h)7.55(d,j＝7.5hz,1h)7.19(d,j＝8.7hz,1h)4.26(br s,2h)4.09(m,1h)3.39(t,2h)2.96(t,2h)1.87(d,j＝3.5hz,2h)1.71(d,j＝3.1hz,2h)1.36(d,j＝6.5hz,6h)。实施例s-14：1-(4-(2-异丙基-3-氧代-6-(1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基氨基)-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶-2-基)环丙烷甲腈(化合物号1.67)的合成
[0176]
步骤1：1-(4-溴吡啶-2-基)环丙烷甲腈的合成：在0℃下向环丙烷甲腈(1.0g，14.5mmol，1.0当量)在甲苯(10ml)中的搅拌溶液中添加lihmds(16ml，15.9mmol，1.1当量)并且将反应混合物搅拌1h。逐滴添加2-氟-4-溴吡啶在甲苯(5ml)(2.56g，14.4mmol，1.0当量)并且搅拌18h。反应完成后，将反应混合物用饱和nh4cl溶液稀释并且用乙醚(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法[硅胶100-200目；在己烷中的0-50％etoac洗脱]纯化以得到呈无色固体的所希望的化合物(2.1g，65.0％)。lcms：222.9(m 1)

。
[0177]
步骤2：1-(4-(2-异丙基-6-(甲硫基)-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶-2-基)环丙烷甲腈的合成：向2-异丙基-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(224mg，1.0mmol，1.0当量)和1-(4-溴吡啶-2-基)环丙烷甲腈(223mg，1.0mmol，1.0当量)在二噁烷(10ml)中的搅拌溶液中添加碳酸钾(276mg，2.0mmol，2.0当量)并且将所得的混合物用氮气吹扫10min，然后添加碘化亚铜(38mg，0.2mmol，0.2当量)和n,
n'-二甲基乙二胺(dmeda)(0.05ml，0.4mmol，0.4当量)并且用氮气再次吹扫10min，然后在90℃下搅拌48h。反应完成后，将反应混合物用水稀释并且用etoac(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法纯化以得到所希望的化合物(50mg，13.6％)。lcms：367.2(m 1)

[0178]
步骤3：6-(1-(2-(1-氰基环丙基)吡啶-4-基)-2-异丙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基氨基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯的合成：向1-(4-(2-异丙基-6-(甲硫基)-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶-2-基)环丙烷甲腈(50mg，0.14mmol，1.0当量)在甲苯(2.0ml)中的搅拌溶液中添加m-cpba(48mg，0.28mmol，2.0当量)并且允许在室温下搅拌1h。添加6-氨基-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(38mg，0.15mmol，1.1当量)和na2co3(58mg，0.55mmol，4.0当量)并且允许在室温下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用水稀释并且用etoac(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法[硅胶100-200目；在己烷中的0-50％etoac洗脱]纯化以得到呈灰白色固体的所希望的化合物(40mg，51.9％)。lcms：567.4(m 1)

。
[0179]
步骤4：1-(4-(2-异丙基-3-氧代-6-(1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基氨基)-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶-2-基)环丙烷甲腈的合成：将6-(1-(2-(1-氰基环丙基)吡啶-4-基)-2-异丙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基氨基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(40mg，0.07mmol，1.0当量)溶解在dcm(5ml)中，然后逐滴添加三氟乙酸(0.51ml)并且允许在室温下搅拌1h。反应完成后，将反应混合物在减压下干燥并且通过反相纯化获得呈白色固体的纯化的产物(20mg，55.4％)。lcms:467.5(m 1)

；1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ10.37(br s,1h)8.85(s,1h)8.65(d,j＝5.2hz,1h)7.56-7.65(m,2h)7.42-7.56(m,2h)7.06(d,j＝8.3hz,1h)3.87-4.03(m,3h)3.08(d,j＝5.7hz,2h)2.78(br s,2h)1.84-1.95(m,2h)1.65-1.79(m,2h)1.37(d,j＝7.0hz,6h)。实施例s-15：2-乙基-1-(6-(1-(氟甲基)环丙基)吡啶-2-基)-6-((1,2,3,4-四氢异喹啉-7-基)氨基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(化合物号1.86)的合成的合成
[0180]
步骤1：2-乙基-1-(6-(1-(氟甲基)环丙基)吡啶-2-基)-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮的合成：向2-乙基-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(172.6mg，0.82mmol，1.0当量)和2-溴-6-(1-(氟甲基)环丙基)吡啶(189.0mg，0.82mmol，1.0当量)在二噁烷(10ml)中的搅拌溶液中添加碳酸钾(227mg，1.64mmol，2.0当量)并且将所得的混合物用氮气吹扫10min，然后添加碘化亚铜(31mg，0.16mmol，0.2当量)和n,n'-二甲基乙二胺(dmeda)(0.03ml，0.33mmol，0.4当量)并且用氮气再次吹扫10min，然后在130℃下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用水稀释并且用etoac(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩
以得到粗产物，将其通过快速色谱法[硅胶100-200目；在己烷中的0-50％etoac洗脱]纯化以得到呈棕色半固体的所希望的产物(213mg，72.8％)。lcms：360.12(m 1)

。
[0181]
步骤2：7-((2-乙基-1-(6-(1-(氟甲基)环丙基)吡啶-2-基)-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯的合成：向2-乙基-1-(6-(1-(氟甲基)环丙基)吡啶-2-基)-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(213mg，0.82mmol，1.0当量)在甲苯(2.0ml)中的搅拌溶液中添加m-cpba(405mg，1.64mmol，2.0当量)并且允许在室温下搅拌60分钟。添加7-氨基-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(204mg，0.82mmol，1.0当量)和na2co3(348mg，3.28mmol，4.0当量)并且允许在室温下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用水稀释并且用etoac(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法[硅胶100-200目；在己烷中的0-50％etoac洗脱]纯化以得到呈浅黄色固体的所希望的化合物(60mg，18.1％)。lcms：560.27(m 1)

。
[0182]
步骤3：2-乙基-1-(6-(1-(氟甲基)环丙基)吡啶-2-基)-6-((1,2,3,4-四氢异喹啉-7-基)氨基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮的合成：将7-((2-乙基-1-(6-(1-(氟甲基)环丙基)吡啶-2-基)-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(60mg，0.11mmol，1.0当量)溶解在二噁烷(1ml)中，然后逐滴添加2.0m-hcl/二噁烷(2.0ml)并且允许在室温下搅拌2h。反应完成后，将反应混合物过滤并且在减压下干燥并且通过反相色谱法获得呈白色固体的纯化的产物(8mg，16.2％)。lcms:460.22(m 1)

；1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ10.25(br s,1h)8.87(s,1h)8.26(s,1h),8.15(t,j＝7.7hz,1h)8.00(d,j＝7.9hz,1h)7.62(br s,1h)7.58(br s,1h)7.51(d,j＝7.5hz,1h)7.05(d,j＝7.8hz,1h)3.99-4.12(m,2h)3.92(s,2h)2.97-3.10(m,2h)2.33(br s,2h)2.00(br s,2h)1.81(d,j＝8.7hz,2h)1.00(t,j＝7.2hz,3h)。实施例s-16：2-乙基-1-(5-氟-6-(2-氟丙-2-基)吡啶-2-基)-6-((1,2,3,4-四氢异喹啉-7-基)氨基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(化合物号1.91)的合成
[0183]
步骤1：2-溴-6-(1-(氟甲基)环丙基)吡啶的合成：在-78℃下向(1-(6-溴吡啶-2-基)环丙基)甲醇(1g，4.38mmol，1.0当量)在dcm(40ml)中的搅拌溶液中，然后添加dast(0.9ml，6.57mmol，1.5当量)并且允许在室温下搅拌过夜。反应完成后，在-78℃下将反应混合物用nahco3(20ml)碱化并且用dcm(100ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法[硅胶100-200目；在己烷中的0-40％etoac洗脱]纯化以得到呈胶状材料的所希望的化合
物。lcms：229.99(m 1)

。
[0184]
步骤2：1-(6-(1-(氟甲基)环丙基)吡啶-2-基)-2-异丙基-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮的合成：向2-溴-6-(1-(氟甲基)环丙基)吡啶(189mg，0.82mmol，1.0当量)和2-异丙基-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(184.23mg，0.82mmol，1.0当量)在二噁烷(10ml)中的搅拌溶液中添加碳酸钾(227mg，1.64mmol，2.0当量)并且将所得的混合物用氮气吹扫10min，然后添加碘化亚铜(31mg，0.16mmol，0.2当量)和n,n'-二甲基乙二胺(dmeda)(0.03ml，0.33mmol，0.4当量)并且用氮气再次吹扫10min，然后在130℃下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用水稀释并且用etoac(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法[硅胶100-200目；在己烷中的0-50％etoac洗脱]纯化以得到呈棕色半固体的所希望的产物(133mg，43.35％)。lcms：374.14(m 1)

。
[0185]
步骤3：6-((1-(6-(1-(氟甲基)环丙基)吡啶-2-基)-2-异丙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯的合成：向1-(6-(1-(氟甲基)环丙基)吡啶-2-基)-2-异丙基-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(133mg，0.36mmol，1.0当量)在甲苯(2.0ml)中的搅拌溶液中添加m-cpba(170mg，0.712mmol，2.0当量)并且允许在室温下搅拌60分钟。添加6-氨基-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(88.4mg，0.36mmol，1.0当量)和na2co3(151mg，1.42mmol，4.0当量)并且允许在室温下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用水稀释并且用etoac(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法[硅胶100-200目；在己烷中的0-50％etoac洗脱]纯化以得到呈浅黄色固体的所希望的化合物(61mg，30.04％)。lcms：574.29(m 1)

。
[0186]
步骤4：1-(6-(1-(氟甲基)环丙基)吡啶-2-基)-2-异丙基-6-((1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)氨基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮的合成：将6-((1-(6-(1-(氟甲基)环丙基)吡啶-2-基)-2-异丙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(61mg，0.106mmol，1.0当量)溶解在二噁烷(1ml)中，然后逐滴添加在乙醚(2.0ml)中的2.0m-hcl并且允许在室温下搅拌2h。反应完成后，将反应混合物过滤并且在减压下干燥并且通过反相色谱法获得呈白色固体的纯化的产物(10mg，18.13％)。lcms:474.23(m 1)

；1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ10.24(br s,1h)8.83(s,1h)8.23(br s,1h)8.14(t,j＝8.1hz,1h)7.91(d,j＝7.8hz,1h)7.62(br s,1h)7.52(d,j＝7.5hz,1h)7.40(d,j＝7.8hz,1h)7.03(d,j＝7.8hz,1h)4.14-4.27(m,1h)3.96(br s,2h)3.12(br s,2h)2.79(br s,2h)2.67(br s,2h)2.59(d,j＝10.1hz,1h)2.01(br s,2h)1.81(dd,j＝16.8,8.1hz,1h)1.38(d,j＝7.0hz,6h)。实施例s-17：2-乙基-1-(5-氟-6-(2-氟丙-2-基)吡啶-2-基)-6-((1,2,3,4-四氢异喹啉-7-基)氨基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(化合物号1.188)的合成
(5-氟-6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-2-异丙基-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(70mg，0.18mmol，1.0当量)在甲苯(4.0ml)中的搅拌溶液中添加m-cpba(88mg，0.37mmol，2.0当量)并且允许在室温下搅拌60分钟。添加7-氨基-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(46mg，0.18mmol，1.0当量)和na2co3(78.4mg，0.74mmol，4.0当量)并且允许在室温下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用水稀释并且用etoac(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法[硅胶100-200目；在己烷中的0-50％etoac洗脱]纯化以得到呈灰白色固体的所希望的化合物(99mg，92.4％)。lcms：578.28(m 1)

。
[0191]
步骤2：1-(5-氟-6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-2-异丙基-6-((1,2,3,4-四氢异喹啉-7-基)氨基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮的合成：将7-((1-(5-氟-6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-2-异丙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(99mg，0.17mmol，1.0当量)溶解在二噁烷(1ml)中，然后逐滴添加在二噁烷(1.5ml)中的4.0m-hcl并且允许在室温下搅拌2h。反应完成后，将反应混合物过滤并且在减压下干燥并且通过反相色谱法获得呈白色固体的纯化的产物(51mg，51.3％)。lcms:478.25(m 1)

；1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ10.33(br s,1h)9.18(br s,2h)8.84(s,1h)7.96-8.08(m,1h)7.88(d,j＝6.6hz,1h)7.67(br s,1h)7.48(d,j＝7.5hz,1h)7.17(d,j＝8.7hz,1h)4.09-4.33(m,4h)3.37(br s,2h)2.95(br s,2h)1.42-1.58(m,6h)1.33(d,j＝6.6hz,6h)。实施例s-19：2-(5-氟-6-(2-异丙基-3-氧代-6-(1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基氨基)-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶-2-基)-2-甲基丙腈(化合物号1.321)的合成
[0192]
步骤1：2-(6-溴吡啶-2-基)-2-氰基丙-1-鎓的合成：在0℃下向异丁腈(1.0g，14.46mmol，1当量)在甲苯(10ml)中的搅拌溶液中添加lihmds(17.4ml，17.35mmol，1.2当量)并且将反应混合物搅拌1h。逐滴添加在甲苯(5ml)中的2,6-二溴-3-氟吡啶(3.68g，14.46mmol，1.0当量)并且搅拌18h。反应完成后，将反应混合物用饱和nh4cl溶液稀释并且用乙醚(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法[硅胶100-200目；在己烷中的0-50％etoac洗脱]纯化以得到呈无色液体的所希望的化合物(2.0g，57.1％)。lcms：242.9(m 1)

。
[0193]
步骤2：2-(3-氟-6-(2-异丙基-6-(甲硫基)-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶-2-基)-2-甲基丙腈的合成：向2-异丙基-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑
并[3,4-d]嘧啶-3-酮(224mg，1.0mmol，1.0当量)和2-(6-溴-5-氟吡啶-2-基)-2-甲基丙腈(243mg，1.0mmol，1.0当量)在二噁烷(10ml)中的搅拌溶液中添加碳酸钾(276mg，2.0mmol，2.0当量)并且将所得的混合物用氮气吹扫10min，然后添加碘化亚铜(38mg，0.2mmol，0.2当量)和n,n'-二甲基乙二胺(dmeda)(0.05ml，0.4mmol，0.4当量)并且用氮气再次吹扫10min，然后在90℃下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用水稀释并且用etoac(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法纯化以得到所希望的化合物(250mg，64.7％)。lcms：387.2(m 1)

。
[0194]
步骤3：6-(1-(6-(2-氰基丙-2-基)-3-氟吡啶-2-基)-2-异丙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基氨基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯的合成：向在甲苯(3.0ml)中的2-(3-氟-6-(2-异丙基-6-(甲硫基)-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶-2-基)-2-甲基丙腈(75mg，0.19mmol，1.0当量)中添加m-cpba(93mg，0.39mmol，2.0当量)并且允许在室温下搅拌1h。添加6-氨基-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(51mg，0.21mmol，1.05当量)和na2co3(83mg，0.78mmol，4.0当量)并且允许在室温下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用水稀释并且用etoac(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法[硅胶100-200目；在己烷中的0-50％etoac洗脱]纯化以得到呈灰白色固体的所希望的化合物(70mg，61.9％)。lcms：587.4(m 1)

。
[0195]
步骤4：2-(5-氟-6-(2-异丙基-3-氧代-6-(1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基氨基)-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶-2-基)-2-甲基丙腈的合成：将6-(1-(6-(2-氰基丙-2-基)-3-氟吡啶-2-基)-2-异丙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基氨基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(70mg，0.12mmol，1.0当量)溶解在二噁烷(1ml)中，然后逐滴添加在二噁烷(1ml)中的4.0m-hcl并且允许在室温下搅拌1h。反应完成后，将反应混合物过滤并且在减压下干燥以得到呈白色固体的所希望的化合物(40mg，68.9％)。lcms:487.4(m 1)

；1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ10.34(br s,1h)9.31(br s,1h)8.83(s,1h)8.13-8.22(m,1h)8.01(dd,j＝8.7,3.1hz,1h)7.59-7.68(m,1h)7.46(m,j＝8.77hz,1h)7.15(m,j＝8.7hz,1h)4.09-4.25(m,3h)3.35(br s,2h)2.98(t,j＝5.9hz,2h)1.73(s,6h)1.34(d,j＝6.5hz,6h)。实施例s-20：2-(5-氟-6-(2-异丙基-3-氧代-6-(1,2,3,4-四氢异喹啉-7-基氨基)-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶-2-基)-2-甲基丙腈(化合物号1.322)的合成
[0196]
步骤1：7-(1-(6-(2-氰基丙-2-基)-3-氟吡啶-2-基)-2-异丙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基氨基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯的合成：向2-(3-氟-6-(2-异丙基-6-(甲硫基)-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶-2-基)-2-甲基丙腈(75mg，0.19mmol，1.0当量)在甲苯(3.0ml)中的搅拌溶液中添加m-cpba
(93mg，0.39mmol，2.0当量)并且允许在室温下搅拌1h。添加7-氨基-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(51mg，0.21mmol，1.05当量)和na2co3(83mg，0.78mmol，4.0当量)并且允许在室温下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用水稀释并且用etoac(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法[硅胶100-200目；在己烷中的0-50％etoac洗脱]纯化以得到呈灰白色固体的所希望的化合物(80mg，71.4％)。lcms：587.4(m 1)

。
[0197]
步骤2：2-(5-氟-6-(2-异丙基-3-氧代-6-(1,2,3,4-四氢异喹啉-7-基氨基)-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶-2-基)-2-甲基丙腈的合成：将7-(1-(6-(2-氰基丙-2-基)-3-氟吡啶-2-基)-2-异丙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基氨基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(70mg，0.12mmol，1.0当量)溶解在二噁烷(1ml)中，然后逐滴添加在二噁烷(1ml)中的4.0m-hcl并且允许在室温下搅拌1h。反应完成后，将反应混合物过滤并且在减压下干燥以得到呈白色固体的所希望的化合物(30mg，47.3％)。lcms:487.5(m 1)

；1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ10.25(br s,1h)8.82(s,1h)8.27(br s,1h)8.16(d,j＝10.1hz,1h)8.01(dd,j＝8.7,3.1hz,1h)7.50(br s,1h)7.40(d,j＝8.3hz,1h)7.07(d,j＝8.3hz,1h)4.18(dt,j＝13.8,6.6hz,1h)3.95(br s,2h)3.07(br s,2h)2.73(br s,2h)1.68-1.83(m,6h)1.36(d,j＝6.5hz,6h)。实施例s-21：2-乙基-1-(5-氟-6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-((1,2,3,4-四氢异喹啉-7-基)氨基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(化合物号1.262)的合成
[0198]
步骤1：2-乙基-1-(5-氟-6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮的合成：向2-乙基-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(359mg，1.71mmol，1.0当量)和2-(6-溴-3-氟吡啶-2-基)丙-2-醇(400mg，1.71mmol，1.0当量)在二噁烷(10ml)中的搅拌溶液中添加碳酸钾(472mg，3.42mmol，2.0当量)并且将所得的混合物用氮气吹扫10min，然后添加碘化亚铜(65mg，0.34mmol，0.2当量)和n,n'-二甲基乙二胺(dmeda)(0.03ml，0.684mmol，0.4当量)并且用氮气再次吹扫10min，然后在130℃下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用水稀释并且用etoac(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法[硅胶100-200目；在己烷中的0-50％etoac洗脱]纯化以得到呈棕色液体的所希望的产物。lcms：364.12(m 1)

。
[0199]
步骤2：7-((2-乙基-1-(5-氟-6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯的合成：向2-乙基-1-(5-氟-6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(100mg，0.27mmol，1.0当量)在甲苯(5.0ml)中的搅拌溶液中添加m-cpba(95mg，0.55mmol，2.0当量)并且允许在室温下搅拌60分钟。添加7-氨基-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(75mg，0.30mmol，1.2当量)和na2co3(93mg，1.09mmol，4.0当量)并且允许在室温下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用水稀释并且用etoac(50ml x 2)萃取。将合并的
有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法[硅胶100-200目；在己烷中的0-50％etoac洗脱]纯化以得到呈浅棕色固体的所希望的化合物(150mg，96.7％)。lcms：564.27(m 1)

。
[0200]
步骤3：2-乙基-1-(5-氟-6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-((1,2,3,4-四氢异喹啉-7-基)氨基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮的合成：将7-((2-乙基-1-(5-氟-6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(150mg，0.26mmol，1.0当量)溶解在醚(1ml)中，然后逐滴添加在hcl(10ml)中的2.0m醚并且允许在室温下搅拌2h。反应完成后，将反应混合物过滤并且在减压下干燥并且通过反相纯化获得呈灰白色固体的纯化的产物(70mg，46.7％)。lcms:464.21(m 1)

；1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ10.33(br s,1h)9.08(br s,2h)8.86(s,1h)7.89-8.09(m,2h)7.70(br s,1h)7.47(d,j＝7.5hz,1h)7.18(d,j＝8.3hz,1h)4.26(br s,2h)4.00(d,j＝7.4hz,2h)3.36(br s,3h)2.94(br s,2h)1.51(s,6h)0.96(t,j＝7.0hz,3h)。实施例s-22：6-((1,1-二甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)氨基)-1-(5-氟-6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-2-异丙基-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(化合物号1.251)的合成
[0201]
步骤1：6-((1-(5-氟-6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-2-异丙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-1,1-二甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯的合成：向1-(5-氟-6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-2-异丙基-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(200mg，0.52mmol，1.0当量)在甲苯(4.0ml)中的搅拌溶液中添加m-cpba(231mg，1.04mmol，2.0当量)并且允许在室温下搅拌60分钟。添加6-氨基-1,1-二甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(146mg，0.52mmol，1.0当量)和na2co3(220mg，2.08mmol，4.0当量)并且允许在室温下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用水稀释并且用etoac(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法[硅胶100-200目；在己烷中的0-50％etoac洗脱]纯化以得到呈灰白色固体的所希望的化合物(120mg，37.4％)。lcms：606.28(m 1)

。
[0202]
步骤2：6-((1,1-二甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)氨基)-1-(5-氟-6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-2-异丙基-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮的合成：将6-((1-(5-氟-6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-2-异丙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-1,1-二甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(92mg，0.15mmol，1.0当量)溶解在二噁烷(1ml)中，然后逐滴添加在二噁烷(1.5ml)中的4.0m-hcl并且允许在室温下搅拌2h。反应完成后，将反应混合物过滤并且在减压下干燥并且通过反相纯化获得呈白
色固体的纯化的产物(21mg，27.3％)。lcms:506.6(m 1)

；1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ10.29(br s,1h)8.83(s,1h)8.02(d,j＝10.1hz,1h)7.86(d,j＝6.1hz,1h)7.64(br s,1h)7.49(d,j＝8.7hz,1h)7.33(d,j＝8.7hz,1h)4.13-4.25(m,2h)3.40(br s,2h)2.98(br s,2h)1.61(s,6h)1.52(s,6h)1.33(d,j＝6.58hz,6h)。实施例s-23：6-((2',3'-二氢-1'h-螺[环丙烷-1,4'-异喹啉]-7'-基)氨基)-1-(5-氟-6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-2-异丙基-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(化合物号1.254)的合成
[0203]
步骤1：7'-((1-(5-氟-6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-2-异丙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-1'h-螺[环丙烷-1,4'-异喹啉]-2'(3'h)-甲酸叔丁酯的合成：向1-(5-氟-6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-2-异丙基-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(200mg，0.52mmol，1.0当量)在甲苯(4.0ml)中的搅拌溶液中添加m-cpba(249mg，1.05mmol，2.0当量)并且允许在室温下搅拌60分钟。添加7'-氨基-1'h-螺[环丙烷-1,4'-异喹啉]-2'(3'h)-甲酸叔丁酯(146mg，0.52mmol，1.0当量)和na2co3(220mg，2.08mmol，4.0当量)并且允许在室温下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用水稀释并且用etoac(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法[硅胶100-200目；在己烷中的0-50％etoac洗脱]纯化以得到呈灰白色固体的所希望的化合物。lcms：604.28(m 1)

。
[0204]
步骤2：6-((2',3'-二氢-1'h-螺[环丙烷-1,4'-异喹啉]-7'-基)氨基)-1-(5-氟-6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-2-异丙基-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮二盐酸盐的合成：将7'-((1-(5-氟-6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-2-异丙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-1'h-螺[环丙烷-1,4'-异喹啉]-2'(3'h)-甲酸叔丁酯(80mg，0.13mmol，1.0当量)溶解在二噁烷(1ml)中，然后逐滴添加在二噁烷(1.5ml)中的4.0m-hcl并且允许在室温下搅拌2h。反应完成后，将反应混合物过滤并且在减压下干燥并且通过反相纯化进行纯化以得到呈白色固体的所希望的化合物(34mg，44.5％)。lcms:504.58(m 1)

；1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ10.31(br s,1h)9.23(br s,2h)8.73-8.87(m,1h),7.97-8.05(m,1h),7.87(d,j＝8.3hz,1h),7.65(br s,1h),7.48(d,j＝8.3hz,1h),6.83(d,j＝8.7hz,1h),4.36(br s,1h)4.14-4.26(m,2h),3.26(br s,2h),1.52(s,6h),1.33(d,j＝6.5hz,6h),1.08(br s,4h)。实施例s-24：2-乙基-1-(5-氟-6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-((1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)氨基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(化合物号1.261)的合成
[0205]
步骤1：2-乙基-1-(5-氟-6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮的合成：向2-乙基-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(500mg，2.37mmol，1.0当量)和2-(6-溴-3-氟吡啶-2-基)丙-2-醇(556.6mg，2.37mmol，1.0当量)在二噁烷(10ml)中的搅拌溶液中添加碳酸钾(657.6mg，4.75mmol，2.0当量)并且将所得的混合物用氮气吹扫10min，然后添加碘化亚铜(90.5mg，0.47mmol，0.2当量)和n,n'-二甲基乙二胺(dmeda)(0.09ml，0.951mmol，0.4当量)并且用氮气再次吹扫10min，在130℃下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用水稀释并且用etoac(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法[硅胶100-200目；在己烷中的0-50％etoac洗脱]纯化以得到呈棕色液体的所希望的产物(520mg，60.2％)。lcms：364.44(m 1)

。
[0206]
步骤2：6-((2-乙基-1-(5-氟-6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯)的合成：向2-乙基-1-(5-氟-6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(250mg，0.68mmol，1.0当量)在甲苯(5.0ml)中的搅拌溶液中添加m-cpba(304mg，1.37mmol，2.0当量)并且允许在室温下搅拌60分钟。添加6-氨基-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(170.8mg，0.68mmol，1.0当量)和na2co3(291.2mg，2.11mmol，4.0当量)并且允许在室温下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用水稀释并且用etoac(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法[硅胶100-200目；在己烷中的0-50％etoac洗脱]纯化以得到呈浅棕色固体的所希望的化合物(97mg，25.0％)。lcms：564.7(m 1)

。
[0207]
步骤3：2-乙基-1-(5-氟-6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-6-((1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)氨基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮的合成：将6-((2-乙基-1-(5-氟-6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-2-基)-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(90mg，0.16mmol，1.0当量)溶解在二噁烷(1ml)中，然后逐滴添加在hcl(10ml)中的4.0m二噁烷并且允许在室温下搅拌2h。反应完成后，将反应混合物过滤并且在减压下干燥；通过反相纯化获得呈灰白色固体的纯化的产物(34mg，44.6％)。lcms:464.58(m 1)

；1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ10.19(br s,1h)8.84(s,1h)7.87-8.06(m,2h)7.51(br s,1h)7.38(d,j＝8.3hz,1h)7.03(d,j＝8.3hz,1h)5.25(s,1h)4.01(d,j＝7.0hz,2h)3.86(s,2h)2.98(t,j＝5.7hz,2h)2.67(d,j＝5.3hz,2h)1.41-1.65(s,6h)1.17-1.29(m,2h)0.97(t,j＝7.0hz,3h)。实施例s-25：1-(6-(6-((4,4-二甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉-7-基)氨基)-2-乙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶-2-基)环丙烷-1-甲腈(化合物号1.40)的合成
[0208]
步骤1：7-((1-(6-(1-氰基环丙基)吡啶-2-基)-2-乙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-4,4-二甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯的合成：向1-(6-(2-乙基-6-(甲硫基)-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶-2-基)环丙烷-1-甲腈(100mg，0.28mmol，1.0当量)在甲苯(3.0ml)中的搅拌溶液中添加m-cpba(134mg，0.56mmol，2.0当量)并且允许在室温下搅拌1h。添加7-氨基-4,4-二甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(78mg，0.28mmol，1.0当量)和na2co3(120mg，1.132mmol，4.0当量)并且允许在室温下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用水稀释并且用etoac(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法[硅胶100-200目；在己烷中的0-50％etoac洗脱]纯化以得到呈浅黄色固体的所希望的化合物(51mg，30.9％)。lcms：581.29(m 1)

。
[0209]
步骤2：1-(6-(6-((4,4-二甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉-7-基)氨基)-2-乙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶-2-基)环丙烷-1-甲腈的合成：将7-((1-(6-(1-氰基环丙基)吡啶-2-基)-2-乙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-4,4-二甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(51mg，0.087mmol，1.0当量)溶解在二噁烷(1ml)中，然后逐滴添加在二噁烷(1ml)中的4.0m-hcl并且允许在室温下搅拌2h。反应完成后，将反应混合物过滤并且在减压下干燥，得到粗品用于预纯化以得到呈白色固体的所希望的化合物(22mg，45.2％)。lcms:481.24(m 1)

；1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ10.36(br s,1h)9.11(br s,2h)8.88(s,1h)8.14(t,j＝7.7hz,1h)7.93(d,j＝7.8hz,1h)7.63(br s,1h)7.49-7.60(m,1h)7.45(d,j＝8.7hz,1h)4.26(br s,2h)3.98(m,j＝7.45hz,2h)3.24(br s,2h)1.81-1.91(m,2h)1.63-1.75(m,2h)1.35(s,6h)0.97(t,j＝7.02hz,3h)。实施例s-26：1-(6-(3-氧代-6-(1,2,3,4-四氢异喹啉-7-基氨基)-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶-2-基)环丙烷甲腈(化合物号1.32)的合成
[0210]
步骤1：1-(6-(6-(甲硫基)-3-氧代-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶-2-基)环丙烷甲腈的合成：向6-(甲硫基)-2-(2,2,2-三氟乙基)-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3(2h)-酮(264mg，1.0mmol，1.0当量)和1-(6-溴吡啶-2-基)环丙烷-1-甲腈(245mg，1.1mmol，1.0当量)在二噁烷(10ml)中的搅拌溶液中添加碳酸钾(276mg，2.0mmol，2.0当量)并且将所得的混合物用氮气吹扫10min，然后添加碘化亚铜(38mg，0.2mmol，0.2当量)和n,n'-二甲基乙二胺(dmeda)(0.05ml，0.4mmol，0.4当量)并且用氮气
再次吹扫10min，然后在130℃下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用水稀释并且用etoac(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法[硅胶100-200目；在己烷中的0-50％etoac洗脱]纯化以得到呈浅棕色固体的所希望的产物(220mg，54.2％)。lcms：407.3(m 1)

。
[0211]
步骤2：7-(1-(6-(1-氰基环丙基)吡啶-2-基)-3-氧代-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基氨基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯的合成：向1-(6-(6-(甲硫基)-3-氧代-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶-2-基)环丙烷甲腈(102mg，0.25mmol，1.0当量)在甲苯(2.0ml)中的搅拌溶液中添加m-cpba(122mg，0.5mmol，2.0当量)并且允许在室温下搅拌60分钟。添加7-氨基-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(75mg，0.31mmol，1.2当量)和na2co3(106mg，1.0mmol，4.0当量)并且允许在室温下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用水稀释并且用etoac(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法[硅胶100-200目；在己烷中的0-50％etoac洗脱]纯化以得到呈灰白色固体的所希望的化合物(100mg，72％)。lcms：607.4(m 1)

。
[0212]
步骤3：1-(6-(3-氧代-6-(1,2,3,4-四氢异喹啉-7-基氨基)-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶-2-基)环丙烷甲腈的合成：将7-(1-(6-(1-氰基环丙基)吡啶-2-基)-3-氧代-2-(2,2,2-三氟乙基)-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基氨基)-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(100mg，0.18mmol，1.0当量)溶解在二噁烷(1ml)中，然后逐滴添加在二噁烷(1ml)中的4.0m-hcl并且允许在室温下搅拌4h。反应完成后，将反应混合物过滤，在减压下干燥并且与乙醚一起研磨以得到白色固体。向此固体中添加nahco3水溶液(10ml)并且将产物萃取到dcm中。将有机层经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到呈灰白色固体的所希望的产物(20mg，22％)。lcms:507.2(m 1)

；1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ10.43(br s,1h)8.95(s,1h)8.11(t,j＝7.8hz,1h)7.91(br s,1h)7.53(d,j＝7.8hz,2h)7.33(br s,1h)7.04(d,j＝8.3hz,1h)4.91(d,j＝8.7hz,2h)3.85(br s,2h)2.96(d,j＝6.1hz,2h)2.67(d,j＝1.75hz,2h)1.79-1.89(m,2h)1.63-1.76(m,2h)。实施例s-27：1-(6-(6-(1,1-二甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基氨基)-2-乙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶-2-基)环丙烷甲腈(化合物号1.39)的合成
[0213]
步骤1：6-(1-(6-(1-氰基环丙基)吡啶-2-基)-2-乙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基氨基)-1,1-二甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯的合成：向1-(6-(2-乙基-6-(甲硫基)-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶-2-基)环丙烷甲腈(125mg，0.35mmol，1.0当量)在甲苯(2.0ml)中的搅拌溶液中添加m-cpba(172mg，0.7mmol，2.0当量)并且允许在室温下搅拌60分钟。添加6-氨基-1,1-二甲基-3,4-二氢异喹
啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(107mg，0.39mmol，1.1当量)和na2co3(149mg，1.4mmol，4.0当量)并且允许在室温下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用水稀释并且用etoac(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法[硅胶100-200目；在己烷中的0-50％etoac洗脱]纯化以得到呈浅黄色固体的所希望的化合物(110mg，54.2％)。lcms：581.2(m 1)

。
[0214]
步骤2：1-(6-(6-(1,1-二甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基氨基)-2-乙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶-2-基)环丙烷甲腈的合成：将6-(1-(6-(1-氰基环丙基)吡啶-2-基)-2-乙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基氨基)-1,1-二甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(110mg，0.19mmol，1.0当量)溶解在二噁烷(2ml)中，然后逐滴添加在二噁烷(2ml)中的4.0m-hcl并且允许在室温下搅拌2h。反应完成后，将溶剂蒸发，与乙醚(3x 5ml)一起研磨并且干燥以得到呈灰白色固体的所希望的化合物(76mg，83.3％)。lcms:481.5(m 1)

；1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ10.34(br s,1h)9.62(br s,2h)8.77-8.94(s,1h)8.17(t,j＝7.8hz,1h)7.91(d,j＝7.8hz,1h)7.68(br s,1h)7.45-7.56(m,2h)7.36(d,j＝8.7hz,1h)3.98(q,j＝6.8hz,2h)3.40(br s,2h)3.04(t,j＝6.1hz,2h)1.81-1.93(m,2h)1.58-1.77(m,8h)0.97(t,j＝7.0hz,3h)。实施例s-28：1-(6-(6-(2',3'-二氢-1'h-螺[环丙烷-1,4'-异喹啉]-7'-基氨基)-2-乙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶-2-基)环丙烷甲腈(化合物号1.42)的合成
[0215]
步骤1：7'-(1-(6-(1-氰基环丙基)吡啶-2-基)-2-乙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基氨基)-1'h-螺[环丙烷-1,4'-异喹啉]-2'(3'h)-甲酸叔丁酯的合成：向1-(6-(2-乙基-6-(甲硫基)-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶-2-基)环丙烷甲腈(125mg，0.35mmol，1.0当量)在甲苯(2.0ml)中的搅拌溶液中添加m-cpba(172mg，0.7mmol，2.0当量)并且允许在室温下搅拌60分钟。添加7'-氨基-1'h-螺[环丙烷-1,4'-异喹啉]-2'(3'h)-甲酸叔丁酯(106mg，0.39mmol，1.1当量)和na2co3(149mg，1.4mmol，4.0当量)并且允许在室温下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用水稀释并且用etoac(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)和盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法[硅胶100-200目；在己烷中的0-50％etoac洗脱]纯化以得到呈浅黄色固体的所希望的化合物(90mg，44.6％)。lcms：579.2(m 1)

。
[0216]
步骤2：1-(6-(6-(2',3'-二氢-1'h-螺[环丙烷-1,4'-异喹啉]-7'-基氨基)-2-乙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶-2-基)环丙烷甲腈的合成：将7'-(1-(6-(1-氰基环丙基)吡啶-2-基)-2-乙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基氨基)-1'h-螺[环丙烷-1,4'-异喹啉]-2'(3'h)-甲酸叔丁酯(90mg，0.16mmol，1.0当量)溶解在二噁烷(1ml)，然后逐滴添加在二噁烷(1ml)中的4.0m-hcl并且允许在室温下搅拌
4h。反应完成后，与乙醚(3x 5ml)一起研磨并且干燥以得到呈灰白色固体的所希望的化合物(31mg，40.5％)。lcms:479.5(m 1)

；1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ10.34(br s,1h)9.36(br s,2h)8.88(s,1h)8.16(t,j＝7.9hz,1h)7.92(d,j＝7.9hz,1h)7.67(br s,1h)7.45-7.56(m,2h)6.84(d,j＝8.7hz,1h)4.37(br s,2h)3.89-4.03(m,2h)3.26(br s,2h)1.77-1.92(m,2h)1.60-1.76(m,2h)1.09(d,j＝4.4hz,4h)0.97(t,j＝6.8hz,3h)。实施例s-29：1-(4-(6-((1,1-二甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)氨基)-2-乙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶-2-基)环丙烷-1-甲腈(化合物号1.63)的合成
[0217]
步骤1：6-((1-(2-(1-氰基环丙基)吡啶-4-基)-2-乙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-1,1-二甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯的合成：向1-(4-(2-乙基-6-(甲硫基)-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶-2-基)环丙烷-1-甲腈(100mg，0.28mmol，1.0当量)在甲苯(3ml)中的搅拌溶液中添加m-cpba(126mg，0.56mmol，2.0当量)并且允许在室温下搅拌60分钟。添加6-氨基-1,1-二甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(78.4mg，0.28mol，1.0当量)和na2co3(120mg，1.13mmol，4.0当量)并且允许在室温下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用水稀释并且用etoac(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)、盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法[硅胶100-200目；在己烷中的0-50％etoac洗脱]纯化以得到标题化合物(70mg，42.5％)。lcms：581.69(m 1)

。
[0218]
步骤2：1-(4-(6-((1,1-二甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基)氨基)-2-乙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)吡啶-2-基)环丙烷-1-甲腈的合成：将6-((1-(2-(1-氰基环丙基)吡啶-4-基)-2-乙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-1,1-二甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(70mg，0.12mmol，1.0当量)溶解在二氯甲烷(1ml)中，然后逐滴添加tfa(0.5ml)并且允许在室温下搅拌1h。反应完成后，将反应混合物过滤并且在减压下干燥并且与乙醚一起研磨以得到标题化合物(4mg，6.3％)。lcms:481.58(m 1)

；1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ10.43(br s,1h)8.84-8.95(m,1h)8.69(d,j＝5.2hz,1h)7.48-7.67(m,4h)7.37(d,j＝8.7hz,1h)3.70-3.86(m,2h)3.39(br s,2h),2.97(br s,2h)1.70-1.95(m,4h),1.61(s,6h),0.98(t,j＝7.2hz,3h)。实施例s-30：2-(6-(6-(1,1-二甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基氨基)-2-乙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-5-氟吡啶-2-基)-2-甲基丙腈(化合物号1.335)的合成
[0219]
步骤1：2-(6-(2-乙基-6-(甲硫基)-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-5-氟吡啶-2-基)-2-甲基丙腈的合成：向2-(6-溴-5-氟吡啶-2-基)-2-甲基丙腈(300mg，1.23mmol，1.0当量)和2-乙基-6-(甲硫基)-1,2-二氢-3h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-3-酮(259mg，1.23mmol，1.0当量)在(10ml)二噁烷中的搅拌溶液中添加碳酸钾(341.2mg，2.46mmol，2.0当量)并且将所得的混合物用氮气吹扫10min，然后添加碘化亚铜(47mg，0.24mmol，0.2当量)和n,n'-二甲基乙二胺(dmeda)(0.05ml，0.49mmol，0.4当量)并且用氮气再次吹扫10min，在90℃下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用水稀释并且用etoac(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)、盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法纯化以得到标题化合物(106mg，23.1％)。lcms：372.4(m 1)

。
[0220]
步骤2：6-((1-(6-(2-氰基丙-2-基)-3-氟吡啶-2-基)-2-乙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-1,1-二甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯的合成：向2-(6-(2-乙基-6-(甲硫基)-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-5-氟吡啶-2-基)-2-甲基丙腈(106mg，0.28mmol，1.0当量)在(3.0ml)甲苯中的搅拌溶液中添加m-cpba(126.4mg，0.56mmol，2.0当量)并且允许在室温下搅拌1h。添加6-氨基-1,1-二甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(79mg，0.28mmol，1.05当量)和na2co3(120mg，1.13mmol，4.0当量)并且允许在室温下搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物用水(50ml)稀释并且用etoac(50ml x 2)萃取。将合并的有机层用水(50ml)、盐水溶液(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥并且在减压下浓缩以得到粗产物，将其通过快速色谱法[硅胶100-200目；在己烷中的0-50％etoac洗脱]纯化得到标题化合物(40mg，23.4％)。lcms：600.7(m 1)

。
[0221]
步骤3：2-(6-(6-(1,1-二甲基-1,2,3,4-四氢异喹啉-6-基氨基)-2-乙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-1-基)-5-氟吡啶-2-基)-2-甲基丙腈的合成：将6-((1-(6-(2-氰基丙-2-基)-3-氟吡啶-2-基)-2-乙基-3-氧代-2,3-二氢-1h-吡唑并[3,4-d]嘧啶-6-基)氨基)-1,1-二甲基-3,4-二氢异喹啉-2(1h)-甲酸叔丁酯(40mg，0.06mmol，1.0当量)溶解在二噁烷(1ml)中，然后逐滴添加在二噁烷(1ml)中的4.0m hcl并且允许在室温下搅拌1h。反应完成后，将反应混合物过滤并且在减压下干燥以得到标题化合物(22mg，60.5％)。lcms:501.5(m 1)

；1h nmr(400mhz,dmso-d6):δ10.24(br s,1h)8.87(s,1h)8.26(br s,1h)8.13-8.24(m,2h)8.09(d,j＝6.1hz,1h)7.51(br s,1h)7.45(d,j＝8.3hz,1h)7.27(d,j＝8.7hz,1h)3.95-4.09(m,2h)3.10(br s,2h)2.77(br s,2h)1.76(s,6h)1.43(s,6h)0.98(t,j＝7.0hz,3h)。
[0222]
此处所公开的化合物是使用适当的起始材料和试剂根据实施例s1-s30和方案1至方案5中例示的实验细节制备的。生物学实施例实施例b1.wee1 ic
50
确定
[0223]
化合物针对wee1激酶的ic
50
值是通过lanthascreentm铽标记的tr-fret测定确定的。在1x激酶缓冲液(#pv6135，invitrogen，life technologies，纽约格兰德岛)中进行激酶测定，其中在小体积384孔板(#4511，corning)中的总反应体积为10μl。将连续稀释的化合物(3倍)与wee1酶(1nm)(#pr7373a，invitrogen，life technologies，纽约格兰德岛)一起孵育10min；添加atp(10μm)(#a1852，sigma，密苏里州圣路易斯)和荧光-polygt底物(200nm)(#pv3610，invitrogen，life technologies，纽约格兰德岛)的混合物并且在室温下在黑暗中孵育1h。1h后，添加10μl终止溶液，所述终止溶液含有在tr-fret稀释缓冲液(#pv3574，invitrogen，life technologies，tr-fret)中的铽标记的抗体(4nm)(#pv3529，invitrogen，life technologies，纽约格兰德岛)和edta(#e5134，sigma，密苏里州圣路易斯)(20mm)。在synergy neo板读取器(biotek，佛蒙特州威努斯基)中在340nm的单一激发和分别在495nm和520nm下的双发射下进行读数。
[0224]
将测试样品的活性％计算为(样品-min)*100/(max-min)。[max：dmso对照，与酶和dmso完全反应；以及min：无酶和dmso]。将抑制百分比(100-活性％)拟合于xlfit的“四参数逻辑斯谛模型”用于确定ic
50
值。结果示出于表2中。表2
实施例b2.pkmyt1 ic
50
确定
[0225]
测试化合物对pkmyt1激酶活性的抑制是通过reaction biology corporation(宾夕法尼亚州莫尔文)的hotspot激酶测定测量的。简而言之，在反应缓冲液(20mm hepes(ph 7.5)、10mm mgcl2、1mm egta、0.01％brij35、0.02mg/ml bsa、0.1mm na3vo4、2mm dtt、1％dmso)中制备髓鞘碱性蛋白底物。将pkmyt1激酶递送到底物溶液中并且轻轻混合。通过acoustic技术(echo550；纳升范围)将在100％dmso中的测试化合物添加到激酶反应混合物中并且在室温下孵育20min。将
33
p-atp递送到反应混合物中以引发反应。在10μm atp下进行反应。在室温下孵育2小时后，通过p81过滤结合方法检测激酶活性。将化合物用3倍连续稀释在10剂量ic
50
模式中进行测试。使用在graphpad prism(graphpad software，加利福尼亚州圣地亚哥)内具有s形剂量响应和可变斜率的非线性回归模型来计算单个测试化合物的ic
50
值。结果示出于表3中。表3
实施例b3.确定化合物在a427细胞系中在细胞毒性测定中的效力
[0226]
将a427(htb-53；atcc)(一种肺上皮细胞系)以1500个细胞/100μl/孔的细胞计数接种到96孔边缘板(167425；thermofisher)中的培养基(mem，41090101；gibco)中。允许使细胞在nuaire培养箱(加湿)中在5％co2环境(培养条件)中在37℃下生长24h。将在所希望
的测试浓度范围内连续稀释的测试化合物(100μl)添加到培养板中，并且将细胞在培养条件下进一步培养72h。在指定的孵育时间通过将培养基用100μl的在培养基中制备的1mm刃天青(r7017；sigma)替代来终止实验，并且将板在培养条件下进一步孵育4-6h。使用多模式板读取器(biotek synergy neo)在535nm的激发波长和590nm的发射波长下记录荧光以获得相对荧光单位。数据分析如下：从每个读数中减去背景荧光(仅含有培养基的空白)值并且用媒介物对照(dmso处理的细胞)归一化以获得存活/增殖百分比。从100中减去存活百分比以得到增殖抑制百分比，其用于计算ic
50
值。在其他细胞系(诸如a549、aspc-1、panc 10.05、a172、u-87mg)中化合物的效力可以以类似的方式确定。结果示出于表4中。表4
实施例b4.确定化合物在选定的癌细胞系中在细胞增殖测定中的效力和细胞pd效应。
[0227]
在具有多种组织类型的另外的细胞系(诸如lovo结直肠腺癌、nci-h460大细胞肺癌、hct-116结直肠癌和a2780卵巢癌细胞)中研究测试化合物的作用。在对数生长期收获癌细胞并且计数。用合适的培养基将细胞浓度调节到合适的数量，并且将90μl细胞悬浮液添加到96孔板中。细胞接种后，将板轻轻摇动以使细胞均匀分布，并且在第1天在37℃、5％co2下孵育。
[0228]
在第2天将细胞用在所希望的浓度范围(例如，1.5nm-10μm)内的9个浓度(通过将测试化合物储备溶液(在dmso中的10mm)用培养基连续稀释)下的测试化合物处理。典型地在处理后72h，通过如promega推荐的cell (目录号：g7572，promega)评估细胞活力。
[0229]
使用graphpad prism(5版，graphpad software,inc.，加利福尼亚州圣地亚哥)绘制细胞活力数据。此外，使用在graphpad prism内具有s形剂量响应和可变斜率的非线性回归模型来计算单个测试化合物的ic
50
值。
[0230]
可以使用类似的增殖方法(其中细胞接种密度和/或孵育持续时间可能会有所不同)在相同和/或其他癌细胞系(它们对报道的wee1抑制化合物具有不同的敏感性)中研究测试化合物。实施例b5.通过测定细胞pd效应确定化合物的效力。
[0231]
磷酸化-cdc2和γ-h2ax是两种临床相关的与wee1抑制相关的生物标记物。据报道，细胞中cdc2y15磷酸化被wee1抑制剂消除(gavory g等人,almac discovery,aacr poster,2016)。在wee1敏感细胞系中通过wee1处理上调γ-h2ax(一种dna双链断裂标记物)
(guertin ad等人,molecular cancer therapeutics,2013)。使用蛋白质印迹方法用选择性抗体处理24或48h后，在选定的癌细胞系中评估选定的测试化合物对pcdc2和γ-h2ax的作用(guertin ad等人,molecular cancer therapeutics,2013)。
[0232]
通过酶联免疫吸附测定(elisa)评估在用测试化合物处理细胞后磷酸化-cdc2水平的变化。将a427细胞或aspc-1细胞在6孔板中铺板并且培养24h至大约80％-90％的汇合度。更换培养基，并且将细胞用媒介物对照或在几种不同浓度下的测试化合物处理。在细胞培养条件下将处理的细胞孵育指定的时间(例如，24h)后，将细胞用冰冷的pbs冲洗并且在含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的1x细胞裂解缓冲液中裂解。在冰上短暂孵育后，将细胞用细胞刮刀从板上刮下并且转移到离心管中，并且然后在液氮和37℃水浴中经受三次冻融循环以进一步裂解。将裂解物离心以沉淀细胞碎片(例如，在4℃下使用2000x g的10min离心)，并且将上清液转移到在冰上的新鲜管中。通过bradford方法或等效方法估计样品的蛋白质浓度。根据制造商的说明书，用磷酸化-cdc2(tyr15)夹心elisa试剂盒(目录号7176，cell signaling technology，马萨诸塞州丹佛斯)进行elisa。结果在表5中示出。表5表5nd：未确定
[0233]
可替代地或另外地，使用针对磷酸化-cdc2的一抗(诸如磷酸化-cdc2(tyr15)(10a11)兔mab(目录号4539，cell signaling technology)或兔多克隆抗cdk1(磷酸化y15)抗体(目录号ab47594，abcam，英国剑桥)通过样品的蛋白质印迹来分析磷酸化-cdc2水平的变化。实施例b6.在小鼠异种移植模型中评估测试化合物
[0234]
为了检查测试化合物(作为单一药剂和与其他药剂(诸如吉西他滨、白蛋白结合型紫杉醇和替莫唑胺(temozomide))组合)的体内抗肿瘤活性，在细胞系异种移植模型和/或
pdx模型中进行肿瘤生长实验。基于以上所述的体外研究选择细胞系。要使用的pdx模型是从直接取自患有例如胰腺导管腺癌(pdac)或胶质母细胞瘤的患者的肿瘤中建立的。
[0235]
将细胞或肿瘤卡盘皮下植入到裸鼠的侧腹并且允许其生长直至肿瘤大小达到200mm3。使用卡尺测量肿瘤，并且使用以下公式计算肿瘤体积：肿瘤体积＝(a x b2/2)，其中
‘
b’是最小直径并且
‘
a’是最大直径。一旦建立的肿瘤达到大约200mm3，然后将小鼠分层至治疗组。治疗组是例如：媒介物对照、吉西他滨 白蛋白结合型紫杉醇、单独的测试化合物、吉西他滨 白蛋白结合型紫杉醇 测试化合物，每组10只小鼠。可替代地，治疗组是例如：媒介物对照、替莫唑胺(temozolomide)、单独的测试化合物、替莫唑胺 测试化合物。根据标准实践特定地针对每项研究确定确切的治疗组、药物剂量和给药方案。监测肿瘤生长，并且以规定的间期记录肿瘤体积。当每只小鼠的单个的肿瘤达到近似终点(肿瘤体积》1,500mm3)时，将小鼠用调节的co2处死。一旦在对照组中达到预确定的终点，则通过将对照组的肿瘤测量值与其他研究组的肿瘤测量值比较来计算肿瘤生长抑制(tgi)。可替代地，将细胞原位植入并且测量总体存活率。
[0236]
尽管为了理解清楚的目的，已经通过说明和举例的方式稍微详细地描述了前述发明，但是对于本领域技术人员清楚的是，鉴于以上教导可以实践某些微小的改变和修改。因此，描述和实施例不应被解释为限制本发明的范围。