一种注射用硫酸头孢匹罗中杂质的检测方法与流程

1.本发明涉及医药检测技术领域，特别涉及一种注射用硫酸头孢匹罗中杂质的检测方法。


背景技术：

2.头孢匹罗属最新的第4代头孢菌素类抗生素，它不仅有第3代头孢菌素的特征而且与青霉素结合蛋白亲合力高，在细菌周质中维持高浓度，对染色体和质粒介导的β内酰胺酶稳定且亲合力低，对多重耐药菌有效，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有高度抗菌活性。不仅具有抗需氧的革兰阴性菌活性，又具强大的抗厌氧菌活性。对引起脑膜炎的细菌均有良好的抗菌活性，且对血脑屏障的穿透力比其他的广谱抗菌素强，是药代动力学优良的长效药物。
3.β-内酰胺类抗生素常见的不良反应是速发型过敏反应。引发过敏反应的过敏原不是抗生素本身，而是其中的高分子杂质，传统采用sephadexg-10凝胶色谱系统对高分子杂质进行分析，但由于硫酸头孢匹罗对照品在流动相中不能完全缔合而无法测定，大大降低检测灵敏度。


技术实现要素：

4.鉴于此，本发明提出一种注射用硫酸头孢匹罗中杂质的检测方法，解决上述问题。
5.本发明的技术方案是这样实现的：一种注射用硫酸头孢匹罗中杂质的检测方法：包括以下步骤：
6.s1、供试品溶液的制备：称取硫酸头孢匹罗
7.s2、使用二维液相色谱质谱联用法检测，将供试品溶液依次通过一维液相色谱、二维液相色谱进行捕集后洗脱分离，再由质谱进行检测；
8.一维色谱条件如下：
9.色谱柱：symmetry c
18
反相液相色谱柱；150
×
4.6mm，3.5μm
10.流动相a：三氟乙酸水溶液；流动相b：甲酸铵水溶液；
11.进样量：5～15μl；柱温：32～45℃；流速：0.2～0.7ml/min；
12.检测波长：210～220nm，洗脱条件为：
13.(1)第0～30min，流动相a与流动相b的体积比为70～100:0～30；
14.(2)第30.01～35min，流动相a与流动相b的体积比为0～30:70～100；
15.(3)第35.01～45min，流动相a与流动相b的体积比为5～95:5～95；
16.二维色谱条件如下：
17.色谱柱：acquity uplc beh c
18
反相色谱柱；50
×
2.3mm，1.8μm；
18.流动相a：甲酸水溶液；
19.流动相b：乙腈-甲酸水溶液；
20.进样量：8～18μl；柱温：32～45℃；流速：0.38～0.52ml/min；
21.检测波长：210～220nm，洗脱条件为：
22.(1)第0～5min，流动相a与流动相b的体积比为95～100:0～5；
23.(2)第5.01～35min，流动相a与流动相b的体积比为20～40:60～80；
24.(3)第35.01～45min，流动相a与流动相b的体积比为5～95:5～95；
25.质谱条件如下：
26.ms系统：xevo g2-sqtof，离子化模式：esl

，毛细管电压0.8～1.6kv，源温度：100～120℃，雾化气温度：400～600℃，雾化气流速：700～900l/h，锥孔气流速40～60l/h，采集模式mse；
27.进一步的，所述供试品溶液的制备：称取硫酸头孢匹罗和二甲基亚砜，密封，溶解摇匀。
28.进一步的，所述硫酸头孢匹罗与二甲基亚砜的质量体积比为g/ml为0.3～0.5:20。
29.进一步的，所述一维色谱的流动相a为1.0～1.5v/v％的三氟乙酸水溶液。
30.进一步的，所述一维色谱的流动相b为1.8～2.6w/v％的甲酸铵水溶液。
31.进一步的，所述二维色谱的流动相a为0.05～0.15v/v％甲酸水溶液。
32.进一步的，所述二维色谱的流动相b为体积比6～10：20的乙腈和0.1～0.3v/v％甲酸水溶液。
33.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
34.本发明通过通过一维色谱确定各杂质出峰位置后，确定目标杂质保留时间，将杂质进行中心分割，将杂质反冲至二维色谱柱上分离，最后经过质谱进行鉴定，其中，一维色谱采用三氟乙酸水溶液为流动相a，甲酸铵水溶液为流动相b，二维色谱采用甲酸水溶液为流动相a，乙腈-甲酸水溶液为流动相b，经梯度洗脱，调整洗脱程序，检测出杂质数量最高达到15个，主峰保留时间在13.2～16.8min，理论塔板数2000以上，拖尾因子1.232～1.389，分离度2.368～2.369，s/n在10～30之间；与对比例1比较，说明采用本发明方法进行硫酸头孢匹罗中杂质的检测时，理论塔板数、分离度较好，拖尾因子在0.9～1.95的范围内，s/n在10～30，峰形好，主峰与杂质峰及各杂质峰之间的分离度较高，杂质的灵敏度和分离度显著提高，检测结果准确可靠，重现性好，为注射用硫酸头孢匹罗高分子杂质的鉴定奠定基础。
具体实施方式
35.为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
36.本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
37.本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
38.实施例1
39.一种注射用硫酸头孢匹罗中杂质的检测方法：包括以下步骤：
40.s1、供试品溶液的制备：称取质量体积比为g/ml为0.3～0.5:20的硫酸头孢匹罗与二甲基亚砜中，密封，溶解摇匀
41.s2、使用二维液相色谱质谱联用法检测，将供试品溶液依次通过一维液相色谱、二维液相色谱进行捕集后洗脱分离，再由质谱进行检测；
42.一维色谱条件如下：
43.色谱柱：symmetry c
18
反相液相色谱柱；150
×
4.6mm，3.5μm
44.流动相a：1.0～1.5v/v％三氟乙酸水溶液；
45.流动相b：1.8～2.6w/v％甲酸铵水溶液；
46.进样量：5～15μl；柱温：32～45℃；流速：0.2～0.7ml/min；
47.检测波长：210～220nm，洗脱条件为：
48.(1)第0～30min，流动相a与流动相b的体积比为70～100:0～30；
49.(2)第30.01～35min，流动相a与流动相b的体积比为0～30:70～100；
50.(3)第35.01～45min，流动相a与流动相b的体积比为5～95:5～95；
51.二维色谱条件如下：
52.色谱柱：acquity uplc beh c
18
反相色谱柱；50
×
2.3mm，1.8μm；
53.流动相a：0.05～0.15v/v％甲酸水溶液；
54.流动相b：体积比6～10：20的乙腈和0.1～0.3v/v％甲酸水溶液；
55.进样量：8～18μl；柱温：32～45℃；流速：0.38～0.52ml/min；
56.检测波长：210～220nm，洗脱条件为：
57.(1)第0～5min，流动相a与流动相b的体积比为95～100:0～5；
58.(2)第5.01～35min，流动相a与流动相b的体积比为20～40:60～80；
59.(3)第35.01～45min，流动相a与流动相b的体积比为5～95:5～95；
60.质谱条件如下：
61.ms系统：xevo g2-sqtof，离子化模式：esl

，毛细管电压0.8～1.6kv，源温度：100～120℃，雾化气温度：400～600℃，雾化气流速：700～900l/h，锥孔气流速40～60l/h，采集模式mse。
62.实施例2
63.一种注射用硫酸头孢匹罗中杂质的检测方法：包括以下步骤：
64.s1、供试品溶液的制备：称取质量体积比为g/ml为0.3～0.5:20的硫酸头孢匹罗与二甲基亚砜中，密封，溶解摇匀
65.s2、使用二维液相色谱质谱联用法检测，将供试品溶液依次通过一维液相色谱、二维液相色谱进行捕集后洗脱分离，再由质谱进行检测；
66.一维色谱条件如下：
67.色谱柱：symmetry c
18
反相液相色谱柱；150
×
4.6mm，3.5μm
68.流动相a：1.0～1.5v/v％三氟乙酸水溶液；
69.流动相b：1.8～2.6w/v％甲酸铵水溶液；
70.进样量：5～15μl；柱温：32～45℃；流速：0.2～0.7ml/min；
71.检测波长：210～220nm，洗脱条件为：
72.(1)第0～30min，流动相a与流动相b的体积比为70～100:0～30；
73.(2)第30.01～35min，流动相a与流动相b的体积比为0～30:70～100；
74.(3)第35.01～45min，流动相a与流动相b的体积比为5～95:5～95；
75.二维色谱条件如下：
76.色谱柱：acquity uplc beh c
18
反相色谱柱；50
×
2.3mm，1.8μm；
77.流动相a：0.05～0.15v/v％甲酸水溶液；
78.流动相b：体积比6～10：20的乙腈和0.1～0.3v/v％甲酸水溶液；
79.进样量：8～18μl；柱温：32～45℃；流速：0.38～0.52ml/min；
80.检测波长：210～220nm，洗脱条件为：
81.(1)第0～5min，流动相a与流动相b的体积比为95～100:0～5；
82.(2)第5.01～35min，流动相a与流动相b的体积比为20～40:60～80；
83.(3)第35.01～45min，流动相a与流动相b的体积比为5～95:5～95；
84.质谱条件如下：
85.ms系统：xevo g2-sqtof，离子化模式：esl

，毛细管电压0.8～1.6kv，源温度：100～120℃，雾化气温度：400～600℃，雾化气流速：700～900l/h，锥孔气流速40～60l/h，采集模式mse。
86.实施例3
87.一种注射用硫酸头孢匹罗中杂质的检测方法：包括以下步骤：
88.s1、供试品溶液的制备：称取质量体积比为g/ml为0.3～0.5:20的硫酸头孢匹罗与二甲基亚砜中，密封，溶解摇匀
89.s2、使用二维液相色谱质谱联用法检测，将供试品溶液依次通过一维液相色谱、二维液相色谱进行捕集后洗脱分离，再由质谱进行检测；
90.一维色谱条件如下：
91.色谱柱：symmetry c
18
反相液相色谱柱；150
×
4.6mm，3.5μm
92.流动相a：1.0～1.5v/v％三氟乙酸水溶液；
93.流动相b：1.8～2.6w/v％甲酸铵水溶液；
94.进样量：5～15μl；柱温：32～45℃；流速：0.2～0.7ml/min；
95.检测波长：210～220nm，洗脱条件为：
96.(1)第0～30min，流动相a与流动相b的体积比为70～100:0～30；
97.(2)第30.01～35min，流动相a与流动相b的体积比为0～30:70～100；
98.(3)第35.01～45min，流动相a与流动相b的体积比为5～95:5～95；
99.二维色谱条件如下：
100.色谱柱：acquity uplc beh c
18
反相色谱柱；50
×
2.3mm，1.8μm；
101.流动相a：0.05～0.15v/v％甲酸水溶液；
102.流动相b：体积比6～10：20的乙腈和0.1～0.3v/v％甲酸水溶液；
103.进样量：8～18μl；柱温：32～45℃；流速：0.38～0.52ml/min；
104.检测波长：210～220nm，洗脱条件为：
105.(1)第0～5min，流动相a与流动相b的体积比为95～100:0～5；
106.(2)第5.01～35min，流动相a与流动相b的体积比为20～40:60～80；
107.(3)第35.01～45min，流动相a与流动相b的体积比为5～95:5～95；
108.质谱条件如下：
109.ms系统：xevo g2-sqtof，离子化模式：esl

，毛细管电压0.8～1.6kv，源温度：100～120℃，雾化气温度：400～600℃，雾化气流速：700～900l/h，锥孔气流速40～60l/h，采集模式mse。
110.对比例1
111.与实施例3的区别在于，所述一维色谱的流动相a为体积比97:3的磷酸盐溶液-乙
腈，流动相b为体积比6:4的磷酸盐溶液-乙腈。
112.一、检测结果
113.根据上述实施例1～3和对比例1的检测方法，通过一维色谱确定各杂质出峰位置后，确定目标杂质保留时间，将杂质进行中心分割，将杂质反冲至二维色谱柱上分离，最后进入质谱，考察杂质数量、主峰理论塔板、主峰拖尾因子及任意相邻峰的分离度等，结果如下表：
[0114][0115]
从上表可知，本发明一维色谱采用三氟乙酸水溶液为流动相a，甲酸铵水溶液为流动相b，二维色谱采用甲酸水溶液为流动相a，乙腈-甲酸水溶液为流动相b，经梯度洗脱，调整洗脱程序，检测出实施例1～3的杂质数量最高达到15个，主峰保留时间在13.2～16.8min，理论塔板数2000以上，拖尾因子1.232～1.389，分离度2.368～2.369，s/n在10～30之间；与对比例1比较，说明采用本发明方法进行硫酸头孢匹罗中杂质的检测时，理论塔板数、分离度较好，拖尾因子在0.9～1.95的范围内，s/n在10～30，峰形好，主峰与杂质峰及各杂质峰之间的分离度较高，实施例3效果最优，均符合要求。
[0116]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。