柳穿鱼叶苷在制备抗骨肉瘤药物中的应用及抗骨肉瘤药物制剂的制作方法

1.本发明涉及医药技术领域，特别是涉及柳穿鱼叶苷在制备抗骨肉瘤药物中的应用及抗骨肉瘤药物制剂。


背景技术：

2.骨肉瘤是一种最为常见的原发性骨肿瘤，多发生于青少年，每年发病率为2-5/100万人。骨肉瘤主要表现为局部侵袭和早期肺部转移，复发率高，预后极差，故极易引起患者死亡或者残疾。目前对于骨肉瘤主要采用手术治疗、辅助化疗、放疗、靶向和免疫治疗等方式。然而骨肉瘤的高度异质性导致其对目前的常规化疗药物易产生耐药性，加之常规化疗药物如甲氨蝶呤、阿霉素、顺铂、异环磷酰胺等带来的极大副作用影响患者生活质量，长期生存率低，故寻找新型、有效、安全的抗癌药物对于提高骨肉瘤的治疗效果有着极为重要的意义。中药毒副作用小，在抗肿瘤治疗方面具有无可比拟的优点，因此，寻找毒副作用小、新的抗癌中药具有重要意义。
3.大蓟为菊科植物大蓟的干燥地上部分，味甘、苦，性凉，具有凉血止血、散瘀解毒消痈的功效，用于治疗衄血、吐血、尿血、便血、崩漏、外伤出血、痈肿疮毒等病症，现代药理学表明大蓟具有凝血止血、降血压、抗肿瘤、抗骨质疏松、抗糖尿病、抑菌等药理性。大蓟化学成分复杂，主要有黄酮及黄酮苷类、长链烯炔醇类、木脂素类、甾醇类和挥发油类等，文献研究表明蒙花苷和柳穿鱼叶苷等黃酮类成分是大蓟发挥凝血止血作用的主要活性物质。已有部分文献报道证实柳穿鱼叶苷可以诱导类风湿关节炎滑膜细胞凋亡，但目前尚未有大蓟中活性成分柳穿鱼叶苷在治疗骨肉瘤方面的研究报道。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供柳穿鱼叶苷在制备抗骨肉瘤药物中的应用及抗骨肉瘤药物制剂，以解决上述现有技术存在的问题，从而解决现有的骨肉瘤治疗用的西药毒副作用大，有严重的不良反应的问题。
5.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
6.本发明的技术方案之一是提供一种柳穿鱼叶苷在制备抗骨肉瘤药物中的应用。
7.进一步地，所述抗骨肉瘤药物为骨肉瘤细胞抑制剂。
8.进一步地，所述骨肉瘤细胞抑制剂包括抑制骨肉瘤细胞增殖的制剂。
9.进一步地，所述骨肉瘤细胞抑制剂包括骨肉瘤细胞消杀制剂。
10.进一步地，所述骨肉瘤细胞抑制剂包括抑制骨肉瘤侵袭和迁移的制剂。
11.本发明的技术方案之二是提供一种抗骨肉瘤药物制剂，包括治疗有效量的柳穿鱼叶苷。
12.本发明经细胞活力及增殖实验检测，结果表明，经柳穿鱼叶苷作用24h、48h、72h后细胞活力检测结果显示，柳穿鱼叶苷干预143b细胞24h、48h和72h的ic 50值分别为209.38、
55.89、37.23μm，干预mg-63细胞24h、48h和72h的ic 50值分别为143.24、99.04、58.52μm，干预hos细胞24h、48h和72h的ic 50值分别为181.69、138.22、73.05μm，干预sao-2细胞24h、48h和72h的ic 50值分别为196.91、120.01、62.35μm，干预u2os细胞24h、48h和72h的ic 50值分别为98.66、58.75、38.24μm，经柳穿鱼叶苷在处理时间为48h,浓度为≥50μm干预下可明显抑制以上五种人骨肉瘤细胞的活力，并且其抑制效应呈现剂量依赖性。
13.本发明经细胞克隆形成实验考察人骨肉瘤细胞在柳穿鱼叶苷干预下的增殖能力。细胞克隆形成实验结果表明，柳穿鱼叶苷干预浓度为50、100、150μm实验组中克隆形成的细胞集落数量明显降低，且呈现剂量依赖性，提示柳穿鱼叶苷可以有效的抑制人骨肉瘤细胞增殖。
14.本发明的细胞凋亡率实验表明，随着柳穿鱼叶苷干预浓度的增加，经annexin v-fitc/pi双染后，用流式细胞仪检测结果显示：143b、hos细胞凋亡率(早期凋亡和晚期凋亡)均逐渐增大，且与正常对照组相比具有统计学差异(p＜0.01)。提示柳穿鱼叶苷对143b、hos细胞有诱导凋亡的作用，且呈剂量依赖性。
15.本发明的细胞周期实验表明，柳穿鱼叶苷干预143b、hos细胞后经流式细胞仪检测发现细胞周期各时相数量出现显著性差异，主要表现为g0/g1期细胞比例随药物浓度上升而增多，g2/m期细胞比例依次减少，组间差异有统计学意义。结果提示柳穿鱼叶苷能将143b、hos细胞阻滞于细胞周期的g0/g1期，从而抑制细胞的增殖。
16.本发明的划痕试验表明，柳穿鱼叶苷干预143b、hos细胞后，随着药物浓度的增加，细胞迁移能力明显下降，组间呈显著性差异(p《0.05)。tranwell穿膜实验结果显示，随着柳穿鱼叶苷浓度的增加，侵袭的细胞数量减少，且与正常对照组间存在显著性差异(p《0.05)。提示柳穿鱼叶苷可有效抑制人骨肉瘤细胞的细胞迁移能力和侵袭能力。
17.本发明公开了以下技术效果：
18.本发明发现柳穿鱼叶苷具有抑制人骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭并诱导凋亡的作用，从体外及体内实验两方面进行了验证，结果显示柳穿鱼叶苷有望用于制备抗骨肉瘤药物，从而提高人骨肉瘤患者的治疗效果，延长患者的生命。
19.柳穿鱼叶苷是大蓟的活性成分之一，取材方便，纯天然，可解决现有骨肉瘤治疗所用西药毒副作用大，有严重不良反应的问题。
20.本发明通过药效学试验，首次证实了柳穿鱼叶苷在≥50μm浓度下可抑制五种人骨肉瘤细胞的增殖活力，可将细胞周期阻滞在g0/g1期，并且药效呈现剂量依赖性。
附图说明
21.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
22.图1为不同浓度柳穿鱼叶苷干预对细胞存活率的影响(n＝6)；图a-e分别为对143b，mg-63,hos,sao-2，u2os细胞存活率的影响；
23.图2为不同浓度柳穿鱼叶苷对骨肉瘤细胞增殖能力影响的克隆形成实验结果以及统计柱状图；其中，图a为克隆形成实验检测细胞增殖结果，图b为实验检测细胞增殖结果统
计柱状图；
24.图3为不同浓度柳穿鱼叶苷对骨肉瘤细胞凋亡的流式结果以及统计柱状图；其中，图a为不同浓度柳穿鱼叶苷对骨肉瘤细胞凋亡的流式结果，图b为不同浓度柳穿鱼叶苷对骨肉瘤细胞凋亡的统计柱状图；
25.图4为不同浓度柳穿鱼叶苷对143b，hos细胞周期的阻滞作用图；其中，图a为不同浓度柳穿鱼叶苷对骨肉瘤细胞周期阻滞的流式结果，图b为不同浓度柳穿鱼叶苷对骨肉瘤143b细胞周期阻滞的统计柱状图；图c为不同浓度柳穿鱼叶苷对骨肉瘤hos细胞周期阻滞的统计柱状图；
26.图5为不同浓度柳穿鱼叶苷对143b、hos细胞迁移能力影响图；其中，图a为不同浓度柳穿鱼叶苷对143b、hos细胞迁移能力影响的伤痕愈合照片,图b为不同浓度柳穿鱼叶苷对143b细胞迁移能力影响的柱状图；图c为不同浓度柳穿鱼叶苷对hos细胞迁移能力影响的柱状图；
27.图6为不同浓度柳穿鱼叶苷对143b、hos细胞侵袭能力影响的倒置显微镜照片和统计柱状图；其中，图a为不同浓度柳穿鱼叶苷对143b、hos细胞侵袭能力影响的显微镜照片，图b为不同浓度柳穿鱼叶苷对143b、hos细胞侵袭能力影响的统计柱状图；
28.图7为柳穿鱼叶苷对骨肉瘤细胞体内成瘤能力的影响图；其中，图a为柳穿鱼叶苷处理后收集的骨肉瘤瘤体组织图，图b为柳穿鱼叶苷处理后收集的肿瘤体积统计图。
具体实施方式
29.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
30.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
31.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
32.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
33.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
34.下面结合实施例对本发明做进一步详细的阐述。
35.本发明实施例所用细胞株、试剂和仪器如下：
36.人骨肉瘤细胞143b、mg-63、u2os、sao-2和hos细胞，均购自atcc(美国菌种保藏中
心)。
37.柳穿鱼叶苷的结构式为：
[0038][0039]
柳穿鱼叶苷购自成都普瑞法生物科技有限公司：白色絮状结晶，纯度为98％，用dmso溶解配制成50μmol
·
ml-1
储备液，细胞实验时用mem或mccoy's 5a培养基稀释；mem培养基，giobco公司；mccoy's 5a培养基，sigma公司；胎牛血清(hyclone)，ge公司；二甲基亚砜(dmso)，giobco公司；四甲基偶氮唑蓝(mtt)，biosharp公司；多聚甲醛，biosharp公司；瑞氏-姬姆萨复合染色液，phygene公司；annexin v fitc/pi细胞凋亡检测试剂盒、细胞周期检测试剂盒、细胞凋亡线粒体膜电位检测试剂盒(jc-1)、核蛋白胞浆蛋白分离提取试剂盒，凯基公司；bca蛋白浓度检测试剂盒。
[0040]
二氧化碳培养箱，thermo，美国；全波长酶标仪，thermo，美国；流式细胞仪，bd，美国；水平冷冻离心机，eppendorf，德国；倒置荧光显微镜，nikon，日本；垂直电泳仪，君意东方，中国；全自动化学发光成像系统，bioshine，中国。
[0041]
实施例1柳穿鱼叶苷对细胞增殖的影响
[0042]
(1)采用mtt法分别检测柳穿鱼叶苷对143b、mg-63、u2os、sao-2和hos细胞增殖的影响。
[0043]
将细胞于37℃、5％co2培养箱中，以含10％胎牛血清的mem培养基在10mm培养皿中进行单层传代培养，取对数生长期的细胞进行实验。细胞消化计数，每孔8000个细胞接种于96孔板中，贴壁生长24h。柳穿鱼叶苷用dmso溶解配制成50μmol
·
ml-1
储备液，用mem稀释至10、20、40、80、160μm、320μm。各组加入不同浓度柳穿鱼叶苷(10、20、40、80、160、320μm)，每个浓度平行6孔，空白对照组中加入等体积含10％胎牛血清的mem培养基，溶剂对照组中加入相应浓度dmso溶液(采用含10％胎牛血清的mem培养基进行稀释)，作用24h。每孔加入15μlmtt溶液(5mg
·
ml-1
)，培养箱中孵育4h，弃上清，每孔加入150μldmso,轻轻震荡溶解结晶，在酶标仪中492nm处检测吸光度值，计算细胞存活率，采用细胞存活率对药物浓度的对数log(c)作图，经曲线拟合，求出半数抑制浓度(ic50)。
[0044]
图1a-e分别为不同浓度柳穿鱼叶苷干预对143b，mg-63,hos,sao-2，u2os细胞存活率的影响(n＝6)。
[0045]
从图1可见，柳穿鱼叶苷≥50μm时，作用48h后，对人骨肉瘤各细胞系的增殖有显著抑制作用，并且呈现药物剂量依赖性。各细胞系不同干预时间半数抑制浓度(ic50)见表1。
[0046]
表1各细胞系不同干预时间下半数抑制浓度(ic50)
[0047][0048]
实施例2柳穿鱼叶苷抑制人骨肉瘤细胞143b，hos的克隆形成能力
[0049]
将对数生长期的143b、hos细胞消化计数，每孔约1000个细胞接种于12孔板中，贴壁生长24h。加入终浓度为50、100、150μm的柳穿鱼叶苷对细胞进行干预，并设置无柳穿鱼叶苷的空白对照组。作用14天后，对12孔板中的细胞用结晶紫溶液染色，并拍摄各组细胞集落形成情况。
[0050]
图2为不同浓度柳穿鱼叶苷对骨肉瘤细胞增殖能力影响的克隆形成实验检测细胞增殖结果以及统计柱状图；其中，图a为克隆形成实验检测细胞增殖结果，图b为实验检测细胞增殖结果统计柱状图。
[0051]
由图2可以看出，不同浓度柳穿鱼叶苷作用于人骨肉瘤143b、hos细胞，当干预浓度为50、100μm时，细胞集落数显著下降，而柳穿鱼叶苷干预浓度为150μm时，细胞克隆形成过程接近终止。
[0052]
实施例3annexin v-fitc/pi双染检测柳穿鱼叶苷对细胞凋亡率的影响
[0053]
采用annexin v-fitc/pi细胞凋亡检测试剂盒(中国凯基)检测不同剂量的柳穿鱼叶苷干预48小时对143b、hos细胞凋亡率的影响。该试剂盒包括binding buffer、annexinv-fitc和propidiμm iodide染色液。
[0054]
对数生长期的143b、hos细胞消化计数，每孔106个细胞接种于6孔板中，贴壁生长24h。分别加入终浓度为50、100、150μm的柳穿鱼叶苷作用48h，同时设立无柳穿鱼叶苷的空白对照组(control)。收集上清液和细胞，1000rpm离心5min，去除培养基，用pbs洗涤2次，将细胞重悬于500μl binding buffer中，使细胞浓度为2
×
106个/ml。加入5μlannexinv-fitc和5μl propidiμm iodide染液于细胞悬液中，轻轻混匀，避光孵育15min，将制备好的细胞悬液转入1.5ml离心管中，流式细胞仪检测细胞凋亡率。
[0055]
图3为不同浓度柳穿鱼叶苷对骨肉瘤细胞凋亡的流式结果以及统计柱状图；其中，图a为流式结果，图b为统计柱状图。
[0056]
从图3可见，柳穿鱼叶苷作用于143b、hos细胞后，随着柳穿鱼叶苷浓度的增加，细胞凋亡率增大，组间差异有统计学意义(p＜0.01)。提示柳穿鱼叶苷对143b、hos细胞均有显著诱导凋亡的作用，且呈剂量依赖性。
[0057]
表2不同柳穿鱼叶苷干预浓度对143b、hos细胞凋亡率影响
[0058][0059]
实施例4流式细胞术(fcm)检测柳穿鱼叶苷对143b、hos细胞周期的影响
[0060]
对数生长期的143b、hos细胞消化计数，每孔106个细胞接种于6孔板中，贴壁生长24h。分别加入终浓度为50、100、150μm的柳穿鱼叶苷作用12h，考察不同浓度柳穿鱼叶苷对143b、hos细胞周期的影响，同时设立无柳穿鱼叶苷的空白对照(control)。收集细胞，1000rpm离心5min，弃上清，加入1ml pbs重悬洗涤细胞，1000rpm离心5min，弃上清，重复洗涤1次，弃上清。缓慢加入预冷的75％乙醇溶液，4℃固定过夜。300g离心5min弃去固定液，加入1mlpbs洗涤1次，300g离心5min，弃上清，加入100μl rnasea酶(10mg
·
ml-1
)，37℃水浴30min，加入300μl pi染色，4℃染核30min，流式细胞仪检测细胞周期。
[0061]
图4显示了柳穿鱼叶苷阻滞143b,hos细胞周期的作用，其中50、100、150μm表示柳穿鱼叶苷干预的浓度。其中，图a为骨肉瘤细胞周期组织流式图；b为143b细胞周期阻滞统计柱状图；c为hos细胞周期阻滞统计柱状图。
[0062]
可以看出，柳穿鱼叶苷作用于143b、hos细胞后，流式细胞仪检测发现细胞周期各时相的差异主要表现为：g0/g1期细胞比例随药物浓度上升而增多，g2/m期细胞比例依次减少，组间差异有统计学意义。提示柳穿鱼叶苷能将143b、hos细胞阻滞于细胞周期的g0/g1期，从而抑制细胞的增殖。
[0063]
实施例5细胞划痕愈合实验考察柳穿鱼叶苷对143b、hob细胞迁移能力的影响
[0064]
取处于对数生长期143b、hob细胞接种于24孔板中，贴壁生长24h。用pbs溶液冲洗2次后，给予不同浓度的柳穿鱼叶苷(50、100、150μm)干预48h，同时设立无柳穿鱼叶苷的空白对照(control)。
[0065]
用10ul枪头作为划痕工具，消毒后的钢尺为依靠模板在每孔的正中间行快速，稳定，用力均匀的划痕。分别用倒置相差显微镜观察，于划痕区域随机选择三个视野，用imagej软件评估各组细胞迁移情况。与对照组相比，计算143b、hos细胞的愈合率＝(给药前划痕面积-实验组24h划痕面积)/(给药前划痕面积)
×
100％。
[0066]
划痕实验结果如图5所示，图a、b、c分别显示了不同浓度柳穿鱼叶苷对143b、hos细胞迁移能力影响的伤痕愈合照片及柱状图(与空白对照组对比，p《0.05)。
[0067]
结果显示：柳穿鱼叶苷干预143b、hos细胞后，与空白对照组相比，给药组的细胞迁移距离减小；当柳穿鱼叶苷干预浓度达50μm时划痕愈合率明显降低，划痕愈合率呈现浓度依赖性。
[0068]
实施例6transwell小室细胞穿膜实验检测柳穿鱼叶苷对143b、hos细胞迁移能力的影响
[0069]
取无血清饥饿培养的143b、hos细胞，胰蛋白酶消化后细胞计数；将transwell小室置于24孔板中，小室上层加入200μl含有不同剂量柳穿鱼叶苷(50、100、150μm)的细胞悬液，溶剂为含有0.1％dmso的无血清培养液，每孔接种106个细胞；阴性对照组中加入200μl细胞悬液(溶剂为含有0.1％dmso的无血清培养液)；transwell小室下层加入600μl含20％胎牛
血清、0.1％dmso的培养液。将24孔板置37℃、co2培养箱中培养24h。除去上下层培养液，pbs溶液清洗2次；滴加瑞氏-姬姆萨复合染色液染色10min，pbs溶液清洗3次；用棉签将transwell小室上层细胞拭去，于倒置显微镜下观察计数穿过聚碳酸酯膜的细胞数目。
[0070]
图6中a显示不同浓度柳穿鱼叶苷对143b、hos细胞侵袭能力影响的倒置显微镜照片；图b为143b和hos细胞侵袭能力统计柱状图(注：与空白对照组对比，p《0.05)。
[0071]
transwell实验结果显示，与空白对照组相比，柳穿鱼叶苷给药组侵袭细胞数量显著的减少，过程呈浓度依赖性。该结果提示，柳穿鱼叶苷可显著抑制人骨肉瘤细胞143b、hos的穿膜能力，且50μm和100μm的柳穿鱼叶苷给药组与阴性对照组相比穿膜细胞数量具有显著性差异。
[0072]
实施例7柳穿鱼叶苷对骨肉瘤细胞体内成瘤能力的影响
[0073]
将含143b细胞的悬液(1*107个/0.lml)接种植至裸鼠皮下，建立荷瘤裸鼠模型；将上述荷瘤裸鼠模型随机分为两组：对照组、柳穿鱼叶苷组(85mg/kg/d)，根据试验方案进行尾静脉给药，每组裸鼠给予正常的进食和饮水；每两天用游标卡尺测量肿瘤的大小，22d采用颈部脱臼法处死荷瘤裸鼠，无菌条件下取出肿瘤，测量肿瘤的体积。
[0074]
图7为柳穿鱼叶苷对骨肉瘤细胞体内成瘤能力的影响；图a、b分别为构建裸鼠皮下荷瘤模型后，柳穿鱼叶苷处理后收集的骨肉瘤组织图和肿瘤体积统计图。
[0075]
裸鼠荷瘤模型结果如图a(pectolinarin表示实验组，control表示对照组)所示，结果显示，柳穿鱼叶苷组肿瘤明显小于对照组。裸鼠体重在整个成瘤过程中稳定增长且组间无明显差异，说明药物无明显的蓄积毒性，对裸鼠的生长无明显影响，如图b(pectolinarin表示实验组，control表示对照组，纵坐标表示裸鼠体重)。随着生存时间增加，对照组肿瘤体积逐渐增大，但柳穿鱼叶苷组肿瘤体积增长速度较缓，且明显小于对照组(*p《0.05)。
[0076]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。