微球标记抗体的方法与流程

1.本发明属于抗体标记技术领域，具体为微球标记抗体的方法。


背景技术：

2.抗体经过酶标记、铁蛋白标记或通过胶体金标记获得标记抗体，是免疫电镜样品制备的一种方法，用于观察抗原抗体免疫复合物方面研究的手段。免疫标记技术是将一些既易测定又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗体分子上，通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的性质与含量。抗体标记主要是用于抗原的定位分析，在某些情况下，也可以对混杂有大量其他分子的样本中的抗原进行定量检测。由于抗体与其相应抗原具有很高的亲和力，因此带有易识别标记物的抗体可以定位分析抗原，并且是一种理想的快速价廉的定量测定方法。
3.但是常见的标记抗体的过程中，样品孔之间也有空隙，这些空隙并没有填进东西，而抗体就会被吸附在空的洞里，这样，就会有很多非特异性的信号，从而影响实验的准确性。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于：为了解决上述提出的问题，提供微球标记抗体的方法。
5.本发明采用的技术方案如下：微球标记抗体的方法，其特征在于：所述微球标记抗体的方法包括以下步骤：
6.s1:取来离心机和50μl微球，将微球加入到离心机的内部，开始对微球进行离心操作，离心过程结束之后，取出离心液中的上清液，将其废弃不用；
7.s2:取来涡旋振荡机，超声震荡机，加入100μlnah2po4，使用涡旋振荡机对其进行涡旋振荡处理，之后使用超声震荡机对其进行超声震荡，处理结束之后，将微球溶液加入到离心机的内部，对其进行离心处理，离心过程结束之后，取出离心液中的上清液，将其废弃不用；
8.s3:取来步骤s2中的溶液，加入80μl50mes缓冲液，使用涡旋振荡机对其进行涡旋振荡处理，之后使用超声震荡机对其进行超声震荡，处理结束之后，加入10μl50mg/mledc溶液和10μl50mg/mlsulfo-nhs溶液，涡旋振荡混匀；
9.s4:步骤s3结束之后，室温避光振荡孵育20分钟，孵育结束后，取来离心机，离心的速度控制为1000xg进行离心10分钟，离心过程结束之后，取出离心液中的上清液，将其废弃不用；
10.s5:加入50mmmes(ph5.0)重悬沉淀，使用涡旋振荡机对其进行涡旋振荡处理，之后使用超声震荡机对其进行超声震荡处理结束之后，将微球溶液加入到离心机的内部，对其进行离心处理，离心过程结束之后，取出离心液中的上清液，将其废弃不用；之后使用清水再对溶液重复洗涤一次备用；
11.s6:取70μl浓度为500μg/ml的抗人il-6抗体，加入脱盐柱脱盐一次；
12.s7:将脱盐后的il-6抗体加入微球中，使用涡旋振荡机对其进行涡旋振荡处理，等其混合均匀之后，室温避光振荡孵育2小时
13.s8:孵育结束2小时后，将微球溶液加入到离心机的内部进行离心操作，离心过程结束之后，取出离心液中的上清液，将其废弃不用；
14.s9:加入封闭液，使用涡旋振荡机对其进行涡旋振荡处理，之后使用超声震荡机对其进行超声震荡处理结束之后，将微球溶液加入到离心机的内部，对其进行离心处理，离心过程结束之后，取出离心液中的上清液，将其废弃不用；
15.s10:用封闭液离心洗涤两次备用；
16.s11:加入250～～300μl封闭液重悬，流式上机计数，之后就可以对混合液进行装瓶保存，最终结束整个标记抗体的过程。
17.在一优选的实施方式中，所述步骤s1中，选用的50μl微球内部微球的含量为4
×
106个，离心的速度控制为1000xg，离心的时间控制为10分钟。
18.在一优选的实施方式中，所述步骤s2中，涡旋振荡后，加入nah2po4的过程中，控制nah2po4溶液的ph在6.2，涡旋振荡的时间为20秒，超声处理的时间为20秒，离心的速度控制为1000xg。
19.在一优选的实施方式中，所述步骤s3中，加入80μl50mes缓冲液之后和加入10μl50mg/mledc溶液和10μl50mg/mlsulfo-nhs溶液之后的涡旋振荡的时间都为20秒，超声处理的时间都为20秒。
20.在一优选的实施方式中，所述步骤s5中，旋振荡的时间为30秒，超声处理的时间为30秒，离心的速度控制为1000xg。
21.在一优选的实施方式中，所述步骤s8中，离心的速度控制为1000xg，离心处理的时间为10分钟。
22.在一优选的实施方式中，所述步骤s9中，封闭液为99.88％pbs溶液、0.1％bsa溶液和0.02％tween20溶液的混合物。
23.在一优选的实施方式中，所述步骤s10中，封闭液为99.88％pbs溶液、0.1％bsa溶液和0.02％tween20溶液的混合物，离心洗涤的速率为控制为1000xg。
24.综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
25.1、本发明中，封闭液为99.88％pbs溶液、0.1％bsa溶液和0.02％tween20溶液的混合物，可以有效的与微球表面发生作用，从而使得空洞都会被bsa或者酪蛋白填满，这样，抗体蛋白就不会被非特异性的吸附到膜上，而只会跟特异性蛋白结合，从而提高了标记的准确性，也提高了后续使用过程中的反应速率。
具体实施方式
26.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
27.实施例一：
28.微球标记抗体的方法，所述微球标记抗体的方法包括以下步骤：
29.s1:取来离心机和50μl微球，将微球加入到离心机的内部，开始对微球进行离心操作，离心过程结束之后，取出离心液中的上清液，将其废弃不用；s1中，选用的50μl微球内部微球的含量为4
×
106个，离心的速度控制为1000xg，离心的时间控制为10分钟；
30.s2:取来涡旋振荡机，超声震荡机，加入100μlnah2po4，使用涡旋振荡机对其进行涡旋振荡处理，之后使用超声震荡机对其进行超声震荡，处理结束之后，将微球溶液加入到离心机的内部，对其进行离心处理，离心过程结束之后，取出离心液中的上清液，将其废弃不用；步骤s2中，涡旋振荡后，加入nah2po4的过程中，控制nah2po4溶液的ph在6.2，涡旋振荡的时间为20秒，超声处理的时间为20秒，离心的速度控制为1000xg；
31.s3:取来步骤s2中的溶液，加入80μl50mes缓冲液，使用涡旋振荡机对其进行涡旋振荡处理，之后使用超声震荡机对其进行超声震荡，处理结束之后，加入10μl50mg/mledc溶液和10μl50mg/mlsulfo-nhs溶液，涡旋振荡混匀；步骤s3中，加入80μl50mes缓冲液之后和加入10μl50mg/mledc溶液和10μl50mg/mlsulfo-nhs溶液之后的涡旋振荡的时间都为20秒，超声处理的时间都为20秒；
32.s4:步骤s3结束之后，室温避光振荡孵育20分钟，孵育结束后，取来离心机，离心的速度控制为1000xg进行离心10分钟，离心过程结束之后，取出离心液中的上清液，将其废弃不用；
33.s5:加入50mmmes(ph5.0)重悬沉淀，使用涡旋振荡机对其进行涡旋振荡处理，之后使用超声震荡机对其进行超声震荡处理结束之后，将微球溶液加入到离心机的内部，对其进行离心处理，离心过程结束之后，取出离心液中的上清液，将其废弃不用；之后使用清水再对溶液重复洗涤一次备用；步骤s5中，旋振荡的时间为30秒，超声处理的时间为30秒，离心的速度控制为1000xg；
34.s6:取70μl浓度为500μg/ml的抗人il-6抗体，加入脱盐柱脱盐一次；
35.s7:将脱盐后的il-6抗体加入微球中，使用涡旋振荡机对其进行涡旋振荡处理，等其混合均匀之后，室温避光振荡孵育2小时
36.s8:孵育结束2小时后，将微球溶液加入到离心机的内部进行离心操作，离心过程结束之后，取出离心液中的上清液，将其废弃不用；步骤s8中，离心的速度控制为1000xg，离心处理的时间为10分钟；
37.s9:加入封闭液，使用涡旋振荡机对其进行涡旋振荡处理，之后使用超声震荡机对其进行超声震荡处理结束之后，将微球溶液加入到离心机的内部，对其进行离心处理，离心过程结束之后，取出离心液中的上清液，将其废弃不用；步骤s9中，封闭液为99.88％pbs溶液、0.1％bsa溶液和0.02％tween20溶液的混合物；
38.s10:用封闭液离心洗涤两次备用；步骤s10中，封闭液为99.88％pbs溶液、0.1％bsa溶液和0.02％tween20溶液的混合物，离心洗涤的速率为控制为1000xg；
39.s11:加入250μl封闭液重悬，流式上机计数，之后就可以对混合液进行装瓶保存，最终结束整个标记抗体的过程；封闭液为99.88％pbs溶液、0.1％bsa溶液和0.02％tween20溶液的混合物，可以有效的与微球表面发生作用，从而使得空洞都会被bsa或者酪蛋白填满，这样，抗体蛋白就不会被非特异性的吸附到膜上，而只会跟特异性蛋白结合，从而提高了标记的准确性，也提高了后续使用过程中的反应速率。
40.实施例二：
41.微球标记抗体的方法，所述微球标记抗体的方法包括以下步骤：
42.s1:取来离心机和50μl微球，将微球加入到离心机的内部，开始对微球进行离心操作，离心过程结束之后，取出离心液中的上清液，将其废弃不用；s1中，选用的50μl微球内部微球的含量为4
×
106个，离心的速度控制为1000xg，离心的时间控制为10分钟；
43.s2:取来涡旋振荡机，超声震荡机，加入100μlnah2po4，使用涡旋振荡机对其进行涡旋振荡处理，之后使用超声震荡机对其进行超声震荡，处理结束之后，将微球溶液加入到离心机的内部，对其进行离心处理，离心过程结束之后，取出离心液中的上清液，将其废弃不用；步骤s2中，涡旋振荡后，加入nah2po4的过程中，控制nah2po4溶液的ph在6.2，涡旋振荡的时间为20秒，超声处理的时间为20秒，离心的速度控制为1000xg；
44.s3:取来步骤s2中的溶液，加入80μl50mes缓冲液，使用涡旋振荡机对其进行涡旋振荡处理，之后使用超声震荡机对其进行超声震荡，处理结束之后，加入10μl50mg/mledc溶液和10μl50mg/mlsulfo-nhs溶液，涡旋振荡混匀；步骤s3中，加入80μl50mes缓冲液之后和加入10μl50mg/mledc溶液和10μl50mg/mlsulfo-nhs溶液之后的涡旋振荡的时间都为20秒，超声处理的时间都为20秒；
45.s4:步骤s3结束之后，室温避光振荡孵育20分钟，孵育结束后，取来离心机，离心的速度控制为1000xg进行离心10分钟，离心过程结束之后，取出离心液中的上清液，将其废弃不用；
46.s5:加入50mmmes(ph5.0)重悬沉淀，使用涡旋振荡机对其进行涡旋振荡处理，之后使用超声震荡机对其进行超声震荡处理结束之后，将微球溶液加入到离心机的内部，对其进行离心处理，离心过程结束之后，取出离心液中的上清液，将其废弃不用；之后使用清水再对溶液重复洗涤一次备用；步骤s5中，旋振荡的时间为30秒，超声处理的时间为30秒，离心的速度控制为1000xg；
47.s6:取70μl浓度为500μg/ml的抗人il-6抗体，加入脱盐柱脱盐一次；
48.s7:将脱盐后的il-6抗体加入微球中，使用涡旋振荡机对其进行涡旋振荡处理，等其混合均匀之后，室温避光振荡孵育2小时
49.s8:孵育结束2小时后，将微球溶液加入到离心机的内部进行离心操作，离心过程结束之后，取出离心液中的上清液，将其废弃不用；步骤s8中，离心的速度控制为1000xg，离心处理的时间为10分钟；
50.s9:加入封闭液，使用涡旋振荡机对其进行涡旋振荡处理，之后使用超声震荡机对其进行超声震荡处理结束之后，将微球溶液加入到离心机的内部，对其进行离心处理，离心过程结束之后，取出离心液中的上清液，将其废弃不用；步骤s9中，封闭液为99.88％pbs溶液、0.1％bsa溶液和0.02％tween20溶液的混合物；
51.s10:用封闭液离心洗涤两次备用；步骤s10中，封闭液为99.88％pbs溶液、0.1％bsa溶液和0.02％tween20溶液的混合物，离心洗涤的速率为控制为1000xg；
52.s11:加入250μl封闭液重悬，流式上机计数，之后就可以对混合液进行装瓶保存，最终结束整个标记抗体的过程；封闭液为99.88％pbs溶液、0.1％bsa溶液和0.02％tween20溶液的混合物，可以有效的与微球表面发生作用，从而使得空洞都会被bsa或者酪蛋白填满，这样，抗体蛋白就不会被非特异性的吸附到膜上，而只会跟特异性蛋白结合，从而提高了标记的准确性，也提高了后续使用过程中的反应速率。
53.需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
54.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。