同种异体CAR-T细胞疗法的制作方法

同种异体car-t细胞疗法
技术领域
1.本发明一般涉及同种异体car-t细胞疗法，并且特别地涉及与同种异体car-t细胞疗法相关的白细胞活化的调节。


背景技术：

2.嵌合抗原受体(car)t细胞是已被基因工程化以产生人工t细胞受体的t细胞。car(也称为嵌合免疫受体、嵌合t细胞受体或人工t细胞受体)是已被工程化以赋予t细胞靶向特定抗原的能力的受体蛋白。所述受体是嵌合的，因为它们将抗原结合和t细胞活化功能结合到单个受体中。更详细地说，car通常由三个区域或结构域组成：胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域。
3.胞外结构域是暴露于t细胞外部并与潜在靶分子(即抗原)相互作用的受体区域。它通常由三个主要组分组成：结合抗原的抗原识别区、引导受体蛋白进入内质网的信号肽和使受体更易于结合的间隔区。抗原识别区负责将car-t细胞靶向表达特定抗原的癌症或肿瘤细胞，并且通常由单链可变片段(scfv)组成。scfv是由免疫球蛋白的轻(vl)链和重(vh)链组成的嵌合蛋白，所述轻(vl)链和重(vh)链与短接头肽连接。这些vl和vh区是根据它们与靶抗原的结合能力预先选择的。两条链之间的接头由亲水性残基组成，其中含有甘氨酸和丝氨酸段以提高灵活性，以及谷氨酸和赖氨酸段以增加溶解度。间隔区是位于抗原识别区与t细胞外膜之间的小的结构域。理想的间隔区增强了scfv受体头部的灵活性，从而减少了car与其靶抗原之间的空间限制。这促进了car-t细胞与癌细胞之间的抗原结合和突触形成。间隔区通常基于来自免疫球蛋白g(igg)或分化簇8(cd8)的铰链结构域。
4.跨膜结构域是由跨越细胞膜的疏水性α螺旋组成的结构组分。此结构域对于受体整体的稳定性很重要。通常，使用来自胞内结构域的最接近膜的组分的跨膜结构域。已知cd28跨膜结构域会产生高度表达的稳定受体。
5.抗原与外部抗原识别区结合后，car受体聚簇在一起并传输活化信号。胞内结构域是使t细胞内部的信号传导持续存在的受体内部细胞质末端。正常的t细胞活化依赖于存在于cd3ζ细胞质结构域中的基于免疫受体酪氨酸的活化基序(itam)的磷酸化。为了模拟此过程，cd3ζ的细胞质结构域通常用作主要的car胞内结构域组分。
6.除了cd3信号传导之外，t细胞还需要共刺激分子来活化。出于此原因，car受体的胞内结构域通常还包括来自共刺激蛋白的一个或多个嵌合结构域，诸如cd28、4-1bb(也称为cd137)或ox40。
7.car-t细胞疗法使用了各种抗原，具体取决于待治疗的特定癌症类型。此类抗原的实例包括用于b细胞源性癌症的cd19，诸如急性淋巴母细胞性白血病(all)和弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)；用于难治性霍奇金淋巴瘤的cd30；用于急性髓系白血病(aml)的cd33、cd123和fms样酪氨酸激酶3(flt3)(也称为cd135)；和用于多发性骨髓瘤的b细胞成熟抗原(bcma)。
8.car-t细胞可来源于从患者自身血液中获得的t细胞，即所谓的自体car-t细胞，或
来源于供体的t细胞，即所谓的同种异体car-t细胞。自体t细胞一直是car-t细胞疗法早期发展的主要焦点。然而，自体car-t细胞疗法有几个缺点。首先，为个体患者制备的产品的制造成本非常高。例如，第一个fda批准的患者来源的，即自体car-t细胞产品的价格为每位患者475,000美元。其次，并非总是能够从患者身上收获足够数量的t细胞，特别是对于可能因疾病或先前的化疗而出现淋巴细胞减少的癌症患者。其他潜在问题包括产品可变性和质量控制、自体car-t细胞制造期间的疾病进展、肿瘤细胞污染的风险和t细胞功能障碍。
9.由于自体car-t细胞疗法的这些缺点，同种异体car-t细胞疗法最近获得了更多关注。对于同种异体car-t细胞疗法的担忧是由于供体与患者之间的人白细胞抗原(hla)错配以及非特异性白细胞活化导致的移植物抗宿主病(gvhd)和car-t细胞排斥。与自体car-t细胞相比，同种异体car-t细胞疗法有可能用于更多的癌症患者。然而，需要改进同种异体car-t细胞疗法，特别是在抑制非特异性白细胞活化方面，以使同种异体car-t细胞疗法更安全且更容易获得。


技术实现要素：

10.总体目标是提供一种改进的同种异体car-t细胞疗法。
11.此目标和其他目标通过如本文公开的实施方案来满足。
12.本发明在独立权利要求中定义。本发明的进一步实施方案在从属权利要求中定义。
13.实施方案的一个方面涉及在同种异体car-t细胞疗法中调节白细胞活化的体外方法。所述方法包括使同种异体car-t细胞与硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐体外接触，以在施用了car-t细胞的受试者中诱导白细胞活化的调节。
14.实施方案的另一方面涉及硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐，所述硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐用于抑制对用同种异体car-t细胞治疗的受试者造成损害的非特异性白细胞活化。
15.实施方案的其他方面涉及硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐，所述硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐与同种异体car-t细胞组合用于癌症治疗、car-t细胞疗法、移植排斥治疗、病毒或细菌感染治疗、自身免疫性疾病治疗或系统性红斑狼疮(sle)治疗。
16.实施方案的其他方面涉及一种包含硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐和同种异体car-t细胞的组合物，此种组合物用作药物、用于同种异体car-t细胞疗法、癌症治疗、移植排斥治疗、病毒或细菌感染治疗、自身免疫性疾病治疗或sle治疗。
17.硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐能够调节同种异体car-t细胞疗法中的白细胞活化，以降低非特异性白细胞活化的水平，诸如单核细胞和粒细胞活化的水平所示，并在car-t细胞中实现活化模式，诸如活化标志物cd69和cd107a所示，所述活化模式类似于用自体car-t细胞获得的活化模式。就能够破坏靶细胞而言，硫酸葡聚糖实现了这种调节，而不会对car-t细胞或car-t细胞的功能产生任何负面影响。
附图说明
18.通过结合附图参考以下描述，可最好地理解实施方案及其进一步的目的和优点，其中：
19.图1a至图1c示出了对整个t细胞群(cd3 t细胞，图1a)、cd4 t细胞(图1b)和cd8 t细胞(图1c)中的car-t特异性标志物呈阳性的细胞的百分比。分离来自四个供体(d1-d4)的外周血单核细胞(pbmc)，用okt-3在细胞培养板上培养并用il-2刺激，之后用逆转录病毒(2g和mock作为对照)进行转导。扩增7至13天后，收获细胞并冷冻。在全血环测定中，使用来自d2的car-t细胞。供体d2被要求作为自体血液供体献血。招募了另外的供体作为同种异体血液供体进行血液采集。
20.图2a至图2g示出了血小板(plt)计数(图2a)、红细胞(rbc)计数(图2b)、白细胞(wbc)计数(图2c)、淋巴细胞(lymph#)计数(图2d)、中性粒细胞(neut#)计数(图2e)、单核细胞(mono#)计数(图2f)和嗜酸性粒细胞(eo#)计数(图2g)。在0、10min、30min和60min时间点从环中提取血液，并使用sysmex xn-l 350血液分析仪自动对血小板和红细胞进行计数。
21.图3a至图3i示出了在来自自体供体和同种异体供体的血液样品中，所有t细胞(cd3 )中cd69 (图3a)、cd107a (图3b)和活力染料阳性细胞(死细胞)(图3c)的百分比、cd8 t细胞群中cd69 (图3d)、cd107a (图3e)和活力染料阳性细胞(死细胞)(图3f)的百分比以及cd4 t细胞群中cd69 (图3g)、cd107a (图3h)和活力染料阳性细胞(死细胞)(图3i)的百分比。收集新鲜血液，并将其立即与乙二胺四乙酸(edta)混合(零时间点样品)或添加到环中，之后在60min时间点取样并与edta混合。
22.图4a至图4c示出了在来自自体供体和同种异体供体的血液样品中，对t细胞群中(cd3 )(图4a)、cd8 t细胞群(图4b)和cd4 t细胞群(图4c)中的car-t细胞特异性标志物呈阳性的细胞百分比。收集新鲜血液，并将其立即与edta混合(零时间点样品)或添加到环中，之后在60min时间点取样并与edta混合。
23.图5a至图5c示出了在来自自体供体和同种异体供体的血液样品中，car-t细胞群中cd69 (图5a)、cd107a (图5b)和活力染料阴性细胞(活细胞)(图5c)的百分比。收集新鲜血液，并将其立即与edta混合(零时间点样品)或添加到环中，之后在60min时间点取样并与edta混合。
24.图6示出了在来自与图5a中相同的自体供体和与图5a相比的另一个同种异体供体的血液样品中，car-t细胞群中cd69 的百分比。收集新鲜血液，并将其立即与edta混合(零时间点样品)或添加到环中，之后在60min时间点取样并与edta混合。
25.图7a和图7b示出了在来自自体供体和同种异体供体的血液样品中，b细胞群(cd19 )中cd69 (图7a)和cd107a (图7b)的百分比。收集新鲜血液，并将其立即与edta混合(零时间点样品)或添加到环中，之后在60min时间点取样并与edta混合。
26.图8a和图8b示出了对b细胞群(cd19)中的cd20标志物呈阳性的细胞的百分比(图8a)和所有淋巴细胞的b细胞频率(显示为相对于零样品的倍数变化)(图8b)。对来自自体供体和同种异体供体的血液样品进行分析。收集新鲜血液，并将其立即与edta混合(零时间点样品)或添加到环中，之后在60min时间点取样并与edta混合。
27.图9a和图9b示出了单核细胞群(图9a)和粒细胞群(图9b)中cd11b 细胞的百分比。对来自自体供体和同种异体供体的血液样品进行分析。收集新鲜血液，并将其立即与edta混合(零时间点样品)或添加到环中，之后在60min时间点取样并与edta混合。
具体实施方式
28.本发明一般涉及同种异体car-t细胞疗法，并且特别地涉及与同种异体car-t细胞疗法相关的白细胞活化的调节。
29.同种异体car-t细胞疗法正在成为自体car-t细胞疗法的替代方案，这主要是由于自体car-t细胞疗法的高成本以及淋巴细胞减少症患者中常见的收获和制造失败。
30.同种异体car-t细胞疗法的潜在问题是可对接受患者和施用于患者的同种异体car-t细胞造成损害的非特异性白细胞活化，有时称为不希望的白细胞活化。此种非特异性白细胞活化的水平通常被认为取决于供体与患者之间的hla匹配程度，其中在hla匹配较差的情况下，通常具有更多非特异性白细胞活化。非特异性白细胞活化可通过多种机制对患者造成损害，包括但不限于细胞因子释放综合征(crs)、神经系统毒性、靶向/脱靶(on target/off tumor)识别、移植物抗宿主病(gvhd)和过敏反应。
31.crs是导致炎症细胞因子升高的负性免疫活化。临床特征包括高热、不适、疲劳、肌痛、恶心、厌食、心动过速/低血压、毛细血管渗漏、心功能不全、肾功能损害、肝功能衰竭和弥散性血管内凝血。
32.据报道，在接受car-t细胞的患者中，非特异性白细胞活化引起的神经系统毒性的发展包括意识错乱、谵妄、表达性失语、迟钝、肌阵挛和癫痫发作。
33.理想的靶抗原仅限于肿瘤细胞，并为恶性克隆提供关键的生存信号。不幸的是，car t细胞的大多数靶标在正常组织上共享表达，并且通过靶抗原与非致病性组织的结合而发生一定程度的“靶向/脱靶”毒性。报告事件的严重程度的范围是从可控的谱系耗竭(b细胞发育不全)到严重毒性(死亡)。
34.因此，通常需要抑制或抑制同种异体car-t细胞疗法中的这种非特异性白细胞活化，并获得各种活化标志物(诸如cd69和cd107a)所示的活化模式，所述活化模式更类似于用自体car-t细胞疗法获得的活化模式。
35.如本文提供的实验数据表明，硫酸葡聚糖能够调节同种异体car-t细胞疗法中的白细胞活化，以降低非特异性白细胞活化的水平，诸如单核细胞和粒细胞活化的水平所示，并在car-t细胞中实现活化模式，诸如活化标志物cd69和cd107a所示，所述活化模式类似于用自体car-t细胞获得的活化模式。
36.就能够使用具有靶向b细胞抗原cd19的抗原识别区的car来减少b细胞计数而言，硫酸葡聚糖实现了这种调节，而不会对car-t细胞或car-t细胞的功能产生任何负面影响。
37.因此，实施方案的一个方面涉及在同种异体car-t细胞疗法中调节白细胞活化的体外方法。所述方法包括优选地使同种异体car-t细胞与硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐体外接触，以在施用了同种异体car-t细胞的受试者中诱导白细胞活化的调节。
38.因此，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐与同种异体car-t细胞接触，并且更优选地，同种异体car-t细胞与硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐体外接触。在一个实施方案中，可将硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐添加到包含同种异体car-t细胞的溶液或媒介物中。在此种情况下，同种异体car-t细胞在施用于经受了同种异体car-t细胞疗法的患者之前用硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐处理。
39.例如，可将硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐添加到包含输液溶液或媒介物中的同种异体car-t细胞的静脉内溶液袋或输液袋中。可将硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐
在将溶液或媒介物中的同种异体car-t细胞施用于受试者的同时或基本上在其之前添加到此种袋中。替代地，可用包含硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的溶液或媒介物预先制造静脉内溶液袋或输液袋，然后可将同种异体car-t细胞添加到袋中以及其中所含有的溶液和媒介物中。另一个替代方案是使制造的静脉内溶液袋或输液袋包含硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐和同种异体car-t细胞。
40.在通常不太优选的实施方案中，可将同种异体car-t细胞和硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐分别施用于患者，然后在患者体内(诸如在血液系统中)在体内使同种异体car-t细胞与硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐接触。在此种情况下，优选地将同种异体car-t细胞和硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐施用于患者体内相同或基本上相同的部位，或者在全身施用诸如静脉内注射的情况下，同种异体car-t细胞和硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐优选地均使用相同的全身途径施用，诸如均静脉内注射。
41.然后，此实施方案涉及一种在同种异体car-t细胞疗法中调节白细胞活化的方法。所述方法包括向受试者施用同种异体car-t细胞和硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐，以在施用同种异体car-t细胞后诱导受试者中白细胞活化的调节。
42.在一个实施方案中，同种异体car-t细胞优选地与硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐体外接触，以减少施用了同种异体car-t细胞的受试者中单核细胞和/或粒细胞的活化。因此，就能够减少或抑制经受了同种异体car-t细胞疗法的受试者中单核细胞和/或粒细胞的活化而言，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐能够减少或抑制非特异性白细胞活化。
43.在一个实施方案中，同种异体car-t细胞优选地与硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐体外接触，以诱导施用了同种异体car-t细胞的受试者中的白细胞活化，所述白细胞活化对应于施用自体car-t细胞后在受试者中获得的白细胞活化。因此，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐能够实现如使用在自体car-t细胞疗法中获得的各种活化标志物(优选cd69和/或cd107a)评估的活化模式，即使向受试者施用了同种异体car-t细胞。因此，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐可被视为使白细胞活化和活化模式“正常化”至通常在自体car-t细胞疗法中获得的水平。因此，在一个特定实施方案中，同种异体car-t细胞优选地与硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐体外接触，以诱导施用了同种异体car-t细胞的受试者中的car-t细胞活化，所述car-t细胞活化对应于施用自体car-t细胞后在受试者中获得的car-t细胞活化。在一个实施方案中，car-t细胞活化由选自由cd69和cd107a组成的组中的至少一种活化标志物的水平表示。
44.可使用各种已知的car-t细胞制造工艺获得同种异体car-t细胞。例如，同种异体car-t细胞可由同种异体造血干细胞移植(hsct)供体制造。hsct是具有hla匹配供体的高危b-all患者的标准护理。在此种情况下，car-t细胞可来源于此种hla匹配的供体。由于hla匹配，由此种供体产生的car-t细胞不太可能导致gvhd，并且由于它们与先前移植的造血干细胞相同，它们不应攻击移植物。同种异体car-t细胞的另一个来源是第三方病毒特异性(vs)t细胞供体。此类供体通常仅部分hla匹配，诸如患者的1-4个等位基因。其他来源包括源自健康供体的同种异体car-t细胞和诱导型多能干(ips)衍生的car-t细胞。有关同种异体car-t细胞来源的更多信息可见于graham等人,allogenic car-t cells:more than ease of access？,cells 2018,7(10):e155中，其第4.1至4.7段中关于同种异体car-t细胞来源
的教导特此以引用的方式并入。
45.与硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐一起用于同种异体car-t细胞疗法的t细胞可以是多种类型，包括但不限于细胞毒性t细胞(cd8 t细胞)、t辅助细胞(cd4 t细胞)、调节性t细胞(treg)以及它们的任何混合物或组合。
46.在car-t细胞中表达的car受体可以是任何已知的具有选定抗原识别区和合适的跨膜结构域和胞内结构域的car受体。抗原识别区的非限制性但说明性实例包括能够识别并特异性结合合适的肿瘤相关抗原(taa)的此类区域，诸如scfv。此类taa的实例包括cd19、cd20、cd30、cd33、cd123、flt3(cd135)、bcma、粘蛋白1(muc1)、间皮素(msln)、ny-eso-1、甲胎蛋白(afp)、癌胚抗原(cea)、人表皮生长因子受体2(her2)、肿瘤蛋白p53(p53)、ras蛋白(ras)、黑色素瘤相关抗原(mage)。例如，car受体胞外结构域中的间隔区可基于igg或cd8的铰链结构域。可用于car受体的跨膜结构域的说明性实例是cd28跨膜结构域。胞内结构域可包含cd3ζ的细胞质结构域和来自共刺激蛋白的一个或多个嵌合结构域，诸如cd28、4-1bb(cd137)或ox40。
47.实施方案的另一方面涉及硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐，所述硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐用于抑制对用同种异体car-t细胞治疗的受试者造成损害的非特异性白细胞活化。
48.在一个实施方案中，非特异性白细胞活化也可或替代地对同种异体car-t细胞造成损害，从而降低同种异体car-t细胞疗法的有效性。
49.在一个实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐用于抑制用同种异体car-t细胞治疗的受试者中的单核细胞和/或粒细胞活化。
50.实施方案的另一方面涉及硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐，所述硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐与同种异体car-t细胞组合用于治疗癌症。
51.癌症可以是任何癌症类型，针对所述癌症类型已经提出了car-t细胞疗法。在一个实施方案中，癌症选自由以下组成的组：白血病，优选慢性淋巴细胞性白血病(cll)诸如晚期b细胞cll、急性淋巴母细胞性白血病(all)诸如b细胞all、或急性髓系白血病(aml)；淋巴瘤，优选b细胞淋巴瘤诸如弥漫性大b细胞淋巴瘤(dlbcl)、或霍奇金淋巴瘤；和骨髓瘤，优选多发性骨髓瘤。
52.同种异体car-t细胞疗法也可用于治疗癌症以外的其他用途。例如，car-t细胞疗法已通过使用抗原识别区应用于治疗、抑制或预防甲型流感病毒，所述抗原识别区靶向来自m2蛋白的抗原，并且特别地m2胞外结构域(m2e)，其在整个甲型流感病毒中高度保守(talbot等人,an influenza virus m2 protein specific chimeric antigen receptor modulates influenza a/wsn/33h1n1 infection in vivo,the open virology journal 2013,7:28-36)。因此，通过使用具有靶向病毒相关抗原或细菌相关抗原的抗原识别区的car受体，同种异体car-t细胞疗法可用于治疗病毒或细菌感染。
53.car-t细胞疗法还被用于治疗各种自身免疫性疾病，包括系统性红斑狼疮(sle)，也简称为狼疮。在此种狼疮治疗中，靶向b细胞的cd19靶向car-t细胞被认为是治疗狼疮的稳定且有效的策略(kansal等人,sustained b cell depletion by cd19-targeted car t cells ishighly effective treatment for murine lupus,science translational medicine 2019,11(482):eaav1648)。
54.car-t细胞疗法通过预防或至少抑制移植排斥进一步用于器官移植中。例如，car技术已被用于将人treg重定向到供体-mhc i类分子，所述分子在同种异体移植物中普遍表达。更详细地说，在此类treg中表达的hal-a2特异性car减轻了在人皮肤异种移植的移植模型中发生的自体免疫介导的皮肤损伤(boardman等人,expression of a chimeric antigen receptor specific for donor hla class i enhances the potency of human regulatory t cells in preventing human skin transplant rejection,american journal of transplantation 2017,17:931-943)。
55.因此，实施方案的另外方面涉及硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐，所述硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐与同种异体car-t细胞组合用于治疗移植排斥、病毒或细菌感染、自身免疫性疾病或sle。事实上，通过用硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐补充治疗，本实施方案可应用于使用car-t细胞的任何已知治疗。因此，实施方案的另一方面涉及硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐，所述硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐与同种异体car-t细胞组合用于car-t细胞疗法。
56.实施方案的又一方面涉及一种组合物，所述组合物包含硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐和同种异体car-t细胞。
57.在一个实施方案中，组合物还包含水性注射溶液，所述水性注射溶液包含硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐和同种异体car-t细胞。水性注射溶液可以是可施用于受试者，优选注射到受试者中并且与car-t细胞相容且对受试者无毒的任何溶液。水性注射溶液可以是盐水，即nacl(水溶液)，诸如0.9％nacl盐水。水性注射溶液的另一个实例是缓冲溶液。此类缓冲溶液的非限制性但说明性实例是柠檬酸缓冲液，诸如一水柠檬酸(cam)缓冲液和磷酸盐缓冲液。
58.组合物可在如上文所讨论的静脉内溶液袋或输液袋中提供。
59.实施方案的相关方面定义了用作药物、用于car-t细胞疗法、用于治疗癌症、用于治疗移植排斥、用于治疗病毒或细菌感染、用于治疗自身免疫性疾病和/或用于治疗sle的组合物。
60.本发明的进一步方面涉及一种治疗、预防或抑制(诸如延迟)癌症、移植排斥、病毒或细菌感染、自身免疫性疾病和/或sle的发作的方法。所述方法包括向有需要的受试者施用根据本发明的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐和同种异体car-t细胞或组合物。
61.在下文中，对硫酸葡聚糖的(平均)分子量和硫含量的提及也适用于硫酸葡聚糖的任何药学上可接受的盐。因此，硫酸葡聚糖的药学上可接受的盐优选具有如以下实施方案中讨论的平均分子量和硫含量。
62.在实施方案的优选范围之外的硫酸葡聚糖被认为具有较差的效果且/或对细胞或受试者造成负面的副作用。
63.例如，与具有较低平均分子量的硫酸葡聚糖相比，分子量超过10,000da(10kda)的硫酸葡聚糖通常具有较低的作用与副作用曲线。这意味着与平均分子量在优选范围内的硫酸葡聚糖分子相比，对于较大的硫酸葡聚糖分子(》10,000da)，可安全地施用于受试者的硫酸葡聚糖的最大剂量较低。因此，当要将硫酸葡聚糖在体内施用于受试者时，此类较大的硫酸葡聚糖分子不太适合临床应用。
64.硫酸葡聚糖是硫酸化多糖，并且特别地硫酸化葡聚糖，即由许多葡萄糖分子组成
的多糖。如本文所定义的平均分子量表示单个硫酸化多糖可具有不同于所述平均分子量的分子量，但平均分子量表示硫酸化多糖的平均分子量。这进一步意味着硫酸葡聚糖样品的所述平均分子量周围将存在分子量的自然分布。
65.通常使用间接方法(诸如凝胶排斥/渗透色谱、光散射或粘度法)确定硫酸葡聚糖的平均分子量，或更准确地重均分子量(mw)。使用此类间接方法确定平均分子量将取决于许多因素，包括柱和洗脱液的选择、流速、校准程序等。
66.重均分子量(mw)：通常用于对分子大小而不是数值敏感的方法，例如光散射和尺寸排阻色谱(sec)方法。如果假设为正态分布，则mw每侧的重量相同，即分子量低于mw的样品中硫酸葡聚糖分子的总重量等于分子量高于mw的样品中硫酸葡聚糖分子的总重量。参数ni表示样品或批次中分子量为mi的硫酸葡聚糖分子的数量。
67.在一个实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的mw等于或低于10,000da。在一个特定实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的mw在2,000da至10,000da的区间内。
68.在另一个实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的mw在2,500da至10,000da的区间内，优选在3,000da至10,000da的区间内。在一个特定实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的mw在3,500da至9,500da的区间内，诸如在3,500da至8,000da的区间内。
69.在另一个特定实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的mw在4,500da至7,500da的区间内，诸如在4,500da至5,500da的区间内。
70.因此，在一些实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的mw等于或低于10,000da、等于或低于9,500da、等于或低于9,000da、等于或低于8,500da、等于或低于8,000da、等于或低于7,500da、等于或低于7,000da、等于或低于6,500da、等于或低于6,000da、或等于或低于5,500da。
71.在一些实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的mw等于或高于1,000da、等于或高于1,500da、等于或高于2,000da、等于或高于2,500da、等于或高于3,000da、等于或高于3,500da、等于或高于4,000da、或等于或高于4,500da。这些实施方案中的任一个可与定义mw上限的上述实施方案中的任一个组合，诸如与等于或低于10,000da的上限组合。
72.在一个特定实施方案中，如上所述的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的mw是平均mw，并且优选地通过凝胶排阻/渗透色谱、尺寸排阻色谱、光散射或基于粘度的方法确定。
73.数均分子量(mn)：通常通过端基测定(例如核磁共振(nmr)光谱或色谱法)得出。如果假设为正态分布，则可发现mn每侧的硫酸葡聚糖分子的数量相同，即分子量低于mn的样品中硫酸葡聚糖分子的数量等于分子量高于mn的样品中硫酸葡聚糖分子的数量。
74.在一个实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的如通过nmr光谱测量的mn在1,850da至3,500da的区间内。
75.在一个特定实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的如通过nmr光谱测量的mn在1,850da至2,500da的区间内，优选在1,850da至2,300da的区间内，诸如在1,850da
至2,000da的区间内。
76.因此，在一些实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的mn等于或低于3,500da、等于或低于3,250da、等于或低于3,000da、等于或低于2,750da、等于或低于2,500da、等于或低于2,250da、或等于或低于2,000da。另外，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的mn等于或高于1,850da。
77.在一个实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的每个葡萄糖单元的平均磷酸盐数在2.5至3.0的区间内。
78.在一个特定实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的每个葡萄糖单元的平均磷酸盐数在2.5至2.8的区间内，优选在2.6至2.7的区间内。
79.在一个实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的平均葡萄糖单元数在4.0至6.0的区间内。
80.在一个特定实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的平均葡萄糖单元数在4.5至5.5的区间内，优选在5.0至5.2的区间内。
81.在一个实施方案中，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的如通过nmr光谱测量的mn在1,850da至3,500da的区间内，每个葡萄糖单元的平均硫酸盐数在2.5至3.0的区间内，并且硫酸葡聚糖的葡萄糖单元中c2位置的平均硫酸化为至少90％。
82.在一个实施方案中，硫酸葡聚糖的平均葡萄糖单元数为约5.1，每个葡萄糖单元的平均硫酸盐数在2.6至2.7的区间内，并且mn在1,850da至2,000da的区间内。
83.在一个实施方案中，硫酸葡聚糖的药学上可接受的盐是硫酸葡聚糖的钠盐。在一个特定实施方案中，硫酸葡聚糖的钠盐的平均葡萄糖单元数为约5.1，每个葡萄糖单元的平均硫酸盐数在2.6至2.7的区间内，并且包括na

抗衡离子的mn在2,100da至2,300da的区间内。
84.在一个实施方案中，硫酸葡聚糖的平均葡萄糖单元数为5.1、每个葡萄糖单元的平均硫酸盐数为2.7、如通过nmr光谱测量的不含na

的平均mn为约1,900da至1,950da，并且如通过nmr光谱测量的含有na

的平均mn为约2,200da至2,250da。
85.根据实施方案的硫酸葡聚糖可作为硫酸葡聚糖的药学上可接受的盐诸如钠盐或钾盐提供。
86.目前优选的硫酸葡聚糖公开于wo 2016/076780中。
87.受试者优选地是哺乳动物受试者，更优选灵长类动物，并且特别地人受试者。然而，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐也可用于兽用同种异体car-t细胞疗法。动物受试者的非限制性实例包括灵长类动物、猫、狗、猪、马、小鼠、大鼠。
88.硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐优选通过注射施用于受试者，并且特别地通过静脉内(i.v.)注射、皮下(s.c.)注射或(i.p.)腹膜内注射，优选i.v.或s.c.注射。可使用的其他胃肠外施用途径包括肌肉内和关节内注射。硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物的注射可替代地或另外地直接发生在例如受试者体内将发生靶向效应的组织或器官或其他部位，诸如实体瘤。
89.实施方案的硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐优选地与选定的溶剂或赋形剂配制为水性注射溶液。溶剂有利地为水性溶剂，并且特别地缓冲溶液。此种缓冲溶液的非限制性实例是柠檬酸缓冲液诸如cam缓冲液，或磷酸盐缓冲液。例如，实施方案的硫酸葡聚糖可
溶解于盐水诸如0.9％nacl盐水中，然后任选地用75mm cam缓冲并使用氢氧化钠将ph调节至约5.9。非缓冲溶液也是可能的，包括水性注射溶液，诸如盐水，即nacl(水溶液)。此外，如果需要缓冲溶液，可使用除cam之外的其他缓冲系统。
90.实施方案不限于注射，并且可替代地使用其他施用途径，包括经口、经鼻、经口、经直肠、经皮、经气管、经支气管或局部。然后用基于特定施用途径选择的合适赋形剂或媒介物配制活性化合物硫酸葡聚糖。
91.实施方案的组合物可使用上述施用途径中的任一种施用。目前优选的施用途径包括静脉内注射，特别是对于白血病、淋巴瘤和骨髓瘤和其他血癌或血液癌症，或在肿瘤部位局部施用，特别是对于实体瘤。
92.硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐的合适剂量范围可根据应用而变化，诸如体外与体内、受试者的大小和重量、癌症类型和其他考虑因素。特别是对于人受试者，可能的剂量范围可为1μg/kg至100mg/kg体重，优选10μg/kg至50mg/kg体重。
93.在优选的实施方案中，将硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐配制成以0.05mg/kg至50mg/kg受试者体重、优选0.05mg/kg或0.1mg/kg至40mg/kg受试者体重、并且更优选0.05mg/kg或0.1mg/kg至30mg/kg、或0.1mg/kg至25mg/kg、或0.1mg/kg至15mg/kg、或0.1mg/kg至10mg/kg受试者体重范围内的剂量施用。
94.硫酸葡聚糖或其药学上可接受的衍生物可以单次施用来施用，诸如以单次推注注射的形式施用。此推注剂量可相当快地注射到受试者，但有利地随着时间的推移而输注，使得硫酸葡聚糖溶液在几分钟内输注到患者，诸如在5至10分钟期间。
95.替代地，硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐可在治疗期间多次(即至少两次)施用。
96.硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐可与其他活性剂一起依次、同时或以包含硫酸葡聚糖或其药学上可接受的盐和至少一种其他活性剂的组合物的形式施用。所述至少一种活性剂可选自可用于上述疾病、病症或病状中的任一种的任何剂。
97.实施例
98.本实施例的目的是在与car-t细胞组合的人全血环测定中研究硫酸葡聚糖。在具有含有和不含car-t细胞的硫酸葡聚糖的人全环系统中孵育后，评估细胞活化和活力以及血液状态。
99.材料和方法
100.car-t细胞的生产
101.使用lymphoprep(progen)从健康供体中分离外周血单核细胞(pbmc)，将其储存在-70℃的冷冻培养基(10％二甲基亚砜(dmso)、90％胎牛血清(fcs))中，并在补充有10％fcs和1％青霉素/链霉素的rpmi-1640中培养。将pbmc用1μg/ml okt-3(biolegend)和200iu/ml il-2(roche)活化1天，以选择性刺激t细胞。预先制备retronectin板(takara)(每孔7μg，在4℃下过夜)，并用500μl浓缩的cd19-car编码逆转录病毒(2g)或mock逆转录病毒(先前描述于karlsson等人,evaluation of intracellular signaling downstream chimeric antigen receptors,plos one 2015,10(12):e0144787中)在37℃下孵育30min两次。在retronectin包被的板和100iu il-2存在下，将活化的细胞用3ml浓缩的cd19-car编码逆转录病毒或mock逆转录病毒在37℃下转导2天。将细胞用100iu/ml il-2培养，并在
分析前扩增2周。为了分析cd19-car表达，将细胞用0.5μl抗car-dylight649(jackson immunoresearch)染色，用磷酸盐缓冲盐水(pbs)洗涤，之后进行表面标记(cd3、cd8、cd4、tf)。使用cytoflex(beckman coulter)进行流式细胞术分析。使用台盼蓝(t-20 counter,bio-rad)确定细胞计数和细胞活力。
102.全血环测定
103.在开放系统中采集健康供体的血液，并立即与测试化合物(cd19-car t细胞和硫酸葡聚糖(tikomed ab,sweden,wo 2016/076780，在图中称为ibsolvmir))混合。自体环境包括由捐献全血的同一供体产生的car-t细胞。在同种异体环境中，血液和car-t细胞错配(来自不同的供体)。与全血直接接触的所有材料均按照制造商的方案(corline,sweden)进行表面肝素化。将全血(2ml)添加到pvc管中，所述pvc管与表面肝素化金属连接器形成环。根据表1添加硫酸葡聚糖(0.2g/l)和car-t细胞(0.5
–5×
106个细胞)，并将环设置为在37℃下在轮上旋转。对血液等分试样进行取样，并添加乙二胺四乙酸(edta)至终浓度为10mm，以在给定时间点停止反应。使用自动血液分析仪xp-300或xn-350(sysmex)评估不同时间点的血细胞计数，同时使用i-stat筒(abbott)测量act白陶土时间和凝血酶原/inr时间测量。
104.将血浆样品保持在冰上，并且通过在4℃下以2000
×
g离心20分钟收集血浆。将血浆储存在-70℃下直到分析时间。根据制造商的说明，对在使用来自raybiotech的elisa试剂盒开始测定后的不同时间点收集的血浆进行补体分析(c3a)。对于涉及流式细胞术的实验，将血液样品与edta(终浓度为10mm)混合，之后与fc块(bd biosciences)和含有用于表面染色的抗人荧光染料标记的抗体(cd3、cd4、cd8、cd20、cd56、cd16、cd66b、cd14、biolegend)(包括活化标志物(cd107a、cd69、cd11b、biolegend))的抗体主混合物混合。将抗体主混合物用全血在4℃下孵育30min，用pbs洗涤并使用cytoflex(beckman coulter)进行分析。
105.表1
–
实验设置
[0106][0107]
结果
[0108]
与零样品相比，媒介物样品和添加了car-t细胞和硫酸葡聚糖的大多数样品中的血小板数量在可接受的20％下降范围内，这表明没有血小板聚集(图2a)。car-t细胞的添加导致白细胞(图2c)和淋巴细胞(图2d)的数量相应增加，但不影响红细胞(图2b)或嗜酸性粒细胞(图2g)的数量。在最高car-t细胞浓度下，中性粒细胞(图2e)和单核细胞(图2f)有增加的趋势。
[0109]
对血细胞比容(hct，％)、血红蛋白(hb，g/l)、平均红细胞体积(mvc，fl)、平均红细胞血红蛋白(mch，pg)和平均红细胞血红蛋白浓度(mchc，g/l)进行分析，并发现所有样品与零样本相比变化《10％(未示出)。
[0110]
硫酸葡聚糖导致所有凝血测量值升高(表2和表3)，并因此具有抗凝血特性。关于凝血参数，自体供体与同种异体供体之间没有显著差异。
[0111]
表2
–
自体供体的活化凝血时间(act)、凝血酶原时间(ptt)和国际标准化比值(inr)
[0112][0113]
∫测量前凝固的样品
[0114]
表3
–
同种异体供体的活化凝血时间(act)、凝血酶原时间(ptt)和国际标准化比值(inr)
[0115][0116]
*未检测到凝血
[0117]
一般来说，在所有时间点都观察到补体的活化，其中在两个供体中添加car-t细胞的情况下，c3a水平略高(数据未示出)。在单独和与car-t细胞共同施用的情况下，添加硫酸葡聚糖降低c3a的水平(数据未示出)。
[0118]
一般来说，在含有和不含硫酸葡聚糖的组中t细胞群(血液供体的cd3 、cd4 、cd8 t细胞)的活力和活化相似(图3a至图3i)。正如预期的那样，在输注更高数量的car-t细胞时，活化标志物增加。t细胞中的car-t细胞比例在自体供体中高于同种异体供体(图4a至图4c)。
[0119]
通过bio-rad细胞计数器测量，多于90％的car-t细胞在添加到全血环系统之前是
有活力的。在自体供体中，对于自体供体，car-t细胞的活力在不含硫酸葡聚糖的情况下为大约40％，并且在含有硫酸葡聚糖的情况下为大约60％(图5c)。在同种异体供体中，car-t细胞的活力在40-60％之间(图5c)。硫酸葡聚糖增加了来自同种异体供体的t细胞群中对car-t细胞特异性标志物呈阳性的细胞的百分比(图4a)。在来自含有硫酸葡聚糖的同种异体供体的cd8 t细胞群(图4b)和cd4 t细胞群(图4c)中，对car-t细胞特异性标志物呈阳性的细胞的百分比有类似的增加趋势。当添加硫酸葡聚糖时，自体组与同种异体组之间cd3 car-t细胞和cd8 car-t细胞的比例更相似。
[0120]
未经处理的同种异体car-t细胞组与自体car-t细胞组之间的活化标志物水平存在显著差异(图5a、图5b和图6)。硫酸葡聚糖诱导同种异体car-t细胞组中活化标志物水平的调节，使其与自体car-t细胞组中的活化标志物水平更相似(图5a、图5b和图6)。因此，同种异体car-t细胞组与自体car-t细胞组之间的活化模式在含有硫酸葡聚糖的供体之间变得更相似。
[0121]
在添加了car-t细胞的组中注意到b细胞数量减少(图8a和图8b)，并且供体之间的b细胞减少或活化没有明显差异，这是预期的，因为b细胞计数的减少取决于car结构。在添加了最高数量的car-t细胞的组中注意到b细胞的最高活化(图7a和图7b)。b细胞计数和活化模式在含有或不含硫酸葡聚糖的样品中相似，这证实硫酸葡聚糖对car功能没有任何负面影响。
[0122]
单核细胞和粒细胞的活化在含有car-t细胞的环中明显增加。硫酸葡聚糖的添加降低了单核细胞和粒细胞上活化标志物cd11b的表达(图9a和图9b)。
[0123]
硫酸葡聚糖对靶向b细胞的car-t细胞没有任何负面影响。因此，car功能不受硫酸葡聚糖的负面影响。硫酸葡聚糖能够减少自体组中car-t细胞的非特异性活化，以使活化模式接近如使用自体car-t细胞所见的活化水平。此外，硫酸葡聚糖能够减少单核细胞和粒细胞的活化，否则这可能相当于同种异体car-t细胞疗法中所见的非特异性白细胞活化的至少一部分。
[0124]
上述实施方案应被理解为本发明的几个说明性实例。本领域技术人员应理解，可在不脱离本发明的范围的情况下对实施方案进行各种修改、组合和改变。特别地，在技术上可能的情况下，不同实施方案中的不同部分解决方案可在其他配置中组合。然而，本发明的范围由所附权利要求定义。