猫胱抑素C荧光定量检测试剂及其制备方法与流程

猫胱抑素c荧光定量检测试剂及其制备方法
技术领域
1.本发明涉及生物检测领域，具体为猫胱抑素c荧光定量检测试剂及其制备方法。


背景技术：

2.肾脏病早期诊断一直是人们关注的问题，评价犬猫肾功能的金标准是肾小球滤过率(gfr)，一般由菊粉或碘己醇试验测量，可是这种方法对于临床来说技术要求高、操作难度大，因此，在兽医临床中常通过测定血清尿素氮(bun)和血清肌酐(crea)来评价肾功能水平，事实上血清尿素氮(bun)和血清肌酐(crea)的浓度会受很多其他因素影响，如摄食状态、机体机能、体重、肌肉量等。此外，在肾小球滤过率(grf)降低75％时，血清肌酐(crea)浓度才会明显上升，因此，人们在寻找更敏感的肾功能标志物的路上，从未停歇。胱抑素c是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，其产生速率稳定，且只通过肾脏代谢，是一种敏感性好、特异性高的肾小球滤过率内源性标志物，动物常规体检时进行胱抑素c筛查，对发现宠物早期肾功能异常有指导意义。
3.对于宠物胱抑素c筛查，可以及早发现早期肾损伤，通过对早期肾损伤进行干预和治疗，可以有效地延长宠物的寿命，提高宠物生活质量，但现有技术中的猫胱抑素c一般采用试剂盒配合检测仪器使用，配备成本高，使用不够方便。


技术实现要素：

4.(一)解决的技术问题
5.针对现有技术的不足，本发明提供了猫胱抑素c荧光定量检测试剂及其制备方法，解决了采用试剂盒配合检测仪器使用成本高且使用不够方便的问题。
6.(二)技术方案
7.为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：猫胱抑素c荧光定量检测试剂，包括以下原料：处理液、玻璃纤维膜、mes缓冲液、微球、edc-hcl、nhs、封闭剂、标记稀释液。
8.优选的，所述的猫胱抑素c荧光定量检测试剂的制备方法，以0.1mg抗体标记量计算，包括以下步骤：
9.s1、结合垫预处理
10.(1)用10mm的pbs配以下溶液：3％bsa、3％蔗糖、1％pvp-k30、1％酪蛋白、1％peg20000、0.1％triton x-100、0.02％nan3，制得处理液；
11.(2)室温下，用所述处理液浸泡玻璃纤维膜12h，温度为42℃条件下鼓风干燥机中干燥16h，得到结合垫；
12.s2、微球缓冲体系调整
13.用0.25ml、20mmol/l的mes缓冲液稀释0.25ml、1μmol/l微球浓度至0.5μmol/l，最终缓冲体系为10mmol/l的mes缓冲液，其中mes缓冲液为ph6.0；
14.s3、微球活化
15.向所述mes缓冲液内加入5ul且浓度为20mg/ml的edc-hcl和5ul且浓度为20mg/ml的nhs，快速混匀后37℃条件下反应15min，10000g离心20min，弃上清，用10mmol/l、ph6.0的mes缓冲液重新悬浮至体积为0.25ml，混匀；
16.s4、抗体偶联微球
17.微球活化后，立即加入0.1mg待标记抗体，迅速混匀，37℃反应1h；
18.s5、洗涤和封闭
19.加入25μl封闭剂，混匀，37℃反应0.5h，10000g离心15min，弃上清，用2ml标记稀释液重新悬浮、分散，得到稀释标记物。
20.s6、喷制结合垫
21.所述稀释标记物3ul/cm喷制所述结合垫，37℃鼓风干燥机中干燥4h。
22.优选的，s3步骤、s4步骤和s5步骤中，如有聚沉现象，采用超声辅助混匀。
23.优选的，s2步骤中，重新悬浮后使微球浓度恢复为1μmol/l。
24.优选的，所述封闭剂包括以下原料：1％bsa、100mm甘氨酸、1％酪蛋白的10mm pbs溶液。
25.优选的，所述标记稀释液包括以下原料：1％bsa、100mm甘氨酸、1％酪蛋白、0.02％nan3的10mm pbs溶液。
26.优选的，还包括划膜条件：划线抗体(t线)：0.5mg/ml,3ul/cm,37℃干燥16h。
27.(三)有益效果
28.本发明提供了猫胱抑素c荧光定量检测试剂及其制备方法。具备以下有益效果：
29.本发明通过将bsa和蔗糖为主料，添加叠氮化钠、peg20000、x-100，采用mes缓冲液、微球、edc-hcl、nhs、封闭剂、标记稀释液，对玻璃纤维膜起到一定程度的封闭作用，可显著降低抗体与样品发生非特异反应，从而有利于提高测试的精密度和灵敏度，能进一步提高抗体耐热能力，有保护抗体的作用，具有优良的防腐杀菌性能，可显著降低抗体反应荧光信号大幅下降的问题，从而有利于提高试剂测试的灵敏度和延长试剂有效期，具有原料价廉易得、反应条件温和、操作要求低等特点，易于工业化生产。
具体实施方式
30.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
31.实施例：
32.本发明实施例提供猫胱抑素c荧光定量检测试剂及其制备方法，猫胱抑素c荧光定量检测试剂，包括以下原料：处理液、玻璃纤维膜、mes缓冲液、微球、edc-hcl、nhs、封闭剂、标记稀释液。
33.edc.hcl是化学物质，分子式是c8h17n3.hcl，用于水溶性浓缩试剂，通用的羰基活化试剂，用于在酰胺与仲胺键合的过程中；能与磷酸基团反应；用于肽合成；蛋白质与核酸交联；制备如免疫交联物，典型条件下，ph4.0-6.0且无缓冲液，特殊条件下，必须避免使用胺以及羧酸盐缓冲液；水溶性肽偶联剂；用于蛋白质中羰基修饰；用于酯的合成。
34.nhs即n-羟基丁二酰亚胺，白色至类白色结晶，用于合成氨基酸保护剂。
35.微球(microspheres)是指药物分散或被吸附在高分子聚合物基质中而形成的微小球状实体，其粒径一般在1—250μm之间，制备微球的载体材料很多,主要分为天然高分子微球(如淀粉微球，白蛋白微球，明胶微球，壳聚糖等)和合成聚合物微球(如聚乳酸微球)。
36.2-(n-吗啉)乙磺酸简称mes，分子式为c6h13no4s，相对分子量为195.24，cas号为4432-31-9。mes用作生物缓冲液，在25℃下pka为6.15，有效缓冲范围在ph5.5～6.7之间，常用ph值为5.5、6.0、6.5，主要由mes、去离子水、防腐剂等组成。
37.猫胱抑素c荧光定量检测试剂的制备方法，以0.1mg抗体标记量计算，包括以下步骤：
38.s1、结合垫预处理
39.(1)用10mm的pbs配以下溶液：3％bsa、3％蔗糖、1％pvp-k30、1％酪蛋白、1％peg20000、0.1％triton x-100、0.02％nan3，制得处理液；牛血清白蛋白(bsa)，是牛血清中的一种球蛋白；pbs是磷酸盐缓冲盐溶液(phosphate buffered saline)，作为溶剂，起溶解保护试剂的作用；pvp-k30是一种非离子型高分子化合物，是n-乙烯基酰胺类聚合物中研究较深且广泛的精细化学品品种，聚乙烯吡咯烷酮k值为30，外观为白色或乳白色粉末或颗粒。polyethylene glycol(peg)，即聚乙二醇，一种氧化乙烯和水的聚合物，在生化实验中，具有多种用途，包括：1)活化后可以结合多肽或蛋白质，用于沉淀蛋白，2)作为一种融合剂强化巨噬细胞杂交瘤的形成，3)分离纯化生物大分子，4)诱导细胞杂交等；也是非常好的溶剂和增溶剂，(peg 20,000)是平均分子量为20,000的聚乙二醇，溶于水，以及许多极性溶剂如丙酮、乙醇和氯化溶剂，peg水溶液室温稳定，初次使用建议用0.45μm的滤膜对其进行过滤除杂。x-100是一种常用的非离子型的表面活性剂和乳化剂，经常用于生化应用以溶解蛋白质，它被视为一种不变性的相对温和的去污剂，并且在许多参考文献中作为一种常规被添加的试剂而被报道，它用于裂解细胞以提取蛋白和细胞器，它还可通透活细胞膜用于转染，与冰冷的pbs(磷酸盐缓冲液)一起悬浮细胞用于细胞dna分析和annexin v检测，在免疫荧光显微研究中对细胞进行通透化处理，免疫荧光标记的组织切片处理等。叠氮化钠，化学式nan3，是一种无机化合物，叠氮化钠为照相乳剂的一种防腐剂，可加入乳剂中，或加到中间层及保护层中，不影响乳剂照相性能，具有优良的防腐杀菌性能。
40.(2)室温下，用所述处理液浸泡玻璃纤维膜12h，温度为42℃条件下鼓风干燥机中干燥16h，得到结合垫；
41.bsa和蔗糖含量较传统配方含量高，添加叠氮化钠、peg20000、bsa和蔗糖含量较传统配方含量高，添加叠氮化钠、peg20000、x-100，对玻璃纤维膜起到一定程度的封闭作用，可显著降低抗体与样品发生非特异反应，从而有利于提高测试的精密度和灵敏度，能进一步提高抗体耐热能力，有保护抗体的作用，具有优良的防腐杀菌性能，可显著降低抗体反应荧光信号大幅下降的问题，从而有利于提高试剂测试的灵敏度和延长试剂有效期。
42.划线羧基量子点荧光微球偶联方法，以0.1mg抗体标记量计算：
43.s2、微球缓冲体系调整
44.用0.25ml、20mmol/l的mes缓冲液稀释0.25ml、1μmol/l微球浓度至0.5μmol/l，最终缓冲体系为10mmol/l的mes缓冲液，其中mes缓冲液为ph6.0。
45.s3、微球活化
46.向所述mes缓冲液内加入5ul且浓度为20mg/ml的edc-hcl和5ul且浓度为20mg/ml的nhs，快速混匀后37℃条件下反应15min，10000g离心20min，弃上清，用10mmol/l、ph6.0的mes缓冲液重新悬浮至体积为0.25ml，使微球浓度恢复为1μmol/l，混匀；如有聚沉现象，可超声辅助混匀。
47.s4、抗体偶联微球
48.微球活化后，立即加入0.1mg待标记抗体，迅速混匀，37℃反应1h；如有聚沉现象，可超声辅助混匀。
49.s5、洗涤和封闭
50.加入25μl封闭剂，混匀，37℃反应0.5h，10000g离心15min，弃上清，用2ml标记稀释液重新悬浮、分散，得到稀释标记物，必要时超声分散。
51.s6、喷制结合垫
52.所述稀释标记物3ul/cm喷制所述结合垫，37℃鼓风干燥机中干燥4h。
53.本实施例中，封闭剂包括以下原料：1％bsa、100mm甘氨酸、1％酪蛋白的10mm pbs溶液。
54.本实施例中，标记稀释液包括以下原料：1％bsa、100mm甘氨酸、1％酪蛋白、0.02％nan3的10mm pbs溶液。
55.本实施例中，划膜条件：划线抗体(t线)：0.5mg/ml,3ul/cm,37℃干燥16h。
56.本发明提供的制备方法具有原料价廉易得、反应条件温和、操作要求低等特点，易于工业化生产。
57.【临床意义】猫胱抑素c(fcys-c)
[0058][0059]
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。