分离检测注射用利福平中利福平及其相关杂质的方法与流程

1.本发明属于分析化学领域，具体涉及一种hplc法分离检测注射用利福平中利福平及其相关杂质的方法。


背景技术：

2.利福平为广谱抗菌素，对结核杆菌，革兰氏阳性菌，革兰阴性菌，麻风杆菌和沙眼病毒均有抑制作用。临床上常与其他抗结核药合用，作为治疗各种结核的第一线药物，也用于治疗对其他抗生素耐药菌所致感染。临床上有口服给药和注射给药，其中注射用利福平效果显著，临床见效快。利福平(rifampicin)，化学名为3-[[(4-甲基-1-哌嗪基)亚氨基]甲基]利福霉素。分子式为c
43h58
n4o
12
，化学结构式为：
[0003][0004]
由利福平的合成工艺及强制降解试验表明，利福平在酸、碱、氧化、高温下均不稳定，主要降解杂质和工艺杂质包括：a/b/c/d/e/f/g/h/i/j/k/l/m/n，即n氧化醌式利福平、27-去甲基利福平、16-羟甲基利福平、醌式利福平、25-去乙酰基利福平、25-去乙酰基-21乙酰利福平、利福霉素sv、25-去乙酰基-23乙酰利福平、n-氧化利福平、利福霉素s、3-甲酰利福霉素sv、利福霉素噁嗪、特定杂质1、特定杂质2等14个杂质，其中杂质b\c\g\j\l为合成工艺杂质，其余杂质为降解杂质，其中特定杂质1和特定杂质2为注射用利福平中特有的杂质。
[0005]
中国药典2015年版收载有注射用利福平的标准，其中有关物质检测方法一致，采用辛基硅烷键合硅胶色谱柱，以乙腈-甲醇-0.075mol/l磷酸二氢钾-1.0mol/l柠檬酸＝30:30:36:4为色谱条件。该色谱条件分离的杂质有醌式利福平、n氧化利福平、3-甲酰利福霉素sv、利福霉素sv、杂质a和利福平(即本发明专利中的杂质d、i、k、g、a和利福平)，不能同时分离上述的14个杂质和利福平。usp42中注射用利福平无有关物质检测项，usp/ep/jp中利福平原料项下有关物质色谱条件基本一致，采用辛基硅烷键合硅胶色谱柱，主要流动性组成是乙腈、磷酸二氢钾缓冲液、柠檬酸和高氯酸，不能同时分离上述的14个杂质和利福平。说明目前现有技术中公开的方法均不能同时适用于上述的14种杂质和利福平的分离检测。


技术实现要素：

[0006]
本发明目的之一是提供一种分离注射用利福平中利福平及其相关杂质的方法，该方法可有效分离利福平及其14种相关杂质。
[0007]
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
[0008]
hplc法分离注射用利福平中利福平及其相关杂质的方法，所述方法采用的色谱柱
是以辛基硅烷键合硅胶为填料，采用流动相a和流动相b进行梯度洗脱，将所述利福平及其相关杂质进行分离；所述相关杂质包括杂质a～n中的一种或多种；所述杂质a～n依次为n氧化醌式利福平(醌式利福平和n氧化利福平混合产生)、27-去甲基利福平、16-羟甲基利福平、醌式利福平、25-去乙酰基利福平、25-去乙酰基-21乙酰利福平、利福霉素sv、25-去乙酰基-23乙酰利福平、n-氧化利福平、利福霉素s、3-甲酰利福霉素sv、利福霉素噁嗪、21-半缩醛利福平(特定杂质1)、特定杂质2；所述利福平及其相关杂质结构式如下：
[0009]
[0010]
[0011][0012]
利福平；
[0013]
所述流动相a为缓冲盐溶液、乙腈和甲醇；所述流动相b为酸性有机溶液；
[0014]
进一步，所述流动相a中缓冲盐溶液、乙腈和甲醇的体积比为42-50:25-34:21-29；
[0015]
具体的，所述流动相a中缓冲盐溶液、乙腈和甲醇的体积比为46:29:25；
[0016]
进一步，所述流动相a中缓冲盐溶液为一水柠檬酸和磷酸二氢钾或磷酸二氢钠的混合物，摩尔浓度比为2-2.5:1；
[0017]
具体的，所述缓冲盐溶液为磷酸二氢钾8.67g和一水柠檬酸30g，加水溶解并稀释至1000ml而得；
[0018]
进一步，所述流动相b中酸为体积百分比浓度0.05％-1.0％的冰醋酸、甲酸、磷酸、柠檬酸和三氟乙酸中的一种或多种；
[0019]
具体的，所述流动相b中酸为体积百分比浓度0.5％的冰醋酸；
[0020]
进一步，所述流动相b中有机相为甲醇或乙腈中的一种或多种；
[0021]
具体的，所述流动相b中有机相为乙腈；
[0022]
进一步，所述梯度洗脱程序为：
[0023][0024][0025]
所述流动相的流速为1.0-1.5ml/min；优选为1.4ml/min；
[0026]
进一步，所述辛烷基硅烷键合硅胶柱为agilent zorbax eclipse xdb-c8 4.6mm
×
250mm，5μm；
[0027]
进一步，所述方法柱温为30
±
3℃；
[0028]
具体的，所述方法柱温为30℃。
[0029]
本发明目的之二是提供一种hplc法检测注射用利福平中利福平及其相关杂质的
方法，该方法可以有效监测注射用利福平中是否存在利福平的相关杂质。
[0030]
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
[0031]
hplc法检测注射用利福平中利福平及其相关杂质的方法，利用目的一中所述方法将所述利福平及其相关杂质进行分离，通入紫外检测器进行检测，将供试品色谱图与已知对照品色谱图进行对比，判定注射用利福平中是否含有所述利福平的相关杂质；所述紫外检测器波长设定为255
±
5nm；
[0032]
进一步，所述紫外检测器波长设定为254nm；
[0033]
进一步，所述紫外检测器为dad检测器和vwd检测器。
[0034]
本发明目的之三是提供一种hplc法测定注射用利福平中利福平及其相关杂质的方法，该方法可以准确测定注射用利福平中利福平及其14种相关杂质的含量。
[0035]
为了实现上述目的，本发明的技术方案为：
[0036]
hplc法测定注射用利福平中利福平及其相关杂质的方法，其特征在于，所述方法具体包含以下步骤：
[0037]
配制供试品溶液、对照品溶液；
[0038]
取供试样品溶于稀释剂中，得供试品溶液；取杂质a～m对照品，用稀释剂溶解稀释制成对照品溶液；
[0039]
分离；
[0040]
利用目的一中所述的方法，将注射用利福平中利福平及其相关杂质进行分离；
[0041]
检测；
[0042]
利用目的二中所述的方法，检测注射用利福平中是否存在利福平的相关杂质；
[0043]
测定；
[0044]
根据检测得到的色谱图，按外标法以峰面积计算供试品溶液中利福平及其相关杂质的含量；
[0045]
进一步，所述步骤1)中稀释剂为乙腈和水。
[0046]
本发明的有益效果在于：
[0047]
1.本发明的一种高效液相色谱法分离测定注射用利福平中利福平和有关物质的方法，该方法对上述的有关物质和利福平均能适用，可以同时对其中的一种或多种有关物质进行分离检测，与现有技术相比，提高了分离检测的效率；
[0048]
2.利用本发明的方法检测注射用利福平高温降解杂质，能更准确、更有效地将特定杂质1、2和其他降解杂质有效分离开；
[0049]
3.利用本发明的方法检测注射用利福平碱降解杂质，能更准确、更有效地将杂质e和杂质h与其他杂质和主成分有效分离开；
[0050]
4.本发明的方法与现有技术相比，检测结果更准确，从而能更精准的确保注射用利福平的质量可控，并最终确定产品的安全有效。
附图说明
[0051]
图1为空白溶剂的hplc色谱图；
[0052]
图2为系统适用性溶液1的hplc色谱图；
[0053]
图3为系统适用性溶液2的hplc色谱图；
[0054]
图4为灵敏度溶液的hplc色谱图；
[0055]
图5为对照品溶液的hplc色谱图；
[0056]
图6为测定注射用利福平样品的hplc色谱图；
[0057]
图7为测定注射用利福平样品稳定性的hplc色谱图；
[0058]
图8为测定注射用利福平中高温降解的hplc色谱图；
[0059]
图9为测定注射用利福平中碱降解样品的hplc色谱图；
[0060]
图10为ep方法测定碱降解样品的hplc色谱图；
[0061]
图11为ep方法测定杂质混合溶液的hplc色谱图；
[0062]
图12为ep方法测定高温降解样品的hplc色谱图；
[0063]
图13为usp方法测定碱降解样品的hplc色谱图；
[0064]
图14为usp方法测定杂质混合的hplc色谱图；
[0065]
图15为中国药典方法测定杂质混合的hplc色谱图。
具体实施方式
[0066]
所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
[0067]
实施例1
[0068]
色谱条件：
[0069]
用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂(agilent zorbax eclipse xdb-c8 4.6mm
×
250mm，5μm)，以缓冲盐溶液(取磷酸二氢钾8.67g和一水柠檬酸30g，加水溶解并稀释至1000ml)-甲醇-乙腈(46:29:25)为流动相a，以冰醋酸甲醇溶液(取冰醋酸5ml，加甲醇1000ml，摇匀)为流动相b，按下表进行线性梯度洗脱。检测波长为254nm，流速为每分钟1.4ml，柱温为30℃。
[0070]
梯度洗脱程序：
[0071][0072]
实施例2
[0073]
试剂配制：
[0074]
空白溶液：乙腈-水(1:1)
[0075]
系统适用性溶液1：取杂质d、杂质i和利福平对照品适量，加少量乙腈溶解后，再用乙腈-水(1:1)定量稀释制成每1ml中各约含40μg的混合溶液，作为系统适用性溶液1。
[0076]
系统适用性溶液2：取杂质b、杂质c、杂质d、杂质e、杂质f、杂质g、杂质h、杂质i、杂质j、杂质k、杂质l和利福平适量，加少量乙腈溶解后，再用乙腈-水(1:1)定量稀释制成含利福平1mg/ml的混合溶液，作为系统适用性溶液2。
[0077]
灵敏度溶液：精密称取利福平对照品适量，加少量乙腈(约10mg加1ml乙腈)溶解后，用乙腈-水(1:1)定量稀释制成每1ml中约含0.5μg的溶液，作为灵敏度溶液。
[0078]
供试品溶液：取待测样品1瓶，用90％的乙腈溶解后，再用乙腈-水(1:1)稀释制成每1ml含利福平1mg的溶液，作为供试品溶液。
[0079]
对照品溶液：精密称取利福平对照品适量，加少量乙腈(约10mg加1ml乙腈)溶解后，再用乙腈-水(1:1)定量稀释制成每1ml中约含10μg的溶液，作为对照品溶液。
[0080]
实施例3
[0081]
检测：
[0082]
取空白溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图(见附图1)。
[0083]
取系统适用性溶液1和2各10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，杂质d与杂质a(杂质d与杂质i在此溶液中产生该杂质)的分离度符合要求(见附图2、3)。
[0084]
取灵敏度溶液10μl注入液相色谱仪，记录色谱图，主成分色谱峰峰髙的信噪比应大于10(见附图4)。
[0085]
精密量取供试品溶液和对照品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液色谱图中如有杂质峰，除溶剂峰与梯度洗脱峰外，按带校正因子的对照品外标法计算供试品中各已知杂质的含量，按对照品外标法计算供试品中其他单个杂质的含量，总杂质为各已知杂质与其他单个杂质之和(见附图5、6)。
[0086]
精密量取供试品溶液测定注射用利福平样品加速稳定性考察3月(见附图7)。
[0087]
实施例4
[0088]
高温和碱强制降解杂质进行分离测定：
[0089]
本发明方法还可以对注射用利福平高温和碱强制降解杂质进行分离测定，高温降解待测样品制备：
[0090]
取本品，置60℃考察箱中放置20天后取出，取1瓶，用90％的乙腈溶解后，再用乙腈-水(1:1)稀释制成每1ml含利福平1mg的溶液，作为供试品溶液。取10μl注入高效液相色谱仪，按照上述的色谱条件完成注射用利福平高温降解杂质的测定(见附图8)。
[0091]
碱降解待测样品制备：
[0092]
取本品1瓶，取内容物共0.6261g，用乙腈-水(9:1)完全溶解至50ml量瓶中，作为贮备液。精密移贮备液取2ml，置25ml量瓶中，加入1mol/l氢氧化钠溶液1.0ml，室温放置5min，加入1mol/l盐酸溶液1.0ml中和后，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为碱降解样品溶液。取10μl注入高效液相色谱仪，按照上述的色谱条件完成注射用利福平碱降解杂质的测定(见附图9)。
[0093]
ep方法：用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂，乙腈-缓冲液(0.1％的磷酸溶液，1.9g/l的高氯酸钠，5.9g/l的柠檬酸一水合物，20.9g/l的磷酸二氢钾)＝(35:65)为流动相；检测波长为254nm，流速为每分钟1.5ml。使用ep方法测定利福平碱降解样品、利福平杂质混合溶
液样品、利福平高温降解样品(见附图10、11、12)。
[0094]
usp方法：用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂，水-乙腈-磷酸盐缓冲液(磷酸二氢钾136.1g，加水500ml溶解，加磷酸6.3ml，加水稀释至1000ml，混匀)-1m柠檬酸-0.5m高氯酸钠＝(510:350:100:20:20)为流动相；检测波长为254nm，流速为每分钟1.5ml。使用usp方法测定碱降解样品以及杂质混合样品(见附图13、14)。
[0095]
中国药典方法：用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇-乙腈-0.075mol/l磷酸二氢钾溶液-1.0mol/l枸橼酸溶液(30:30:36:4)为流动相；检测波长为254nm。使用中国药典方法测定杂质混合样品(见附图15)。
[0096]
结果，ep方法和usp方法测定杂质e和杂质a重合，主峰利福平与杂质h重合，特定杂质2峰型差，分离度差；中国药典方法中，杂质a和杂质e重合。
[0097]
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。